CN104232773A - 一种用于运动性心脏意外筛查的snp复合检测体系 - Google Patents

一种用于运动性心脏意外筛查的snp复合检测体系 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于运动性心脏意外筛查的SNP复合检测体系，利用美国贝克曼超高通量SNP分型检测平台（BeckmanGenomeLabSNPstreamUHTGenotypingSystem）进行早期筛查遗传性心血管疾病，属于生物检测技术领域。本发明包括多重PCR引物和SNP标签引物设计、多重PCR扩增体系体系与程序、SNP延伸反应液、SNP延伸反应程序。本发明根据国内外运动性心脏意外基因最新研究，建立了5种遗传性心血管疾病、13个相关基因、37个突变位点的快速、准确、高通量检测方法，弥补了常规赛前心血管系统体检指标不够完善和敏感低的缺点，在运动性心脏意外的早期诊断、筛查、预防等方面具有很好的应用前景。

Description

一种用于运动性心脏意外筛查的SNP复合检测体系
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及肥厚性心肌病(HCM)、致心律失常性右室发育不良(AVRD)、遗传性LQT综合症(LQT)、短QT综合症(SQT)、儿茶酚胺依赖性多形性室性心动过速(CPVT)5种遗传性心血管疾病早期筛查诊断方法，可用于上述5种疾病、13个相关基因、37个突变位点的快速、准确、高通量检测。
背景技术
运动性心脏意外作为体育运动人群在运动中发生的心血管事件，严重威胁着人类的生命，越来越引起世人的关注和研究的兴趣。近年体坛不断传来的优秀运动员猝死事件，更是撼人心弦。尽管运动性心脏意外与其他疾病相比，发生率并不高，但因其直接危及“健康人”的生命，给人们的印象和震撼很深。遗憾的是即使进行了赛前健康检查和心血管结构和功能评估，由于现有方法学的限制，也不能正确地排查出一些存有潜在运动性猝死隐患的运动员，一些体检正常的运动员也有发生猝死的现象。最近，Maron等人的调查进一步证实这一问题，其调研的115名猝死的运动员都经过了赛前健康检查，仅有4名运动员(占总人数的3％)被怀疑有心脏病，可见，目前即使对运动员进行常规赛前健康检查，现有的心血管系统的筛检指标仍然不够完善和敏感，很多潜在的心血管系统隐患问题仍不能得到早期诊断。遗传流行病学研究表明，运动性心脏意外具有较高的遗传度。许多心脏猝死与某些基因多态性相关，比如α2肾上腺素能受体B亚型(α2B-ADR)、血管紧张素转换酶(ACE)、离子通道基因(HERG)及内皮素-1(ET-1)等基因。因此，有必要建立一种新型敏感的运动性心脏意外早期诊断方法，以期达到筛选高风险个体，以达到预测、预防运动性心脏意外，保护高危人群的作用。
贝克曼超高通量SNP基因分型平台(Beckman GenomeLabSNPstream UHTGenotyping System)是一套自动化的多重SNP分析系统，在特制384孔板的每个微孔中可分析12个或48个SNP位点。该系统已广大应用于遗传图谱标记的绘制、疾病诊断和疾病易感基因的鉴别、药物代谢和药物遗传学、法医鉴定和个体识别等遗传相关研究和应用领域。其特点是：准确——采用贝克曼独家专利的单碱基引物延伸SNP(SNP-it)检测技术，准确率高达99％以上，通过集成的综合软件使质控和数据统计一体化，全程100％质量控制；快速——灵活的多路线技术与先进的自动化操作保证每天可以处理4,600-3,000,000个基因型；高转化率——一般认为约有50％的基因或者序列并不适合基于荧光定量PCR的方法，但该方法转化率高达85％，可以弥补这一缺陷；超低样本量——每个基因型检测仅需0.04ng的DNA。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够快速、准确、高通量筛查运动性心脏意外的SNP复合检测体系。涉及肥厚性心肌病(HCM)、致心律失常性右室发育不良(AVRD)、遗传性LQT综合症(LQT)、短QT综合症(SQT)、儿茶酚胺依赖性多形性室性心动过速(CPVT)5种遗传性心血管疾病早期筛查诊断方法。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
1、运动性心脏意外相关的基因SNP标记数据库的建立
(1)通过综合分析国内外运动性心脏意外相关研究，筛选出7种主要与运动性心脏意外相关遗传疾病：肥厚性心肌病、致心律失常性右室发育不良、扩张型心肌病、马方综合症、遗传性LQT综合症、短QT综合症、儿茶酚胺依赖性多形性室性心动过速。
(2)通过选择基因型和表型关系密切，缺乏早期诊断技术的遗传疾病作为基因芯片设计候选疾病，共筛出5种疾病：肥厚性心肌病(HCM)、致心律失常性右室发育不良(AVRD)、遗传性LQT综合症(LQT)、短QT综合症(SQT)、儿茶酚胺依赖性多形性室性心动过速(CPVT)。
