CN103667500B - 一种帕金森病隐性遗传致病基因诊断芯片 - Google Patents
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Abstract
一种帕金森病隐性遗传致病基因诊断芯片，该基因诊断芯片共有96个突变点序列，其中<i>Parkin？</i>23个，<i>PINK1？</i>19个，<i>DJ-1？</i>6个，<i>ATP13A2？</i>14个，<i>PLA2G6？</i>25个，<i>FBXO7？</i>9个。其检测步骤包括：制作SUD板；沉淀SUD板；重悬SUD板；制作ASE板；加MEL；PCR前期工作；PCR产物的结合；芯片前样品准备；芯片杂交；清洗芯片；芯片扫描及数据读取；数据分析。本发明之帕金森病隐性遗传致病基因诊断芯片，耗资少，能方便、快速进行帕金森病隐性致病遗传基因的筛查。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因诊断芯片，尤其是涉及一种帕金森病隐性遗传致病基因诊断芯片。
背景技术
帕金森病（parkinson’sdisease,PD），又称震颤麻痹（paralysisagitans）,是一种常见的神经系统退行性疾病，病理以黑质多巴胺（Dopamine,DA）能神经元的丢失和残存神经元胞体内路易小体（Lewybody,LB）的形成为特点。一般认为帕金森病与遗传、环境、衰老等多种因素有关。随着分子生物学的发展，遗传因素在帕金森病的发病机制中起到的作用越来越受到关注。目前至少定位了18个帕金森病的致病基因位点，并克隆了13个致病基因。从遗传方式看，PD可呈常染色体显性遗传(autosomaldominantprkinson’sdisease,AD-PD)、常染色体隐性遗传(autosomalrecessiveparkinson’sdisease,AR-PD)，一些病例呈散发。通常帕金森病多见于老年人，英国人群中PD发病率为140/十万，约3.6%的PD病人发病年龄小于45岁，称为早发性帕金森病，较晚发性帕金森病人更容易表现出家族聚集性。PD可由不同基因的不同突变引起，因此，找寻及鉴定本病的致病基因不仅是了解、阐明本病发病的必须途径，同时也是建立本病的基因诊断和基因治疗的先决条件。
由于基因的突变是本病发生的原因之一，从长远看，对突变的鉴定使我们有可能使用纠正突变的基因疗法或其他针对这一突变的生物学效应的方法去治疗本病。迄今为止，PD已发现了13个致病基因，其中与AD-PD相关的致病基因有7个，分别为SNCA、UCH-L1、LRRK2、GIGYF2、Omi/HTRA2、VPS35、EIF4G1，与AR-PD相关的致病基因有6个，分别为Parkin、PINK1、DJ-1、ATP13A2、PLA2G6、FBX07。这些致病的突变类型包括：错义突变、无义突变、插入突变、缺失突变、剪切位点突变、重排突变、移码突变、大片段缺失等多种类型，而点突变占有很重要的地位。对于基因微突变检测，目前多采用PCR结合DNA直接测序法，结果直观、可靠，但由于PD致病基因多，且很多致病基因序列长，应用PCR结合DNA直接测序法逐个进行基因检测筛查耗时长、耗资大。而目前已知在某些致病基因中可能存在相对常见的突变热点，如国内外报导的Parkin基因IVS9+18C>T可能为隐性遗传PD的热点突变，如能建立对PD隐性遗传致病基因常见突变热点的基因筛查技术将大大提高PD的基因诊断效率，降低基因检测成本。
由于帕金森病存在临床异质性及多基因遗传，给基因检测带来巨大困难，且需要耗费相当大的人力和物力。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种耗资少，能方便、快速进行筛查的帕金森病隐性遗传致病基因诊断芯片。
本发明解决所述技术问题所采用的技术方案是：
本发明之帕金森病隐性遗传致病基因诊断芯片共有96个突变点序列，包含Parkin23个、PINK119个、DJ-16个、ATP13A214个、PLA2G625个、FBXO79个。
本发明之帕金森病隐性遗传致病基因诊断芯片96个突变点序列的设计步骤：（1）利用pubmed数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）和万方数据库（http://www.wanfangdata.com.cn）在线查阅帕金森病隐性遗传致病基因相关文献，检索词分别为“parkinson’sdiseaseORPD”和“帕金森病ORPD”，选择帕金森病导致隐性遗传方式各基因中已报导的点突变（错义突变或剪切位点突变）位点，UCSCGenomeBioinformatics网站（http://genome.ucsc.edu）在线查询相应序列，突变点上下游各包含60个碱基，突变位点等位基因用“/”分开（TAG[T/G]ACG），将每个位点编号，输入序列、染色体定位信息，以EXCEL文档保存；（2）将初步选定的点突变位点的序列文档，用芯片设计软件（AsaayDesignTool,ADT）进行评分，得到评分文件，包含设计成功率、最小等位基因频率（minorallelefrequencies.MAFs）；（3）合分析各位点评分结果，除去错误序列，选择设计成功率评分大于0.5的位点，进入下一步分析；（3）选择热点突变，选择的突变点，确保两序列之间距离大于60bp，突变点上下游各包含60bp，以避免交叉，影响芯片质量，最终确定96个突变点序列；（4）将SNPs资料交由Illumina公司制备成HSPGoldenGateUniversal-32BeadChips基因诊断芯片。
