CN102912029A

CN102912029A - 一种检测人结核杆菌相关易感基因cish +1320位点的单核苷酸多态性的方法

Info

Publication number: CN102912029A
Application number: CN2012104409530A
Authority: CN
Inventors: 俞杨; 王自正; 邬兰; 焦杰; 杜同信; 瞿卫; 谢玉为
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-11-06
Filing date: 2012-11-06
Publication date: 2013-02-06

Abstract

本发明属于医学分子生物学领域，公开了一种检测人结核杆菌相关易感基因CISH+1320位点的单核苷酸多态性的方法。该方法应用PCR-荧光标记单碱基-毛细管电泳分离检测技术检测CISH+1320位点多态性，具体方法包括人全血基因组DNA提取、单核苷酸多态性位点扩增引物及延伸引物设计与合成、PCR扩增产物质量验证、单核苷酸多态性位点检测样本的制备及检测、数据分析、与测序结果的对照评价。本发明在保证结果可靠性的基础上，不需要像测序法那样检测较长的无关片段，只需要产生单个碱基的信号，避免了无关片段的复杂结构对检测的干扰，检测周期和成本均显著低于测序法，结果可读性强。

Description

一种检测人结核杆菌相关易感基因CISH +1320位点的单核苷酸多态性的方法

技术领域

本发明属于医学分子生物学领域，涉及一种检测人结核杆菌相关易感基因CISH+1320位点的单核苷酸多态性的方法。

背景技术

随着人类基因组测序计划的完成，人类已进入后基因组时代。该时代的研究重点是个体间的遗传差异。这种差异最常见的是单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)，即在基因组水平上由单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性，它具有密度高、遗传稳定、易于自动化分析等特点，被认为是继限制性片段长度多态性、微卫星多态性之后的第三代遗传标记，可用于基因定位、多态性分析等方面，是研究疾病易感性、疾病诊断、药物筛选等的常用指标。

单碱基延伸法(single base primer extension)又称微测序法、模板介导染料终止剂掺入分析或单核苷酸多态性鉴定技术(single-nucleotide polymorphism-identification technology，SNP-IT)，是在双脱氧测序法的基础上发展出来的单核苷酸多态性检测方法。其原理是:首先设计1对PCR引物，从基因组DNA中扩增出含有目的单核苷酸多态性位点的片段，再设计1条与待测单核苷酸多态性位点上游序列互补的延伸引物，该引物的3’端最后一个碱基与单核苷酸多态性位点上游相邻的1个碱基互补，将延伸引物与PCR产物混合，掺入标记不同荧光染料的ddNTPs进行延伸反应，由于ddNTP的特性，当延伸1个碱基，即加入的ddNTP与单核普酸多态性位点碱基互补时，反应即终止，通过检测延伸碱基所发出的荧光类型来判断单核苷酸多态性位点的碱基类型。

CISH基因编码Cytokine-inducible SH2-containing protein，可调节白细胞介素-2（IL-2）的信号传导途径，其特定的基因型与细菌、病毒、结核杆菌和疟疾的易感性相关。Khor CC等人通过病例对照研究，分析二十余种免疫相关基因单核苷酸多态性与细菌、结核和疟疾感染的相关性。研究发现，CISH-639、-292、-163、+1320和+3415位点的单核苷酸多态性与细菌、结核杆菌和疟疾的易感性相关，其中，CISH+1320位点多态性与结核杆菌易感性的相关性最强。（Khor CC,et al.CISH and susceptibility toinfectious diseases.N Engl J Med.2010;362(22):2092–2101.）

发明内容

本发明的目的是建立并优化了PCR-荧光标记单碱基-毛细管电泳分离检测技术检测人CISH+1320位点基因型的方法。

本发明所述方法包括以下步骤：

1、CISH+1320位点扩增引物及延伸引物设计与合成

从NCBI Gene bank上下载人CISH基因核酸序列（登录号：NC_000003），保存成fasta格式。采用Primer3（http://frodo.wi.mit.edu/）设计引物（见表1），BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）验证所设计引物的特异性。设计好的引物委托上海invitrogen合成，采用HPLC纯化。

