CN110106240A - 一种基因多态性的检测方法 - Google Patents

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雒琴
智慧芳
倪君君
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Abstract

本发明提供了一种基因多态性的检测方法，包括：预先合成CYP2D6基因的c.100C>T位点、c.1661G>C位点和c.4180G>C位点的特异性扩增引物和单碱基延伸引物；从待测样本中提取出待测样本基因组DNA，并作为DNA模板；配置包含特异性扩增引物和DNA模板的聚合酶链式反应PCR扩增体系；利用PCR仪对PCR扩增体系进行扩增；顺次进行消化处理；顺次将配置包含单碱基延伸引物的单碱基延伸反应体系加入反应体系中进行延伸反应，顺次进行脱盐纯化处理，获得纯化产物；利用包括有质谱仪的检测仪器检测纯化产物，确定待测样本的CYP2D6*10的基因多态性。本方案能够提高CYP2D6*10基因多态性的检测效率。

Description

一种基因多态性的检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种基因多态性的检测方法。
背景技术
细胞色素P450(CYP450)是一类由亚铁血红素-硫醇盐蛋白组成的基因家族，可参与生物体内的甾醇类激素合成以及内源性物质和外源性物质的代谢。CYP2D6基因是CYP450家族中的成员之一，在遗传药理学上具有重要意义。
目前，通常采用聚合酶链式反应PCR-直接测序法来检测CYP2D6*10基因多态性。但是，PCR-直接测序法的检测周期长，从而导致CYP2D6*10基因多态性的检测效率低。
发明内容
本发明实施例提供了一种基因多态性的检测方法，能够提高CYP2D6*10基因多态性的检测效率。
本发明实施例提供了一种基因多态性的检测方法，包括：
预先合成CYP2D6基因的c.100C>T位点、c.1661G>C位点和c.4180G>C位点的特异性扩增引物和单碱基延伸引物，其中，所述C.100C>T位点的特异性扩增引物中的正向引物如SEQ ID NO.1所示，反向引物如SEQ ID NO.2所示；所述C.1661G>C位点的特异性扩增引物中的正向引物如SEQ ID NO.3所示，反向引物如SEQ ID NO4所示；所述C.4180G>C位点的特异性扩增引物中的正向引物如SEQ ID NO.5所示，反向引物如SEQ ID NO.6所示；所述C.100C>T位点的单碱基延伸引物如SEQ ID NO.7所示，所述C.1661G>C位点的单碱基延伸引物如SEQID NO.8所示和所述C.4180G>C位点的单碱基延伸引物如SEQ ID NO.9所示；
从待测样本中提取出待测样本基因组DNA，并将所述待测样本基因组DNA作为DNA模板；
配置包含所述特异性扩增引物和所述DNA模板的聚合酶链式反应PCR扩增体系；
利用PCR仪对所述PCR扩增体系进行扩增反应，获得第一反应体系；
对所述第一反应体系进行消化处理，获得第二反应体系；
配置包含所述单碱基延伸引物的单碱基延伸反应体系；
向所述第二反应体系中加入所述单碱基延伸反应体系，并对加入所述单碱基延伸反应体系的所述第二反应体系进行延伸反应，获得第三反应体系；
对所述第三反应体系进行脱盐纯化处理，获得纯化产物；
利用包括有质谱仪的检测仪器检测所述纯化产物，确定所述待测样本的CYP2D6*10的基因多态性。
优选地，
所述利用PCR仪对所述PCR扩增体系进行扩增反应，获得第一反应体系，包括：
利用PCR仪执行：
步骤A1：在90～98℃下，对所述PCR扩增体系预热0.5～10min；
步骤A2：在90～95℃下，对预热后的所述PCR扩增体系进行变性反应0.17～1min；
步骤A3：在50～60℃下，对变性反应后的所述PCR扩增体系进行退火反应0.17～1min；
步骤A4：在68～72℃下，对退火反应后的所述PCR扩增体系进行延伸反应0.5～10min；
步骤A5：将步骤A2、步骤A3和步骤A4循环25～45次，对延伸反应后的所述PCR扩增体系进行循环反应；
步骤A6：在68～72℃下，对循环反应后的所述PCR扩增体系进行终延伸反应0～10min，获得第一反应体系，并在2～8℃下，保存所述第一反应体系。
优选地，
所述利用PCR仪对加入所述待测样本所述对所述第一反应体系进行消化处理，获得第二反应体系，包括：
向所述第一反应体系中加入0.5～2U的碱性磷酸酶和对应的碱性磷酸酶缓冲液；
利用所述PCR仪，在30～40℃下，对加入所述碱性磷酸酶和所述碱性磷酸酶缓冲液的所述第一反应体系进行消化处理10～60min，并在70～85℃下，对消化处理后的所述第一反应体系进行加热变性处理5～30min，获得第二反应体系，最后在2～8℃下，保存所述第二反应体系。
优选地，
所述利用PCR仪对加入所述待测样本所述碱性磷酸酶，包括：虾碱性磷酸酶、小牛肠碱性磷酸酶、大肠杆菌碱性磷酸酶和大鼠碱性磷酸酶中的任意一种。
优选地，
所述利用PCR仪对加入所述待测样本所述对加入所述单碱基延伸反应体系的所述第二反应体系进行延伸反应，获得第三反应体系，包括：
利用所述PCR仪执行：
步骤B1：在90～98℃下，对加入所述单碱基延伸反应体系的所述第二反应体系预热0.5～10min；
步骤B2：在90～98℃下，对预热后的所述第二反应体系进行变性反应5s；
步骤B3：在50～58℃下，对变性反应后的所述第二反应体系进行退火反应5～30s；
步骤B4：在65～82℃下，对退火反应后的所述第二反应体系进行延伸反应5～30s；
步骤B5：将步骤B3至步骤B4循环5次，对所述延伸反应后的所述第二反应体系进行退火、延伸循环反应；
步骤B6：将步骤B2至步骤B5循环40次，对变性、退火循环反应后的所述第二反应体系进行扩增循环反应；
步骤B7：在68～75℃下，对扩增循环反应后的所述第二反应体系进行终延伸反应0～10min，获得第三反应体系，并在2～8℃下，保存所述第三反应体系。
优选地，
所述利用PCR仪对加入所述待测样本所述PCR扩增体系，包括：
蒸馏水8～10份，10*PCR buffer 4～6份，25mmol的MgCl2 3～5份，20mmol的脱氧核糖核苷三磷酸混合物1～2份，所述c.100C>T位点、所述c.1661G>C位点和所述c.4180G>C位点的特异性扩增引物的混合物9～11份，DNA聚合酶1～2份和DNA模板19～21份，其中，各组分按体积比计，9～11份的特异性扩增引物的混合物中的所述c.100C>T位点、所述c.1661G>C位点和所述c.4180G>C位点的特异性扩增引物的浓度均为0.1～2μmol，1～2份的所述DNA聚合酶的浓度为0.5～2U/μl，19～21份的所述DNA模板的量为5～500ng。
优选地，
所述利用PCR仪对加入所述待测样本所述单碱基延伸反应体系，包括：
