CN114395642B

CN114395642B - 一种小麦-黑麦全基因组液相芯片及应用

Info

Publication number: CN114395642B
Application number: CN202210113279.9A
Authority: CN
Inventors: 吉万全; 杜欣; 邓平川; 王斯文; 陈春环; 赵继新; 王长有; 李停栋
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2022-01-30
Filing date: 2022-01-30
Publication date: 2023-01-31
Anticipated expiration: 2042-01-30
Also published as: CN114395642A

Abstract

本发明属于全基因组基因芯片技术领域，涉及小麦‑黑麦全基因组液相芯片及应用。该液相芯片，由独立包装的小麦‑黑麦90K探针混合液和杂交捕获试剂构成，小麦‑黑麦90K探针混合液包含5K小麦寡核苷酸探针位点和40K黑麦寡核苷酸探针位点，且每个位点2个液相探针。该液相芯片，是一种基于靶向捕获测序技术开发的小麦‑黑麦全基因组液相芯片，利用该液相芯片，可在小麦、黑麦及其衍生材料的鉴定、分析、克隆等方面进行应用。

Description

一种小麦-黑麦全基因组液相芯片及应用

技术领域

本发明属于全基因组基因芯片技术领域，涉及小麦-黑麦全基因组液相芯片及应用，尤其涉及一种基于靶向捕获测序技术开发的小麦-黑麦全基因组液相芯片，以及该液相芯片在小麦、黑麦研发过程中的应用。

背景技术

小麦远缘杂交是指将小麦与小麦族其它种、属间进行跨物种杂交的过程，其可分为属内种间杂交和属间杂交。远缘杂交可以打破种间基因转移的障碍，加强物种间的基因交流，进而改变后代的基因型及表现型。同时，远缘杂交还可创制新物种，丰富自然界的物种，加快物种的形成及进化。目前，小麦族中多数近缘种属都可与普通小麦杂交，为小麦育种提供了丰富的种质资源，包括黑麦属、山羊草属、赖草属、偃麦草属、冰草属、簇毛麦属、新麦草属等共计20余种小麦近缘种属，其中，黑麦是应用最为广泛、成功的物种之一。

黑麦(Secale cereale；2n＝2x＝14，RR)属禾本科，是一年或越年生草本植物，分布广泛、几乎遍布全世界。黑麦起源于欧洲南部，北欧、北非是黑麦的主要产区，中国主要分布于北方山区或较寒冷地区。按照生长类型，黑麦可被划分成4类：一年生异花授粉的普通黑麦(S. cereale.L)、一年生自花授粉的森林黑麦(S.sylvestre Host，2n＝2x＝14，染色体为RsRs)、瓦维洛夫黑麦(S.vavilovii Grossh，2n＝2x＝14，染色体组成为RvRv)和多年生异花授粉的山地黑麦(S.montanum Guss)。黑麦植株高大繁茂、叶片蜡粉覆盖、根系发达、花粉量多，具有耐寒、耐旱、耐贫瘠以及良好的适应环境能力，产量也较高，并蕴藏丰富的抗性基因，是十分重要的改良小麦的三级基因源。

目前，源于黑麦被正式命名的基因包括：5个抗白粉病基因Pm7、Pm8、Pm17、Pm20 与Pm56，1个条锈病抗性基因Yr9，3个叶锈病抗性基因Lr25、Lr26与Lr45，4个秆锈病抗性基因Sr27、Sr31、Sr50与Sr59，2个抗蚜虫基因H21与H25。1RS携带有抗叶锈、抗毛细管锈、抗条锈和抗白粉病等多种抗病基因，同时，具有很好的丰产性和适应性。1BL·1RS易位系作为优秀基因资源被广泛利用与实践，是外源基因用于小麦品种改良最成功的范例之一，被广泛地作为杂交育种的亲本。此外，很多研究者通过将小麦与黑麦杂交获得了一系列小麦- 黑麦异附加系、异代换系、易位系等具有优良特性的小麦育种中间材料，为小麦遗传改良奠定重要基础。

