CN114574613A - 一种小麦-拟鹅观草全基因组液相芯片及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于全基因组基因芯片技术领域，涉及一种小麦‑拟鹅观草全基因组液相芯片及应用。该液相芯片，包含一组小麦全基因组5K寡核苷酸探针位点和一组拟鹅观草全基因组40K寡核苷酸探针位点。该液相芯片，可应用于小麦、拟鹅观草的背景位点检测以及二者衍生材料的鉴定分析等，检测准确度高、有效信息多、灵活多样性高、检测通量高、功能丰富。

Description

一种小麦-拟鹅观草全基因组液相芯片及应用

技术领域

本发明属于全基因组基因芯片技术领域，涉及一种小麦-拟鹅观草全基因组液相芯片及应用，尤其涉及一种基于靶向测序的小麦-拟鹅观草全基因组液相芯片的开发，以及利用该液相芯片在小麦、拟鹅观草物种研发中的应用。

背景技术

远缘杂交使得人们可直接利用其它野生植物优异基因资源，为小麦遗传改良奠定重要基础。目前，小麦族中20余种小麦近缘种属都实现了与普通小麦远缘杂交，为小麦育种提供了丰富的种质资源，包括山羊草属(Aegilops)、小麦属(Triticum)、大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、簇毛麦属(Dasypyrum)、旱麦草属(Eremopyrum)、异型花属(Heteranthelium)、披碱草属(Elymus)、冰草属(Agropyron)、赖草属(Leymus)、拟鹅观草属(Pseudoroegneria)、新麦草属(Psathyrostachys)、偃麦草属(Elytrigia)和仲彬草属(Kengyilia)等；而其中9个种属已育成小麦新品种，拟鹅观草是其中之一。

拟鹅观草属隶属于冰草属偃麦草亚属的拟鹅观草组，拟鹅观草属形态上的主要特征表现为：簇生或丛生草本，异花授粉；穗状花序疏松，狭长；小穗单生，紧贴穗轴，含3-5小花；颖片小，约为小穗的一半；外稃长超过10mm，无芒或有芒；内稃与外稃近等长；花药长达4-7mm，具有抗病(条锈病、白粉病等)、耐寒、耐旱等优良特性。拟鹅观草属的基本染色体组为St，包括二倍体和四倍体，四倍体中包含有同源四倍体和部分同源四倍体，主要分布于中东、高加索、中亚以及北美西部。拟鹅观草属的St染色体组在小麦族系统演化方面占有极为重要的地位，其是近50％小麦族物种的供体物种，包括披碱草属、偃麦草属、鹅观草属、仲彬草属、猬草属等，该类群物种系统发育关系比较混乱，在分类历史上争议较多。

远缘杂交衍生后代外源组分鉴定是其利用的关键步骤之一，目前常用的方法主要包括：形态学观察(外部形态、籽粒特征等)、细胞学鉴定(根尖染色体数目、花粉母细胞构型、染色体组型、染色体分带技术)、原位杂交技术(GISH、FISH)、分子标记技术(CAPS、AFLP、SSR、STS、EST、PLUG标记等)、生化标记(贮藏蛋白、同工酶鉴定)。其中，原位杂交技术是用于鉴定外源物质最常用的一种方法，基因组原位杂交(GISH)，是以某一物种的全基因组DNA为探针，利用探针与待测经变性的染色体进行杂交。根据荧光显微镜观察的染色体显色结果，判断被测物种染色体的来源或者变异情况等。虽然GISH可以直观地反应检测结果，但通常只能检测到整条染色体或者大片段外源物质，且无法直接确定外源染色体的同源群归属。随后，人们利用荧光原位杂交技术(FISH)构建了小麦、黑麦、冰草、二倍体长穗偃麦草、大麦等小麦近缘种属染色体核型，以用于区分普通小麦与外源染色体。但是目前关于拟鹅观草St染色体组的FISH核型仍未见报道，人们通常是借助小麦与中间偃麦草、十倍体长穗偃麦草等衍生后代中St染色的FISH核型进行研究。此外，FISH技术虽然可以区分导入到小麦中的外源染色体及其同源群归属，但是，其不能反映外源遗传物质基因组成，且精度局限于大片段染色体层面。