蒸馏水5～7份，10*PCR buffer 1～3份，20mmol的双脱氧核苷三磷酸混合物1～3份，所述c.100C>T位点、所述c.1661G>C位点和所述c.4180G>C位点的单碱基延伸引物的混合物8～11份，以及DNA聚合酶0.3～0.5份，其中，各组分按体积比计，0.3～0.5份的所述DNA聚合酶的浓度为0.5～2U/μl，8～11份的单碱基延伸引物的混合物中的所述c.100C>T位点、所述c.1661G>C位点和所述c.4180G>C位点的单碱基延伸引物的浓度均为1～20μmol。
优选地，
所述利用PCR仪对加入所述待测样本所述对所述第三反应体系进行脱盐纯化处理，获得纯化产物，包括：
向所述第三反应体系中加入树脂，再加入蒸馏水，并将加入所述树脂和所述蒸馏水的所述第三反应体系混匀，将混匀后的所述第三反应体系的上清液作为纯化产物；
优选地，
所述利用PCR仪对加入所述待测样本所述对所述第三反应体系进行脱盐纯化处理，获得纯化产物，包括：
通过柱层析或者滤膜滤除所述第三反应体系中的盐，获得纯化产物。
优选地，
所述利用PCR仪对加入所述待测样本所述利用包括有质谱仪的检测仪器检测所述纯化产物，确定所述待测样本的CYP2D6*10的基因多态性，包括：
利用包括有质谱仪的检测仪器，通过预设的检测条件对所述纯化产物进行测试，获得谱图；
对于所述纯化产物中CYP2D6*10的c.100C>T位点，当所述谱图中只存在分子量为6362±3Da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的CYP2D6*10的基因型为c.100C>T-CC型；当所述谱图中只存在分子量为6442±3Da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的CYP2D6*10的基因型为c.100C>T-TT型；当所述谱图中同时存在分子量为6362±3Da和6442±3Da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的CYP2D6*10的基因型为c.100C>T-CT型；
对于所述纯化产物中CYP2D6*10的c.1661G>C位点，当所述谱图中只存在分子量为7382±3Da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的CYP2D6*10的基因型为c.1661G>C-GG型；当所述谱图中只存在分子量为7422±3Da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的CYP2D6*10的基因型为c.1661G>C-CC型；当所述谱图中同时存在分子量为7382±3Da和7422±3Da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的CYP2D6*10的基因型为c.1661G>C-GC型；
对于所述纯化产物中CYP2D6*10的c.4180G>C位点，当所述谱图中只存在分子量为7655±3Da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的CYP2D6*10的基因型为c.4180G>C-GG型；当所述谱图中只存在分子量为7615±3Da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的CYP2D6*10的基因型为c.4180G>C-CC型；当所述谱图中同时存在分子量为7655±3Da和7615±3Da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的CYP2D6*10的基因型为c.4180G>C-GC型；
其中，所述检测条件，包括：所述质谱仪的喷雾电压为3500～4000V，鞘气为25～50Arb，辅气为10～50Arb，离子传输管温度为260～400℃，离子源雾化温度为300～400℃，离子源温度为300～400℃，分辨率为3000～140000。
优选地，
所述利用PCR仪对加入所述待测样本所述检测仪器，进一步包括：高效液相色谱仪；
所述检测条件，进一步包括：C18反相色谱柱，所述C18反相色谱柱的柱温为：40～70℃，所述纯化产物的进样量为：5～50μl；
所述高效液相色谱仪的流动相为：A相：蒸馏水，B相：甲醇；
其中，色谱梯度为：0-1min，5％-20％B；1-4.5min，20％-55％B；4.5-5.5min，55％-95％B；5.5-7min，95％-5％B；7-10min，5％B。
本发明实施例提供了一种基因多态性的检测方法，将从待测样本提取出的待测样本基因组DNA，加入到包括有CYP2D6基因的c.100C>T位点、c.1661G>C位点和c.4180G>C位点的特异性扩增引物的PCR扩增体系中，即可利用PCR仪对该体系进行扩增反应，扩增出包含CYP2D6基因的c.100C>T位点、c.1661G>C位点和c.4180G>C位点的目的片段的第一反应体系，再顺次进行消化处理，可以获得消化处理后的第二反应体系，顺次利用配置好的单碱基延伸反应体系进行延伸反应，可以获得延伸反应后的第三反应体系，顺次进行脱盐纯化处理，即可获得纯化后的纯化产物，利用包括有质谱仪的检测仪器对纯化产物进行检测，即可确定待测样本的CYP2D6*10的基因多态性，由于包括有质谱仪的检测仪器检测CYP2D6*10基因多态性的周期短，因此可以实现提高CYP2D6*10基因多态性的检测效率的目的。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一实施例提供的一种基因多态性的检测方法的流程图；
图2是本发明一实施例提供的c.100C>T位点为c.100C>T-C基因型的LC-MS谱图；
图3是本发明一实施例提供的c.100C>T位点为c.100C>T-T基因型的LC-MS谱图；
图4是本发明一实施例提供的c.1661G>C位点为c.1661G>C-G基因型的LC-MS谱图；
图5是本发明一实施例提供的c.1661G>C位点为c.1661G>C-C基因型的LC-MS谱图；
图6是本发明一实施例提供的c.4180G>C位点为c.4180G>C-G基因型的LC-MS谱图；
图7是本发明一实施例提供的c.4180G>C位点为c.4180G>C-C基因型的LC-MS谱图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1所示，本发明实施例提供了一种基因多态性的检测方法，包括：
步骤101：预先合成CYP2D6基因的c.100C>T位点、c.1661G>C位点和c.4180G>C位点的特异性扩增引物和单碱基延伸引物，其中，所述C.100C>T位点的特异性扩增引物中的正向引物如SEQ ID NO.1所示，反向引物如SEQ ID NO.2所示；所述C.1661G>C位点的特异性扩增引物中的正向引物如SEQ ID NO.3所示，反向引物如SEQ ID NO4所示；所述C.4180G>C位点的特异性扩增引物中的正向引物如SEQ ID NO.5所示，反向引物如SEQ ID NO.6所示；所述C.100C>T位点的单碱基延伸引物如SEQ ID NO.7所示，所述C.1661G>C位点的单碱基延伸引物如SEQ ID NO.8所示和所述C.4180G>C位点的单碱基延伸引物如SEQ ID NO.9所示；