本发明之帕金森病隐性遗传致病基因诊断芯片是在光纤微珠上固定能与突变点杂交的探针。
本发明建立起基于这一基因的诊断技术，对临床上可疑隐性遗传帕金森病及散发早发性患者进行确凿的基因水平的诊断，能立即得到较可靠的结果，其早期诊断率将大大提高，从而降低误诊率，有利于治疗。
本发明可建立PD隐性遗传致病基因常见突变热点的基因筛查技术，将本发明之芯片应用于PD隐性遗传家系病人及散发早发性PD病人突变检测，耗资少，能方便、快速的对PD隐性遗传家系患者及散发早发性PD患者进行筛查，由于有多位点，可以有效地减少因个体差异所引起的漏检。
附图说明
图1为Parkin基因c.850G>C突变位点的基因分型示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例
本发明之帕金森病基因诊断芯片共有96个突变点序列，均为AR-PD，其中Parkin23个、PINK119个、DJ-16个、ATP13A214个、PLA2G625个、FBXO79个。
本发明之帕金森病基因诊断芯片是在光纤微珠上固定能与突变点杂交的探针，所述探针的序列表为：
| 编号 | 序列 |
| 1 | ctggcgccgctgcgcgcatgggcctgttcctggcccgcagccgccacctacccagtgaccwtgataggtacgtgggtacctgccaggtacagcctctctgcgccgccccacgccccggtat |
| 2 | gcatcttccagctcaaggaggtggttgctaagcgacagggggttccggctgaccagttgcstgtgattttcgcagggaaggagctgaggaatgactggactgtgcaggtgagtctcccttg |
| 3 | tgtgacctggatcagcagagcattgttcacattgtgcagagaccgtggagaaaaggtcaakaaatgaatgcaactggaggcgacgaccccagaaacgcggcgggaggctgtgagcgggagc |
| 4 | ggaggcgacgaccccagaaacgcggcgggaggctgtgagcgggagccccagagcttgactygggtggacctcagcagctcagtcctcccaggagactctgtggggctggctgtcattctgc |
| 5 | aatctacaacagcttttatgtgtattgcaaaggcccctgtcaaagagtgcagccgggaaawctcagggtacagtgcagcacctgcaggcaggcaacgctcaccttgacccaggtaaggaaa |
| 6 | gttgttttttcccaaagggtccatcttgctgggatgatgttttaattccaaaccggatgaktggtgaatgccaatccccacactgccctgggactagtgcagtaagtacctggtcacattc |
| 7 | cacaccccacctctgacaaggaaacatcagtagctttgcacctgatcgcaacaaatagtcrgaacatcacttgcattacgtgcacagacgtcaggagccccgtcctggttttccagtgcaa |
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| 9 | ttccacttatactgtgtgacaagactcaatgatcggcagtttgttcacgaccctcaacttsgctactccctgccttgtgtgggtaagtctagcatgttttctctccatctctaatgctaat |
| 10 | gctggctgtcccaactccttgattaaagagctccatcacttcaggattctgggagaagagyaggtgagtgagcatctcaaaggctgcatcagactgtcatgaaagatagacgctaatgaga |
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| 19 | cggagcctgaccagaggaaagtcacctgcgaagggggcaatggcctgggctgtggggtgaktactgcccacacccctggagcggtgtgttcctgtccttgtttgcttttgcacatgggctg |
