CN110157779A - 一种cyp2d6基因分型的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种CYP2D6基因分型的检测方法，包括：配置包含SEQ ID NO.1～14所示的特异性扩增引物的第一聚合酶链式反应PCR扩增体系，以及包含SEQ ID NO.15～28所示的特异性扩增引物的第二PCR扩增体系，顺次进行扩增反应，再进行消化处理。获得第一消化反应体系和第二消化反应体系；配置包含SEQ ID NO.29～49所示的单碱基延伸引物的第一单碱基延伸反应体系，以及包含SEQ ID NO.50～69所示的单碱基延伸引物第二单碱基延伸反应体系；对加入第一单碱基延伸反应体系的第一消化反应体系和加入第二单碱基延伸反应体系的第二消化反应体系进行延伸反应，再进行纯化处理，顺次利用包括有质谱仪的检测仪器进行检测，确定待测样本CYP2D6基因的SNP位点的基因型。本方案能够提高CYP2D6基因分型的检测效率。

Description

一种CYP2D6基因分型的检测方法

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，特别涉及一种CYP2D6基因分型的检测方法。

背景技术

细胞色素P450(CYP450)是一类由亚铁血红素-硫醇盐蛋白组成的基因家族，可参与生物体内的甾醇类激素合成以及内源性物质和外源性物质的代谢。CYP2D6基因是CYP450家族中的成员之一，在遗传药理学上具有重要意义。

目前，通常二代测序法来检测CYP2D6*2、*3、*4、*5、*6、*7、*8、*9、*10、*11、*12、*13、*14、*15、*16、*17、*19、*20、*21、*29、*33、*35、*36、*38、*40、*41、*42的基因型。但是，二代测序法的检测周期长、成本高，从而导致CYP2D6基因分型的检测效率低。

发明内容

本发明实施例提供了一种CYP2D6基因分型的检测方法，能够提高CYP2D6基因分型的检测效率。

本发明实施例提供了一种CYP2D6基因分型的检测方法，包括：

预先合成CYP2D6基因的SNP位点的特异性扩增引物和单碱基延伸引物，其中，所述特异性扩增引物序列如SEQ ID NO.1～28所示，所述单碱基延伸引物序列如SEQ ID NO.29～69所示；

从待测样本中提取出待测样本基因组DNA，并将所述待测样本基因组DNA作为DNA模板；

配置包含SEQ ID NO.1～14所示的特异性扩增引物和所述DNA模板的第一聚合酶链式反应PCR扩增体系，以及包含SEQ ID NO.15～28所示的特异性扩增引物和所述DNA模板的第二PCR扩增体系；

利用PCR仪对所述第一PCR扩增体系和所述第二PCR扩增体系进行扩增反应，获得分别对应的第一扩增反应体系和第二扩增反应体系；

对所述第一扩增反应体系和所述第二扩增反应体系进行消化处理，获得分别对应的第一消化反应体系和第二消化反应体系；

配置包含SEQ ID NO.29～49所示的单碱基延伸引物的第一单碱基延伸反应体系，以及包含SEQ ID NO.50～69所示的单碱基延伸引物第二单碱基延伸反应体系；

对加入所述第一单碱基延伸反应体系后的所述第一消化反应体系和加入所述第二单碱基延伸反应体系后的所述第二消化反应体系进行延伸反应，获得分别对应的第一延伸反应体系和第二延伸反应体系；

对所述第一延伸反应体系和所述第二延伸反应体系进行脱盐纯化处理，获得分别对应的第一纯化产物和第二纯化产物；

利用包括有质谱仪的检测仪器，通过预设的检测条件检测所述第一纯化产物和所述第二纯化产物，确定所述待测样本CYP2D6基因的SNP位点的基因型。

优选地，

所述第一PCR扩增体系，包括：

蒸馏水8～10份，10*PCR buffer 4～6份，25mmol的MgSO₄或MgCl₂ 3～5份，20mmol的脱氧核糖核苷三磷酸混合物1～2份，SEQ ID NO.1～14所示的特异性扩增引物的混合物8～12份，DNA聚合酶1～2份和DNA模板19～21份，其中，各组分按体积比计，8～12份的SEQ IDNO.1～14所示的特异性扩增引物的混合物中的每条特异性扩增引物的浓度均为0.1～2μmol，1～2份的所述DNA聚合酶的浓度为0.5～3U/μl，19～21份的所述DNA模板的量为5～500ng；

所述第二PCR扩增体系，包括：

蒸馏水8～10份，10*PCR buffer 4～6份，25mmol的MgSO₄或MgCl₂ 3～5份，20mmol的脱氧核糖核苷三磷酸混合物1～2份，SEQ ID NO.15～28所示的特异性扩增引物的混合物8～12份，DNA聚合酶1～2份和DNA模板19～21份，其中，各组分按体积比计，8～12份的SEQID NO.15～28所示的特异性扩增引物的混合物中的所述每条扩增引物(SEQ ID NO15～28)的浓度均为0.1～2μmol，1～2份的所述DNA聚合酶的浓度为0.5～3U/μl，19～21份的所述DNA模板的量为5～500ng。

优选地，

所述第一单碱基延伸反应体系，包括：

蒸馏水5～7份，10*PCR buffer 1～3份，20mmol的双脱氧核苷三磷酸混合物1～3份，SEQ ID NO.29～49所示的单碱基延伸引物的混合物8～12份，以及DNA聚合酶0.3～0.5份，其中，各组分按体积比计，0.3～0.5份的所述DNA聚合酶的浓度为0.5～2U/μl，8～12份SEQ ID NO.29～49所示的单碱基延伸引物的混合物中的每条单碱基延伸引物的浓度均为1～20μmol；

所述第二单碱基延伸反应体系，包括：

蒸馏水5～7份，10*PCR buffer 1～3份，20mmol的双脱氧核苷三磷酸混合物1～3份，SEQ ID NO.50～69所示的单碱基延伸引物的混合物8～12份，以及DNA聚合酶0.3～0.5份，其中，各组分按体积比计，0.3～0.5份的所述DNA聚合酶的浓度为0.5～2U/μl，8～12份SEQ ID NO.50～69所示的单碱基延伸引物的混合物中的每条单碱基延伸引物的浓度均为1～20μmol。

优选地，

所述利用PCR仪对所述第一PCR扩增体系和所述第二PCR扩增体系进行扩增反应，获得分别对应的第一扩增反应体系和第二扩增反应体系，包括：

利用PCR仪执行：

步骤A1：在90～98℃下，分别对所述第一PCR扩增体系和所述第二PCR扩增体系预热0.5～10min；

步骤A2：在90～98℃下，分别对预热后的所述第一PCR扩增体系和所述第二PCR扩增体系进行变性反应0.17～1min；

步骤A3：在45～60℃下，分别对变性反应后的所述第一PCR扩增体系和所述第二PCR扩增体系进行退火反应0.17～1min；

步骤A4：在60～72℃下，分别对退火反应后的所述PCR扩增体系进行延伸反应0.1～10min；

步骤A5：将步骤A2、步骤A3和步骤A4循环25～45次，分别对延伸反应后的所述第一PCR扩增体系和所述第二PCR扩增体系分别进行循环反应；

步骤A6：在60～72℃下，分别对循环反应后的所述第一PCR扩增体系和所述第二PCR扩增体系进行终延伸反应0～10min，获得所述第一PCR扩增体系扩增反应后的第一扩增反应体系和所述第二PCR扩增体系扩增反应后的第二扩增反应体系，并在2～10℃下，保存所述第一扩增反应体系和所述第二扩增反应体系。

优选地，

所述对所述第一扩增反应体系和所述第二扩增反应体系进行消化处理，获得所述第一扩增反应体系消化处理后的第一消化反应体系和所述第二扩增反应体系消化处理后的第二消化反应体系，包括：

分别向所述第一扩增反应体系和所述第二扩增反应体系中加入0.5～2U的碱性磷酸酶和对应的碱性磷酸酶缓冲液；

利用所述PCR仪，在25～40℃下，分别对加入所述碱性磷酸酶和所述碱性磷酸酶缓冲液的所述第一扩增反应体系和所述第二扩增反应体系进行消化处理10～60min，并在70～85℃下，分别对消化处理后的所述第一扩增反应体系和所述第二扩增反应体系进行加热变性处理5～30min，获得所述第一扩增反应体系消化处理后的第一消化反应体系和所述第二扩增反应体系消化处理后的第二消化反应体系，并在2～8℃下，保存所述第一消化反应体系和所述第二消化反应体系。

优选地，

所述碱性磷酸酶，包括：虾碱性磷酸酶、小牛肠碱性磷酸酶、大肠杆菌碱性磷酸酶、大鼠碱性磷酸酶和热敏性碱性磷酸酶中的任意一种。

优选地，

所述对加入所述第一单碱基延伸反应体系后的所述第一消化反应体系和加入所述第二单碱基延伸反应体系后的所述第二消化反应体系进行延伸反应，获得分别对应的第一延伸反应体系和第二延伸反应体系，包括：

利用所述PCR仪执行：

步骤B1：在90～98℃下，分别对加入所述第一单碱基延伸反应体系后的所述第一消化反应体系和加入所述第二单碱基延伸反应体系后的所述第二消化反应体系预热0.1～10min；

步骤B2：在90～98℃下，分别对预热后的所述第一消化反应体系和所述第二消化反应体系进行变性反应5～10s；

步骤B3：在48～58℃下，分别对变性反应后的所述第一消化反应体系和所述第二消化反应体系进行退火反应5～30s；

步骤B4：在65～82℃下，分别对退火反应后的所述第一消化反应体系和所述第二消化反应体系进行延伸反应5～30s；

步骤B5：将步骤B3至步骤B4循环5次，分别对延伸反应后的所述第一消化反应体系和所述第二消化反应体系进行退火、延伸循环反应；

步骤B6：将步骤B2至步骤B5循环35-45次，分别对退火、延伸循环反应后的所述第一消化反应体系和所述第二消化反应体系进行扩增循环反应；

步骤B7：在68～75℃下，分别对扩增循环反应后的所述第一消化反应体系和所述第二消化反应体系进行终延伸反应0～10min，获得所述第一消化反应体系延伸反应后的第一延伸反应体系和所述第一消化反应体系延伸反应后的第二延伸反应体系，并在2～8℃下，保存所述第一延伸反应体系和所述第二延伸反应体系。