(3)综合国内外运动性心脏意外相关遗传性疾病的基因研究文献，并通过生物信息学方法从美国国家生物技术信息中心(NCBI)的核酸序列数据库(GenBank)和最新的人类孟德尔遗传病数据库(OMIM)中寻找出与运动性心脏意外密切相关的13个基因及其37个突变位点，建立了运动性心脏意外相关基因标记数据库。
表1运动性心脏意外SNP基因标记数据库
注：RS号空白处是因为这些SNP位点是较新的位点，美国国家生物技术信息中心(NCBI)目前还没有指定相应的RS号。
2、运动性心脏意外早期基因诊断方法的研发
(1)采用Beckman GenomeLabSNPstream UHT Genotyping System作为基因芯片技术平台，设计多重PCR引物及SNP标签引物。
一种用于运动性心脏意外筛查的SNP复合检测体系，包括37个SNP位点、多重PCR引物组、SNP标签引物组，所述多重PCR引物组中包括与所述37个SNP位点一一对应的37对扩增引物，每对多重PCR引物能扩增待检测DNA上包括其相应的SNP位点的突变型或野生型碱基在内的核苷酸序列；
所述SNP标签引物组中包括与所述37个SNP位点一一对应到37条SNP标签引物；
所述37个SNP位点如表1所示。
由于某些SNP位点较新，美国国家生物技术信息中心(NCBI)目前还没有指定相应的RS号，本专利利用基因(氨基酸突变)来表示相应的SNP位点。
进一步的，所述的扩增引物组为序列表中SEQ IN No.1至SEQ IN No.74的核苷酸序列。
进一步的，所述的SNP引物组为序列表中SEQ IN No.75至SEQ IN No.111的核苷酸序列。
(2)设计优化多重PCR扩增体系与程序。
5μl多重PCR反应体系
成分 最终浓度
10xPCR Buffer 1x
MgCl2(25mM Stock) 5mM
dNTP(2.5mM Each) 75μM
Primer Pool(2.5μM Each) 50nM
Genomic DNA 2ng/5μl
Taq Gold(5U/μl) 0.1U/μl
MBG水 Total volume 5μl
在AB9700PCR仪上进行PCR反应，程序：94℃，1分钟；94℃，30秒钟，39个循环；55℃，30秒钟；72℃，1分钟。前6个循环的退火温度为50℃，在后续的循环中，其退火温度以0.2℃递增，直至达到55℃的退火温度。循环完毕后，72℃延伸7分钟，然后是4℃保存。
PCR反应程序
(3)设计优化SNP延伸反应液与程序。
将已合成好的SNP引物以TE溶解并配成每种引物各5μM浓度的混合液(SNP Primer Mix)。按下表配制SNP延伸反应。
SNP延伸反应液
试剂 每个样本
SNP Extension Dilation Buffer 3.76μl
SNP primer Mix(5μM Each) 0.06μl
C/T(OR C/G，T/C，etal.)extension Mix 0.2μl
MBG水 2.96μl
SNP ware DNA polymerase 0.02μl
Total 7μl
在MJ-Research PCR仪上进行延伸反应：在经过Exo I/SAP处理的PCR反应中加入7μL的SNP延伸反应液，密封微阵列板，然后按照以下程序进行：96℃，3分钟；94℃，20秒钟，45个循环；40℃，11秒钟。最后一个循环后，4℃保存。
单碱基延伸反应体系
(4)芯片杂交，基因分型。
通过标准芯片杂交流程，采用SNPstream UHT Array Imager(成像仪)检测，像点检测采用一种先进的grid drawing算法编写的SNPstream UHT Image软件完成，依据每个像点的相对荧光强度来生成具体的基因型数据。
本发明相比现有技术的有益效果是：
本研究针对运动医学中严重问题运动性心脏意外，总结了国内外运动性心脏意外基因最新研究，建立了运动性心脏意外基因标记数据库，利用美国Beckman GenomeLabSNPstream UHTGenotyping System系统开发出用于运动性心脏意外早期诊断的SNP复合检测体系，具有以下特点：准确——准确率高达99％以上；快速——每天可以处理4,600-3,000,000个基因型；高转化率——转化率高达85％；超低样本量——每个基因型检测仅需0.04ng的DNA。
附图说明
图1为SNP stream UHT Array Imager(成像仪)扫描读取基因型示意图；
图2～图5为测序图；
图6为基因分型检测路线图。
具体实施方式：
一、引物设计
采用Autoprimer软件在线设计多重PCR引物及SNP标签引物。
一种用于运动性心脏意外筛查的SNP复合检测体系，包括37个SNP位点、多重PCR引物组、SNP标签引物组，所述多重PCR引物组中包括与所述37个SNP位点一一对应的37对扩增引物，每对多重PCR引物能扩增待检测DNA上包括其相应的SNP位点的突变型或野生型碱基在内的核苷酸序列；