针对小麦和近缘种属杂交后的衍生后代材料，鉴定其外源物质是否成功导入到普通小麦中，目前主要的方法包括：形态学观察(外部形态、籽粒特征等)、细胞学鉴定(根尖染色体数目、花粉母细胞构型、染色体组型、染色体分带技术)、原位杂交技术(GISH、FISH)、分子标记技术(CAPS、RFLP、AFLP、SSR、STS、EST、PLUG标记等)、生化标记(贮藏蛋白、同工酶鉴定)。其中，原位杂交技术是用于鉴定外源物质最常用的一种方法，基因组原位杂交(GISH)，是以某一物种的全基因组DNA为探针，利用探针与待测经变性的染色体进行杂交。根据荧光显微镜观察的染色体显色结果，判断被测物种染色体的来源或者变异情况等，虽然可以直观的反应检测结果，但通常只能检测到整条染色体或者大片段外源物质，且无法直接确定外源染色体的同源群归属。

近年来，人们利用荧光原位杂交技术(FISH)构建了小麦、黑麦、冰草、二倍体长穗偃麦草、大麦等小麦近缘种属染色体核型，以用于区分普通小麦与外源染色体。目前基于黑麦串联重复序列开发了多种黑麦FISH，如：专利CN200810054899.X公布了一种小麦-黑麦T2BL.1RS新易位系种质的选育方法；专利CN201410397392.X公布了一种黑麦染色体寡核苷酸探针及其制备方法；专利CN201510428499.0公布了一种利用寡聚核苷酸探针染液涂染染色体的新方法；专利CN201710067844.1公布了一种鉴别栽培黑麦与野生黑麦染色体的分子检测方法等。FISH技术虽然可以区分导入到小麦中的外源染色体及其同源群归属，但是导入的微小外源片段是难以被信号覆盖的。

关于分子标记检测，众多研究者利用外源物种特异序列致力于外源物质特异标记的开发，采用的方法有利于小麦EST序列、BAC文库构建、简化基因组测序、转录组测序等，在黑麦中应用非常广泛，如：专利CN200710139507.5和CN200710139509.4，公布了一种黑麦1RS 染色体特异的EST-STS标记引物1和2、筛选方法及用途；专利CN201110092988.5公布了基于小麦EST序列的黑麦1R～7R染色体特异的分子标记及其应用；专利CN201110092989.X，公布了基于黑麦EST序列的黑麦1R～7R染色体特异的分子标记及其应用；专利CN201210479074.9公布了基于黑麦EST序列的黑麦1R和6R染色体特异的分子标记及其应用；专利CN201510030338.6公布了小麦抗白粉病小片段易位系T1BL.1BS-2RL的选育与分子标记方法；专利CN201811439693.9公布了一种黑麦通用2RL染色体特异共显性KASP分子标记及其应用；专利CN202010107963.7公布了一种黑麦6RL染色体臂特异KASP分子标记及其应用；然而，这些特异标记在使用时，都要经历PCR扩增、凝胶电泳等程序。总的来说，原位杂交技术(GISH和FISH)只能用来鉴定导入到小麦中的大片段外源物质且耗时长，而分子标记鉴定特异标记数量太少，覆盖到基因组或者基因上的比例太小，小片段标记不易检测到，两种技术都有单次检测样本数有限、成本较高等不利因素，极大限制了黑麦的基础研究和应用进程。

随着技术的发展，全基因组层面高通量SNP芯片蓬勃发展，但是市场上却无黑麦芯片，目前，黑麦相关研究基本借助于小麦相关固态芯片，如15K、55K、660K芯片等。虽然这样的芯片可以辅助部分黑麦研究，但从实验效果看来，存在很大弊端：首先，这些芯片都是基于小麦的SNP位点开发的，单个碱基的差异对于小麦背景下的黑麦信息鉴定难度大，其次，外源物种染色体位点捕获存在随机性，不能反映黑麦基因组具体信息。2021年，河南农业大学王道文教授课题组破译了黑麦基因组，为黑麦全基因组层面芯片开发奠定了重要基础。