优选地，

所述对所述第一延伸反应体系和所述第二延伸反应体系进行脱盐纯化处理，获得分别对应的第一纯化产物和第二纯化产物，包括：

分别向所述第一延伸反应体系和所述第二延伸反应体系中加入树脂，再分别加入蒸馏水，并分别将加入所述树脂和所述蒸馏水的所述第一延伸反应体系和所述第二延伸反应体系混匀，将混匀后的所述第一延伸反应体系的上清液作为第一纯化产物，将混匀后的所述第二延伸反应体系的上清液作为第二纯化产物。

优选地，

所述对所述第一延伸反应体系和所述第二延伸反应体系进行脱盐纯化处理，获得分别对应的第一纯化产物和第二纯化产物，包括：

通过层析、超滤和分子筛中的任意一种或多种方式，分别去除所述第一延伸反应体系和所述第二延伸反应体系中的盐离子，获得所述第一延伸反应体系纯化后的第一纯化产物和所述第二延伸反应体系纯化后的第二纯化产物。

优选地，

所述检测仪器的检测条件，包括：所述质谱仪的喷雾电压为3500～4500V，鞘气为20～50Arb，辅气为10～50Arb，离子传输管温度为260～400℃，离子源雾化温度为300～400℃，离子源温度为300～400℃，分辨率为3000～140000。

优选地，

所述检测仪器，进一步包括：高效液相色谱仪；

所述检测条件，进一步包括：C18反相色谱柱，所述C18反相色谱柱的柱温为：40～70℃，所述纯化产物的进样量为：5～100μl；

所述高效液相色谱仪的流动相为：A相：蒸馏水，B相：甲醇；

其中，色谱梯度为：0-2min，5％-20％B；2-5min，20％-55％B；5-7min，55％-95％B；7-8.5min，95％-5％B；8.5-10min，5％B。

在本发明实施例中，为了避免不同的特异性扩增引物在PCR扩增反应中发生交叉反应，可以将CYP2D6基因的SNP位点的特异性扩增引物中分为SEQ ID NO.1～14所示的特异性扩增引物和SEQ ID NO.15～28所示的特异性扩增引物，将从待测样本中提取出的待测样本基因组DNA，加入到包含有SEQ ID NO.1～14所示的特异性扩增引物的第一PCR扩增体系，并将待测样本基因组DNA加入到SEQ ID NO.15～28所示的特异性扩增引物第二PCR扩增体系中，进行扩增反应，以扩增出含有对应的CYP2D6基因的SNP位点的目的片段的第一扩增反应体系和第二扩增反应体系，再顺次进行消化处理，可以去除第一扩增反应体系和第二扩增反应体系内多余的dNTP，顺次向第一扩增反应体系加入SEQ ID NO.29～49所示的单碱基延伸引物，向第二扩增反应体系内加入SEQ ID NO.50～69所示的单碱基延伸引物，并进行延伸反应，可以获得包含有对应的单碱基延伸产物的第一延伸反应体系和第二延伸反应体系，再分别进行脱盐纯化处理，去除第一延伸反应体系和第二延伸反应体系中的盐离子，即可获得对应的第一纯化产物和第二纯化产物，最后利用包括有质谱仪的检测仪器检测第一纯化产物和第二纯化产物的分子量，即可确定待测样本CYP2D6基因的SNP位点的基因型，由于包括有质谱仪的检测仪器检测SNP位点的基因型的周期短，因此可以能够实现提高CYP2D6基因分型的检测效率的目的。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明一实施例提供的一种CYP2D6基因分型的检测方法的流程图；

图2是本发明一实施例提供的CYP2D6基因的-1770G>A位点为-1770G>A-G基因型的LC-MS谱图；

图3是本发明一实施例提供的CYP2D6基因的-1770G>A位点为-1770G>A-A基因型的LC-MS谱图；

图4是本发明一实施例提供的CYP2D6基因的-1584C>G位点为-1584C>G-C基因型的LC-MS谱图；

图5是本发明一实施例提供的CYP2D6基因的-1584C>G位点为-1584C>G-G基因型的LC-MS谱图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1所示，本发明实施例提供了一种CYP2D6基因分型的检测方法，其特征在于，包括：

步骤101：预先合成CYP2D6基因的SNP位点的特异性扩增引物和单碱基延伸引物，其中，所述特异性扩增引物序列如SEQ ID NO.1～28所示，所述单碱基延伸引物序列如SEQID NO.29～69所示；

步骤102：从待测样本中提取出待测样本基因组DNA，并将所述待测样本基因组DNA作为DNA模板；

步骤103：配置包含SEQ ID NO.1～14所示的特异性扩增引物和所述DNA模板的第一聚合酶链式反应PCR扩增体系，以及包含SEQ ID NO.15～28所示的特异性扩增引物和所述DNA模板的第二PCR扩增体系；

步骤104：利用PCR仪对所述第一PCR扩增体系和所述第二PCR扩增体系进行扩增反应，获得分别对应的第一扩增反应体系和第二扩增反应体系；

步骤105：对所述第一扩增反应体系和所述第二扩增反应体系进行消化处理，获得分别对应的第一消化反应体系和第二消化反应体系；

步骤106：配置包含SEQ ID NO.29～49所示的单碱基延伸引物的第一单碱基延伸反应体系，以及包含SEQ ID NO.50～69所示的单碱基延伸引物第二单碱基延伸反应体系；

步骤107：对加入所述第一单碱基延伸反应体系后的所述第一消化反应体系和加入所述第二单碱基延伸反应体系后的所述第二消化反应体系进行延伸反应，获得分别对应的第一延伸反应体系和第二延伸反应体系；

步骤108：对所述第一延伸反应体系和所述第二延伸反应体系进行脱盐纯化处理，获得分别对应的第一纯化产物和第二纯化产物；

步骤109：利用包括有质谱仪的检测仪器，通过预设的检测条件检测所述第一纯化产物和所述第二纯化产物，确定所述待测样本CYP2D6基因的SNP位点的基因型。

在本发明实施例中，为了避免不同的特异性扩增引物在PCR扩增反应中发生交叉反应，可以将CYP2D6基因的SNP位点的特异性扩增引物中分为SEQ ID NO.1～14所示的特异性扩增引物和SEQ ID NO.15～28所示的特异性扩增引物，将从待测样本中提取出的待测样本基因组DNA，加入到包含有SEQ ID NO.1～14所示的特异性扩增引物的第一PCR扩增体系，并将待测样本基因组DNA加入到SEQ ID NO.15～28所示的特异性扩增引物第二PCR扩增体系中，进行扩增反应，以扩增出含有对应的CYP2D6基因的SNP位点的目的片段的第一扩增反应体系和第二扩增反应体系，再顺次进行消化处理，可以去除第一扩增反应体系和第二扩增反应体系内多余的dNTP，顺次向第一扩增反应体系加入SEQ ID NO.29～49所示的单碱基延伸引物，向第二扩增反应体系内加入SEQ ID NO.50～69所示的单碱基延伸引物，并进行延伸反应，可以获得包含有对应的单碱基延伸产物的第一延伸反应体系和第二延伸反应体系，再分别进行脱盐纯化处理，去除第一延伸反应体系和第二延伸反应体系中的盐离子，即可获得对应的第一纯化产物和第二纯化产物，最后利用包括有质谱仪的检测仪器检测第一纯化产物和第二纯化产物的分子量，即可确定待测样本CYP2D6基因的SNP位点的基因型，由于包括有质谱仪的检测仪器检测SNP位点的基因型的周期短，因此可以能够实现提高CYP2D6基因分型的检测效率的目的。

需要说明的是，提取待测样本基因组DNA的方式，可以是用口腔拭子收集的口腔脱落细胞，或收集的新鲜外周血/组织样本采用天根口腔拭子基因组DNA提取试剂盒(DP322)，或血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)提取，并采用NP80-touch(德国IMPLEN)测定DNA的浓度及纯度后的待测样本基因组DNA，其中，待测样本基因组DNA的OD260/OD280比值位于1.6～2.2范围区间内，且浓度位于5～1000ng/μl范围区间内，以便提取出的待测样本基因组DNA的质量符合测试要求。

其中，SEQ ID NO.1所示的特异性扩增引物为CYP2D6基因的-1770G>A和-1584C>G位点的正向引物，SEQ ID NO.2所示的特异性扩增引物为其反向引物；

SEQ ID NO.3所示的特异性扩增引物为CYP2D6基因的-1000G>A位点的正向引物，SEQ ID NO.4所示的特异性扩增引物为其反向引物；

SEQ ID NO5所示的特异性扩增引物为CYP2D6基因的c.310G>T位点的正向引物，SEQ ID NO.6所示的特异性扩增引物为其反向引物；

SEQ ID NO7所示的特异性扩增引物为CYP2D6基因的c.1659G>A(rs61736512)位点、c.1661G>C(rs1058164)位点、c.1707delT(rs5030655)位点、c.1758G>T(rs5030865)位点、c.1846G>A(rs3892097)位点、c.1863-1864ins(TTTCGCCCC)2位点、c.1973_1974insG(rs72549354)位点的正向引物，SEQ ID NO.8所示的特异性扩增引物为其反向引物；

SEQ ID NO9所示的特异性扩增引物为CYP2D6基因的c.2483G>A(rs28371717)、c.2539-2542delAACT、c.2549delA(rs35742686)、c.2573insC、c.2587-2590delGACT、c.2615-2617delAAG(rs5030656)位点的正向引物，SEQ ID NO.10所示的特异性扩增引物为其反向引物；

SEQ ID NO11所示的特异性扩增引物为CYP2D6基因的c.3183G>A(rs59421388)、c.3259-3260insGT、c.3384A>C位点的正向引物，SEQ ID NO.12所示的特异性扩增引物为其反向引物；