所述SNP标签引物组中包括与所述37个SNP位点一一对应到37条SNP标签引物；
所述37个SNP位点包括：CASQ2(LEU167HIS)、CASQ2(ASP307HIS)、DSG2(ARG45GLN)、DSG2(ARG48HIS)、DSG2(VAL55MET)、DSG2(CYS506TYR)、DSG2(GLY811CYS)、KCNE1(SER74LEU)、KCNQ1(GLY189ARG)、KCNQ1(VAL307LEU)、KCNQ1(ALA341VAL)、KCNQ1(GLY589ASP)、MYH7(MET349THR)、MYH7(ARG663CYS)、PKP2(N852FSX930)、RYR2(PRO2328SER)、RYR2(ASN2386ILE)、RYR2(VAL4653PHE)、RYR2(ALA4860GLY)、TGFB3(-36G-A，5-PRIME UTR)、rs28934270、rs16991652、rs74315447、rs74315448、rs16991654、KCNQ1(LEU191PRO)、KCNQ1(PHE275SER)、KCNQ1(SER277LEU)、TNNT2(ILE79ASN)、TNNT2(ARG92GLN)、TNNI3(LYS206GLN)、rs77615401、、RYR2(SER2246LEU)、RYR2(ARG2474SER)、RYR2(ASN4104LYS)、RYR2(ARG4497CYS)、rs72546668。
进一步的，所述的扩增引物组为序列表中SEQ IN No.1至SEQ IN No.74的核苷酸序列。
进一步的，所述的SNP引物组为序列表中SEQ IN No.75至SEQ IN No.111的核苷酸序列。
二、检测实验操作步骤：
1.多重PCR反应：
(1)合成的多重PCR引物以MBG(Molecular Biology Grade)水溶解并配成每种引物各2.5μM浓度的混合液(Primer pool)
(2)根据本次实验的样本数配制下述反应体系：见下表。在384孔板中可以进行5μl的PCR反应(MJ Research，Watertown，MA，USA)，合成的多重PCR引物以TE溶解并配成每种引物各2.5μM浓度的混合液(Primer pool)。
5μl 48-plex反应各组份终浓度
成分 浓度
10xPCR Buffer 1x
MgCl2(25mM Stock) 5mM
dNTP(2.5mM Each) 75uM
Primer Pool(2.5μM Each) 50nM
Genomic DNA 2ng/5μl
Taq Gold(5U/μl) 0.1U/μl
MBG水 Total volume 5μl
*注实验中设置一个阴性对照
(3)将384孔PCR反应板加封Tap膜，在AB9700PCRPCR仪上进行PCR反应(程序如下表)：94℃，1分钟；94℃，30秒钟，39个循环；55℃，30秒钟；72℃，1分钟。前6个循环的退火温度为50℃，在后续的循环中，其退火温度以0.2℃递增，直至达到55℃的退火温度。循环完毕后，72℃延伸7分钟，然后是4℃保存。
PCR反应程序
(4)结束反应后，取出PCR产物板，离心(1000rpm 1min)，置于冰上。
2.PCR产物的洁净
将SBE酶试剂(美国GE Healthcare公司)用配套的稀释液稀释成1×的工作液，384孔板的每个反应样孔中加3ul，混匀，重新封膜，在AB9700PCR仪上执行下表程序：为了降解残留的PCR引物和dNTPs将密封的微阵列板37℃保温30分钟；然后为了灭活酶的活性，96℃10分钟；然后是4℃保存。见下表。
PCR产物的洁净
3.SNP延伸反应
(1)将已合成好的SNP引物以TE溶解并配成每种引物各5μM浓度的混合液(SNP Primer Mix)。
(2)按照反应的样本数配制下表反应体系：在上述每孔8μl的体系中加入每孔7μl的延伸反应液(见下表)，混匀。
单碱基延伸反应液
试剂 每个样本
SNP Extension Dilation Buffer 3.76μl
SNP primer Mix(5μM Each) 0.06μl
C/T(OR C/G，T/C，etal.)extension Mix 0.2μl
MBG水 2.96μl
SNP ware DNA polymerase 0.02μl
Total 7μl
(3)在MJ-Research PCR仪上进行延伸反应：在经过Exo I/SAP处理的PCR反应中加入7μL的混合液(见上表)。密封微阵列板，然后按照以下程序(见下表)进行：96℃，3分钟；94℃，20秒钟，45个循环；40℃，11秒钟。最后一个循环后，4℃保存。
单碱基延伸反应体系
4.芯片杂交反应