| 20 | gaatgcgtgttttccaggtacttgctgcgaacccaccacacctttgttttctgcccccaasaggaggctgcatgcacatgaagtgtccgcagccccagtgcaggctcgagtggtgctggaa |
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| 69 | acctgctgtgcctggatggaggaggagtgaaaggcctcatcatcatccagctcctcatcgycatcgagaaggcctcgggtgtggccaccaaggacctgtttgactgggtggcgggcaccag |
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| 71 | ccaaggtgatgctgacagggacactgtctgaccggcagccggctgaactccacctcttccrgaactacgatgctccagaaactgtccgggagcctcgtttcaaccagaacgttaacctcag |
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| 74 | cgtttcaaccagaacgttaacctcaggcctccagctcagccctcagaccagctggtgtggygggcggcccgaagcagcggggcagctcctacttacttccgacccaatgggcgcttcctgg |
| 75 | caggacctgatccgcaagggtcaggccaacaaggtgaagaaactctccatcgttgtctccstggggacagggaggtccccacaagtgcctgtgacctgtgtggatgtcttccgtcccagca |
| 76 | gtcaaccccaggaactcacagagtggattccgactcttccagctggagttggaggctgacrccctagtgaatttccatcagtattcttcccagctgctacccttctatgagagctcccctc |
| 77 | ggctgaccccgctgcacctggcctgccagctggggaagcaggagatggtccgcgtgctgcygctgtgcaatgctcggtgcaacatcatgggccccaacggctaccccatccactcggccat |
| 78 | aagacccccgttacggagccagccccctccactgggccaagaacgcagagatggcccgcakgctgctgaaacggggctgcaacgtgaacagcaccagctccgcggggaacacggccctgca |
| 79 | tagtgctgctgacccacggggccaacgcggatgcccgcggagagcacggcaacaccccgcygcacctggccatgtcgaaagacaacgtggagatgatcaaggccctcatcgtgttcggagc |
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| 82 | gctcctacttacttccgacccaatgggcgcttcctggacggtgggctgctggccaacaacmccacgctggatgccatgaccgagatccatgagtacaatcaggacctgatccgcaagggtc |
| 83 | aagactgtttttggggccaaggaactgggcaagatggtggtggactgttgcacggatccasacgggcgggctgtggaccgggcacgggcctggtgcgagatggtcggcatccagtacttca |
| 84 | ccgcacctgggactgcgtcctggtcaaccccaggaactcacagagtggattccgactcttmcagctggagttggaggctgacgccctagtgaatttccatcagtattcttcccagctgcta |
| 85 | aacagcaccagctccgcggggaacacggccctgcacgtggcggtgatgcgcaaccgcttckactgtgccatagtgctgctgacccacggggccaacgcggatgcccgcggagagcacggca |
| 86 | tgcagctgggtcgagcgctgctgctgcgcttcacgggcaagcccggccgggcctacggctwggggcggccgggcccggcggcgggctgtgtccgcggggagcgtccaggctgggccgcagg |
| 87 | accccacgctggatgccatgaccgagatccatgagtacaatcaggacctgatccgcaaggktcaggccaacaaggtgaagaaactctccatcgttgtctccctggggacagggaggtcccc |