关于分子标记检测，众多研究者通常利用BAC文库构建、简化基因组测序、转录组测序等技术，鉴定外源物种潜在特异序列，进而开发各物种特异标记。例如，专利CN201110092988.5公布了基于小麦EST序列的黑麦1R～7R染色体特异的分子标记及其应用；专利CN201410226850.3公布了小麦背景中长穗偃麦草染色体特异标记及其应用，专利CN201210444430.3公布了基于SLAF-seq开发的长穗偃麦草7E染色体特异分子标记及应用；专利CN201410473529.5公布了一种开发小麦亲缘物种特异分子标记的方法及应用；专利CN201610629389.5公布了检测小麦中顶芒山羊草2M、3M、6M和7M染色体的特异分子标记、试剂盒及方法等。迄今为止，关于拟鹅观草特异分子标记的开发报道相对较少，有研究者利用RAPD标记在小麦族物种中进行特异标记筛选。如专利CN202110595870.8公布了一种快速鉴定中间偃麦草4St染色体的方法等。一般而言，原位杂交技术(GISH和FISH)仅用于鉴定导入到小麦中的大片段外源物质，但耗时长、技术要求高；而分子标记鉴定特异标记数量太少，覆盖到基因组或者基因上的比例太小，小片段标记不易检测；两种技术都有单次检测样本数有限、成本较高等不利因素，极大地限制了拟鹅观草的利用。

随着芯片技术的兴起，人们利用单核苷酸多态性(SNP)，开发了系列固态芯片，如小麦 15K、55K、660K芯片等。在缺乏各物种自己芯片的条件下，小麦系列固态芯片也经常被应用于远缘杂交衍生材料外源染色体鉴定。如：人们利用小麦15K芯片鉴定小麦-华山新麦草后代2Ns(2D)代换系DH66；利用小麦15K芯片鉴定小麦-华山新麦草3DS-5NsL·5NsS易位系TR77；利用小麦55K芯片鉴定小麦-华山新麦草3Ns(3D)代换系DH109和小麦-滨麦3Ns(3D)代换系DM131；基于小麦55K芯片对簇毛麦6V#2和6V#4染色体及其与小麦6A、 6D染色体的多态性分析；利用小麦55K芯片初定位“川中”鹅观草成株期抗条锈病基因 YrK1007；利用660K芯片构建冰草遗传连锁图谱揭示冰草与小麦染色体间的部分同源关系等。虽然小麦系列固态芯片可在一定程度上反映外源染色体组成，但从实验效果看来，存在以下弊端：(1)精度有限，只能用于小麦和外源种属的代换系和大片段易位系的鉴定，且是基于统计小麦1A-7D染色体缺失情况和染色体补偿性推断，可能是导入了外源材料的该部分同源群染色体，无法真正确定导入的外源染色体的同源群归属，同时，还必须结合原位杂交合特异分子标记来辅助鉴定；(2)信息有限，这些芯片都是基于小麦的SNP位点开发的，绝大部分SNP是无法补捕获到外源遗传信息，且可捕获信息还存在较大随机性，更为重要的是其无法反馈各物种基因层面组成、变异。

近期，基于靶向捕获测序技术(GBTS)的基因分型手段逐渐在动植物上得到应用，其是通过降低文库丰度实现仅对目标位点深度重测序的技术，其工作原理是设计与靶向序列碱基互补配对的目标探针，进而实现特定区域序列的定点捕获，并结合高通量测序，实现目标片段位点检测、变异分析。与固相芯片相比，GBTS标记开发技术简单，开发、测试、验证成本远远低于传统的固态芯片，而且还有以下优势：开发的芯片密度可以灵活调整，以主流的40-50K为基础，可以减少至低密度1K，也可扩展至高密度200K；可以随时补充新的位点，少量样本即可检测，无样本量限制，该技术适用于所有的生物物种，包括各种病原菌、微生物、植物、动物。目前，基于GBTS技术的单核苷酸液相芯片已在小麦、大麦、棉花、玉米、水稻、大豆等植物中得到开发和利用，但没有一款可鉴定拟鹅观草及小麦族其它St基因组的液相芯片。

