CN102329881A - 基于单碱基延伸反应进行基因多态性检测的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于单碱基延伸反应进行基因多态性检测的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：（1）根据待测基因序列设计并选取特异性引物；将特异性引物加入含有所测样本、双脱氧核苷酸三磷酸对（ddNTP）或三磷酸脱氧核糖核苷对（dNTP）的混合液中，进行单碱基延伸反应使特异性引物末端加入一个双脱氧核苷酸三磷酸对（ddNTP）或三磷酸脱氧核糖核苷对（dNTP）中的碱基；所述特异性引物位于待测基因SNP位点的上游，且引物的3′-末端碱基紧靠待测SNP位点，含有待测基因序列15～45个连续的核苷酸组成连续核苷酸序列；（2）测定延伸产物中剩余核糖核苷酸的量；根据延伸产物中剩余双脱氧核苷酸三磷酸（ddNTP）或三磷酸脱氧核糖核苷（dNTP）的多少判断该靶基因多态性的类型。该方法成本低、操作简便、不需复杂优化步骤即可快速检测基因多态性。

Description

基于单碱基延伸反应进行基因多态性检测的方法

技术领域

本发明属于基因多态性检测技术领域，具体涉及一种基于单碱基延伸反应进行基因多态性检测的方法。

背景技术

国际人类基因组计划(HGP)完成之后，科学家在破译人类基因组的过程中发现，任何两个不同个体的基因组序列都有约0.1％的差异。这种基因序列差异被称为基因多态性，其中最普遍的是单个核苷酸的差异，即单核苷酸多态性(SNP)，占所有已知多态性的90％以上【Lander ES，Linton LM，Birren B，et al.Initial sequencing and analysis of the human genome.Nature 2001，409(6822)：860-921.】。基因多态性决定了不同人种和群体的差异，以及不同人群疾病易感性和药物治疗敏感性的差异。因此，基因多态性尤其是SNP可成为疾病发生和药物反应相关基因，进行疾病预防、诊断和临床用药指导的基础【Brown PO，Hartwell L.Genomics and humandisease--variations on variation.Nat Genet 1998，18(2)：91-93.】。

通常，SNP是一种双等位基因，即在该位置上存在两种不同的碱基。因此，对已知SNP位点的检测就是进行两种不同类型碱基的确认分析，而无须对DNA片段进行全序列测定。目前，已经发展了多种检测SNP的方法，这些检测方法主要包括两个部分，即检测原理和检测平台。检测原理主要包括引物延伸反应、内切酶酶切反应、连接酶酶连反应、构象和杂交；而检测平台主要有电泳、高效液相色谱、荧光、芯片和质谱分析等【汪维鹏，倪坤仪，周国华.单核苷酸多态性检测方法的研究进展.遗传，2006，28(1)：117-126.】。

这些技术虽然在某种程度上能完成对SNP的检测，但应用上还存在很多不足，有些检测过程繁琐，需要多步反应，费时费力，如限制性片段长度多态性(RFLP)分析【Cohen JB，Levinson AD.A point mutation in the lastintron responsible for increased expression and transforming activity ofthe c-Ha-ras oncogene.Nature 1988，334(6178)：119-124.】；有些技术需要多种昂贵的试剂，如焦测序技术【Ronaghi M，Uhlen M，Nyren P.Asequencing method based on real-time pyrophosphate.Science 1998，281(5375)：363，365.】；有些技术设计复杂，如引物入侵技术【Lyamichev V，MastAL，Hall JG，et al.Polymorphism identification and quantitative detectionof genomic DNA by invasive cleavage of oligonucleotide probes.NatBiotechnol 1999，17(3)：292-296.】；有些技术对反应条件要求很高，难于控制，容易出现非特异性反应产物，如等位基因特异性扩增(ASA)【SommerSS，Groszbach AR，Bottema CD.PCR amplification of specific alleles(PASA)is a general method for rapidly detecting known single-basechanges.Biotechniques 1992，12(1)：82-87.】和等位基因特异性杂交(ASO)等【Tsuji S，Martin BM，Barranger JA，et al.Genetic heterogeneity in type1 Gaucher disease：multiple genotypes in Ashkenazic and non-Ashkenazicindividuals.Proc Natl Acad Sci U S A 1988，85(7)：2349-2352.】；还有些技术需要对核苷酸进行荧光、同位素或酶标记，这就需要采用相应的检测平台进行检测，使得检测成本大大提高，如TaqMan探针技术【Livak KJ，MarmaroJ，Todd JA.Towards fully automated genome-wide polymorphism screening.Nat Genet 1995，9(4)：341-342.】和SNP芯片技术【Fan JB，Chen X，Halushka MK，et al.Parallel genotyping of human SNPs using generichigh-density oligonucleotide tag arrays.Genome Res 2000，10(6)：853-860.】等。