步骤102：从待测样本中提取出待测样本基因组DNA，并将所述待测样本基因组DNA作为DNA模板；
步骤103：配置包含所述特异性扩增引物和所述DNA模板的聚合酶链式反应PCR扩增体系；
步骤104：利用PCR仪对所述PCR扩增体系进行扩增反应，获得第一反应体系；
步骤105：对所述第一反应体系进行消化处理，获得第二反应体系；
步骤106：配置包含所述单碱基延伸引物的单碱基延伸反应体系；
步骤107：向所述第二反应体系中加入所述单碱基延伸反应体系，并对加入所述单碱基延伸反应体系的所述第二反应体系进行延伸反应，获得第三反应体系；
步骤108：对所述第三反应体系进行脱盐纯化处理，获得纯化产物；
步骤109：利用包括有质谱仪的检测仪器检测所述纯化产物，确定所述待测样本的CYP2D6*10的基因多态性。
在本发明实施例中，将从待测样本提取出的待测样本基因组DNA，加入到包括有CYP2D6基因的c.100C>T位点、c.1661G>C位点和c.4180G>C位点的特异性扩增引物的PCR扩增体系中，即可利用PCR仪对该体系进行扩增反应，扩增出包含CYP2D6基因的c.100C>T位点、c.1661G>C位点和c.4180G>C位点的目的片段的第一反应体系，再顺次进行消化处理，可以获得消化处理后的第二反应体系，顺次利用配置好的单碱基延伸反应体系进行延伸反应，可以获得延伸反应后的第三反应体系，顺次进行脱盐纯化处理，即可获得纯化后的纯化产物，利用包括有质谱仪的检测仪器对纯化产物进行检测，即可确定待测样本的CYP2D6*10的基因多态性，由于包括有质谱仪的检测仪器检测CYP2D6*10基因多态性的周期短，因此可以实现提高CYP2D6*10基因多态性的检测效率的目的。
需要说明的是，提取待测样本基因组DNA的方式，可以是用口腔拭子收集的口腔脱落细胞，或收集的新鲜外周血/组织样本采用天根口腔拭子基因组DNA提取试剂盒(DP322)，或血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)提取，并采用NP80-touch(德国IMPLEN)测定DNA的浓度及纯度后的待测样本基因组DNA，其中，待测样本基因组DNA的纯度的合适比值位于1.6～2.2范围区间内，且浓度位于5～1000ng/μl范围区间内，以便提取出的待测样本基因组DNA的质量符合测试要求。
其中，c.100C>T位点、c.1661G>C位点和c.4180G>C位点的特异性扩增引物和单碱基延伸引物可以根据需求设计。按照c.100C>T位点、c.1661G>C位点和c.4180G>C位点的正向引物和反向引物序列合成对应的特异性扩增引物，特异性扩增引物的合成采用固相合成法或者委托生物合成公司合成并检测正向和反向引物；单碱基延伸引物可以委托生物合成公司合成并检测。
其中，
所述c.100C>T位点的特异性扩增引物中的正向引物序列为：5’-ACGTTGGATGGTCGAAGCAGTATGGTGTGT-3’，反向引物序列为：5’-ACGTTGGATGTTGTGTCCAGAGGAGCCCAT-3’；
所述c.1661G>C位点的特异性扩增引物中的正向引物序列为：5’-ACGTTGGATGTATGGTGGATGGTGGGGCT-3’，反向引物序列为：5’-ACGTTGGATGTTCCGACTCCTCCTTCAGTC-3’；
所述c.4180G>C位点的特异性扩增引物中的正向引物序列为：5’-ACGTTGGATGCCGAGTTGGAACTACCACATT-3’，反向引物序列为：5’-ACGTTGGATGTTAGCTTCTCGGTGCCCACT-3’。
其中，c.100C>T位点、c.1661G>C位点和c.4180G>C位点的单碱基延伸引物，包含一条单碱基延伸正向引物或一条单碱基延伸反向引物；
所述c.100C>T位点的单碱基延伸引物序列为：
5’-AATGCTGGGCTGCACGCTAC-3’；
所述c.1661G>C位点的单碱基延伸引物序列为：
5’-AGGCCCAAGTTGCGCAAGGTGGA-3’；
所述c.4180G>C位点的单碱基延伸引物序列为：
5’-ATGGTGTCTTTGCTTTCCTGGTGA-3’。
在本发明一实施例中，配置的所述PCR扩增体系，包括：
蒸馏水8～10份，10*PCR buffer 4～6份，25mmol的MgCl2 3～5份，20mmol的脱氧核糖核苷三磷酸混合物1～2份，所述c.100C>T位点、所述c.1661G>C位点和所述c.4180G>C位点的特异性扩增引物的混合物9～11份，DNA聚合酶1～2份和DNA模板19～21份，其中，各组分按体积比计，9～11份的特异性扩增引物的混合物中的所述c.100C>T位点、所述c.1661G>C位点和所述c.4180G>C位点的特异性扩增引物的浓度均为0.1～2μmol，1～2份的所述DNA聚合酶的浓度为0.5～2U/μl，19～21份的所述DNA模板的量为5～500ng。
其中，PCR扩增体系中的DNA聚合酶，包括：大肠杆菌DNA聚合酶、Klenowfragment、T7DNA聚合酶、T4DNA聚合酶、修饰过的T7DNA聚合酶、逆转录酶和TaqDNA聚合酶中的任意一种或多种。
在本发明一实施例中，配置的所述单碱基延伸反应体系，包括：
蒸馏水5～7份，10*PCR buffer 1～3份，20mmol的双脱氧核苷三磷酸混合物1～3份，所述c.100C>T位点、所述c.1661G>C位点和所述c.4180G>C位点的单碱基延伸引物的混合物8～11份，以及DNA聚合酶0.3～0.5份，其中，各组分按体积比计，0.3～0.5份的所述DNA聚合酶的浓度为0.5～2U/μl，8～11份的单碱基延伸引物的混合物中的所述c.100C>T位点、所述c.1661G>C位点和所述c.4180G>C位点的单碱基延伸引物的浓度均为1～20μmol。
其中，单碱基延伸反应体系中的DNA聚合酶，包括：大肠杆菌DNA聚合酶、Klenowfragment、T7DNA聚合酶、T4DNA聚合酶、修饰过的T7DNA聚合酶、逆转录酶和TaqDNA聚合酶中的任意一种或多种。
在本发明一实施例中，所述利用PCR仪对所述PCR扩增体系进行扩增反应，获得第一反应体系，包括：
利用PCR仪执行：
步骤A1：在90～98℃下，对所述PCR扩增体系预热0.5～10min；
步骤A2：在90～95℃下，对预热后的所述PCR扩增体系进行变性反应0.17～1min；
步骤A3：在50～60℃下，对变性反应后的所述PCR扩增体系进行退火反应0.17～1min；
步骤A4：在68～72℃下，对退火反应后的所述PCR扩增体系进行延伸反应0.5～10min；
步骤A5：将步骤A2、步骤A3和步骤A4循环25～45次，对延伸反应后的所述PCR扩增体系进行循环反应；
步骤A6：在68～72℃下，对循环反应后的所述PCR扩增体系进行终延伸反应0～10min，获得第一反应体系，并在2～8℃下，保存所述第一反应体系。