SEQ ID NO13所示的特异性扩增引物为CYP2D6基因的c.4180G>C(rs1135840)位点的正向引物，SEQ ID NO.14所示的特异性扩增引物为其反向引物；

SEQ ID NO15所示的特异性扩增引物为CYP2D6基因的-1426C>T、-1235A>G位点的正向引物，SEQ ID NO.16所示的特异性扩增引物为其反向引物；

SEQ ID NO17所示的特异性扩增引物为CYP2D6基因的-740C>T、-678G>A位点的正向引物，SEQ ID NO.18所示的特异性扩增引物为其反向引物；

SEQ ID NO19所示的特异性扩增引物为CYP2D6基因的c.31G>A(rs769258)、c.100C>T(rs1065852)、c.124G>A(rs5030862)、c.137_138insT位点的正向引物，SEQ ID NO.20所示的特异性扩增引物为其反向引物；

SEQ ID NO21所示的特异性扩增引物为CYP2D6基因的c.843T>G、c.883G>C(rs5030863)、c.1023C>T(rs28371706)、c.1039C>T位点的正向引物，SEQ ID NO.22所示的特异性扩增引物为其反向引物；

SEQ ID NO23所示的特异性扩增引物为CYP2D6基因的c.2097A>G位点的正向引物，SEQ ID NO.24所示的特异性扩增引物为其反向引物；

SEQ ID NO25所示的特异性扩增引物为CYP2D6基因的c.2850C>T(rs16947)、c.2935A>C(rs5030867)、c.2988G>A(rs28371725)位点的正向引物，SEQ ID NO.26所示的特异性扩增引物为其反向引物；

SEQ ID NO27所示的特异性扩增引物为CYP2D6基因的c.3582A>G、c.3584G>A、c.3790C>T位点的正向引物，SEQ ID NO.28所示的特异性扩增引物为其反向引物；

SEQ ID NO.29为CYP2D6基因的-1770G>A位点的单碱基延伸引物；SEQ ID NO.30为CYP2D6基因的-1584C>G位点；SEQ ID NO.31为CYP2D6基因的-1000G>A位点单碱基延伸引物；SEQ ID NO.32为CYP2D6基因的c.310G>T位点的单碱基延伸引物；SEQ ID NO.33为CYP2D6基因的c.1659G>A(rs61736512)位点的单碱基延伸引物；SEQ ID NO.34为c.1661G>C(rs1058164)位点的单碱基延伸引物SEQ ID NO.35为CYP2D6基因的c.1707delT(rs5030655)位点的单碱基延伸引物；SEQ ID NO.36为CYP2D6基因的c.1758G>T(rs5030865)位点的单碱基延伸引物；SEQ ID NO.37为CYP2D6基因的c.1846G>A(rs3892097)位点的单碱基延伸引物；SEQ ID NO.38为CYP2D6基因的c.1863-1864ins(TTTCGCCCC)2位点的单碱基延伸引物；SEQ ID NO.39为c.1973_1974insG(rs72549354)位点的单碱基延伸引物；SEQ ID NO.40为CYP2D6基因的c.2483G>A(rs28371717)位点的单碱基延伸引物；SEQ ID NO.41为CYP2D6基因的c.2539-2542delAACT位点的单碱基延伸引物；SEQ ID NO.42为CYP2D6基因的c.2549delA(rs35742686)位点的单碱基延伸引物；SEQ IDNO.43为c.2573insC位点的单碱基延伸引物；SEQ ID NO.44为c.2587-2590delGACT位点的单碱基延伸引物；SEQ ID NO.45为c.2615-2617delAAG(rs5030656)位点的单碱基延伸引物；SEQ ID NO.46为c.3183G>A(rs59421388)位点的单碱基延伸引物；SEQ ID NO.47为.3259-3260insGT位点的单碱基延伸引物；SEQ ID NO.48为c.3384A>C位点的单碱基延伸引物；SEQ ID NO.49为c.4180G>C(rs1135840)位点的单碱基延伸引物；SEQ ID NO.50为-1426C>T位点的单碱基延伸引物；SEQ ID NO.51为-1235A>G位点的单碱基延伸引物；SEQ IDNO.52为-740C>T位点的单碱基延伸引物；SEQ ID NO.53为-678G>A位点的单碱基延伸引物；SEQ ID NO.54为c.31G>A(rs769258)位点的单碱基延伸引物；SEQ ID NO.55为c.100C>T(rs1065852)位点的单碱基延伸引物；SEQ ID NO.56为c.124G>A(rs5030862)位点的单碱基延伸引物；SEQ ID NO.58为c.843T>G位点的单碱基延伸引物；SEQ ID NO.59为c.883G>C(rs5030863)位点的单碱基延伸引物；SEQ ID NO.60为c.1023C>T(rs28371706)位点的单碱基延伸引物；SEQ ID NO.61为c.1039C>T位点的单碱基延伸引物；SEQ ID NO.62为c.2097A>G位点的单碱基延伸引物；SEQ ID NO.63为c.2850C>T(rs16947)位点的单碱基延伸引物；SEQ ID NO.64为c.2935A>C(rs5030867)位点的单碱基延伸引物；SEQ ID NO.65为c.2988G>A(rs28371725)位点的单碱基延伸引物；SEQ ID NO.66和SEQ ID NO.67为c.3582A>G位点的单碱基延伸引物；SEQ ID NO.68为c.3584G>A位点的单碱基延伸引物；SEQ ID NO.69为c.3790C>T位点的单碱基延伸引物。

在本发明一实施例中，进行扩增反应的第一PCR扩增体系，包括：

蒸馏水8～10份，10*PCR buffer 4～6份，25mmol的MgSO₄或MgCl₂ 3～5份，20mmol的脱氧核糖核苷三磷酸混合物1～2份，SEQ ID NO.1～14所示的特异性扩增引物的混合物8～12份，DNA聚合酶1～2份和DNA模板19～21份，其中，各组分按体积比计，8～12份的SEQ IDNO.1～14所示的特异性扩增引物的混合物中的每条特异性扩增引物的浓度均为0.1～2μmol，1～2份的所述DNA聚合酶的浓度为0.5～3U/μl，19～21份的所述DNA模板的量为5～500ng；

进行扩增反应第二PCR扩增体系，包括：

蒸馏水8～10份，10*PCR buffer 4～6份，25mmol的MgSO₄或MgCl₂ 3～5份，20mmol的脱氧核糖核苷三磷酸混合物1～2份，SEQ ID NO.15～28所示的特异性扩增引物的混合物8～12份，DNA聚合酶1～2份和DNA模板19～21份，其中，各组分按体积比计，8～12份的SEQID NO.15～28所示的特异性扩增引物的混合物中的所述每条扩增引物(SEQ ID NO15～28)的浓度均为0.1～2μmol，1～2份的所述DNA聚合酶的浓度为0.5～3U/μl，19～21份的所述DNA模板的量为5～500ng；

进行延伸反应的第一单碱基延伸反应体系，包括：

蒸馏水5～7份，10*PCR buffer 1～3份，20mmol的双脱氧核苷三磷酸混合物1～3份，SEQ ID NO.29～49所示的单碱基延伸引物的混合物8～12份，以及DNA聚合酶0.3～0.5份，其中，各组分按体积比计，0.3～0.5份的所述DNA聚合酶的浓度为0.5～2U/μl，8～12份SEQ ID NO.29～49所示的单碱基延伸引物的混合物中的每条单碱基延伸引物的浓度均为1～20μmol；

进行延伸反应的第二单碱基延伸反应体系，包括：

蒸馏水5～7份，10*PCR buffer 1～3份，20mmol的双脱氧核苷三磷酸混合物1～3份，SEQ ID NO.50～69所示的单碱基延伸引物的混合物8～12份，以及DNA聚合酶0.3～0.5份，其中，各组分按体积比计，0.3～0.5份的所述DNA聚合酶的浓度为0.5～2U/μl，8～12份SEQ ID NO.50～69所示的单碱基延伸引物的混合物中的每条单碱基延伸引物的浓度均为1～20μmol。

在本发明一实施例中，所述利用PCR仪对所述第一PCR扩增体系和所述第二PCR扩增体系进行扩增反应，获得分别对应的第一扩增反应体系和第二扩增反应体系，包括：

利用PCR仪执行：

步骤A1：在90～98℃下，分别对所述第一PCR扩增体系和所述第二PCR扩增体系预热0.5～10min；

步骤A2：在90～98℃下，分别对预热后的所述第一PCR扩增体系和所述第二PCR扩增体系进行变性反应0.17～1min；

步骤A3：在45～60℃下，分别对变性反应后的所述第一PCR扩增体系和所述第二PCR扩增体系进行退火反应0.17～1min；

步骤A4：在60～72℃下，分别对退火反应后的所述PCR扩增体系进行延伸反应0.1～10min；

步骤A5：将步骤A2、步骤A3和步骤A4循环25～45次，分别对延伸反应后的所述第一PCR扩增体系和所述第二PCR扩增体系分别进行循环反应；

步骤A6：在60～72℃下，分别对循环反应后的所述第一PCR扩增体系和所述第二PCR扩增体系进行终延伸反应0～10min，获得所述第一PCR扩增体系扩增反应后的第一扩增反应体系和所述第二PCR扩增体系扩增反应后的第二扩增反应体系，并在2～10℃下，保存所述第一扩增反应体系和所述第二扩增反应体系。

为了防止在进行PCR扩增反应时，部分第一PCR扩增体系和第二PCR扩增体系出现冷凝，可以先对第一PCR扩增体系和第二PCR扩增体系进行预热处理，再进行DNA模板的变性反应，顺次进行DNA模板与SNP位点的特异性扩增引物的退火反应，顺次进行SNP位点的特异性扩增引物的延伸反应，再重复循环“变性-退火-延伸”25～45次，扩增出CYP2D6基因的SNP位点的目的片段，再对体系进行终延伸反应，以提高完整双链DNA的比例。