近期，基于靶向捕获测序技术(Genotyping by Targeted Sequencing,GBTS)的基因分型手段逐渐在动植物上得到应用，其是通过降低文库丰度实现仅对目标位点深度重测序的技术，其工作原理是设计与靶向序列碱基互补配对的目标探针，进而实现特定区域序列的定点捕获，并结合高通量测序，实现目标片段位点检测、变异分析。与固相芯片相比，GBTS标记开发技术简单，开发、测试、验证成本远远低于传统的固态芯片；开发的SNP芯片密度可以灵活调整，以主流的40-50K 为基础，可以减少至低密度1K，也可扩展至高密度200K；可以随时补充新的位点，少量样本即可检测，无样本量限制；该技术适用于所有的生物物种，包括各种病原菌、微生物、植物、动物。目前，基于GBTS技术的单核苷酸液相芯片已在小麦、大麦、棉花、玉米、水稻、大豆等植物中得到开发和利用；但尚无针对小麦-黑麦两个物种开发的液相芯片，进而不利于针对小麦、黑麦其衍生材料的产品鉴定和物种分析等方面的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供小麦-黑麦全基因组液相芯片及应用，基于小麦与其近缘种属远缘杂交的寡核苷酸探针设计原则及理念，融入小麦及黑麦的寡核苷酸位点，混合而成获得以40K 黑麦位点为主、辅以5K小麦寡核苷酸位点的液相芯片，通量高、准确度高、成本低、灵活性强，同时，还可更好的应用于小麦-黑麦属及衍生材料的相关鉴定、分析和育种等方面。

本发明的解决上述技术问题的技术方案如下。

一种小麦-黑麦全基因组液相芯片，该小麦-黑麦全基因组液相芯片由独立包装的小麦-黑麦90K探针混合液和杂交捕获试剂构成，小麦-黑麦90K探针混合液包含5K小麦寡核苷酸探针位点和40K黑麦寡核苷酸探针位点，且每个位点2个液相探针。

进一步地，该液相芯片中，5K小麦寡核苷酸探针位点的核心位点信息如表1所示，40K 黑麦寡核苷酸探针位点的核心位点信息如表2所示。

进一步地，该小麦-黑麦全基因组液相芯片的探针设计过程如下：

(1)探针长度110bp、探针GC含量在30％～80％之间、同源性区域个数≤5，选取区域最大限度地不包含SSR和GAP区域；

(2)根据筛选获得的寡核苷酸探针位点设计两条有60％～70％重叠且覆盖所述寡核苷酸探针位点的核苷酸序列；

(3)根据上述设计的核苷酸序列进行单链核苷酸合成，合成的两条长度为110bp、5’端带有生物素基团修饰的DNA核苷酸序列，称为小麦-黑麦45K探针；

(4)将上述两条合成后的小麦-黑麦45K探针进行等摩尔质量混合，利用EDTA和Tris-HCl混合液定容为3pmol/mL的小麦-黑麦45K探针混合液。

进一步地，该小麦-黑麦全基因组液相芯片为液相探针通过C12分子臂和氨基修饰偶联在荧光微球上；每个荧光微球偶联一种液相探针；其中，液相探针为上述液相探针组中的液相探针。

进一步地，该小麦-黑麦全基因组液相芯片，应用于小麦-黑麦属物种衍生后代产生的异附加系、异代换系、易位系、渐渗系材料鉴定。

进一步地，该小麦-黑麦全基因组液相芯片，应用于外源导入产生的优异性状基因的克隆和遗传解析。

进一步地，该小麦-黑麦全基因组液相芯片，应用于黑麦属物种进行染色体组成、基因结构变异、同源关系进化关系分析。

进一步地，该小麦-黑麦全基因组液相芯片，应用于小麦、黑麦物种及其衍生材料的遗传多样性分析、品种鉴定、亲缘关系鉴定、全基因组关联分析、基因组选择育种。本发明小麦- 黑麦全基因组液相芯片的有益效果为：

(1)利用小麦和黑麦基因组及重测序数据，通过生物信息学手段在全基因组层面鉴定小麦、黑麦特异性区域，设计基因区域或邻位区域液相芯片寡核苷酸探针，实现大规模目标片段捕获，重点覆盖具有重大应用价值的抗病、优质基因区域；

(2)提供对于小麦与其近缘种属远缘杂交的寡核苷酸探针设计原则及理念，并融入了小麦及黑麦的寡核苷酸位点混合而成的探针，可有效解决通量低、准确度低、成本高、灵活性差等问题；

(3)该液相芯片是基于靶向捕获技术开发的液相芯片，工作原理是基于设计探针与检测样本DNA通过碱基互补配对进行靶向捕获及测序，从而实现目标区域基因检测、分型的目的；