在本发明实施例中，为了防止在进行PCR反应时，部分PCR扩增体系出现冷凝，可以先利用PCR仪对加入待测样本基因组DNA的PCR扩增体系预热0.5～10min，顺次在90～95℃条件下变性反应0.17～1min，顺次在50～60℃条件下退火0.17～1min，顺次在68～72℃条件下延伸0.5～10min，顺次将90～95℃条件下变性0.17～1min、50～60℃条件下退火0.17～1min和68～72℃条件下延伸0.5～10min扩增循环25～45次，顺次在68～72℃条件下终延伸0～10min，最后在2～8℃保存包含c.100C>T；c.1661G>C；c.4180G>C位点的目的片段的第一反应体系，完成扩增。
在本发明一实施例中，所述对所述第一反应体系进行消化处理，获得第二反应体系，包括：
向所述第一反应体系中加入0.5～2U的碱性磷酸酶和对应的碱性磷酸酶缓冲液；
利用所述PCR仪，在30～40℃下，对加入所述碱性磷酸酶和所述碱性磷酸酶缓冲液的所述第一反应体系进行消化处理10～60min，并在70～85℃下，对消化处理后的所述第一反应体系进行加热变性处理5～30min，获得第二反应体系，最后在2～8℃下，保存所述第二反应体系。
在本发明实施例中，利用碱性磷酸酶和对应的碱性磷酸酶缓冲液，对扩增后的第一反应体系进行消化处理，可以去除该体系内多余的脱氧核糖核苷三磷酸dNTP，获得第二反应体系，即利用PCR仪进行30～40℃下消化处理30min，然后70～85℃下加热变性5～30min，最后在2～8℃条件下保存第二反应体系。
其中，所述碱性磷酸酶，包括：虾碱性磷酸酶、小牛肠碱性磷酸酶、大肠杆菌碱性磷酸酶和大鼠碱性磷酸酶中的任意一种。
在本发明一实施例中，所述对加入所述单碱基延伸反应体系的所述第二反应体系进行延伸反应，获得第三反应体系，包括：
利用所述PCR仪执行：
步骤B1：在90～98℃下，对加入所述单碱基延伸反应体系的所述第二反应体系预热0.5～10min；
步骤B2：在90～98℃下，对预热后的所述第二反应体系进行变性反应5s；
步骤B3：在50～58℃下，对变性反应后的所述第二反应体系进行退火反应5～30s；
步骤B4：在65～82℃下，对退火反应后的所述第二反应体系进行延伸反应5～30s；
步骤B5：将步骤B3至步骤B4循环5次，对所述延伸反应后的所述第二反应体系进行退火、延伸循环反应；
步骤B6：将步骤B2至步骤B5循环40次，对变性、退火循环反应后的所述第二反应体系进行扩增循环反应；
步骤B7：在68～75℃下，对扩增循环反应后的所述第二反应体系进行终延伸反应0～10min，获得第三反应体系，并在2～8℃下，保存所述第三反应体系。
在本发明实施例中，在向消化处理后获得的第二反应体系中加入单碱基延伸反应体系后，为了防止配置的单碱基延伸反应体系在进行延伸反应时，部分体系出现冷凝，可以利用PCR仪在90～98℃下预热0.5～10min，顺次在90～98℃下变性5s，顺次在50～58℃下退火5～30s，顺次在65～82℃下延伸5～30s，顺次将50～58℃退火5～30s和65～82℃延伸5～30s循环5次，顺次将90～98℃变性5s至(50～58℃退火5～30s和65～82℃延伸5～30s循环5次)进行扩增循环40次，顺次在68～75℃终延伸0～10min，即可获得包含有单碱基延伸产物的第三反应体系，并在2～8℃保存延伸反应后获得的第三反应体系。
在本发明一实施例中，所述对所述第三反应体系进行脱盐纯化处理，获得纯化产物，包括：
向所述第三反应体系中加入树脂，再加入蒸馏水，并将加入所述树脂和所述蒸馏水的所述第三反应体系混匀，将混匀后的所述第三反应体系的上清液作为纯化产物；
或者，通过柱层析或者滤膜滤除所述第三反应体系中的盐，获得纯化产物。
在本发明实施例中，在延伸反应后获得的第三反应体系进行脱盐纯化处理时，可以通过树脂脱盐、层析脱盐或者时超滤脱盐方式去除第三反应体系中的盐离子，便于检测待测样本中的CYP2D6*10基因多态性。
在本发明一实施例中，所述利用包括有质谱仪的检测仪器检测所述纯化产物，确定所述待测样本的CYP2D6*10的基因多态性，包括：
利用包括有质谱仪的检测仪器，通过预设的检测条件对所述纯化产物进行测试，获得谱图；
对于所述纯化产物中CYP2D6*10的c.100C>T位点，当所述谱图中只存在分子量为6362±3Da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的CYP2D6*10的基因型为c.100C>T-CC型；当所述谱图中只存在分子量为6442±3Da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的CYP2D6*10的基因型为c.100C>T-TT型；当所述谱图中同时存在分子量为6362±3Da和6442±3Da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的CYP2D6*10的基因型为c.100C>T-CT型；
对于所述纯化产物中CYP2D6*10的c.1661G>C位点，当所述谱图中只存在分子量为7382±3Da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的CYP2D6*10的基因型为c.1661G>C-GG型；当所述谱图中只存在分子量为7422±3Da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的CYP2D6*10的基因型为c.1661G>C-CC型；当所述谱图中同时存在分子量为7382±3Da和7422±3Da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的CYP2D6*10的基因型为c.1661G>C-GC型；
对于所述纯化产物中CYP2D6*10的c.4180G>C位点，当所述谱图中只存在分子量为7655±3Da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的CYP2D6*10的基因型为c.4180G>C-GG型；当所述谱图中只存在分子量为7615±3Da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的CYP2D6*10的基因型为c.4180G>C-CC型；当所述谱图中同时存在分子量为7655±3Da和7615±3Da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的CYP2D6*10的基因型为c.4180G>C-GC型；
其中，所述检测条件，包括：所述质谱仪的喷雾电压为3500～4000V，鞘气为25～50Arb，辅气为10～50Arb，离子传输管温度为260～400℃，离子源雾化温度为300～400℃，离子源温度为300～400℃，分辨率为3000～140000。
图2～图6示出了部分目标基因的目标SNP位点的基因型的LC-MS谱图，图2～图7中的第一个坐标系均为色谱图，第二坐标系均为质谱图。其中，第一坐标系的横坐标为保留时间，单位为min，纵坐标为电信号强度，单位为mV。第二坐标系的横坐标为例子的质荷比，单位为m/z，纵坐标为离子流的强度。