在上述技术中，单碱基延伸反应原理简单、特异性好，即设计一条引物位于待测SNP位点的上游，该引物的3′-末端碱基紧靠待测SNP位点，加入标记的ddNTPs进行反应，只有当加入的ddNTP与SNP位点碱基互补时，引物才得以延伸，通过检测引物延伸产物来判断SNP的类型；但该技术仍需要对ddNTPs进行标记，大大增加了检测成本。本发明因此而来。

发明内容

本发明目的在于提供一种基于单碱基延伸反应进行基因多态性检测的方法，解决了现有技术中单碱基延伸反应检测时需要ddNTPs进行标记造成检测成本增加、荧光标记检测结果受荧光性质的影响等问题。

为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是：

一种基于单碱基延伸反应进行基因多态性检测的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

(1)根据待测基因序列设计并选取特异性引物；将特异性引物加入含有所测样本、双脱氧核苷酸三磷酸对(ddNTP)或三磷酸脱氧核糖核苷对(dNTP)的混合液中，进行单碱基延伸反应使特异性引物末端加入一个双脱氧核苷酸三磷酸对(ddNTP)或三磷酸脱氧核糖核苷对(dNTP)中的碱基；所述特异性引物位于待测基因SNP位点的上游，且引物的3′-末端碱基紧靠待测SNP位点，含有待测基因序列15～45个连续的核苷酸组成连续核苷酸序列；

(2)测定延伸产物中剩余核糖核苷酸的量；根据延伸产物中剩余双脱氧核苷酸三磷酸(ddNTP)或三磷酸脱氧核糖核苷(dNTP)的多少判断该靶基因多态性的类型。

优选的，所述方法中进行单碱基延伸反应的单碱基延伸反应液终浓度组成为：

单碱基延伸反应缓冲液         终浓度1～10×；

ddNTP或dNTP                  0.01～1.5mM

单碱基延伸反应的DNA聚合酶    0.01～1.0U/μL；

特异性引物序列               终浓度为0.01～2μM；

MgCl₂                        终浓度为0.5～5mM。

优选的，所述方法中测定延伸产物中剩余核糖核苷酸的量的方法选自高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳(CE)或微流控芯片电泳(MCE)方法。

优选的，所述方法中在步骤(1)进行单碱基延伸反应前进行PCR扩增待测基因样本，进行单碱基延伸反应使用的所测样本采用PCR扩增后的待测基因样本。

优选的，所述方法中双脱氧核苷酸三磷酸对(ddNTP)选自ddATP/ddGTP、ddATP/ddCTP、ddATP/ddTTP、ddGTP/ddTTP、ddGTP/ddCTP、ddCTP/ddTTP；所述三磷酸脱氧核糖核苷对(dNTP)选自dATP/dGTP、dATP/dCTP、dATP/dTTP、dGTP/dTTP、dGTP/dCTP、dCTP/dTTP。

优选的，所述方法应用在CYP2D6基因的基因多态性检测时，所述特异性引物为具有SEQ No：1～4的序列。其中具有SEQ No：1和SEQ No：2的特异性引物组成特异性引物对(正向和反向引物)；其中具有SEQ No：3和SEQ No：4的特异性引物组成特异性引物对(正向和反向引物)。

优选的，所述方法中单碱基延伸反应在PCR仪器上进行，其条件为：92～97℃预变性1～4min；92～97℃变性5～15s，50～60℃退火10～15s，70～75℃延伸10～15s，循环35～45次；然后降温到15～20℃保存。