(1)杂交前洗板：用双蒸水将Hybridization Wash Buffer I稀释成1×的工作液，倒入加样槽，用排枪从加样槽中取10μl加入384孔的芯片板孔中，手指轻轻叩打板的边缘，使洗液充分覆盖整个孔底面积。板上覆盖一张无尘纸巾，倒置放入离心机中，1000rpm 1分钟进行离心去除洗液。此步骤再重复两次。
(2)杂交：将Hybridization solution和Hybridization additive溶液以18.18∶1混合配制成杂交液，在上述15ul的反应体系中每孔加入8μl杂交液，混匀后各取15μl加入已预洗的384孔芯片板相应的孔中。将板置于保湿环境中42°杂交2小时。
(3)杂交后洗板：杂交好的芯片板上覆盖一张无尘纸巾，倒置放入离心机中，1000rpm 1分钟离心去除杂交反应溶液。将Hybridization Wash Buffer II稀释成1×的工作液，倒入加样槽，用排枪从加样槽中取15μl加入384孔的芯片板孔中，手指轻轻叩打板的边缘，使洗液充分覆盖整个孔底面积。板上覆盖一张无尘纸巾，倒置放入离心机中，1000rpm 1分钟进行离心去除洗液。此步骤再重复两次。
(4)用甲醇洁净384芯片板的背面玻璃。将板放入SNPstream仪器进行数据扫描及分析。
5.数据分析
采用SNPstream UHT Array Imager(成像仪)检测，每个样品首先用488nm的激光照射，然后是532nm激光的照射，以激活固定在SNPstream UHT微阵列板上的寡核苷酸的荧光。每个384孔板拍64张2×3孔的彩色图像。像点检测采用一种先进的grid drawing算法编写的SNPstream UHT Image软件完成，依据每个像点的相对荧光强度来生成具体的基因型数据，写入Oracle数据库中。
6.基因分型结果验证
随机抽取样本采用测序方法检测10个检测位点基因型，结果与芯片检测结果完全一致，具体情况如下：
编号 疾病 基因 芯片结果 测序结果
GXL1 CPVT CASQ2 TT TT
GXL62 HCM TPM1 GG GG
GXL101 HCM TNNI3 AA AA
GXL67 LQT KCNE2 TT TT
GXL68 LQT KCNE2 TT TT
GXL69 LQT KCNE2 TT TT
GXL110 LQT CAV3 CC CC
GXL93 LQT KCNQ1 TT TT
GXL94 LQT KCNQ1 CC CC
GXL16 SQT KCNQ1 GG GG

Claims (3)

1.一种用于运动性心脏意外筛查的SNP复合检测体系，其特征在于，包括37个SNP位点、多重PCR引物组、SNP标签引物组，
所述多重PCR引物组中包括与所述37个SNP位点一一对应的37对扩增引物，每对多重PCR引物能扩增待检测DNA上包括其相应的SNP位点的突变型或野生型碱基在内的核苷酸序列；
所述SNP标签引物组中包括与所述37个SNP位点一一对应到37条SNP标签引物；
所述37个SNP位点包括：CASQ2（LEU167HIS）、CASQ2（ASP307HIS）、DSG2（ARG45GLN）、DSG2（ARG48HIS）、DSG2（VAL55MET）、DSG2（CYS506TYR）、DSG2（GLY811CYS）、KCNE1（SER74LEU）、KCNQ1（GLY189ARG）、KCNQ1（VAL307LEU）、KCNQ1（ALA341VAL）、KCNQ1（GLY589ASP）、MYH7（MET349THR）、MYH7（ARG663CYS）、PKP2（N852FSX930）、RYR2（PRO2328SER）、RYR2（ASN2386ILE）、RYR2（VAL4653PHE）、RYR2（ALA4860GLY）、TGFB3（-36G-A，5-PRIME UTR）、rs28934270、rs16991652、rs74315447、rs74315448、rs16991654、KCNQ1（LEU191PRO）、KCNQ1（PHE275SER）、KCNQ1（SER277LEU）、TNNT2（ILE79ASN）、TNNT2（ARG92GLN）、TNNI3（LYS206GLN）、rs77615401、RYR2（SER2246LEU）、RYR2（ARG2474SER）、RYR2（ASN4104LYS）、RYR2（ARG4497CYS）、rs72546668。
2.根据权利要求1所述的用于运动性心脏意外筛查的SNP复合检测体系，其特征在于，所述的扩增引物组为序列表中SEQ IN No.1至SEQ IN No.74的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的用于运动性心脏意外筛查的SNP复合检测体系，其特征在于，所述的SNP引物组为序列表中SEQ IN No.75至SEQ IN No.111的核苷酸序列。
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