发明内容

本发明的目的在于提供一种小麦-拟鹅观草全基因组液相芯片及应用，基于靶向捕获技术开发的液相芯片，包含5K小麦背景位点和40K拟鹅观草背景位点，同时，每个位点2个液相探针、共计90K液相探针；获得的液相芯片可有效应用于小麦、拟鹅观草的背景位点检测。

本发明的解决上述技术问题的技术方案如下。

一种小麦-拟鹅观草全基因组液相芯片，包含一组小麦全基因组5K寡核苷酸探针位点和一组拟鹅观草全基因组40K寡核苷酸探针位点；其中，小麦全基因组5K寡核苷酸探针位点的核心位点信息如表1所示，拟鹅观草全基因组40K寡核苷酸探针位点的核心位点信息如表 2所示。

进一步地，该液相芯片中，每个位点合成两条分子探针，共计90K液相探针；更进一步地，每根液相探针长度为110bp，分子探针通过C12分子臂和氨基修饰偶联在荧光微球上，每个荧光微球偶联一种分子探针。

一种小麦-拟鹅观草全基因组液相芯片的应用，可应用于小麦远缘杂交形成的双二倍体、附加系、代换系、易位系的材料鉴定。

进一步地，该液相芯片可应用于小麦远缘杂交形成的衍生材料及品种的潜在外源片段、外源基因的分析以及克隆。

进一步地，该液相芯片可应用于小麦族St基因组物种比较基因组学研究，如，分析染色体组成、基因组结构变异、同源关系、进化关系等。

进一步地，该液相芯片可应用于小麦、拟鹅观草及其衍生材料的遗传多样性分析、品种鉴定、亲缘关系鉴定、全基因组关联分析、基因组选择育种。

本发明小麦-拟鹅观草全基因组液相芯片及应用的有益效果为：

(1)基于靶向捕获技术开发的液相芯片，包含一组小麦全基因组5K寡核苷酸探针位点和一组拟鹅观草全基因组40K寡核苷酸探针位点，每个位点合成两条分子探针，共计90K液相探针；

(2)该液相芯片可在小麦与拟鹅观草远缘杂交形成的材料鉴定中应用，应用该芯片可直接获得各衍生材料中拟鹅观草、小麦基因组组成、外源片段携带基因情况，实现拟鹅观草远缘杂交材料快速鉴定；

(3)该液相芯片可在小麦远缘杂交形成的衍生材料及品种潜在外源片段、外源基因分析、克隆中应用，精准锁定衍生材料及品种潜在外源片段基因组成，辅助基因克隆；

(4)该液相芯片同时包含5K小麦和40K拟鹅观草寡核苷酸位点，可应用于小麦、拟鹅观草及其衍生材料遗传多样性分析、品种鉴定、亲缘关系鉴定、DNA指纹数据库构建、全基因组关联分析、基因组选择育种等；

(5)该芯片为液相芯片，相较于固相芯片，该液相芯片具有检测准确度高、有效信息多、灵活多样性高、检测通量高、功能丰富等特点，且有效降低了检测成本，为小麦分子育种提供重要的技术支撑。

附图说明

图1为小麦-拟鹅观草45K液相芯片中小麦5K目标位点基因组分布图；

图2为小麦-拟鹅观草45K液相芯片中拟鹅观草40K目标位点基因组分布图；

图3为CS-5St(中国春附加拟鹅观草5St染色体)材料FISH鉴定结果；

图4为CS-5St(中国春附加拟鹅观草5St染色体)材料本液相芯片鉴定结果。

具体实施方式

实施例1

一种小麦-拟鹅观草全基因组液相芯片，包含一组小麦全基因组5K寡核苷酸探针位点和一组拟鹅观草全基因组40K寡核苷酸探针位点，即，以40K拟鹅观草寡核苷酸位点为主，辅以5K小麦寡核苷酸位点。