优选的，所述方法步骤(2)中测定延伸产物中剩余核糖核苷酸的量采用高效液相色谱法进行分离检测，采用的色谱条件：C18色谱柱，流动相为0.1mmol/L，pH＝3.85的KH₂PO₄缓冲液，检测波长260nm，柱温30℃，流速控制在1.0ml/min。

本发明特异性引物的连续核苷酸序列由5’端的地址序列和3’端的位点检测区组成。待测基因样本可以是提取的基因样本，也可以是PCR扩增后的基因样本。如果是PCR扩增后的基因样本，有可能需要对扩增产物进行洁净反应。如加入单碱基延伸反应的洁净酶到PCR扩增产物中从而提纯待测基因样本。

基因样本的获取来源可以是来自存在该基因序列的细胞、组织，组织可以选自外周血、体液、腔道的脱落物、病变组织，以及用这些组织制成的石蜡块、石蜡切片。

本发明解决了现有单碱基延伸反应技术进行基因多态性分析存在的缺点，得到一种成本低、操作简便、不需复杂优化步骤即可快速检测基因多态性的方法。

本发明先根据所测样本靶序列设计一条引物；然后将上述引物加入含有所测样本、两种核糖核苷酸、反应缓冲液和酶的溶液中，进行单碱基延伸反应；最后以高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳(CE)或微流控芯片电泳(MCE)等方法测定延伸产物中剩余核糖核苷酸的量；根据延伸产物中剩余核糖核苷酸的多少判断基因多态性的类型。

本发明的方法原理如图1所示。图1中，以最常见的基因多态性SNP为例阐述本方法的原理。假设基因组1中存在SNP位点，其类型为2，即C/T型。加入引物3及等量的核糖核苷酸4和5，即dCTP(或ddCTP)和dTTP(或ddTTP)，进行延伸反应。当SNP的类型为“CC纯合子”时，引物3与5发生延伸反应，产生延伸产物6；而4与G不互补，不会与引物3发生延伸反应，所以反应后溶液中剩余4。当SNP的类型为“TT纯合子”时，引物3与4发生延伸反应，产生延伸产物7；而5与A不互补，不会与引物3发生延伸反应，所以反应后溶液中剩余5。当SNP的类型为“CT杂合子”时，引物3与等量的4和5发生延伸反应，产生延伸产物6和7，反应后溶液中既有4也有5。采用HPLC、CE或MCE等方法测定延伸产物中剩余核糖核苷酸，剩余的4和5分别产生峰信号8和9。最后根据8和9的多少判断SNP的类型：如果图谱中只有8或8明显高于9为“CC纯合子”，只有9或9明显高于8为“TT纯合子”，而8与9高度接近则为“CT杂合子”。

在本发明中，术语“引物”是指一种寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成，它可以作为在一定条件下诱发DNA合成的起始点，在上述条件下可以诱发合成与核酸链相互补的引物扩增产物，即在四种不同的三磷酸脱氧核糖核酸及一种聚合试剂(即DNA聚合酶或逆转录酶)存在下，在一种合适的缓冲液并在合适的温度下进行上述合成。优选的引物是单股寡脱氧核糖核苷酸。引物的合适长度取决于该引物的设计用途，但在一般在15～25个核苷酸之间，较短的引物分子通常需要较低的温度，从而与模板形成充分稳定的杂交复合物。引物不必反应模板的准确序列，但必须充分互补，已与模板杂交并引发DNA合成。

引物设计应遵循以下原则：1.引物应在核酸系列保守区内设计并具有特异性。2.产物不能形成二级结构。3.引物长度一般在15～30碱基之间。4.G+C含量在40％～60％之间，Tm值最好接近72℃。5.碱基要随机分布。6.引物自身不能有连续4个碱基的互补。7.引物之间不能有连续4个碱基的互补。8.引物5′端可以修饰。9.引物3′端不可修饰。10.引物3′端要避开密码子的第3位。11.引物3′端不能选择A，最好选择T。12.扩增产物的单链不能形成二级结构。进行引物设计时，可以通过Primer Premier 5，Beacon Designer 7软件进行设计，将设计好的序列通过人工合成方法得到。