在本发明一实施例中，所述对所述第一扩增反应体系和所述第二扩增反应体系进行消化处理，获得所述第一扩增反应体系消化处理后的第一消化反应体系和所述第二扩增反应体系消化处理后的第二消化反应体系，包括：

分别向所述第一扩增反应体系和所述第二扩增反应体系中加入0.5～2U的碱性磷酸酶和对应的碱性磷酸酶缓冲液；

利用所述PCR仪，在25～40℃下，分别对加入所述碱性磷酸酶和所述碱性磷酸酶缓冲液的所述第一扩增反应体系和所述第二扩增反应体系进行消化处理10～60min，并在70～85℃下，分别对消化处理后的所述第一扩增反应体系和所述第二扩增反应体系进行加热变性处理5～30min，获得所述第一扩增反应体系消化处理后的第一消化反应体系和所述第二扩增反应体系消化处理后的第二消化反应体系，并在2～8℃下，保存所述第一消化反应体系和所述第二消化反应体系。

向第一扩增反应体系和第二扩增反应体系中加入碱性磷酸酶和对应的碱性磷酸酶缓冲液，再进行“消化-变性”处理可以去除体系内多余的dNTP，最后在2～8℃条件下保存第二反应体系。

其中，碱性磷酸酶，包括：虾碱性磷酸酶、小牛肠碱性磷酸酶、大肠杆菌碱性磷酸酶、大鼠碱性磷酸酶和热敏性碱性磷酸酶中的任意一种。

在本发明一实施例中，所述对加入所述第一单碱基延伸反应体系后的所述第一消化反应体系和加入所述第二单碱基延伸反应体系后的所述第二消化反应体系进行延伸反应，获得分别对应的第一延伸反应体系和第二延伸反应体系，包括：

利用所述PCR仪执行：

步骤B1：在90～98℃下，分别对加入所述第一单碱基延伸反应体系后的所述第一消化反应体系和加入所述第二单碱基延伸反应体系后的所述第二消化反应体系预热0.1～10min；

步骤B2：在90～98℃下，分别对预热后的所述第一消化反应体系和所述第二消化反应体系进行变性反应5～10s；

步骤B3：在48～58℃下，分别对变性反应后的所述第一消化反应体系和所述第二消化反应体系进行退火反应5～30s；

步骤B4：在65～82℃下，分别对退火反应后的所述第一消化反应体系和所述第二消化反应体系进行延伸反应5～30s；

步骤B5：将步骤B3至步骤B4循环5次，分别对延伸反应后的所述第一消化反应体系和所述第二消化反应体系进行退火、延伸循环反应；

步骤B6：将步骤B2至步骤B5循环35-45次，分别对退火、延伸循环反应后的所述第一消化反应体系和所述第二消化反应体系进行扩增循环反应；

步骤B7：在68～75℃下，分别对扩增循环反应后的所述第一消化反应体系和所述第二消化反应体系进行终延伸反应0～10min，获得所述第一消化反应体系延伸反应后的第一延伸反应体系和所述第一消化反应体系延伸反应后的第二延伸反应体系，并在2～8℃下，保存所述第一延伸反应体系和所述第二延伸反应体系。

为了防止第一单碱基延伸反应体系和第二单碱基延伸反应体系在进行延伸反应时出现冷凝，可以先对第一单碱基延伸反应体系和第二单碱基延伸反应体系进行预热处理，再进行“退火-延伸”以延伸出单碱基延伸引物的延伸产物，再对体系进行“退火-延伸”循环反应，最后进行终延伸反应，以增加单碱基延伸引物的延伸产物的量。

在本发明一实施例中，所述对所述第一延伸反应体系和所述第二延伸反应体系进行脱盐纯化处理，获得分别对应的第一纯化产物和第二纯化产物，包括：

分别向所述第一延伸反应体系和所述第二延伸反应体系中加入树脂，再分别加入蒸馏水，并分别将加入所述树脂和所述蒸馏水的所述第一延伸反应体系和所述第二延伸反应体系混匀，将混匀后的所述第一延伸反应体系的上清液作为第一纯化产物，将混匀后的所述第二延伸反应体系的上清液作为第二纯化产物。

还包括：

通过层析、超滤和分子筛中的任意一种或多种方式，分别去除所述第一延伸反应体系和所述第二延伸反应体系中的盐离子，获得所述第一延伸反应体系纯化后的第一纯化产物和所述第二延伸反应体系纯化后的第二纯化产物。

在进行单碱基延伸反应后获得的第一延伸反应体系和第二延伸反应体系进行脱盐处理时，脱盐的方式可以是通过树脂、层析(例如，凝胶过滤层析、高效液相层析、通过ZipTip微量层析柱脱盐、通过SPE小柱脱盐)、超滤、分子筛去除第三反应体系中的盐离子。

在本发明一实施例中，所述检测仪器的检测条件，包括：所述质谱仪的喷雾电压为3500～4500V，鞘气为20～50Arb，辅气为10～50Arb，离子传输管温度为260～400℃，离子源雾化温度为300～400℃，离子源温度为300～400℃，分辨率为3000～140000；

所述检测仪器，进一步包括：高效液相色谱仪；

所述检测条件，进一步包括：C18反相色谱柱，所述C18反相色谱柱的柱温为：40～70℃，所述纯化产物的进样量为：5～100μl；

所述高效液相色谱仪的流动相为：A相：蒸馏水，B相：甲醇；

色谱梯度为：0-2min，5％-20％B；2-5min，20％-55％B；5-7min，55％-95％B；7-8.5min，95％-5％B；8.5-10min，5％B。

需要说明的是，质谱仪器可以是基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪，或者是能够检测核酸分子量的质谱仪器。如，Q-Obitrap质谱、Q-TOF质谱、MALDI-TOF质谱、四级杆质谱、三重四级杆质谱。

C18反相色谱柱可以是Proteomix-SAX色谱柱(5μm,4.6x 150mm)，或者是SUPELCOSIL LC-18-T液相色谱柱，或者是ACQUITY UPLC OST C181.7μm，或者是DNAPacPA100核酸分析柱，或者是XBridge Oligonucleotide BEH C18OBD色谱柱，或者是TSKgelDNA-NPR色谱柱，或者是Shim–pack VP-ODS色谱柱，或者是TSKgel DNA-STAT色谱柱。

利用包括有质谱仪的检测仪器，通过预设的检测条件检测对第一纯化产物和第二纯化产物进行检测后所分别获得的谱图。

对于第一纯化产物中CYP2D6的-1770G>A位点，当谱图中只存在分子量为6064±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的-1770G>A的基因型为-1770G>A-GG型；当谱图中只存在分子量为6048±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的-1770G>A的基因型为-1770G>A-AA型；当谱图中同时存在分子量为6064±3Da和6048±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的-1770G>A的基因型为-1770G>A-GA型；

对于第一纯化产物中CYP2D6的-1584C>G位点，当谱图中只存在分子量为6379±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的-1584C>G的基因型为-1584C>G-CC型；当谱图中只存在分子量为6419±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的-1584C>G的基因型为-1584C>G-GG型；当谱图中同时存在分子量为6379±3Da和6419±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的-1584C>G的基因型为-1584C>G-CG型；

对于第一纯化产物中CYP2D6的-1000G>A位点，当谱图中只存在分子量为7878±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的-1000G>A的基因型-1000G>A-GG型；当谱图中只存在分子量为7958±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的-1000G>A的基因型为-1000G>A-CC型；当谱图中同时存在分子量为7878±3Da和7958±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的-1000G>A的基因型为-1000G>A-GC型；

对于第一纯化产物中CYP2D6的c.310G>T位点，当谱图中只存在分子量为5992±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.310G>T的基因型为c.310G>T-GG型；当谱图中只存在分子量为6016±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.310G>T的基因型为c.310G>T-TT型；当谱图中同时存在分子量为5992±3Da和6016±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.310G>T的基因型为c.310G>T-GT型；

对于第一纯化产物中CYP2D6的c.1659G>A(rs61736512)位点，当谱图中只存在分子量为8890±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.1659G>A(rs61736512)的基因型为c.1659G>A-GG型；当谱图中只存在分子量为8874±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.1659G>A(rs61736512)的基因型为c.1659G>A-AA型；当谱图中同时存在分子量为8890±3Da和8874±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.1659G>A(rs61736512)的基因型为c.1659G>A-GA型；

对于第一纯化产物中CYP2D6的c.1661G>C(rs1058164)位点，当谱图中只存在分子量为7382±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.1661G>C(rs1058164)的基因型为c.1661G>C-GG型；当谱图中只存在分子量为7422±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.1661G>C(rs1058164)的基因型为c.1661G>C-CC型；当谱图中同时存在分子量为7382±3Da和7422±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.1661G>C(rs1058164)的基因型为c.1661G>C-GC型；

对于第一纯化产物中CYP2D6的c.1707delT(rs5030655)位点，当谱图中只存在分子量为5352±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.1707delT(rs5030655)的基因型为c.1707delT-野生型；当谱图中只存在分子量为5328±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.1707delT(rs5030655)的基因型为c.1707delT-突变型；当谱图中同时存在分子量为5352±3Da和5328±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.1707delT(rs5030655)的基因型为c.1707delT-杂合突变型；

对于第一纯化产物中CYP2D6的c.1758G>T(rs5030865)位点，当谱图中只存在分子量为6203±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.1758G>T(rs5030865)的基因型为c.1758G>T-GG型；当谱图中只存在分子量为6243±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.1758G>T(rs5030865)的基因型为c.1758G>T-TT型；当谱图中同时存在分子量为6203±3Da和6243±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.1758G>T(rs5030865)的基因型为c.1758G>T-GT型；

对于第一纯化产物中CYP2D6的c.1846G>A(rs3892097)位点，当谱图中只存在分子量为7358±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.1846G>A(rs3892097)的基因型为c.1846G>A-GG型；当谱图中只存在分子量为7342±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.1846G>A(rs3892097)的基因型为c.1846G>A-AA型；当谱图中同时存在分子量为7358±3Da和7342±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.1846G>A(rs3892097)的基因型为c.1846G>A-GA型；