具体的，该液相芯片基于靶向捕获技术开发而成，其工作原理是基于设计探针与检测样本DNA，通过碱基互补配对进行靶向捕获及测序，从而实现目标区域基因检测、分型的目的。

小麦全基因组5K寡核苷酸位点的筛选，其具体方法如下。

(1)基于拟鹅观草重测序数据，利用BWA软件与中国春小麦参考基因组(EnsembleGenome数据库:Triticum_aestivum.IWGSC.41)进行序列比对，基于此，提取小麦基因组未有序列覆盖区域，即，小麦相较于拟鹅观草潜在物种特异性区间；

(2)根据潜在小麦物种特异区间起始、终止位置信息，取平均值，以此平均值为基础，左右延伸150bp提取序列，即，代表该区间300bp序列；

(3)利用gmap、BLAST软件将其与拟鹅观草参考基因组(Pseuderogneriastrigosa-REFERENCE-NWSUAF-1.0)进行序列比对，进一步剔除可与拟鹅观草基因组比对位点；再将保留位点与小麦参考基因组进行比对，剔除多位点比对序列；

(4)对各区域候选序列进行靶向捕获探针评估，完成液相芯片探针设计，每个位点2根液相芯片捕获探针；

(5)根据可设计液相芯片的探针位点，结合小麦参考基因组注释信息，以如下优先级标准筛选探针：基因区>基因启动子区(2Kb)>基因下游邻位区(2Kb)>基因间隔区，结合染色体均匀分布原则，最终得到小麦染色体均匀分布的5000个寡核苷酸位点及对应的10000个液相芯片定向捕获探针。

针对拟鹅观草全基因组40K寡核苷酸位点的筛选，因中国春、阿勃通常为小麦远缘杂交工具品种，因此，本申请以这两个材料的重测序数据为基础，挖掘拟鹅观草全基因组物种特异性区间，其具体方法如下。

(1)下载小麦中国春(CNCB数据库登录号CRR062130)、阿勃(CNCB数据库登录号CRR062102)品种重测序序列，利用BWA软件与拟鹅观草参考基因组(Pseuderogneriastrigosa-REFERENCE-NWSUAF-1.0)进行序列比对，基于此，提取拟鹅观草基因组未有序列覆盖区域，即，拟鹅观草相较于小麦潜在物种特异性区间；

(2)根据潜在拟鹅观草物种特异区间起始、终止位置信息，取平均值，以此平均值为基础，左右延伸150bp提取序列，即，代表该区间300bp序列；

(3)利用gmap、BLAST软件将其与小麦参考基因组(Ensemble Genome数据库:Triticum_aestivum.IWGSC.41)进行序列比对，进一步剔除可与小麦基因组比对位点；再将保留位点与拟鹅观草参考基因组进行比对，剔除多位点比对序列；

(4)对各区域候选序列进行靶向捕获探针评估，完成液相芯片探针设计，每个位点2根液相芯片捕获探针；

(5)根据可设计液相芯片探针位点，结合拟鹅观草参考基因组注释信息，以如下优先级标准筛选探针：基因区>基因启动子区(2Kb)>基因下游邻位区(2Kb)>基因间隔区，结合染色体均匀分布原则，最终得到拟鹅观草染色体均匀分布的40000个寡核苷酸位点及对应的 800000个液相芯片定向捕获探针。

将通过上述方法获得的5K小麦和40K拟鹅观草寡核苷酸位点及其对应的90K靶向捕获探针进行探针合成，从而得到小麦-拟鹅观草全基因组液相芯片。

实施例2

一种小麦-拟鹅观草45K液相芯片，包含一组小麦全基因组5K寡核苷酸探针位点和一组拟鹅观草全基因组40K寡核苷酸探针位点。

其中，小麦全基因组5K寡核苷酸探针位点的核心位点基因组分布图如图1所示，同时，其核心位点信息如表1所示。

表1.小麦全基因组5K寡核苷酸探针位点的核心位点信息

表1的位点编号中，左侧1A～7A、1B～7B、1D～7D表示位点所在的染色体，后续两组数值分别为该寡核苷酸探针在小麦参考基因组(中国春)上各染色体对应起始、终止位点；小麦参考基因组中国春的全基因组序列版本号为Ensemble Genome数据库: Triticum_aestivum.IWGSC.41。