相对于现有技术中的方案，本发明的优点是：

本发明是一种利用单碱基延伸反应和高效液相色谱法等分离检测反应产物中剩余核糖核苷酸量来快速检测基因多态性的方法，属于一种改变常规单碱基延伸反应产物检测对象以实现基因多态性快速检测的方法。具体而言，是一种通过在含有所测样本、反应缓冲液和酶的溶液中加入一条引物和两种核糖核苷酸，进行单碱基延伸反应，然后以高效液相色谱法等方法测定延伸产物中剩余核糖核苷酸的量来判断基因多态性类型的方法。根据本发明，不需对核苷酸进行任何标记，不需任何昂贵的试剂和仪器设备，也不需复杂的优化步骤，即可实现基因多态性的快速测定；可用于单碱基多态性、基因突变、碱基插入或缺失、基因插入或缺失和mRNA剪接异构体分析等。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

图1为基于单碱基延伸反应进行基因多态性检测的方法原理图；

图2-4为CYP2D6基因SNP位点检测时单碱基延伸反应后反应产物的高效液相色谱图；

图5-7为CYP2D6基因插入/缺失位点检测时单碱基延伸反应后反应产物的高效液相色谱图；

图8为高效液相色谱法测定等位基因频率的方法原理图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

实施例1高效液相色谱法测定CYP2D6基因中100C＞T位点

异喹胍4-羟化酶CYP2D6是细胞色素P450酶系统的成员之一，参与代谢80多种药，如阿普洛尔、普萘洛尔等。CYP2D6基因多态性对该酶的代谢活性存在明显影响。本实施例以其SNP位点100C＞T(rs1065852)为例，研究本发明的实用性。为了提高检测灵敏度和降低基因组DNA的使用量，首先设计一对引物扩增含100C＞T位点的DNA片段，引物序列为P1：5′-AACGCT GGG CTG CAC GCT AC-3′和P2：5′-TGG TCG AAG CAG TAT GGTGT-3′，扩增产生的DNA片段长度为100bp；引物P1的3′-末端紧靠100C＞T位点，所以也被用作单碱基延伸引物。然后经过纯化步骤除去反应液中目的DNA片段外的其他成分。再以纯化DNA片段为模板，在反应液中加入两种与SNP等位基因C和T对应的脱氧核糖核苷酸dCTP和dTTP，与引物P1发生延伸反应。具体操作过程如下。

1.实验材料：基因组DNA样本；Taq DNA聚合酶(FERMENTAS INC，USA)；引物P1：5′-AAC GCT GGG CTG CAC GCT AC-3′和P2：5′-TGGTCG AAG CAG TAT GGT GT-3′(上海英骏生物技术有限公司合成，PAGE纯化)；dCTP、dTTP、Tris碱和溴化乙锭(EtBr)均为上海生工生物公司产品；琼脂糖(LP0028A，Oxoid Ltd，UK)；实验所用其他试剂均为分析纯或优级纯；PCR产物纯化试剂盒(杭州爱思进生物技术有限公司)。所有溶液均由灭菌去离子水配制。

仪器：PCR扩增仪(PTC-200，BIO-RAD Inc，USA)；POWERBC6003EN型电泳仪(上海申能博彩生物科技有限公司)；GeneGenius凝胶成像系统(SYNGENE Co Ltd，UK)；高效液相色谱仪(Agilent，USA)；COSMOSIL C18色谱柱(5μm，4.6×250mm)。

2.实验方法：在PCR反应液(25μL)中加入1μL(约100ng)基因组DNA、1×PCR缓冲液、2.5mmol/L MgCl₂、引物P1和P2各0.4μmol/L、0.2mmol/L dNTPs和0.625U Taq DNA聚合酶。放入PCR仪中，94℃预变性5min；然后以94℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；最后72℃延伸7min使反应完全；16℃保存。反应完成后，取反应产物3μL在2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳(1×TAE电泳缓冲液，8V/cm恒压电泳10min)，凝胶成像系统拍摄电泳图谱。