图2示出了c.100C>T位点为c.100C>T-C基因型的LC-MS谱图；
图3示出了c.100C>T位点为c.100C>T-T基因型的LC-MS谱图；
图4示出了c.1661G>C位点为c.1661G>C-G基因型的LC-MS谱图；
图5示出了c.1661G>C位点为c.1661G>C-C基因型的LC-MS谱图；
图6示出了c.4180G>C位点为c.4180G>C-G基因型的LC-MS谱图；
图7示出了c.4180G>C位点为c.4180G>C-C基因型的LC-MS谱图。
需要说明的是，质谱仪器可以是基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪，或者是能够检测核酸分子量的质谱仪器。
在本发明一实施例中，所述检测仪器，进一步包括：高效液相色谱仪；
所述检测条件，进一步包括：C18反相色谱柱，所述C18反相色谱柱的柱温为：40～70℃，所述纯化产物的进样量为：5～50μl；
所述高效液相色谱仪的流动相为：A相：蒸馏水，B相：甲醇；
其中，色谱梯度为：0-1min，5％-20％B；1-4.5min，20％-55％B；4.5-5.5min，55％-95％B；5.5-7min，95％-5％B；7-10min，5％B。
在本发明实施例中，根据c.100C>T；c.1661G>C；c.4180G>C位点各自的单碱基延伸产物的理论分子量，若在液质联用仪对纯化产物进行测试获得的谱图中出现相应的分子量(质荷比)的质谱峰，则可以确定待测样本中存在对应的基因型。由于包括高效液相色谱仪和质谱仪的检测仪器来检测基因多态性的周期短，因此可以缩短CYP2D6*10基因多态性的检测时间，提高CYP2D6*10基因多态性检测的效率。并且通过色谱、质谱方式进行基因多态性的检测，还可以特异、简单、高通量的对目标基因的SNP位点进行分型，进一步提高CYP2D6*10基因多态性检测的效率，同时，由于包括高效液相色谱仪和质谱仪的检测仪器检测的重现性高，因此可以使得基因多态性的检测结果可重现性高，并且使得检测的自动化程度高，降低CYP2D6*10基因多态性检测的难度。
综上可见，通过能够特异性扩增包含SNP位点区域的目标基因片段的引物和DNA聚合酶系进行PCR扩增，PCR结束后加入碱性磷酸酶消化处理，去除反应液中的dNTP。之后，在反应液中加入SNP位点特异的延伸引物及ddNTP等相关组分并进行单碱基延伸反应，反应过程中，SNP位点特异的延伸引物能够与待测的SNP位点的5’端进行特异结合并根据碱基互补配对原则延伸出与目标SNP基因型互补的碱基，根据不同的基因型的DNA模板可得到不用的单碱基延伸产物。由于不同碱基的分子量不同，因此根据单碱基延伸产物的分子量能够确定所分析SNP位点的基因型。
需要说明的是，下述所用的待测样本基因组DNA，均是在患者或患者的监护人知情同意的情况下收集的。
下面通过几个具体的实施例对本发明作进一步的说明：
在实施例1中，基因多态性的检测方法可包括：
步骤C1：预先合成CYP2D6基因的c.100C>T位点、c.1661G>C位点和c.4180G>C位点的特异性扩增引物和单碱基延伸引物。
步骤C2：从待测样本中提取出待测样本基因组DNA，并将该待测样本基因组DNA作为DNA模板，其中，DNA模板的浓度为50ng/μl。
步骤C3：配置由蒸馏水0.9μl，25mmol的MgCl20.4μl，20mmol的脱氧核糖核苷三磷酸混合物0.1μl，c.100C>T位点、c.1661G>C位点和c.4180G>C位点的特异性扩增引物的混合物1μl，TaqDNA聚合酶0.1μl，TaqDNA聚合酶对应的10*PCR buffer 0.5μl，以及DNA模板2μl组成的PCR扩增体系，其中，该PCR扩增体系中的c.100C>T位点、c.1661G>C位点和c.4180G>C位点的每种特异性扩增引物的浓度均为1μmol，TaqDNA聚合酶的浓度为1.25U/μl，DNA模板的量为100ng。
其中，待测样本基因组DNA为，利用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)提取从待测样本的新鲜外周血样本中中提取获得，并采用NP80-touch测定浓度位于5～1000ng/μl范围区间内，且待测样本基因组DNA的OD260/OD280比值位于1.6～2.2范围区间内。
步骤C4：利用PCR仪对PCR扩增体系95℃预热2min，顺次在95℃下变性30s，顺次在56℃下退火30s，顺次在72℃下延伸1min，再将95℃变性30s、56℃退火30s和72℃延伸1min循环45次，顺次在72℃下终延伸5min，获得包含c.100C>T、c.1661G>C、c.4180G>C位点的目的片段的第一反应体系，最后在4℃下保存第一反应体系。
步骤C5：向第一反应体系中加入1U的大肠杆菌碱性磷酸酶和对应的碱性磷酸缓冲液，利用PCR仪在37℃下消化处理30min，顺次在75℃下加热变性10min，去除体系内多余的dNTP，获得消化处理后的第二反应体系，并在4℃下，保存第二反应体系。
步骤C6：配置由蒸馏水0.619μl，20mmol的双脱氧核苷三磷混合物0.2μl，c.100C>T位点、c.1661G>C位点和c.4180G>C位点位点的单碱基延伸引物的混合物0.94μl，T7DNA聚合酶0.041μl，以及对应的10*PCR buffer 0.2μl组成的单碱基延伸反应体系，其中，该单碱基延伸反应体系中的c.100C>T位点、c.1661G>C位点和c.4180G>C位点的单碱基延伸引物的浓度均为10μmol，T7DNA聚合酶的浓度为1.25U/μl。
步骤C7：将步骤C6获得的单碱基延伸反应体系加入到步骤C5获得的第二反应体系中，利用PCR仪在94℃下预热30s，顺次在94℃下变性5s，顺次在56℃下退火30s，顺次在80℃下延伸5s，顺次将56℃下退火30s和80℃延伸5s循环5次，顺次将94℃下变性5s与(56℃下退火30s和80℃下延伸5s循环5次)循环40次，最后在72℃下终延伸5min，获得包括c.100C>T位点、c.1661G>C位点和c.4180G>C位点的单碱基延伸产物的第三反应体系，并在4℃下，保存获得的第三反应体系。
步骤C8：将第三反应体系加入25mg的树脂，再加入50μl的蒸馏水，并将加入树脂后和蒸馏水的第三反应体系混匀，并在混匀后的体系中取上清液作为纯化产物。
步骤C9：利用包括有高效液相色谱仪和质谱仪的检测仪器，通过预设的检测条件对纯化产物进行测试，确定待测样本中的CYP2D6基因多态性。
其中，步骤C9中的质谱仪的检测条件为喷雾电压为3800V，鞘气为32Arb，辅气为30Arb，离子传输管温度为320℃，离子源雾化温度为350℃，离子源温度为350℃，分辨率为70000。
其中，步骤C9中的高效液相色谱仪的检测条件为C18反相色谱柱，C18反相色谱柱的柱温为：55℃，纯化产物的进样量为：22.5μl，其中，所述C18反相色谱柱的色谱柱型号为：Acquity UPLC Oligo BEH C18，柱内径为：1.7μm，柱长为：2.1x 50mm；