对于第一纯化产物中CYP2D6的c.1863-1864ins(TTTCGCCCC)2位点，当谱图中只存在分子量为5312±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.1863-1864ins(TTTCGCCCC)2的基因型为c.1863-1864ins(TTTCGCCCC)2-野生型；当谱图中只存在分子量为5368±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.1863-1864ins(TTTCGCCCC)2的基因型为c.1863-1864ins(TTTCGCCCC)2-突变型；当谱图中同时存在分子量为5312±3Da和5367±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.1863-1864ins(TTTCGCCCC)2的基因型为c.1863-1864ins(TTTCGCCCC)2-杂合突变型；

对于第一纯化产物中CYP2D6的c.1973_1974insG(rs72549354)位点，当谱图中只存在分子量为8344±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.1973_1974insG(rs72549354)的基因型为c.1973_1974insG-野生型；当谱图中只存在分子量为8360±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.1973_1974insG(rs72549354)的基因型为c.1973_1974insG-突变型；当谱图中同时存在分子量为8344±3Da和8360±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.1973_1974insG(rs72549354)的基因型为c.1973_1974insG-杂合突变型；

对于第一纯化产物中CYP2D6的c.2483G>A(rs28371717)位点，当谱图中只存在分子量为5456±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.2483G>A(rs28371717)的基因型为c.2483G>A-GG型；当谱图中只存在分子量为5536±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.2483G>A(rs28371717)的基因型为c.2483G>A-AA型；当谱图中同时存在分子量为5456±3Da和5536±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.2483G>A(rs28371717)的基因型为c.2483G>A-GA型；

对于第一纯化产物中CYP2D6的c.2539-2542delAACT位点，当谱图中只存在分子量为7572±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.2539-2542delAACT的基因型为c.2539-2542delAACT-野生型；当谱图中只存在分子量为7588±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.2539-2542delAACT的基因型为c.2539-2542delAACT-突变型；当谱图中同时存在分子量为7572±3Da和7588±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.2539-2542delAACT的基因型为c.2539-2542delAACT-杂合突变型；

对于第一纯化产物中CYP2D6的c.2549delA(rs35742686)位点，当谱图中只存在分子量为5183±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.2549delA(rs35742686)的基因型为c.2549delA-野生型；当谱图中只存在分子量为5143±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.2549delA(rs35742686)的基因型为c.2549delA-突变型；当谱图中同时存在分子量为5183±3Da和5143±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.2549delA(rs35742686)的基因型为c.2549delA-杂合突变型；

对于第一纯化产物中CYP2D6的c.2573insC位点，当谱图中只存在分子量为4978±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.2573insC位点的基因型为c.2573insC-野生型；当谱图中只存在分子量为4938±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.2573insC位点的基因型为c.2573insC-突变型；当谱图中同时存在分子量为4978±3Da和4938±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.2573insC位点的基因型为c.2573insC-杂合突变型；

对于第一纯化产物中CYP2D6的c.2587-2590delGACT位点，当谱图中只存在分子量为7044±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.2587-2590delGACT的基因型为c.2587-2590delGACT-野生型；当谱图中只存在分子量为7004±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.2587-2590delGACT的基因型为c.2587-2590delGACT-突变型；当谱图中同时存在分子量为7044±3Da和7004±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.2587-2590delGACT的基因型为c.2587-2590delGACT-杂合突变型；

对于第一纯化产物中CYP2D6的c.2615-2617delAAG(rs5030656)位点，当谱图中只存在分子量为5087±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.2615-2617delAAG(rs5030656)位点的基因型为c.2615-2617delAAG-野生型；当谱图中只存在分子量为5007±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.2615-2617delAAG(rs5030656)位点的基因型为c.2615-2617delAAG-突变型；当谱图中同时存在分子量为5087±3Da和5007±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.2615-2617delAAG(rs5030656)位点的基因型为c.2615-2617delAAG-杂合突变型；

对于第一纯化产物中CYP2D6的c.3183G>A(rs59421388)位点，当谱图中只存在分子量为6547±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.3183G>A(rs59421388)的基因型为c.3183G>A-GG型；当谱图中只存在分子量为6627±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.3183G>A(rs59421388)的基因型为c.3183G>A-AA型；当谱图中同时存在分子量为6547±3Da和6627±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.3183G>A(rs59421388)的基因型为c.3183G>A-GA型；

对于第一纯化产物中CYP2D6的c.3259-3260insGT位点，当谱图中只存在分子量为5815±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.3259-3260insGT的基因型为c.3259-3260insGT-野生型；当谱图中只存在分子量为5895±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.3259-3260insGT的基因型为c.3259-3260insGT-突变型；当谱图中同时存在分子量为5815±3Da和5895±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.3259-3260insGT的基因型为c.3259-3260insGT-杂合突变型；

对于第一纯化产物中CYP2D6的c.3384A>C位点，当谱图中只存在分子量为6771±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.3384A>C的基因型为c.3384A>C-AA型；当谱图中只存在分子量为6731±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.3384A>C的基因型为c.3384A>C-CC型；当谱图中同时存在分子量为6771±3Da和6731±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.3384A>C的基因型为c.3384A>C-AC型；

对于第一纯化产物中CYP2D6的c.4180G>C(rs1135840)位点，当谱图中只存在分子量为7655±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.4180G>C(rs1135840)的基因型为c.4180G>C-GG型；当谱图中只存在分子量为7615±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.4180G>C(rs1135840)的基因型为c.4180G>C-CC型；当谱图中同时存在分子量为7655±3Da和7615±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.4180G>C(rs1135840)的基因型为c.4180G>C-GC型；

对于第二纯化产物中CYP2D6的-1426C>T位点，当谱图中只存在分子量为7569±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的-1426C>T的基因型为-1426C>T-CC型；当谱图中只存在分子量为7553±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的-1426C>T的基因型为-1426C>T-TT型；当谱图中同时存在分子量为7569±3Da和7553±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的-1426C>T的基因型为-1426C>T-CT型；

对于第二纯化产物中CYP2D6的-1235A>G位点，当谱图中只存在分子量为6051±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的-1235A>G的基因型为-1235A>G-AA型；当谱图中只存在分子量为5971±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的-1235A>G的基因型为-1235A>G-GG型；当谱图中同时存在分子量为6051±3Da和5971±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的-1235A>G的基因型为-1235A>G-AG型；

对于第二纯化产物中CYP2D6的-740C>T位点，当谱图中只存在分子量为6956±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的-740C>T的基因型-740C>T-CC型；当谱图中只存在分子量为6940±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的-740C>T的基因型为-740C>T-TT型；当谱图中同时存在分子量为6956±3Da和6940±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的-740C>T的基因型为-740C>T-CT型；

对于第二纯化产物中CYP2D6的-678G>A位点，当谱图中只存在分子量为7053±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的-678G>A的基因型为-678G>A-GG型；当谱图中只存在分子量为7037±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的-678G>A的基因型为-678G>A-AA型；当谱图中同时存在分子量为7053±3Da和7037±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的-678G>A的基因型为-678G>A-GA型；

对于第二纯化产物中CYP2D6的c.31G>A(rs769258)位点，当谱图中只存在分子量为7021±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.31G>A(rs769258)的基因型为c.31G>A-GG型；当谱图中只存在分子量为7101±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.31G>A(rs769258)的基因型为c.31G>A-AA型；当谱图中同时存在分子量为7021±3Da和7101±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.31G>A(rs769258)的基因型为c.31G>A-GA型；

对于第二纯化产物中CYP2D6的c.100C>T(rs1065852)位点，当谱图中只存在分子量为6362±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.100C>T(rs1065852)的基因型为c.100C>T-CC型；当谱图中只存在分子量为6442±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.100C>T(rs1065852)的基因型为c.100C>T-TT型；当谱图中同时存在分子量为6362±3Da和6442±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.100C>T(rs1065852)的基因型为c.100C>T-CT型；

对于第二纯化产物中CYP2D6的c.124G>A(rs5030862)位点，当谱图中只存在分子量为7542±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.124G>A(rs5030862)的基因型为c.124G>A-GG型；当谱图中只存在分子量为7622±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.124G>A(rs5030862)的基因型为c.124G>A-AA型；当谱图中同时存在分子量为7542±3Da和7622±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.124G>A(rs5030862)的基因型为c.124G>A-GA型；

对于第二纯化产物中CYP2D6的c.137_138insT位点，当谱图中只存在分子量为7965±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.137_138insT的基因型为c.137_138insT-野生型；当谱图中只存在分子量为7949±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.137_138insT的基因型为c.137_138insT-突变型；当谱图中同时存在分子量为7965±3Da和7949±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.137_138insT的基因型为c.137_138insT-杂合突变型；

对于第二纯化产物中CYP2D6的c.843T>G位点，当谱图中只存在分子量为6826±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.843T>G的基因型为c.843T>G-TT型；当谱图中只存在分子量为6786±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.843T>G的基因型为c.843T>G-GG型；当谱图中同时存在分子量为6826±3Da和6786±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.843T>G的基因型为c.843T>G-TG型；

对于第二纯化产物中CYP2D6的c.883G>C(rs5030863)位点，当谱图中只存在分子量为6317±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.883G>C(rs5030863)的基因型为c.883G>C-GG型；当谱图中只存在分子量为6357±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.883G>C(rs5030863)的基因型为c.883G>C-CC型；当谱图中同时存在分子量为6317±3Da和6357±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.883G>C(rs5030863)的基因型为c.883G>C-GC型；

对于第二纯化产物中CYP2D6的c.1023C>T(rs28371706)位点，当谱图中只存在分子量为8346±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.1023C>T(rs28371706)的基因型为c.1023C>T-CC型；当谱图中只存在分子量为8426±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.1023C>T(rs28371706)的基因型为c.1023C>T-TT型；当谱图中同时存在分子量为8346±3Da和8426±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.1023C>T(rs28371706)的基因型为c.1023C>T-CT型；