采用PCR产物纯化试剂盒按照说明书纯化PCR扩增产物。然后，在25μL单碱基延伸反应溶液中加入10μL纯化PCR扩增产物、1×PCR缓冲液、2.5mmol/L MgCl₂、0.4μmol/L引物P1、10μmol/L dCTP、10μmol/L dTTP和0.625U Taq DNA聚合酶。放入PCR仪中，94℃预变性3min；然后以94℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸10s，循环40次；16℃保存。反应完成后，取10μL反应产物注入高效液相色谱仪进行分离检测。色谱条件：C18色谱柱，流动相0.1mmol/L KH₂PO₄缓冲液(pH3.85)，检测波长260nm，柱温30℃，流速1.0ml/min。

3.实验结果：结果如图2-4所示。图2中dCTP和dTTP峰的峰面积分别为46.4和56.7，说明反应液中dCTP参与了延伸反应，由此判断该样本基因型为CC；图3中dCTP和dTTP峰的峰面积分别为38.8和39.5，说明反应液中dCTP和dTTP都参与了延伸反应，由此判断该样本基因型为CT；图4中dCTP和dTTP峰的峰面积分别为72.7和57.2，说明反应液中dTTP参与了延伸反应，由此判断该样本基因型为TT。

实施例2高效液相色谱法测定CYP2D6基因中100C＞T位点

本实施例以CYP2D6基因中插入/缺失位点4657-4659ACA＞del(rs78340630)为例，研究本发明的实用性。为了提高检测灵敏度和降低基因组DNA的使用量，首先设计一对引物扩增含rs78340630位点的DNA片段，引物序列为P3：5′-TCC TGC CAG CAC CAT CAC A-3′和P4：5′-AGGGAA CGT TCT GGC ACC T-3′，扩增产生的DNA片段长度为139bp；引物P3的3′-末端紧靠rs78340630位点，所以也被用作单碱基延伸引物。然后经过纯化步骤除去反应液中目的DNA片段外的其他成分。再以纯化DNA片段为模板，在反应液中加入两种与SNP等位基因对应的脱氧核糖核苷酸dATP和dGTP，与引物P3发生延伸反应。具体操作过程如下。

1.实验材料：基因组DNA样本；引物P3：5′-TCC TGC CAG CAC CATCAC A-3′和P4：5′-AGG GAA CGT TCT GGC ACC T-3′(上海英骏生物技术有限公司合成，PAGE纯化)；dGTP和dATP为上海生工生物公司产品；其他试剂及仪器设备同实施例1。

2.实验方法：在PCR反应液(25μL)中加入1μL(约100ng)基因组DNA、1×PCR缓冲液、2.5mmol/L MgCl₂、引物P3和P4各0.4μmol/L、0.2mmol/L dNTPs和0.625U Taq DNA聚合酶。放入PCR仪中，94℃预变性5min；然后以94℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；最后72℃延伸7min使反应完全；16℃保存。反应完成后，取反应产物3μL在2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳(1×TAE电泳缓冲液，8V/cm恒压电泳10min)，凝胶成像系统拍摄电泳图谱。

采用PCR产物纯化试剂盒按照说明书纯化PCR扩增产物。然后，在25μL单碱基延伸反应溶液中加入10μL纯化PCR扩增产物、1×PCR缓冲液、2.5mmol/L MgCl₂、0.4μmol/L引物P3、10μmol/L dGTP、10μmol/L dATP和0.625U Taq DNA聚合酶。放入PCR仪中，94℃预变性3min；然后以94℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸10s，循环40次；16℃保存。反应完成后，取10μL反应产物注入高效液相色谱仪进行分离检测。色谱条件：C18色谱柱，流动相0.1mmol/L KH₂PO₄缓冲液(pH3.85)，检测波长260nm，柱温30℃，流速1.0ml/min。

3.实验结果：结果如图5-7所示。图5中dGTP和dATP峰的峰面积分别为62.1和46.7，说明反应液中dATP参与了延伸反应，由此判断该样本基因型为ACA/ACA；图6中dGTP和dATP峰的峰面积分别为49.7和50.5，说明反应液中dGTP和dATP都参与了延伸反应，由此判断该样本基因型为ACA/del；图7中dGTP和dATP峰的峰面积分别为46.5和59.2，说明反应液中dGTP参与了延伸反应，由此判断该样本基因型为del/del。