2、基因组DNA样品制备

采集受试者静脉血2mL，入乙二胺四乙酸二钾抗凝管，混匀。采用QIAGEN公司QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒（货号：51104）提取人外周血基因组DNA，按说明书操作，具体步骤如下:①1.5mL EP管中依次加入20μL QIAGEN蛋白酶，200μL抗凝全血，200μL Bufffer AL，室温下涡旋混匀15秒;②56℃孵育10min，瞬时离心;③加入200μL无水乙醇，室温下涡旋混匀15秒，瞬时离心;④将裂解产物转移至提取柱上，6000g离心1分钟，弃滤过液;⑤加入500μLBuffer AW1，6000g离心1分钟，弃滤过液;⑥加入500μL Buffer AW2，20000g离心3分钟，弃滤过液;⑦换收集管，加入100μLBuffer AE，6000g离心1分钟洗脱，将DNA溶液置超低温冰箱保存。

3、PCR扩增目的片段

按下列反应体系配置PCR反应液，加入0.2mL PCR管中。

在PCR仪上运行如下程序：94℃3min;{94℃30s;64℃30s;72℃30s;}35cycles;

4、PCR扩增产物纯化

采用Axygen PCR clean up试剂盒（货号：AP-PCR-50）纯化PCR扩增产物，操作按说明书，30μL洗脱。DNA溶液保存于超低温冰箱。

5、单碱基延伸反应

（1）采用BECKMAN COULTER GenomeLab^TM SNPStart Primer Extension Kit（货号：PNA23201）按下列反应体系配置反应液，加入0.2mLPCR管中。

（2）在PCR仪上运行如下程序：{94℃10s;45℃20s;}25CYCLES

（3）延伸产物纯化，采用Takara CIAP酶解过量的ddNTP

37℃反应30min

65℃灭活30min，瞬时离心，收集样品，-20摄氏度保存

6、采用毛细管电泳检测样本单核苷酸多态性位点

（1）上样体系如下：

（2）采用Beckman CEQ8000遗传分析仪检测，对6(1)样品进行电泳，运行SNP-1程序，分析。

7、结果判读：

运行Beckman CEQ8000遗传分析仪分析软件(9.0版本)中的片段分析（Fragments）程序，Slope Threshold设成30，Relative Peak Height Threshold设成20，选取SNP ver.2 Dye Mobility Calibration.

以DNA标准品S80（Beckman:PN 608395）为参照峰，根据GenomeLab SNPStart引物延伸试剂盒（Beckman:PN A23201）的说明书，分析结果。正确的峰应落在S80的两个参照峰（分别为13nt峰和88nt峰）之间，大小约在23nt。软件中显示的峰的颜色是单碱基延伸反应中荧光染料的指示效果，可以用于判断+1320位点是何种碱基。黑白图片中已标识出相应碱基，23nt位置的单峰表示AA纯合野生型或CC纯合突变型；双峰表示AC杂合突变型。

8、单核苷酸位点检测正确性评价。

进一步，可以通过测序和单碱基延伸两个实验结果的比对，观察PCR-单碱基延伸和测序的结果符合率。

本发明的有益效果

CISH+1320位点多态性是新近发现的结核杆菌易感基因，本发明建立并优化了“PCR-单碱基延伸（荧光标记）-毛细管电泳分离检测技术”检测人CISH+1320位点基因型的方法，不需要像测序法那样检测较长的无关片段，只需要产生单个碱基的信号，避免了无关片段的复杂结构对检测的干扰，检测周期和成本均显著低于测序法，结果可读性强；而且该方法避免了杂交法中探针错配产生的假阳性信号，显著提高了检测的信噪比，准确性高，其结果与DNA测序完全符合。本发明提供的方法准确性高、周期短、成本低，适合进行临床样本的大规模、自动化检测，便于对CISH+1320位点多态性在结核杆菌感染预防与控制中的作用进行研究。

附图说明

图1：7个标本和一个空白对照经目的片段扩增后的琼脂糖电泳图。目标片段大小约为318bp。

图2：为PCR-单碱基延伸分析结果与测序结果的对比图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例1：

1．1主要试剂

Alkaline Phosphatase(CIAP)(calf inestine)（Takara，货号：D2250）

rTaq^TM（Takara，货号：DR011）

GenomeLab TM DNA size standard kit-80(Beckmen，货号：PN 608395)