(4)该小麦-黑麦45K寡核苷酸位点，包含5K小麦背景位点和40K黑麦背景位点，每个位点2个液相探针，共计90K液相探针；即，以40K黑麦位点为主，辅以5K小麦寡核苷酸位点，可用于鉴定小麦-黑麦属衍生材料、追踪外源物质、克隆基因，另外还可用于小麦、黑麦属及其衍生材料遗传多样性分析、品种鉴定、亲缘关系鉴定、基因组成探讨、全基因组关联分析、基因组选择育种等；

(5)该液相芯片可在小麦与黑麦杂交形成的材料鉴定中应用，如，小麦与黑麦杂交衍生的附加系、代换系、易位系、渐渗系等；提取待检测样本基因组DNA，应用该液相芯片可直接获得各衍生材料中黑麦、小麦基因组组成、外源片段携带基因情况，加速了对外源优异基因的利用；

(6)该液相芯片可在小麦远缘杂交形成的衍生材料及品种潜在外源片段、外源基因分析、克隆中应用，如：黑麦属优异性状基因克隆；该液相芯片包括黑麦80000根探针，近75％位于黑麦基因区，剩余25％位于基因邻位区(上下游2Kb)，涉及黑麦全基因组39355个基因；因此，应用该液相芯片可精准锁定衍生材料及品种潜在外源片段基因组成，辅助基因克隆；

(7)该液相该芯片，弥补了黑麦无芯片的空白，同时，相较于固相芯片，该液相芯片检测准确度高、有效信息多、灵活多样性高，显著降低了检测成本，不仅可为黑麦基础研究奠定重要基础，而且可为利用黑麦进行小麦遗传改良提供重要的技术支撑。

附图说明

图1为实施例2中小麦5K目标位点基因组分布图；

图2为实施例2中黑麦40K目标位点基因组分布图；

图3为实施例3中小麦品种中国春捕获位点染色体分布图；

图4为实施例3中贵州黑麦捕获位点染色体分布图；

图5和图6均为实施例4中小麦-黑麦衍生代换系CS-3R(3D)液相芯片鉴定结果，其中，图5位液相芯片补获位点染色体分布图，图6为FISH鉴定结果；

图7、图8和图9均为实施例5中小麦-黑麦1B.1R易位材料液相芯片鉴定结果，其中，图7为西农511液相芯片补获位点染色体分布图；图8为不同小麦品种1R染色体黑麦碱编码基因ScWN1R01G011200芯片检测结果；图9为不同小麦、黑麦品种3R染色体黑麦碱编码基因ScWN3R01G087900芯片检测结果。

具体实施方式

实施例1

一种小麦-黑麦全基因组液相芯片，由独立包装的小麦-黑麦90K探针混合液和杂交捕获试剂构成；小麦-黑麦90K探针混合液包含5K小麦寡核苷酸探针位点和40K黑麦寡核苷酸探针位点，且每个位点2个液相探针；杂交捕获试剂为来自石家庄博瑞迪生物技术有限公司的 GenoBaits DNA-seq Library Prep试剂盒，包括独立包装的GenoBaits Block I、GenoBaits Block II、GenoBaits 2×Hyb Buffer、GenoBaits Hyb Buffer Enhancer、GenoBaits2×Beads Wash Buffer、 GenoBaits 10×Wash Buffer I、GenoBaits 10X Wash BufferII、GenoBaits 10X Wash Buffer III、 GenoBaits 10X Stringent Wash Buffer。

其中，5K小麦寡核苷酸探针位点的核心位点信息如表1所示。

表1.5K小麦寡核苷酸探针位点的核心位点信息

表1中，位点编号中左侧1A～7A、1B～7B、1D～7D表示位点所在的染色体，后续两组数值分别为该寡核苷酸探针在小麦参考基因组(中国春)上各染色体对应起始、终止位点。小麦参考基因组为中国春的全基因组序列，版本号为Ensemble Genome，数据库:Triticum_aestivum.IWGSC.41。

40K黑麦寡核苷酸探针位点的核心位点信息如表2所示。

表2.40K黑麦寡核苷酸探针位点的核心位点信息

表2中，位点编号中左侧1R～7R、UN表示位点所在的染色体，其中，UN为未锚定染色体；后续两组数值分别为该寡核苷酸位点在黑麦参考基因组上各染色体对应起始、终止位点。黑麦参考基因组为Weining V1(https://ngdc.cncb.ac.cn/gwh/Assembly/12832/show)。