实施例3高效液相色谱法测定等位基因频率

研究和发现与疾病发生发展相关的SNP位点，或者与药物代谢差异相关的SNP位点常常通过对比两组人群(疾病人群和正常人群)中所研究的SNP的等位基因频率来获得，这往往需要对成千上万个样本进行分析，工作量非常巨大，因此急需一些高通量、低成本的SNP分型技术，以满足需求。对大量个体来说，单核苷酸多态性分析仍然是非常昂贵和费时的。因此，一个有效降低检测成本和操作的方法是测定等量混合的DNA样本。测定等量混合DNA样本的方法减少了基因分型的操作，而且DNA混合样本中的野生型/突变型等位基因的比率在很大范围内都能够准确测定。本例先将两组中多个样品10分别等量混合成样品11，然后配制单碱基延伸反应溶液，等量分为两份12和13，12进行单碱基延伸反应，13不进行延伸反应；取适量反应液12注入高效液相色谱仪分离，得峰14和15，分别对应于两种等位基因类型“C”和“T”；另取适量溶液13注入高效液相色谱仪分离，得峰16和17。根据峰14、15、16和17的峰面积A14、A15、A16和A17，分别按公式18和19计算“C”和“T”的出现频率，其测定原理如图8所示。

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种基于单碱基延伸反应进行基因多态性检测的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

（1）根据待测基因序列设计并选取特异性引物；将特异性引物加入含有所测样本、双脱氧核苷酸三磷酸对（ddNTP）或三磷酸脱氧核糖核苷对（dNTP）的混合液中，进行单碱基延伸反应使特异性引物末端加入一个双脱氧核苷酸三磷酸对（ddNTP）或三磷酸脱氧核糖核苷对（dNTP）中的碱基；所述特异性引物位于待测基因SNP位点的上游，且引物的3′-末端碱基紧靠待测SNP位点，含有待测基因序列15～45个连续的核苷酸组成连续核苷酸序列；

（2）测定延伸产物中剩余核糖核苷酸的量；根据延伸产物中剩余双脱氧核苷酸三磷酸（ddNTP）或三磷酸脱氧核糖核苷（dNTP）的多少判断该靶基因多态性的类型。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中进行单碱基延伸反应的单碱基延伸反应液终浓度组成为：

单碱基延伸反应缓冲液  终浓度1～10×；ddNTP或dNTP      0.01～1.5mM；单碱基延伸反应的DNA聚合酶      0.01～1.0U/μL；特异性引物序列 终浓度为0.01～2μM；MgCl ₂    终浓度为0.5～5mM。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中测定延伸产物中剩余核糖核苷酸的量的方法选自高效液相色谱法（HPLC）、毛细管电泳（CE）或微流控芯片电泳（MCE）方法。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中在步骤（1）进行单碱基延伸反应前进行PCR扩增待测基因样本，进行单碱基延伸反应使用的所测样本采用PCR扩增后的待测基因样本。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中双脱氧核苷酸三磷酸对（ddNTP）选自ddATP/ddGTP 、ddATP/ddCTP、ddATP/ddTTP、ddGTP/ddTTP、ddGTP/ddCTP、ddCTP/ ddTTP；所述三磷酸脱氧核糖核苷对（dNTP）选自dATP/dGTP 、dATP/dCTP、dATP/dTTP、dGTP/dTTP、dGTP/dCTP、dCTP/ dTTP。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法应用在CYP2D6基因的基因多态性检测时，所述特异性引物为具有SEQ No：1～4的序列。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述方法中单碱基延伸反应在PCR仪器上进行，其条件为：92～97℃预变性1～4min；92～97℃变性5～15s，50～60℃退火10～15 s，70～75℃延伸10～15s，循环35～45次；然后降温到15～20℃保存。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述方法步骤（2）中测定延伸产物中剩余核糖核苷酸的量采用高效液相色谱法进行分离检测，采用的色谱条件：C18色谱柱，流动相为0.1mmol/L，pH=3.85的KH₂PO₄缓冲液，检测波长260nm，柱温30℃，流速控制在1.0 ml/min。

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