高效液相色谱仪的流动相为：A相：蒸馏水，B相：甲醇；
色谱梯度为：0-1min，5％-20％B；1-4.5min，20％-55％B；4.5-5.5min，55％-95％B；5.5-7min，95％-5％B；7-10min，5％B。
在实施例2中，基因多态性的检测方法可包括：
步骤D1：预先合成CYP2D6基因的C.100C>T位点、C.1661G>C位点和C.4180G>C位点的特异性扩增引物和单碱基延伸引物。
步骤D2：从待测样本中提取出待测样本基因组DNA，并将该待测样本基因组DNA作为DNA模板，其中，DNA模板的浓度为5ng/μl。
步骤D3：配置由蒸馏水0.8μl，25mmol的MgCl20.3μl，20mmol的脱氧核糖核苷三磷酸混合物0.1μl，C.100C>T位点、C.1661G>C位点和C.4180G>C位点的特异性扩增引物的混合物0.9μl，TaqDNA聚合酶0.1μl，TaqDNA聚合酶对应的10*PCR buffer 0.4μl，以及DNA模板1.9μl组成的PCR扩增体系，其中，该PCR扩增体系中的C.100C>T位点、C.1661G>C位点和C.4180G>C位点的每种特异性扩增引物的浓度均为0.1μmol，TaqDNA聚合酶的浓度为0.5U/μl，DNA模板的量为9.5ng。
其中，待测样本基因组DNA为，利用天根口腔拭子基因组DNA提取试剂盒(DP322)从待测样本的口腔脱落细胞中提取出的，并采用NP80-touch测定浓度位于5～1000ng/μl范围区间内，且待测样本基因组DNA的OD260/OD280比值位于1.6～2.2范围区间内。
步骤D4：利用PCR仪对PCR扩增体系90℃预热0.5min，顺次在90℃下变性0.17min，顺次在50℃下退火0.17min，顺次在68℃下延伸0.5min，再将90℃变性0.17min、50℃下退火0.17min和68℃下延伸0.5min循环25次，获得包含C.100C>T位点、C.1661G>C位点和C.4180G>C位点的目的片段的第一反应体系，最后在4℃下保存第一反应体系。
步骤D5：向第一反应体系中加入0.5U的大肠杆菌碱性磷酸酶和对应的碱性磷酸缓冲液，再利用PCR仪进行30℃消化处理10min，顺次在70℃下加热变性5min，去除体系内多余的dNTP，获得消化处理后的第二反应体系，最后在4℃下，保存第二反应体系。
步骤D6：配置由蒸馏水0.5μl，20mmol的双脱氧核苷三磷混合物0.1μl，C.100C>T位点、C.1661G>C位点和C.4180G>C位点的单碱基延伸引物的混合物0.8μl，T7DNA聚合酶0.03μl，以及T7DNA聚合酶对应的10*PCR buffer0.1μl组成的单碱基延伸反应体系，其中，该单碱基延伸反应体系中的C.100C>T位点、C.1661G>C位点和C.4180G>C位点的单碱基延伸引物的浓度均为1μmol，T7DNA聚合酶的浓度为0.5U/μl。
步骤D7：将单碱基延伸反应体系加入到第二反应体系中，利用PCR仪在90℃下预热30s，顺次在90℃下变性5s，顺次在50℃下退火5s，顺次在65℃下延伸5s，顺次将50℃下退火5s和65℃下延伸5s循环5次，顺次将90℃下变性5s与(50℃下退火5s和65℃下延伸5s循环5次)循环40次，获得延伸反应后的第三反应体系，最后在4℃下，保存获得的第三反应体系。
步骤D8：将第三反应体系加入15mg的树脂，再加入40μl的蒸馏水，并将加入树脂后和蒸馏水的第三反应体系混匀，并在混匀后的体系中取上清液作为纯化产物。
步骤D9：利用包括有高效液相色谱仪和质谱仪的检测仪器，通过预设的检测条件对纯化产物进行测试，确定待测样本中的CYP2D6基因多态性。
其中，步骤D9中的质谱仪的检测条件为喷雾电压为3500V，鞘气为25Arb，辅气为30Arb，离子传输管温度为260℃，离子源雾化温度为300℃，离子源温度为300℃，分辨率为3000。
其中，步骤D9中的高效液相色谱仪的检测条件为C18反相色谱柱，C18反相色谱柱的柱温为：40℃，纯化产物的进样量为：5μl，其中，所述C18反相色谱柱的色谱柱型号为：Acquity UPLC Oligo BEH C18，柱内径为：1.7μm，柱长为：2.1x 50mm。
高效液相色谱仪的流动相为：A相：蒸馏水，B相：甲醇；
色谱梯度为：0-1min，5％-20％B；1-4.5min，20％-55％B；4.5-5.5min，55％-95％B；5.5-7min，95％-5％B；7-10min，5％B。
在实施例3中，基因多态性的检测方法可包括：
步骤E1：预先合成CYP2D6基因的C.100C>T位点、C.1661G>C位点和C.4180G>C位点的特异性扩增引物和单碱基延伸引物。
步骤E2：从待测样本中提取出待测样本基因组DNA，并将该待测样本基因组DNA作为DNA模板，其中，DNA模板的浓度为119ng/μl。
步骤E3：配置由蒸馏水1μl，25mmol的MgCl20.5μl，20mmol的脱氧核糖核苷三磷酸混合物0.2μl，C.100C>T位点、C.1661G>C位点和C.4180G>C位点的特异性扩增引物的混合物1.1μl，大肠杆菌DNA聚合酶0.1μl，大肠杆菌DNA聚合酶对应的10*PCR buffer 0.6μl，以及DNA模板2.1μl组成的PCR扩增体系，其中，该PCR扩增体系中的C.100C>T位点、C.1661G>C位点和C.4180G>C位点的每种特异性扩增引物的浓度均为2μmol，大肠杆菌DNA聚合酶的浓度为2U/μl，DNA模板的量为250ng。
其中，待测样本基因组DNA为，利用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)从待测样本的组织样本中提取获得，并采用NP80-touch测定浓度位于5～1000ng/μl范围区间内，且OD260/OD280比值位于1.6～2.2范围区间内的基因组DNA。
步骤E4：利用PCR仪对PCR扩增体系98℃预热10min，顺次在95℃下变性1min，顺次在60℃下退火1min，顺次在72℃下延伸10min，再将95℃变性1min、60℃退火1min和72℃延伸10min循环45次，顺次在72℃下终延伸5min，获得包含C.100C>T位点、C.1661G>C位点和C.4180G>C位点的目的片段的第一反应体系，最后在4℃下保存第一反应体系。
步骤E5：向第一反应体系中加入2U的大肠杆菌碱性磷酸酶和对应的碱性磷酸缓冲液，再利用PCR仪进行40℃消化处理60min，顺次在75℃下加热变性30min，去除体系内多余的dNTP，获得消化处理后的第二反应体系，最后在4℃下，保存第二反应体系。
步骤E6：配置由蒸馏水0.7μl，20mmol的双脱氧核苷三磷混合物0.1μl，C.100C>T位点、C.1661G>C位点和C.4180G>C位点的单碱基延伸引物的混合物1.1μl，T7DNA聚合酶0.05μl，以及T7DNA聚合酶对应的10*PCR buffer0.3μl组成的单碱基延伸反应体系，其中，该单碱基延伸反应体系中的C.100C>T位点、C.1661G>C位点和C.4180G>C位点的单碱基延伸引物的浓度均为20μmol，T7DNA聚合酶的浓度为2U/μl。