实施例2

实施例1中小麦全基因组5K寡核苷酸位点的筛选方法如下：

(1)下载黑麦重测序数据(NCBI数据库登录号SRR13077075和SRR13077080)，利用BWA软件与中国春小麦参考基因组(Ensemble Genome数据库:Triticum_aestivum.IWGSC.41) 进行序列比对，提取小麦基因组未有序列覆盖区域，即，小麦相较于黑麦潜在物种的特异性区间；

(2)根据潜在小麦物种特异区间的起始、终止位置信息，取平均值，以此平均值为基础，左右延伸150bp提取序列，即，代表该区间300bp序列，随后，利用gmap、BLAST软件将其与黑麦基因组进行序列比对，进一步剔除可与黑麦基因组比对位点，保留位点与小麦参考基因组进行比对，剔除多位点比对序列，获得候选序列；

(3)对各区域候选序列进行靶向捕获探针评估，完成液相芯片探针设计，每个位点2根液相芯片捕获探针；

(4)根据可设计液相芯片探针位点，结合小麦参考基因组注释信息，以如下优先级标准筛选探针：基因区>基因启动子区(2Kb)>基因下游邻位区(2Kb)>基因间隔区，结合染色体均匀分布原则，最终得到小麦染色体均匀分布的5000个寡核苷酸位点(如图1所示)及对应的10000个液相芯片定向捕获探针。随后,兼顾重要农艺形状基因、染色体均匀分布、物种特异性原则，筛选出小麦610个液相芯片定向捕获探针核心位点。

实施例1中黑麦全基因组40K寡核苷酸位点的筛选，以中国春重测序数据挖掘黑麦全基因组物种特异性区间，具体方法如下：

(1)下载小麦中国春(GSA数据库登录号CRR062130)和阿勃(GSA数据库登录号CRR062102)，利用BWA软件与黑麦参考基因组Weining V1 (https://ngdc.cncb.ac.cn/gwh/Assembly/12832/show)进行序列比对，基于此，提取黑麦基因组未有序列覆盖区域，即黑麦相较于小麦潜在物种特异性区间；

(2)根据潜在黑麦物种特异区间起始、终止位置信息，取平均值，以此平均值为基础，左右延伸150bp提取序列，即代表该区间300bp序列，随后，利用gmap、BLAST软件将其与小麦参考基因组(Ensemble Genome数据库:Triticum_aestivum.IWGSC.41)进行序列比对，进一步剔除可与小麦基因组比对位点，保留位点与黑麦参考基因组进行比对，剔除多位点比对序列，获得候选序列；

(3)将对各区域候选序列进行靶向捕获探针评估，完成液相芯片探针设计，每个位点2 根液相芯片捕获探针；

(4)根据可设计液相芯片探针位点，结合黑麦参考基因组注释信息，以如下优先级标准筛选探针：基因区>基因启动子区(2Kb)>基因下游邻位区(2Kb)>基因间隔区，结合染色体均匀分布原则，最终得到黑麦染色体均匀分布的40000个寡核苷酸位点(如图2所示)及对应的800000个液相芯片定向捕获探针。随后，兼顾重要农艺形状基因(高分子谷蛋白基因、低分子谷蛋白基因、黑麦碱等)、染色体均匀分布、物种特异性原则，筛选出二倍体长穗偃麦草850个液相芯片定向捕获探针核心位点。

根据获得的5K小麦和40K黑麦寡核苷酸位点及其对应的90K靶向捕获探针进行探针合成，从而得到小麦-黑麦45K液相芯片。

实施例3

该小麦-黑麦全基因组液相芯片可用于黑麦、小麦品种中国春和矮抗58的鉴定中；具体的鉴定过程如下。

(1)待检测材料DNA的提取及质检：选取小麦品种中国春、矮抗58，每个品种两次生物学重复；同时，选取贵州黑麦，取待检测样自然晾干叶片，使用CTAB法提取DNA；利用琼脂糖凝胶电泳检测样本DNA，保证基因组完整性；利用微量紫外分光光度计测定基因组 DNA浓度，各样本DNA工作浓度调整至10～50ng/ul。