拟鹅观草全基因组40K寡核苷酸探针位点的核心位点基因组分布图如图2所示，同时，其核心位点信息如2所示。

表2.拟鹅观草全基因组40K寡核苷酸探针位点的核心位点信息

表2的位点编号中，左侧1St～7St表示位点所在的染色体，后续两组数值分别为该寡核苷酸探针在拟鹅观草参考基因组上各染色体对应起始、终止位点；拟鹅观草参考基因组的全基因组序列版本号为Pseuderogneria strigosa-REFERENCE-NWSUAF-1.0。

上述每个位点合成两条分子探针，共计90K液相探针；分子探针通过C12分子臂和氨基修饰偶联在荧光微球上，每个荧光微球偶联一种分子探针。

实施例3

该小麦-拟鹅观草全基因组液相芯片可用于小麦族St基因组与小麦远缘杂交形成的衍生材料的鉴定中；具体的鉴定过程如下。

(1)待检测材料DNA的提取及质检：选取中国春与中间偃麦草St基因组远缘杂交衍生材料CS-5St(中国春附加中间偃麦草5St染色体)，取待检测样自然晾干叶片，使用CTAB法提取DNA；利用琼脂糖凝胶电泳检测样本DNA，保证基因组完整性；利用微量紫外分光光度计测定基因组DNA浓度，各样本DNA工作浓度调整至10～50ng/ul。

(2)小麦-拟鹅观草全基因组液相芯片检测：按照液相探针杂交的靶向基因捕获技术 (http://www.molbreeding.com/index.php/Technology/GenoBaits.html)标准流程构建液相芯片 DNA杂交捕获文库，文库测序依赖于华大MGISEQ2000测序平台。

(3)数据分析：下机序列利用FastQC软件进行质控，得到Clean data；随后，利用BWA 软件将其与小麦中国春参考基因组、拟鹅观草基因组进行比对，得到各样本比对文件，利用 bedtools统计各探针位点序列覆盖情况；通过检出位点与芯片位点进行比较发现。

(4)FISH鉴定表明该材料包括44条染色体，除却小麦基因组42条染色体外，附加了中间偃麦草5St染色体(如图3所示)；从图4中可以看出，本套液相芯片可很好实现小麦族St衍生材料基因组组成的快速鉴定。

随着组学时代的到来，小麦及众多小麦族物种基因组信息逐渐被解析。前期，发明人利用三代基因组测序解析了拟鹅观草基因组，并在此基础上开发了小麦-拟鹅观草全基因组液相芯片，以填补拟鹅观草无芯片空白，更好服务于利用拟鹅观草对小麦进行遗传改良。在利用三代基因组测序技术完成拟鹅观草基因组组装、注释后，再利用生物信息学手段在全基因组层面鉴定小麦、拟鹅观草物种特异性区域，设计基因区域或邻位区域液相芯片寡核苷酸探针，实现大规模目标片段捕获，重点覆盖具有重大应用价值的抗病、优质基因区域。

该小麦-拟鹅观草全基因组液相芯片以40K拟鹅观草位点为主，辅以5K小麦寡核苷酸位点，可在小麦与拟鹅观草远缘杂交形成的材料鉴定中应用，如“拟鹅观草-小麦”杂交形成的系列双二倍体、附加系、代换系、易位系等；提取待检测样本基因组DNA，应用该芯片可直接获得各衍生材料中拟鹅观草、小麦基因组组成、外源片段携带基因情况，实现拟鹅观草远缘杂交材料快速鉴定。

该液相芯片，还可在小麦远缘杂交形成的衍生材料及品种潜在外源片段、外源基因分析、克隆中进行应用，如拟鹅观草衍生材料优异性状基因克隆，因外源基因组与小麦自身遗传重组率低，使得传统图位克隆方法挖掘优异性状调控基因十分困难，而本套芯片包括拟鹅观草 80000根探针，可精准锁定衍生材料及品种潜在外源片段基因组成，辅助基因克隆。