步骤E7：将单碱基延伸反应体系加入到第二反应体系中，利用PCR仪在98℃下预热10min，顺次在98℃下变性5s，顺次在58℃下退火30s，顺次在80℃下延伸5s，顺次将58℃下退火30s和80℃延伸5s循环5次，顺次将98℃下变性5s与(58℃下退火30s和80℃下延伸5s循环5次)循环40次，最后在75℃下终延伸10min，获得延伸反应后的第三反应体系，在8℃下，保存第三反应体系。
步骤E8：将第三反应体系加入40mg的树脂，再加入70μl的蒸馏水，并将加入树脂后和蒸馏水的第三反应体系混匀，并在混匀后的体系中取上清液作为纯化产物。
步骤E9：利用包括有高效液相色谱仪和质谱仪的检测仪器，通过预设的检测条件对纯化产物进行测试，确定待测样本的CYP2D6基因多态性。
其中，步骤E9中的质谱仪的检测条件为喷雾电压为4000V，鞘气为50Arb，辅气为50Arb，离子传输管温度为400℃，离子源雾化温度为400℃，离子源温度为400℃，分辨率为140000；
其中，步骤E9中的高效液相色谱仪的检测条件为C18反相色谱柱，C18反相色谱柱的柱温为：70℃，纯化产物的进样量为：50μl，其中，其中，所述C18反相色谱柱的色谱柱型号为：Acquity UPLC Oligo BEH C18，柱内径为：1.7μm，柱长为：2.1x 50mm；
高效液相色谱仪的流动相为：A相：蒸馏水，B相：甲醇；
色谱梯度为：0-1min，5％-20％B；1-4.5min，20％-55％B；4.5-5.5min，55％-95％B；5.5-7min，95％-5％B；7-10min，5％B。
本发明各个实施例至少具有如下有益效果：
1、在本发明一实施例中，将从待测样本提取出的待测样本基因组DNA，加入到包括有CYP2D6基因的c.100C>T位点、c.1661G>C位点和c.4180G>C位点的特异性扩增引物的PCR扩增体系中，即可利用PCR仪对该体系进行扩增反应，扩增出包含CYP2D6基因的c.100C>T位点、c.1661G>C位点和c.4180G>C位点的目的片段的第一反应体系，再顺次进行消化处理，可以获得消化处理后的第二反应体系，顺次利用配置好的单碱基延伸反应体系进行延伸反应，可以获得延伸反应后的第三反应体系，顺次进行脱盐纯化处理，即可获得纯化后的纯化产物，利用包括有质谱仪的检测仪器对纯化产物进行检测，即可确定待测样本的CYP2D6*10的基因多态性，由于包括有质谱仪的检测仪器检测CYP2D6*10基因多态性的周期短，因此可以实现提高CYP2D6*10基因多态性的检测效率的目的。
2、在本发明一实施例中，根据c.100C>T；c.1661G>C；c.4180G>C位点各自的单碱基延伸产物的理论分子量，若在液质联用仪对纯化产物进行测试获得的谱图中出现相应的分子量(质荷比)的质谱峰，则可以确定待测样本中存在对应的基因型。由于包括高效液相色谱仪和质谱仪的检测仪器来检测基因多态性的周期短，因此可以缩短CYP2D6*10基因多态性的检测时间，提高CYP2D6*10基因多态性检测的效率。并且通过色谱、质谱方式进行基因多态性的检测，还可以特异、简单、高通量的对目标基因的SNP位点进行分型，进一步提高CYP2D6*10基因多态性检测的效率，同时，由于包括高效液相色谱仪和质谱仪的检测仪器检测的重现性高，因此可以使得基因多态性的检测结果可重现性高，并且使得检测的自动化程度高，降低CYP2D6*10基因多态性检测的难度。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个······”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同因素。
最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种基因多态性的检测方法，其特征在于，包括：
预先合成CYP2D6基因的c.100C>T位点、c.1661G>C位点和c.4180G>C位点的特异性扩增引物和单碱基延伸引物，其中，所述C.100C>T位点的特异性扩增引物中的正向引物如SEQID NO.1所示，反向引物如SEQ ID NO.2所示；所述C.1661G>C位点的特异性扩增引物中的正向引物如SEQ ID NO.3所示，反向引物如SEQ ID NO4所示；所述C.4180G>C位点的特异性扩增引物中的正向引物如SEQ ID NO.5所示，反向引物如SEQ ID NO.6所示；所述C.100C>T位点的单碱基延伸引物如SEQ ID NO.7所示，所述C.1661G>C位点的单碱基延伸引物如SEQ IDNO.8所示和所述C.4180G>C位点的单碱基延伸引物如SEQ ID NO.9所示；
从待测样本中提取出待测样本基因组DNA，并将所述待测样本基因组DNA作为DNA模板；
配置包含所述特异性扩增引物和所述DNA模板的聚合酶链式反应PCR扩增体系；
利用PCR仪对所述PCR扩增体系进行扩增反应，获得第一反应体系；
对所述第一反应体系进行消化处理，获得第二反应体系；
配置包含所述单碱基延伸引物的单碱基延伸反应体系；
向所述第二反应体系中加入所述单碱基延伸反应体系，并对加入所述单碱基延伸反应体系的所述第二反应体系进行延伸反应，获得第三反应体系；
对所述第三反应体系进行脱盐纯化处理，获得纯化产物；
利用包括有质谱仪的检测仪器检测所述纯化产物，确定所述待测样本的CYP2D6*10的基因多态性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述利用PCR仪对所述PCR扩增体系进行扩增反应，获得第一反应体系，包括：
利用PCR仪执行：
步骤A1：在90～98℃下，对所述PCR扩增体系预热0.5～10min；
步骤A2：在90～95℃下，对预热后的所述PCR扩增体系进行变性反应0.17～1min；
步骤A3：在50～60℃下，对变性反应后的所述PCR扩增体系进行退火反应0.17～1min；
步骤A4：在68～72℃下，对退火反应后的所述PCR扩增体系进行延伸反应0.5～10min；
步骤A5：将步骤A2、步骤A3和步骤A4循环25～45次，对延伸反应后的所述PCR扩增体系进行循环反应；
步骤A6：在68～72℃下，对循环反应后的所述PCR扩增体系进行终延伸反应0～10min，获得第一反应体系，并在2～8℃下，保存所述第一反应体系。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述对所述第一反应体系进行消化处理，获得第二反应体系，包括：
向所述第一反应体系中加入0.5～2U的碱性磷酸酶和对应的碱性磷酸酶缓冲液；
利用所述PCR仪，在30～40℃下，对加入所述碱性磷酸酶和所述碱性磷酸酶缓冲液的所述第一反应体系进行消化处理10～60min，并在70～85℃下，对消化处理后的所述第一反应体系进行加热变性处理5～30min，获得第二反应体系，最后在2～8℃下，保存所述第二反应体系。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，