| 88 | gtttgtcgtgacctctttactgcttcaaatgacccactcctgtggaggtttttatatctgsgtgattttcgagacaatactgtcagagttcaagacacagattggaaagaactgtacagga |
| 89 | ctgagaccacgctttgatccagttggcccacttccaggacctaaccccatcttgccagggygaggcggccccaatgacagatttccctttagacccagcaggggtcggccaactgatggcc |
| 90 | ggattgtttctggggacttgatatgtttgattcttcaagatgacattccagcgcctaatayaccttcatccacagattcagagcattcttcactccagaataatgagcaaccctctttggc |
| 91 | tttaaagaccagctggtgtatcctcttctggcttttacccgacaagcactgaacctaccaratgtatttgggttggtcgtcctcccattggaactgaaactacggatcttccgacttctgg |
| 92 | atttttcccttttcctttgtagacaatactgtcagagttcaagacacagattggaaagaaktaggtatttttaaatattaagactaatgtccataacacagaaatgactagtgaattaata |
| 93 | ctctcacctgtgtgcctttgggaaacctgattgttgtaaatgctacactaaaaatcaacartgagattagaagtgtgaaaagattgcagctgctaccagaatcttttatttgcaaagagaa |
| 94 | atcagttcactcattcctggtcctggggagacgcccagccagtttcctccactgagaccaygctttgatccagttggcccacttccaggacctaaccccatcttgccagggcgaggcggcc |
| 95 | tctttactgcttcaaatgacccactcctgtggaggtttttatatctgcgtgattttcgagktgatttccgtaatgacatattcacaagaaagggctcttattgtcttgattactcagctca |
| 96 | ttcttcactccagaataatgagcaaccctctttggccaccagctccaatcagactagcatrcaggatgaacaaccaagtgattcattccaaggacaggcagcccagtctggtgtttggaat |
检测步骤包括：制作SUD板；沉淀SUD板；重悬SUD板；制作ASE板；加MEL；PCR前期工作；PCR产物的结合；芯片前样品准备；芯片杂交；清洗芯片；芯片扫描及数据读取；数据分析。
具体操作方法如下：
第一天：
【1】制作SUD板
1.取一个0.2ml96孔裙边板,标记为SUD板，每孔加5μlMS1工作液；
2.每孔加5μl浓度为50ng/μl的DNA模板；
3.盖热盖5秒,盖住96孔SUD板；
4.SUD板250×g，离心1分钟；
5.2300rpm震荡，20秒，250×g，离心1分钟；
6.将SUD板放入加热箱，95℃，30分钟；
7.取出SUD板，250×g离心1分钟。
【2】沉淀SUD板
1.轻轻去掉热盖。
2.每孔加5μlPS1至SUD板，盖透明膜。
3.250×g离心1分钟，2300rpm震荡20秒，直到溶液均呈蓝色。
4.去掉透明膜，加15μl异丙醇至每孔。
5.盖透明膜，1600rpm震荡20秒，离心3000×g，20分钟，离心后底部应有的蓝色沉淀。
6.去掉透明膜，倒掉上清，倒置在吸水纸上，吸收过多的上清液，8g倒置离心1分钟。
7.SUD板正置室温干燥15分钟。
【3】重悬SUD板
1.每孔加10μlRS1,溶解DNA沉淀。
2.盖上透明膜，250×g离心1分钟。
3.2300rpm震荡1min，直至所有沉淀完全被溶解。
【4】制作ASE板
1.SUD板250×g离心1分钟。
2.取新的0.2ml96孔裙边板（ASE板），每孔加OPA10μl，OB130μl。
3.小心去掉SUD板的透明膜，从SUD板中每孔取出10μl加入至ASE板。
4.ASE板盖热盖3秒，离心250×g，1分钟。
5.震荡ASE板1600rpm，1分钟，直到所有的磁珠完全重悬。
6.将封膜的ASE板放入70℃的加热箱，调为30℃，至少2小时，不超过16小时。
第二天
【5】加MEL
1.从加热箱中取出ASE板250×g离心1分钟。
2.将ASE板放在磁板上，2分钟。
3.用移液枪去上清50μl，操作不宜太久，磁珠易干，难震起来。
4.加50μlAm1至每孔，盖透明膜。