对于第二纯化产物中CYP2D6的c.1039C>T位点，当谱图中只存在分子量为5405±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.1039C>T的基因型为c.1039C>T>A-CC型；当谱图中只存在分子量为5485±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.1039C>T的基因型为c.1039C>T-TT型；当谱图中同时存在分子量为5405±3Da和5485±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.1039C>T的基因型为c.1039C>T-CT型；

对于第二纯化产物中CYP2D6的c.2097A>G位点，当谱图中只存在分子量为7068±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.2097A>G的基因型为c.2097A>G-AA型；当谱图中只存在分子量为7084±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.2097A>G的基因型为c.2097A>G-GG型；当谱图中同时存在分子量为7068±3Da和7084±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.2097A>G的基因型为c.2097A>G-AG型；

对于第二纯化产物中CYP2D6的c.2850C>T(rs16947)位点，当谱图中只存在分子量为6385±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.2850C>T(rs16947)的基因型为c.2850C>T-CC型；当谱图中只存在分子量为6465±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.2850C>T(rs16947)的基因型为c.2850C>T-TT型；当谱图中同时存在分子量为6385±3Da和6465±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.2850C>T(rs16947)的基因型为c.2850C>T-CT型；

对于第二纯化产物中CYP2D6的c.2935A>C(rs5030867)位点，当谱图中只存在分子量为5943±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.2935A>C(rs5030867)位点的基因型为c.2935A>C-AA型；当谱图中只存在分子量为5919±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.2935A>C(rs5030867)位点的基因型为c.2935A>C-CC型；当谱图中同时存在分子量为5943±3Da和5919±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.2935A>C(rs5030867)位点的基因型为c.2935A>C-AC型；

对于第二纯化产物中CYP2D6的c.2988G>A(rs28371725)位点，当谱图中只存在分子量为7183±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.2988G>A(rs28371725)的基因型为c.2988G>A-GG型；当谱图中只存在分子量为7167±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.2988G>A(rs28371725)的基因型为c.2988G>A-AA型；当谱图中同时存在分子量为7183±3Da和7167±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.2988G>A(rs28371725)的基因型为c.2988G>A-GA型；

对于第二纯化产物中CYP2D6的c.3582A>G位点，当谱图中只存在分子量为6619±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.3582A>G位点的基因型为c.3582A>G-AA型；当谱图中只存在分子量为6554±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.3582A>G位点的基因型为c.3582A>G-GG型；当谱图中同时存在分子量为6619±3Da和6554±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.3582A>G位点的基因型为c.3582A>G-AG型；

对于第二纯化产物中CYP2D6的c.3584G>A位点，当谱图中只存在分子量为8602±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.3584G>A的基因型为c.3584G>A-GG型；当谱图中只存在分子量为8682±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.3584G>A的基因型为c.3584G>A-AA型；当谱图中同时存在分子量为8602±3Da和8682±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.3584G>A的基因型为c.3584G>A-GA型；

对于第二纯化产物中CYP2D6的c.3790C>T位点，当谱图中只存在分子量为7388±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.3790C>T的基因型为c.3790C>T-CC型；当谱图中只存在分子量为7468±3Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.3790C>T的基因型为c.3790C>T-TT型；当谱图中同时存在分子量为7388±3Da和7468Da的单碱基延伸产物时，待测样本的CYP2D6的c.3790C>T的基因型为c.3790C>T-CT型；

通过上述CYP2D6基因位点的基因型，可以确定CYP2D6*2、*3、*4、*5、*6、*7、*8、*9、*10、*11、*12、*13、*14、*15、*16、*17、*19、*20、*21、*29、*33、*35、*36、*38、*40、*41、*42的基因型。

由于根据CYP2D6基因的SNP位点的单碱基延伸产物的理论分子量，若在包括高效液相色谱仪和质谱仪的检测仪器对纯化产物进行测试获得的谱图中出现相应的分子量(质荷比)的质谱峰和对应的色谱峰，则可以确定待测样本中存在对应的基因型。由于包括高效液相色谱仪和质谱仪的检测仪器来检测基因多态性的周期短，因此可以缩短CYP2D6基因的SNP位点的基因型的检测时长，提高CYP2D6基因分型的检测效率。并且通过色谱、质谱方式进行基因多态性的检测，还可以特异、简单、高通量的对目标基因的SNP位点进行分型。同时，由于包括高效液相色谱仪和质谱仪的检测仪器检测的重现性高，因此可以使得基因多态性的检测结果可重现性高，并且使得检测的自动化程度高，降低CYP2D6基因分型的难度。

图2～图5示出了CYP2D6基因的部分SNP位点的基因型的LC-MS谱图，其中，图2～图5中的第一个坐标系均为色谱图，第二坐标系均为质谱图。其中，第一坐标系的横坐标为保留时间，单位为min，纵坐标为电信号强度，单位为mV。第二坐标系的横坐标为例子的质荷比，单位为m/z，纵坐标为离子流的强度。

图2为CYP2D6基因的-1770G>A位点为-1770G>A-G基因型的LC-MS谱图；

图3为CYP2D6基因的-1770G>A位点为-1770G>A-A基因型的LC-MS谱图；

图4为CYP2D6基因的-1584C>G位点为-1584C>G-C基因型的LC-MS谱图；

图5为CYP2D6基因的-1584C>G位点为-1584C>G-G基因型的LC-MS谱图。

需要说明的是，下述所用的待测样本基因组DNA，均是在患者或患者的监护人知情同意的情况下收集的。

下面通过几个具体的实施例对本发明作进一步的说明：

在实施例1中，CYP2D6基因分型的检测方法可包括：

步骤C1：预先合成SEQ ID NO.1～28所示的特异性扩增引物和SEQ ID NO.29～69所示的单碱基延伸引物。

步骤C2：从待测样本中提取出待测样本基因组DNA，并将该待测样本基因组DNA作为DNA模板，其中，DNA模板的浓度为50ng/μl。

其中，待测样本基因组DNA为，利用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)提取从待测样本的新鲜外周血样本中中提取获得，并采用NP80-touch测定浓度位于5～1000ng/μl范围区间内，且OD260/OD280比值位于1.6～2.2范围区间内的基因组DNA。

步骤C3a：配置由蒸馏水0.9μl，25mmol的MgCl₂0.4μl，20mmol的脱氧核糖核苷三磷酸混合物0.1μl，SEQ ID NO.1～14所示的特异性扩增引物的混合物1μl，TaqDNA聚合酶0.1μl，TaqDNA聚合酶对应的10*PCR buffer 0.5μl，以及DNA模板2μl组成的第一PCR扩增体系，其中，1μl的特异性扩增引物的混合物中的每种特异性扩增引物的浓度均为1μmol，TaqDNA聚合酶的浓度为1.25U/μl，DNA模板的量为100ng。

步骤C3b：配置由蒸馏水0.9μl，25mmol的MgCl₂0.4μl，20mmol的脱氧核糖核苷三磷酸混合物0.1μl，SEQ ID NO.15～28所示的特异性扩增引物的混合物1μl，TaqDNA聚合酶0.1μl，TaqDNA聚合酶对应的10*PCR buffer 0.5μl，以及DNA模板2μl组成的第二PCR扩增体系，其中，1μl的特异性扩增引物的混合物中的每种特异性扩增引物的浓度均为1μmol，TaqDNA聚合酶的浓度为1.25U/μl，DNA模板的量为100ng。

步骤C4：利用PCR仪分别对第一PCR扩增体系和第二PCR扩增体系95℃预热3min，顺次在95℃下变性30s，顺次在54℃下退火30s，顺次在72℃下延伸0.5min，再将95℃变性30s、54℃退火30s和72℃延伸0.5min循环45次，顺次在72℃下终延伸5min，获得包含CYP2D6基因部分SNP位点的目的片段的第一扩增反应体系和CYP2D6基因的剩余SNP位点的第二扩增反应体系，最后在4℃下保存第一扩增反应体系和第二扩增反应体系。

步骤C5：分别向第一扩增反应体系和第二扩增反应体系加入1U的大肠杆菌碱性磷酸酶和对应的碱性磷酸缓冲液，利用PCR仪在37℃下消化处理40min，顺次在75℃下加热变性10min，去除体系内多余的dNTP，获得消除处理后的第一消化反应体系和第二消化反应体系，并在4℃下，保存第一消化反应体系和第二消化反应体系。

步骤C6a：配置由蒸馏水0.659μl，20mmol的双脱氧核苷三磷混合物0.2μl，SEQ IDNO.29～49所示的单碱基延伸引物的混合物0.9μl，T7DNA聚合酶0.041μl，以及对应的10*PCR buffer 0.2μl组成的第一单碱基延伸反应体系，其中，0.9μl的单碱基延伸引物的混合物中的每条单碱基延伸引物的浓度均为10μmol，T7DNA聚合酶的浓度为1.25U/μl。

步骤C6b：配置由蒸馏水0.659μl，20mmol的双脱氧核苷三磷混合物0.2μl，SEQ IDNO.50～69所示的单碱基延伸引物的混合物0.9μl，T7DNA聚合酶0.041μl，以及对应的10*PCR buffer 0.2μl组成的第二单碱基延伸反应体系，其中，0.9μl的单碱基延伸引物的混合物中的每条单碱基延伸引物的浓度均为10μmol，T7DNA聚合酶的浓度为1.25U/μl。

步骤C7：将步骤C6获得的第一单碱基延伸反应体系加入到步骤C5获得的第一消化反应体系中，并将第二单碱基延伸反应体系加入到第二消化反应体系中，利用PCR仪在94℃下预热30s，顺次在94℃下变性5s，顺次在54℃下退火10s，顺次在80℃下延伸5s，顺次将54℃下退火10s和80℃延伸5s循环5次，顺次将94℃下变性5s与(54℃下退火10s和80℃下延伸5s循环5次)循环40次，最后在72℃下终延伸5min，获得包括CYP2D6基因部分SNP位点的单碱基延伸产物的第一延伸反应体系，以及包括CYP2D6基因剩余部分SNP位点的单碱基延伸产物的第二延伸反应体系，并在4℃下，保存获得的第一延伸反应体系和第二延伸反应体系。