所述碱性磷酸酶，包括：虾碱性磷酸酶、小牛肠碱性磷酸酶、大肠杆菌碱性磷酸酶和大鼠碱性磷酸酶中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述对加入所述单碱基延伸反应体系的所述第二反应体系进行延伸反应，获得第三反应体系，包括：
利用所述PCR仪执行：
步骤B1：在90～98℃下，对加入所述单碱基延伸反应体系的所述第二反应体系预热0.5～10min；
步骤B2：在90～98℃下，对预热后的所述第二反应体系进行变性反应5s；
步骤B3：在50～58℃下，对变性反应后的所述第二反应体系进行退火反应5～30s；
步骤B4：在65～82℃下，对退火反应后的所述第二反应体系进行延伸反应5～30s；
步骤B5：将步骤B3至步骤B4循环5次，对所述延伸反应后的所述第二反应体系进行退火、延伸循环反应；
步骤B6：将步骤B2至步骤B5循环40次，对变性、退火循环反应后的所述第二反应体系进行扩增循环反应；
步骤B7：在68～75℃下，对扩增循环反应后的所述第二反应体系进行终延伸反应0～10min，获得第三反应体系，并在2～8℃下，保存所述第三反应体系。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述PCR扩增体系，包括：
蒸馏水8～10份，10*PCR buffer 4～6份，25mmol的MgCl2 3～5份，20mmol的脱氧核糖核苷三磷酸混合物1～2份，所述c.100C>T位点、所述c.1661G>C位点和所述c.4180G>C位点的特异性扩增引物的混合物9～11份，DNA聚合酶1～2份和DNA模板19～21份，其中，各组分按体积比计，9～11份的特异性扩增引物的混合物中的所述c.100C>T位点、所述c.1661G>C位点和所述c.4180G>C位点的特异性扩增引物的浓度均为0.1～2μmol，1～2份的所述DNA聚合酶的浓度为0.5～2U/μl，19～21份的所述DNA模板的量为5～500ng；
和/或，
所述单碱基延伸反应体系，包括：
蒸馏水5～7份，10*PCR buffer 1～3份，20mmol的双脱氧核苷三磷酸混合物1～3份，所述c.100C>T位点、所述c.1661G>C位点和所述c.4180G>C位点的单碱基延伸引物的混合物8～11份，以及DNA聚合酶0.3～0.5份，其中，各组分按体积比计，0.3～0.5份的所述DNA聚合酶的浓度为0.5～2U/μl，8～11份的单碱基延伸引物的混合物中的所述c.100C>T位点、所述c.1661G>C位点和所述c.4180G>C位点的单碱基延伸引物的浓度均为1～20μmol。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述对所述第三反应体系进行脱盐纯化处理，获得纯化产物，包括：
向所述第三反应体系中加入树脂，再加入蒸馏水，并将加入所述树脂和所述蒸馏水的所述第三反应体系混匀，将混匀后的所述第三反应体系的上清液作为纯化产物。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述对所述第三反应体系进行脱盐纯化处理，获得纯化产物，包括：
通过柱层析或者滤膜滤除所述第三反应体系中的盐，获得纯化产物。
9.根据权利要求1至8中任一所述的方法，其特征在于，
所述利用包括有质谱仪的检测仪器检测所述纯化产物，确定所述待测样本的CYP2D6*10的基因多态性，包括：
利用包括有质谱仪的检测仪器，通过预设的检测条件对所述纯化产物进行测试，获得谱图；
对于所述纯化产物中CYP2D6*10的c.100C>T位点，当所述谱图中只存在分子量为6362±3Da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的CYP2D6*10的基因型为c.100C>T-CC型；当所述谱图中只存在分子量为6442±3Da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的CYP2D6*10的基因型为c.100C>T-TT型；当所述谱图中同时存在分子量为6362±3Da和6442±3Da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的CYP2D6*10的基因型为c.100C>T-CT型；
对于所述纯化产物中CYP2D6*10的c.1661G>C位点，当所述谱图中只存在分子量为7382±3Da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的CYP2D6*10的基因型为c.1661G>C-GG型；当所述谱图中只存在分子量为7422±3Da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的CYP2D6*10的基因型为c.1661G>C-CC型；当所述谱图中同时存在分子量为7382±3Da和7422±3Da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的CYP2D6*10的基因型为c.1661G>C-GC型；
对于所述纯化产物中CYP2D6*10的c.4180G>C位点，当所述谱图中只存在分子量为7655±3Da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的CYP2D6*10的基因型为c.4180G>C-GG型；当所述谱图中只存在分子量为7615±3Da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的CYP2D6*10的基因型为c.4180G>C-CC型；当所述谱图中同时存在分子量为7655±3Da和7615±3Da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的CYP2D6*10的基因型为c.4180G>C-GC型；
其中，所述检测条件，包括：所述质谱仪的喷雾电压为3500～4000V，鞘气为25～50Arb，辅气为10～50Arb，离子传输管温度为260～400℃，离子源雾化温度为300～400℃，离子源温度为300～400℃，分辨率为3000～140000。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，
所述检测仪器，进一步包括：高效液相色谱仪；
所述检测条件，进一步包括：C18反相色谱柱，所述C18反相色谱柱的柱温为：40～70℃，所述纯化产物的进样量为：5～50μl；
所述高效液相色谱仪的流动相为：A相：蒸馏水，B相：甲醇；
其中，色谱梯度为：0-1min，5％-20％B；1-4.5min，20％-55％B；4.5-5.5min，55％-95％B；5.5-7min，95％-5％B；7-10min，5％B。
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