5.1600rpm震荡20秒，至磁珠完全震起来。
6.将ASE板放磁板上2分钟，直到磁珠完全靠在两边。
7.去上清50μl，加50μlAM1至每孔，盖透明膜。
8.1600rpm震荡，20秒，至磁珠完全震起来。
9.将ASE板放在磁板上，2分钟，去上清50μl。
10.加AM150μl至每孔，盖膜。
11.1600rpm震荡20秒，直到把所有磁珠全部震起来为止。
12.将ASE板放在磁板上，2分钟，去上清50μl。
13.将ASE板从磁板上取出，加UB150μl至每孔。
14.ASE板放在磁板上，2分钟，去上清50μl。
15.将ASE板从磁板上取出，加UB150μl至每孔。
16.ASE板放在磁板上，2分钟，去上清50μl。
17.将ASE板从磁板上取出，在ASE板中加MEL37μl，盖透明膜。
18.1600rpm震荡1分钟，至磁珠全部震匀。
19.将ASE板放在45℃加热箱中，15分钟。
【6】PCR前期工作
1.将一个新的裙边板编为PCR板。
2.MMP管中加64μlDNA聚合。
3.颠倒试管多次，混合溶液，将其倒入一个可放试剂的容器中。
4.PCR板中，每孔加混合溶液30μl。
5.盖上透明膜，250×g离心1分钟。
6.将PCR板置于避光区。
7.将从加热箱中取出ASE板，放在磁板上，去掉透明膜，去上清。
8.把ASE板从磁板上取下，加50μlUB1至每孔。
9.把ASE板放在磁板上，约2分钟，去上清50μl。
10.每孔加35μlIP1，盖膜，1800rpm震荡，1分钟,95℃加热箱中，1分钟。
11.取出ASE板，置磁板上2分钟。
12.从ASE板各取30μl上清液至PCR板，盖膜，置PCR仪上做PCR，总体积60μl。
PCR反应程序：
【7】PCR产物的结合
1.从PCR仪上取下PCR板，250×g离心1分钟。
2.取20μlMPB至每孔，调移液枪至85μl，上下打匀，将缓冲液与模板充分混匀。
3.每孔各取70μl加入至过滤板中，过滤板下面套一个96孔板，盖膜，避光，室温孵育60分钟。
【8】芯片前样品准备
1.1000×g离心5分钟，25℃，在96孔过滤板中每孔加50μlUB2，盖盖子。
2.1000×g离心5分钟，25℃，在96孔过滤板下换一个新的96孔板。
3.在新的96孔板中，每孔各加30μlMH1。
4.在96孔过滤板中每孔各加30μl0.1NNaOH，洗脱DNA。
5.1000×g离心5min，25℃。
6.离心后的过滤下来的液体前后、左右平行轻摇混匀
7.盖膜，避光，准备芯片上样。
【9】芯片杂交
1.将96孔过滤板过滤下来的样品每个取15μl加入芯片。
2.上好样的芯片放入杂交盒置60℃，30分钟。
3.30分钟后调为45℃，至少放置16小时，不能超过18小时。
第三天
【10】清洗芯片
1.将芯片从杂交盒中取出后置PB1中，抽提10次。
2.提完后放在另一个PB1中，浸泡5分钟。
3.放入XC4中上下提10次，浸泡5分钟。
4.干燥0.68bar，50-55分钟。
【11】芯片扫描及数据读取
通过激光共聚焦微珠芯片扫描仪用IlluminaBeadScan软件进行芯片扫描。
打开电脑，打开激光共聚焦微珠芯片扫描仪→用DMAP软件将每张芯片的Barcode文件在Illumina公司的网站上下载下来，并考入扫描用的电脑→双击打开IlluminaBeadScan软件→按Edit→激光共聚焦微珠芯片扫描仪会自动打开Tray→把芯片放入激光共聚焦微珠芯片扫描仪的Tray上，用条形码识别器把芯片上的Barcode扫描→按Scan，激光共聚焦微珠芯片扫描仪开始扫描→扫描完毕按Done→关闭IlluminaBeadScan软件，关闭激光共聚焦微珠芯片扫描仪，关电脑。
【12】数据分析
通过激光共聚焦微珠芯片扫描仪扫描后得到的芯片结果，用GenomeStudio软件分析。
双击打开GenomeStudio软件（电脑内存要大于2G）→按Genotyping建立新NewProject→按Next→在ProjectsRepository处选择存储的路径，并建一个新文件的名字，按Next→点击Loadsampleintensitiesbyselectingdirectorieswithintensityfiles,按Next→选择.opa文件，选择需要分析的芯片编号Barcode，按Next→点击Importclusterpositionsfromaclusterfile，点击Pre-Calculate，按Finish，软件开始分析数据，得到样本基因分型的结果。每个SNP位点在cluster中独立分析，在SNPGraph界面分析每个突变位点的分型，鉴别基因型。芯片上每一个SNP位点的等位基因型被定义为“AA”、“BB”，即样本SNP位点等位基因为纯合型；“AB”为等位基因杂交型（参见图1。图中：左侧椭圆区域点表示基因型为AA，中间椭圆区域点表示基因型为AB，右侧椭圆区域点表示基因型为BB；左侧椭圆区域点为样品M12273的基因分型，提示该患者该突变位点的基因分型为AA。实际实验结果为彩图，左侧椭圆区域为红色点，中间椭圆区域为紫色点，右侧椭圆区域为蓝色点）。