GenomeLab TM SNPStart Primer Extension Kit（Beckmen，货号：PN A23201）

AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen，货号：AP-PCR-50）

QIAamp DNA Blood Mini kit（Qiagen，货号：51104）

100bp DNA Ladder(Tiangen，货号：MD109-01)

GelRed^TM Nucleic Acid Gel Stain(BIOTIUM，货号：41003)

1．2主要设备

Bio-Rad Gel DOC^TM EZ Imager

Eppendorf Centrifuge 5417R

S1000^TM Thermal Cycler

CEQ^TM 8000 Genetic Analysis Systems

2．2实施方法：

本发明所述方法包括以下步骤：

（1）CISH+1320位点扩增引物及延伸引物设计与合成

表1扩增引物及延伸引物

（2）基因组DNA样品制备

采集受试者静脉血2mL，入乙二胺四乙酸二钾抗凝管，混匀。采用QIAGEN公司QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒（货号：51104）提取人外周血基因组DNA，按说明书操作，具体步骤如下:①1.5mL EP管中依次加入20μLQIAGEN蛋白酶，200μL抗凝全血，200μL Bufffer AL，室温下涡旋混匀15秒;②56℃孵育10min，瞬时离心;③加入200μL无水乙醇，室温下涡旋混匀15秒，瞬时离心;④将裂解产物转移至提取柱上，6000g离心1分钟，弃滤过液;⑤加入500μLBuffer AW1，6000g离心1分钟，弃滤过液;⑥加入500μL Buffer AW2，20000g离心3分钟，弃滤过液;⑦换收集管，加入100μLBuffer AE，6000g离心1分钟洗脱，将DNA溶液置超低温冰箱保存。

（3）PCR扩增目的片段

按下列反应体系配置PCR反应液，加入0.2mL PCR管中。

在PCR仪上运行如下程序：94℃3min;{94℃30s;64℃30s;72℃30s;}35cycles;电泳检测结果见图1。

（4）PCR扩增产物纯化

（5）单碱基延伸反应

采用BECKMAN COULTER GenomeLab^TM SNPStart Primer Extension Kit（货号：PNA23201）按下列反应体系配置反应液，加入0.2mLPCR管中。

在PCR仪上运行如下程序：{94℃10s;45℃20s;}25CYCLES

延伸产物纯化，采用Takara CIAP（货号：D2250）酶解过量的ddNTP

37℃反应30min

65℃灭活30min，瞬时离心，收集样品，-20摄氏度保存

（6）采用毛细管电泳检测样本单核苷酸多态性位点

上样体系如下：

采用Beckman CEQ8000遗传分析仪检测，对样品进行电泳，运行SNP-1程序，分析。

（7）结果判读

（8）单核苷酸位点检测正确性评价

通过测序和单碱基延伸两个实验结果的比对，结果见图2。

经PCR-单碱基延伸分析结果与测序结果的对比可知，可见本发明提供的方法检测结果与DNA测序完全符合。

Claims

1.一种检测人结核杆菌相关易感基因CISH+1320位点的单核苷酸多态性的方法，其特征方法在于检测方法包括如下步骤：

(1)设计CISH单核苷酸多态性位点的扩增引物及延伸引物；

(2)制备人全血基因组DNA样本；

(3)PCR扩增靶片段；

(4)PCR扩增产物纯化；

(5)单碱基延伸反应制备CISH 1320+位点多态性的样本；

(6)采用毛细管电泳检测样本单核苷酸多态性位点；

(7)采用Fragment程序分析，根据片段分析结果中单碱基延伸所产生的峰来判读相应的碱基，确定CISH+1320位点的单核苷酸多态性。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于可进一步采用测序方法，验证PCR-单碱基延伸检测方法的准确性。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于设计的单核苷酸多态性位点扩增引物的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示；延伸引物序列如SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在步骤(3)中的PCR反应体系。

。

5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于步骤(3)中所述的PCR循环条件为：94-98℃变性30秒，56-68℃退火60秒，72℃延伸30-180秒，共30-40个循环；最佳循环反应条件为：94℃30秒，64℃30秒，72℃30秒，共35个循环。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于根据Beckman CEQ8000遗传分析仪分析软件(9.0版本)中的片段分析（Fragments）程序的软件判断结果，评价人CISH+1320位点的多态性，或者进一步将该结果和DNA测序的结果进行比较。