(2)小麦-黑麦全基因组液相芯片检测：按照液相探针杂交的靶向基因捕获技术(http://www.molbreeding.com/index.php/Technology/GenoBaits.html)标准流程构建液相芯片 DNA杂交捕获文库，文库测序依赖于华大MGISEQ2000测序平台。

(3)数据分析：下机序列利用FastQC软件进行质控，得到Clean data；随后，利用BWA 软件将其与小麦中国春参考基因组、黑麦基因组进行比对，得到各样本比对文件，利用bedtools 统计各探针位点序列覆盖情况；通过检出位点与芯片位点进行比较发现(如图3及图4所示)，针对中国春小麦品种，小麦5K寡核苷酸位点1A～7D不同染色体位点检出率为91.9％～98.5％；贵州黑麦在黑麦40K寡核苷酸位点不同染色体位点检出率为89.7％～94.5％；矮抗58为1B.1R 易位系，除却1B染色体外，其它小麦染色体1A～7D位点检出率为85.2％～97.3％；不同生物学重复间检出位点一致性高达99.5％，相关系数为0.99，说明芯片检测的稳定性很好。

同时，基于各样本比对文件，可利用GATK软件的标准流程检测中国春、矮抗58各检出位点SNP，进而对不同小麦品种进行基因分型。

实施例4

该小麦-黑麦全基因组液相芯片可用于黑麦衍生材料染色体组成的鉴定，其鉴定过程如下。其中，利用该液相芯片进行黑麦衍生材料遗传组成分析中，其样品准备、检测方案、分析流程与实施例3相同。

本次测试选取中国春与黑麦远缘杂交衍生材料代换系CS-3R(3D)，FISH鉴定表明该材料为42条染色体，但小麦的3D染色体被黑麦3R染色体代换，从图5和图6中可以看出，本套液相芯片可很好实现黑麦衍生材料基因组组成的快速鉴定。

实施例5

小麦-黑麦1B.1R易位系具有高产和适应性广等优点，在我国的小麦生产中得到了广泛的应用，但由于其含有黑麦碱导致小麦加工品质变差。该液相芯片黑麦1R染色体设计了4331 个靶向捕获位点，共计9889根液相探针；同时，针对黑麦全基因组14个黑麦碱位点，设计了552根液相探针。因此，高效鉴定小麦-黑麦1B.1R易位系及追踪黑麦碱基因是本套液相芯片的重要特征之一。

利用该小麦-黑麦全基因组液相芯片鉴定小麦-黑麦1B.1R易位系及追踪黑麦碱基因的过程如下。

首先，选取贵州黑麦、法国黑麦、奥地利黑麦3个黑麦品种，同时，挑选不同黑麦1B.1R 易位材料周8425B、矮孟牛、矮抗58、洛夫林10、洛夫林13、牛朱特、西农511，此外，以非1B.1R易位材料中国春作为对照。利用该液相芯片对上述材料进行分析，结果显示(如图7、图8及图9所示)，该液相芯片可准确鉴定1B.1R易位材料，同时，可利用GATK软件的标准流程追踪1B.1R易位材料对应1R染色体基因变异，如ScWN1R01G011200为1R染色体上黑麦碱，贵州黑麦与参考基因组威宁黑麦存在较多SNP，而携带1B.1R易位材料的小麦品种周8425B、矮孟牛、矮抗58、洛夫林10、洛夫林13、牛朱特、西农511在该基因位点与参考基因组威宁黑麦序列一致。与此同时，非1B.1R易位材料小麦品种中国春无检测信号。针对黑麦基因组3R染色体上的黑麦碱编码基因ScWN3R01G087900，其仅可在贵州黑麦、法国黑麦、奥地利黑麦等黑麦品种中检测到，而在其它小麦品种中无信号，说明该液相芯片在黑麦碱基因位点的高覆盖性和特异性。

该液相芯片包括黑麦全基因组层面80000根探针，其中近75％位于黑麦基因区，剩余25％位于基因邻位区(上下游2Kb)，涉及黑麦全基因组39355个基因，可聚焦分析重要基因定型、遗传变异。同时，因是液相芯片，可随时根据需要添减感兴趣靶位点，可为黑麦及其它远缘物种的利用奠定重要基础。