步骤C8：分别向第一延伸反应体系和第二延伸反应体系中加入25mg的树脂，再分别加入50μl的蒸馏水，并分别将加入树脂后和蒸馏水的第一延伸反应体系和第二延伸反应体系混匀，将混匀后的第一延伸反应体系的上清液作为第一纯化产物，将混匀后的第二延伸反应体系的上清液作为第二纯化产物。

步骤C9：利用包括有高效液相色谱仪和质谱仪的检测仪器，通过预设的检测条件分别对第一纯化产物和第二纯化产物进行测试，确定CYP2D6基因的SNP位点的基因型。

其中，步骤C9中的质谱仪的检测条件为喷雾电压为3800V，鞘气为32Arb，辅气为30Arb，离子传输管温度为320℃，离子源雾化温度为350℃，离子源温度为350℃，分辨率为70000。

其中，步骤C9中的高效液相色谱仪的检测条件为C18反相色谱柱，C18反相色谱柱的柱温为：55℃，纯化产物的进样量为：22.5μl，其中，所述C18反相色谱柱的色谱柱型号为：Acquity UPLC Oligo BEH C18，柱内径为：1.7μm，柱长为：2.1x 50mm；

高效液相色谱仪的流动相为：A相：蒸馏水，B相：甲醇；

色谱梯度为：0-2min，5％-20％B；2-5min，20％-55％B；5-7min，55％-95％B；7-8.5min，95％-5％B；8.5-10min，5％B。

在实施例2中，CYP2D6基因分型的检测方法可包括：

步骤D1：预先合成SEQ ID NO.1～28所示的特异性扩增引物和SEQ ID NO.29～69所示的单碱基延伸引物。

步骤D2：从待测样本中提取出待测样本基因组DNA，并将该待测样本基因组DNA作为DNA模板，其中，DNA模板的浓度为5ng/μl。

其中，待测样本基因组DNA为，利用天根口腔拭子基因组DNA提取试剂盒(DP322)从待测样本的口腔脱落细胞中提取出的，并采用NP80-touch测定浓度位于5～1000ng/μl范围区间内，且OD260/OD280比值位于1.6～2.2范围区间内的基因组DNA。

步骤D3a：配置由蒸馏水0.8μl，25mmol的MgCl₂0.3μl，20mmol的脱氧核糖核苷三磷酸混合物0.1μl，SEQ ID NO.1～14所示的特异性扩增引物的混合物0.8μl，TaqDNA聚合酶0.1μl，TaqDNA聚合酶对应的10*PCR buffer 0.4μl，以及DNA模板1.9μl组成的第一PCR扩增体系，其中，0.8μl的特异性扩增引物的混合物中的每种特异性扩增引物的浓度均为0.1μmol，TaqDNA聚合酶的浓度为0.5U/μl，DNA模板的量为9.5ng。

步骤D3b：配置由蒸馏水0.8μl，25mmol的MgCl₂0.3μl，20mmol的脱氧核糖核苷三磷酸混合物0.1μl，SEQ ID NO.15～28所示的特异性扩增引物的混合物0.8μl，TaqDNA聚合酶0.1μl，TaqDNA聚合酶对应的10*PCR buffer 0.4μl，以及DNA模板1.9μl组成的第二PCR扩增体系，其中，0.8μl的特异性扩增引物的混合物中的每种特异性扩增引物的浓度均为0.1μmol，TaqDNA聚合酶的浓度为0.5U/μl，DNA模板的量为9.5ng。

步骤D4：利用PCR仪分别对第一PCR扩增体系和第二PCR扩增体系90℃预热30s，顺次在90℃下变性10s，顺次在45℃下退火10s，顺次在60℃下延伸0.1min，再将90℃下变性10s、45℃下退火10s和60℃延伸0.1min循环25次，获得包含CYP2D6基因部分SNP位点的目的片段的第一扩增反应体系和CYP2D6基因的剩余SNP位点的第二扩增反应体系，最后在4℃下保存第一扩增反应体系和第二扩增反应体系。

步骤D5：分别向第一扩增反应体系和第二扩增反应体系加入0.5U的大肠杆菌碱性磷酸酶和对应的碱性磷酸缓冲液，利用PCR仪在25℃下消化处理10min，顺次在70℃下加热变性5min，去除体系内多余的dNTP，获得消除处理后的第一消化反应体系和第二消化反应体系，并在4℃下，保存第一消化反应体系和第二消化反应体系。

步骤D6a：配置由蒸馏水0.5μl，20mmol的双脱氧核苷三磷混合物0.1μl，SEQ IDNO.29～49所示的单碱基延伸引物的混合物0.8μl，T7DNA聚合酶0.03μl，以及对应的10*PCRbuffer 0.1μl组成的第一单碱基延伸反应体系，其中，0.8μl的单碱基延伸引物的混合物中的每条单碱基延伸引物的浓度均为1μmol，T7DNA聚合酶的浓度为0.5U/μl。

步骤D6b：配置由蒸馏水0.5μl，20mmol的双脱氧核苷三磷混合物0.1μl，SEQ IDNO.50～69所示的单碱基延伸引物的混合物0.8μl，T7DNA聚合酶0.03μl，以及对应的10*PCRbuffer 0.1μl组成的第二单碱基延伸反应体系，其中，0.8μl的单碱基延伸引物的混合物中的每条单碱基延伸引物的浓度均为0.1μmol，T7DNA聚合酶的浓度为0.5U/μl。

步骤D7：将步骤D6获得的第一单碱基延伸反应体系加入到步骤D5获得的第一消化反应体系中，并将第二单碱基延伸反应体系加入到第二消化反应体系中，利用PCR仪在90℃下预热30s，顺次在90℃下变性5s，顺次在45℃下退火10s，顺次在65℃下延伸5s，顺次将48℃下退火5s和65℃下延伸5s循环5次，顺次将90℃下变性5s与(48℃下退火5s和65℃下延伸5s循环5次)循环35次，获得包括CYP2D6基因部分SNP位点的单碱基延伸产物的第一延伸反应体系，以及包括CYP2D6基因剩余部分SNP位点的单碱基延伸产物的第二延伸反应体系，并在4℃下，保存获得的第一延伸反应体系和第二延伸反应体系。

步骤D8：分别向第一延伸反应体系和第二延伸反应体系中加入15mg的树脂，再分别加入50μl的蒸馏水，并分别将加入树脂后和蒸馏水的第一延伸反应体系和第二延伸反应体系混匀，将混匀后的第一延伸反应体系的上清液作为第一纯化产物，将混匀后的第二延伸反应体系的上清液作为第二纯化产物。

步骤D9：利用包括有高效液相色谱仪和质谱仪的检测仪器，通过预设的检测条件分别对第一纯化产物和第二纯化产物进行测试，确定CYP2D6基因的SNP位点的基因型。

其中，步骤D9中的质谱仪的检测条件为喷雾电压为3500V，鞘气为25Arb，辅气为30Arb，离子传输管温度为260℃，离子源雾化温度为300℃，离子源温度为300℃，分辨率为3000。

其中，步骤D9中的高效液相色谱仪的检测条件为C18反相色谱柱，C18反相色谱柱的柱温为：40℃，纯化产物的进样量为：5μl，其中，所述C18反相色谱柱的色谱柱型号为：Acquity UPLC Oligo BEH C18，柱内径为：1.7μm，柱长为：2.1x 50mm。

高效液相色谱仪的流动相为：A相：蒸馏水，B相：甲醇；

色谱梯度为：0-2min，5％-20％B；2-5min，20％-55％B；5-7min，55％-95％B；7-8.5min，95％-5％B；8.5-10min，5％B。

在实施例3中，CYP2D6基因分型的检测方法可包括：

步骤E1：预先合成SEQ ID NO.1～28所示的特异性扩增引物和SEQ ID NO.29～69所示的单碱基延伸引物。

步骤E2：从待测样本中提取出待测样本基因组DNA，并将该待测样本基因组DNA作为DNA模板，其中，DNA模板的浓度为119ng/μl。

其中，待测样本基因组DNA为，利用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)从待测样本的组织样本中提取获得，并采用NP80-touch测定浓度位于5～1000ng/μl范围区间内，且OD260/OD280比值位于1.6～2.2范围区间内的基因组DNA。

步骤E3a：配置由蒸馏水1μl，25mmol的MgCl₂0.5μl，20mmol的脱氧核糖核苷三磷酸混合物0.2μl，SEQ ID NO.1～14所示的特异性扩增引物的混合物1.2μl，TaqDNA聚合酶0.2μl，TaqDNA聚合酶对应的10*PCR buffer 0.6μl，以及DNA模板2.1μl组成的第一PCR扩增体系，其中，1.2μl的特异性扩增引物的混合物中的每种特异性扩增引物的浓度均为2μmol，TaqDNA聚合酶的浓度为2U/μl，DNA模板的量为250ng。

步骤E3b：配置由蒸馏水1μl，25mmol的MgCl₂0.5μl，20mmol的脱氧核糖核苷三磷酸混合物0.2μl，SEQ ID NO.15～28所示的特异性扩增引物的混合物1.2μl，TaqDNA聚合酶0.2μl，TaqDNA聚合酶对应的10*PCR buffer 0.6μl，以及DNA模板2.1μl组成的第二PCR扩增体系，其中，1.2μl的特异性扩增引物的混合物中的每种特异性扩增引物的浓度均为2μmol，TaqDNA聚合酶的浓度为2U/μl，DNA模板的量为500ng。

步骤E4：利用PCR仪分别对第一PCR扩增体系和第二PCR扩增体系98℃预热10min，顺次在98℃下变性1min，顺次在60℃下退火1min，顺次在72℃下延伸10min，再将98℃变性1min、60℃退火1min和72℃延伸10min循环45次，获得包含CYP2D6基因部分SNP位点的目的片段的第一扩增反应体系和CYP2D6基因的剩余SNP位点的第二扩增反应体系，最后在4℃下保存第一扩增反应体系和第二扩增反应体系。