序列表
<110>中南大学湘雅医院
<120>一种帕金森病隐性遗传致病基因诊断芯片
<160>96
<210>1
<211>121
<212>DNA
<213>人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400>1
ctggcgccgctgcgcgcatgggcctgttcctggcccgcagccgccacctacccagtgacc60
wtgataggtacgtgggtacctgccaggtacagcctctctgcgccgccccacgccccggta120
t121
<210>2
<211>121
<212>DNA
<213>人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400>2
gcatcttccagctcaaggaggtggttgctaagcgacagggggttccggctgaccagttgc60
stgtgattttcgcagggaaggagctgaggaatgactggactgtgcaggtgagtctccctt120
g121
<210>3
<211>121
<212>DNA
<213>人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400>3
tgtgacctggatcagcagagcattgttcacattgtgcagagaccgtggagaaaaggtcaa60
kaaatgaatgcaactggaggcgacgaccccagaaacgcggcgggaggctgtgagcgggag120
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<210>4
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<212>DNA
<213>人类
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<400>4
ggaggcgacgaccccagaaacgcggcgggaggctgtgagcgggagccccagagcttgact60
ygggtggacctcagcagctcagtcctcccaggagactctgtggggctggctgtcattctg120
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<212>DNA
<213>人类
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<221>
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<400>5
aatctacaacagcttttatgtgtattgcaaaggcccctgtcaaagagtgcagccgggaaa60
wctcagggtacagtgcagcacctgcaggcaggcaacgctcaccttgacccaggtaaggaa120
a121
<210>6
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<212>DNA
<213>人类
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<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400>6
gttgttttttcccaaagggtccatcttgctgggatgatgttttaattccaaaccggatga60
ktggtgaatgccaatccccacactgccctgggactagtgcagtaagtacctggtcacatt120
c121
<210>7
<211>121
<212>DNA
<213>人类
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Claims (2)
1.一种帕金森病隐性遗传致病基因诊断芯片，其特征在于，帕金森病隐性遗传致病基因诊断芯片共有96个突变点序列，均为常染色体隐性遗传，其中Parkin23个，PINK119个，DJ-16个，ATP13A214个，PLA2G625个，FBXO79个；所述96个突变点序列分别是SEQIDNO：1－96的序列。
2.根据权利要求1所述的帕金森病隐性遗传致病基因诊断芯片，其特征在于，采用IlluminaGoldenGate高通量基因芯片，检测步骤包括：制作SUD板；沉淀SUD板；重悬SUD板；制作ASE板；加MEL；PCR前期工作；PCR产物的结合；芯片前样品准备；芯片杂交；清洗芯片；芯片扫描及数据读取；数据分析。
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