另外，该液相芯片同时包含5K小麦和40K拟鹅观草寡核苷酸位点，使得该芯片可应用于小麦、拟鹅观草及其衍生材料遗传多样性分析、品种鉴定、亲缘关系鉴定、DNA指纹数据库构建、全基因组关联分析、基因组选择育种。

该小麦-拟鹅观草全基因组液相芯片由5000(5K)小麦和40000(40K)拟鹅观草物种特异寡核苷酸位点混合组成，每个位点包括2根靶向捕获探针，共计90000(90K)根液相探针。针对40K拟鹅观草寡核苷酸位点，约67.2％探针位于基因区，剩余33.8％位于基因邻位区，涉及拟鹅观草47258个基因。因而，该液相芯片基本实现拟鹅观草全基因组基因的全覆盖，并包含10K小麦全基因组染色体均匀分布靶向捕获探针，可快速实现：(1)鉴定小麦与拟鹅观草及小麦族其它St基因组物种远缘杂交的衍生后代材料中外源染色体或外源片段及确定部分同源群的归属；(2)辅助拟鹅观草衍生材料优异性状遗传解析，加速外源优异基因克隆； (3)辅助小麦族含有St基因组的物种间比较基因组学研究，如，染色体组成、结构变异、同源及进化关系分析等；(4)对小麦、拟鹅观草及小麦族其它St基因组物种衍生材料遗传多样性分析、品种鉴定、亲缘关系鉴定、全基因组关联分析，服务于基因组选择育种。

Claims (9)

1.一种小麦-拟鹅观草全基因组液相芯片，其特征在于，包含一组小麦全基因组5K寡核苷酸探针位点和一组拟鹅观草全基因组40K寡核苷酸探针位点。

2.如权利要求1所述的小麦-拟鹅观草全基因组液相芯片，其特征在于，所述小麦全基因组5K寡核苷酸探针位点的核心位点信息如下：

其中，位点编号中左侧1A～7A、1B～7B、1D～7D表示位点所在的染色体，后续两组数值分别为该寡核苷酸探针在小麦参考基因组上各染色体对应起始、终止位点。

3.如权利要求1所述的小麦-拟鹅观草全基因组液相芯片，其特征在于，所述拟鹅观草全基因组40K寡核苷酸探针位点的核心位点信息如下：

其中，位点编号中左侧1St～7St表示位点所在的染色体，后续两组数值分别为该寡核苷酸探针在拟鹅观草参考基因组上各染色体对应起始、终止位点。

4.如权利要求1-3中任一项所述的小麦-拟鹅观草全基因组液相芯片，其特征在于，每个位点合成两条分子探针，共计90K液相探针。

5.如权利要求4所述的小麦-拟鹅观草全基因组液相芯片，其特征在于，每根液相探针长度为110bp，所述分子探针通过C12分子臂和氨基修饰偶联在荧光微球上，每个荧光微球偶联一种分子探针。

6.如权利要求1-3中任一项所述的小麦-拟鹅观草全基因组液相芯片的应用，其特征在于，该小麦-拟鹅观草全基因组液相芯片应用于小麦远缘杂交形成的双二倍体、附加系、代换系、易位系的材料鉴定。

7.如权利要求1-3中任一项所述的小麦-拟鹅观草全基因组液相芯片的应用，其特征在于，该小麦-拟鹅观草全基因组液相芯片应用于小麦远缘杂交形成的衍生材料及品种的潜在外源片段、外源基因的分析以及克隆。

8.如权利要求1-3中任一项所述的小麦-拟鹅观草全基因组液相芯片的应用，其特征在于，该小麦-拟鹅观草全基因组液相芯片应用于小麦族St基因组物种比较基因组学研究。

9.如权利要求1-3中任一项所述的小麦-拟鹅观草全基因组液相芯片的应用，其特征在于，该小麦-拟鹅观草全基因组液相芯片应用于小麦、拟鹅观草及其衍生材料的遗传多样性分析、品种鉴定、亲缘关系鉴定、全基因组关联分析、基因组选择育种。

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