综上所述，该小麦-黑麦全基因组液相芯片在应用层面，具有如下优势。

(1)可在小麦与黑麦杂交形成的材料鉴定中应用，如，小麦与黑麦杂交衍生的附加系、代换系、易位系、渐渗系等；提取待检测样本基因组DNA，应用该液相芯片可直接获得各衍生材料中黑麦、小麦基因组组成、外源片段携带基因情况，加速了对外源优异基因的利用。

(2)可在小麦远缘杂交形成的衍生材料及品种潜在外源片段、外源基因分析、克隆中应用，如：黑麦属优异性状基因克隆，因小麦的大多数近缘种属与小麦的亲缘关系相对较远，杂交后还得经过胚拯救、多代回交、杂交才可产生稳定的衍生系，但对于含有大片段外源染色体的材料，由于与普通小麦杂交后染色体之间发生交换和重组的概率非常低，通过构建遗传群体，使用传统图位克隆方法挖掘优异性状调控基因十分困难。而本液相芯片包括黑麦 80000根探针，近75％位于黑麦基因区，剩余25％位于基因邻位区(上下游2Kb)，涉及黑麦全基因组39355个基因；因此，应用该液相芯片可精准锁定衍生材料及品种潜在外源片段基因组成，辅助基因克隆。

(3)该小麦-黑麦45K液相芯片同时包含5K小麦和40K黑麦寡核苷酸位点，可应用于小麦、黑麦及其衍生材料遗传多样性分析、品种鉴定、亲缘关系鉴定、进化关系分析、DNA 指纹数据库构建、全基因组关联分析、基因组选择育种等。

Claims

1.一种小麦-黑麦全基因组液相芯片，其特征在于，该小麦-黑麦全基因组液相芯片由独立包装的小麦-黑麦90K探针混合液和杂交捕获试剂构成，所述小麦-黑麦90K探针混合液包含5K小麦寡核苷酸探针位点和40K黑麦寡核苷酸探针位点，且每个位点2个液相探针；

所述5K小麦寡核苷酸探针位点的核心位点信息如下：

其中，位点编号中左侧1A～7A、1B～7B、1D～7D表示位点所在的染色体，后续两组数值分别为5K小麦寡核苷酸探针在小麦参考基因组上各染色体对应起始、终止位点；所述小麦参考基因组为中国春的全基因组序列，版本号为Ensemble Genome，Triticum_aestivum.IWGSC.41；

所述40K黑麦寡核苷酸探针位点的核心位点信息如下：

其中，位点编号中左侧1R～7R、UN表示位点所在的染色体，其中，UN为未锚定染色体；后续两组数值分别为40K黑麦寡核苷酸探针在黑麦参考基因组上各染色体对应起始、终止位点；所述黑麦参考基因组为Weining V1，https://ngdc.cncb.ac.cn/gwh/Assembly/12832/show；

该小麦-黑麦全基因组液相芯片的探针长度110bp、探针GC含量在30％～80％之间、同源性区域个数≤5。

2.如权利要求1所述的小麦-黑麦全基因组液相芯片，其特征在于，该小麦-黑麦全基因组液相芯片为液相探针通过C12分子臂和氨基修饰偶联在荧光微球上；每个荧光微球偶联一种液相探针。

3.如权利要求1所述的小麦-黑麦全基因组液相芯片的应用，其特征在于，该小麦-黑麦全基因组液相芯片应用于小麦-黑麦属物种衍生后代产生的异附加系、异代换系、易位系、渐渗系材料鉴定。

4.如权利要求1所述的小麦-黑麦全基因组液相芯片的应用，其特征在于，该小麦-黑麦全基因组液相芯片应用于外源导入产生的优异性状基因的克隆和遗传解析。

5.如权利要求1所述的小麦-黑麦全基因组液相芯片的应用，其特征在于，小麦-黑麦全基因组液相芯片应用于黑麦属物种进行染色体组成、基因结构变异、同源关系进化关系分析。

6.如权利要求1所述的小麦-黑麦全基因组液相芯片的应用，其特征在于，该小麦-黑麦全基因组液相芯片应用于小麦、黑麦物种及其衍生材料的遗传多样性分析、品种鉴定、亲缘关系鉴定、全基因组关联分析、基因组选择育种。