步骤E5：分别向第一扩增反应体系和第二扩增反应体系加入2U的大肠杆菌碱性磷酸酶和对应的碱性磷酸缓冲液，利用PCR仪在40℃下消化处理60min，顺次在85℃下加热变性30min，去除体系内多余的dNTP，获得消除处理后的第一消化反应体系和第二消化反应体系，并在4℃下，保存第一消化反应体系和第二消化反应体系。

步骤E6a：配置由蒸馏水0.7μl，20mmol的双脱氧核苷三磷混合物0.3μl，SEQ IDNO.29～49所示的单碱基延伸引物的混合物1.2μl，T7DNA聚合酶0.03μl，以及对应的10*PCRbuffer 0.1μl组成的第一单碱基延伸反应体系，其中，1.2μl的单碱基延伸引物的混合物中的每条单碱基延伸引物的浓度均为20μmol，T7DNA聚合酶的浓度为2U/μl。

步骤E6b：配置由蒸馏水0.7μl，20mmol的双脱氧核苷三磷混合物0.3μl，SEQ IDNO.50～69所示的单碱基延伸引物的混合物1.2μl，T7DNA聚合酶0.03μl，以及对应的10*PCRbuffer 0.1μl组成的第二单碱基延伸反应体系，其中，1.2μl的单碱基延伸引物的混合物中的每条单碱基延伸引物的浓度均为20μmol，T7DNA聚合酶的浓度为2U/μl。

步骤E7：将步骤E6获得的第一单碱基延伸反应体系加入到步骤E5获得的第一消化反应体系中，并将第二单碱基延伸反应体系加入到第二消化反应体系中，利用PCR仪在98℃下预热10min，顺次在98℃下变性10s，顺次在58℃下退火30s，顺次在85℃下延伸30s，顺次将58℃下退火30s和85℃下延伸30s循环5次，顺次将98℃下变性10s与(58℃下退火30s和85℃下延伸30s循环5次)循环45次，最后在75℃下终延伸10min，获得包括CYP2D6基因部分SNP位点的单碱基延伸产物的第一延伸反应体系，以及包括CYP2D6基因剩余部分SNP位点的单碱基延伸产物的第二延伸反应体系，并在4℃下，保存获得的第一延伸反应体系和第二延伸反应体系。

步骤E8：分别向第一延伸反应体系和第二延伸反应体系中加入45mg的树脂，再分别加入70μl的蒸馏水，并分别将加入树脂后和蒸馏水的第一延伸反应体系和第二延伸反应体系混匀，将混匀后的第一延伸反应体系的上清液作为第一纯化产物，将混匀后的第二延伸反应体系的上清液作为第二纯化产物。

步骤E9：利用包括有高效液相色谱仪和质谱仪的检测仪器，通过预设的检测条件分别对第一纯化产物和第二纯化产物进行测试，确定CYP2D6基因的SNP位点的基因型。

其中，步骤E9中的质谱仪的检测条件为喷雾电压为4000V，鞘气为50Arb，辅气为50Arb，离子传输管温度为400℃，离子源雾化温度为400℃，离子源温度为400℃，分辨率为140000；

其中，步骤E9中的高效液相色谱仪的检测条件为C18反相色谱柱，C18反相色谱柱的柱温为：70℃，纯化产物的进样量为：50μl，其中，其中，所述C18反相色谱柱的色谱柱型号为：Acquity UPLC Oligo BEH C18，柱内径为：1.7μm，柱长为：2.1x 50mm。

高效液相色谱仪的流动相为：A相：蒸馏水，B相：甲醇；

色谱梯度为：0-2min，5％-20％B；2-5min，20％-55％B；5-7min，55％-95％B；7-8.5min，95％-5％B；8.5-10min，5％B。

本发明各个实施例至少具有如下有益效果：

1、在本发明一实施例中，由于根据CYP2D6基因的SNP位点的单碱基延伸产物的理论分子量，若在包括高效液相色谱仪和质谱仪的检测仪器对纯化产物进行测试获得的谱图中出现相应的分子量(质荷比)的质谱峰和对应的色谱峰，则可以确定待测样本中存在对应的基因型。由于包括高效液相色谱仪和质谱仪的检测仪器来检测基因多态性的周期短，因此可以缩短CYP2D6基因的SNP位点的基因型的检测时长，提高CYP2D6基因分型的检测效率。并且通过色谱、质谱方式进行基因多态性的检测，还可以特异、简单、高通量的对目标基因的SNP位点进行分型。同时，由于包括高效液相色谱仪和质谱仪的检测仪器检测的重现性高，因此可以使得基因多态性的检测结果可重现性高，并且使得检测的自动化程度高，降低CYP2D6基因分型的难度。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个······”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同因素。

最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京和合医学诊断技术股份有限公司

<120> 一种CYP2D6基因分型的检测方法

<140> 2019104649112

<141> 2019-05-30

<160> 69

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

acgttggatg ctgccataca atccacctgt ag 32

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

acgttggatg tgcacccaat cccagctaat 30

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

acgttggatg cctgaacaaa ggatcctcca taa 33

<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

acgttggatg gggctatggc ttcttgtttg 30

<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

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acgttggatg cctactcttc cttggccttt g 31

<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

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acgttggatg aatgaggctc ccctaccaga 30

<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 7

acgttggatg tatggtggat ggtggggct 29

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 8

acgttggatg ttccgactcc tccttcagtc 30

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

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acgttggatg tatgcactgg tccaaccttt 30

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

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acgttggatg atttccccgt cctcctgcat 30

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

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acgttggatg taaacgcatg tctgtccagg 30

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 12

acgttggatg tgtggtggca ttgaggacta 30

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

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acgttggatg ccgagttgga actaccacat t 31

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

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acgttggatg ttagcttctc ggtgcccact 30

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

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acgttggatg aaattagctg ggattgggt 29

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

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acgttggatg ttcccaagta gctgggacta 30

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

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acgttggatg acttgcaggg acacgattac 30

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

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acgttggatg ttcccatcca ggaaacctcc 30

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

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acgttggatg ttgtgtccag aggagcccat 30

<210> 20

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

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acgttggatg gtcgaagcag tatggtgtgt 30

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 21

acgttggatg gggtcgtcca aggttcaaat a 31

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

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acgttggatg ccacggaaat ctgtctctgt c 31

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

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acgttggatg aatcacacct ctcccacgac 30

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

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acgttggatg aatcacacct ctcccacgac 30

<210> 25

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

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acgttggatg ttcgggtgtc ccagcaaagt 30

<210> 26

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

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acgttggatg tgagagcagc ttcaatgatg ag 32

<210> 27

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

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acgttggatg cgtctagtgg ggagacaaac 30

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<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 28

acgttggatg ttggtgatga gtgtcgttcc 30

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 29

gtcctcagtg gatgatccc 19

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 30

ctggacaact tggaagaacc 20

<210> 31

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 31

acatcctccc gggctgcctg agggt 25

<210> 32

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 32

taaatgccct tctccagga 19

<210> 33

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 33

cgcgtggcgc gagcagaggc gcttctcc 28

<210> 34

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 34

aggcccaagt tgcgcaaggt gga 23

<210> 35

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

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ggcctcctcg gtcaccc 17

<210> 36

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

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ccgccttcgc caaccactcc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

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ccttacccgc atctcccacc ccca 24

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

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gacgcccctt tcgcccc 17

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 39

agcccgactc ctccttcagt ccc 23

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 40

gcgtaggacc ttgccag 17

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

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cctgacccat ctggatgagc tgct 24

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

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gggtcccagg tcatcc 16

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<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 43

ccagcccagc cccccc 16

<210> 44

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 44

atctctgcca ggaaggcctc ag 22

<210> 45

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 45

gcagccactc tcacct 16

<210> 46

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 46

gtcgccgcac ctgccctatc a 21

<210> 47

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 47

gccgtgattc atgaggtg 18

<210> 48

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 48

catgctgggg ctatcaccag g 21

<210> 49

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 49

atggtgtctt tgctttcctg gtga 24

<210> 50

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 50

gtgtgccacc acgtctagct tttt 24

<210> 51

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 51

aggcaccacc cagcctaat 19

<210> 52

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 52

acagactcac actgacactt ag 22

<210> 53

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 53

ctttgtgtgg gtgattttct gc 22

<210> 54

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 54

agcaggaaga tggccactat ca 22

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 55

aatgctgggc tgcacgctac 20

<210> 56

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 56

tcacatgcag caggttgccc agcc 24

<210> 57

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 57

gaagtccaca tgcagca 17

<210> 58

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 58

actaggacct gtagtctggg g 21

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 59

tccccgaagc ggcgccgcaa 20

<210> 60

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 60

ccgccgaccg cccgcctgtg cccatca 27

<210> 61

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 61

acccagatcc tgggttt 17

<210> 62

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 62

gcctcggaag agcaggattt gc 22

<210> 63

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 63

gcttcaatga tgagaacctg 20

<210> 64

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 64

ctcctgctca tgatcctac 19

<210> 65

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 65

aacagtgcag gggccgaggg ag 22

<210> 66

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 66

tgccccctct ccctgcaggc g 21

<210> 67

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 67

tgccccctct ccctgcaggt g 21

<210> 68

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 68

cacccacact gacccctctc cctacagg 28

<210> 69

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 69

agtccccact ctcaccctgc atct 24

Claims (10)

1.一种CYP2D6基因分型的检测方法，其特征在于，包括：

预先合成CYP2D6基因的SNP位点的特异性扩增引物和单碱基延伸引物，其中，所述特异性扩增引物序列如SEQ ID NO.1～28所示，所述单碱基延伸引物序列如SEQ ID NO.29～69所示；

从待测样本中提取出待测样本基因组DNA，并将所述待测样本基因组DNA作为DNA模板；

配置包含SEQ ID NO.1～14所示的特异性扩增引物和所述DNA模板的第一聚合酶链式反应PCR扩增体系，以及包含SEQ ID NO.15～28所示的特异性扩增引物和所述DNA模板的第二PCR扩增体系；

利用PCR仪对所述第一PCR扩增体系和所述第二PCR扩增体系进行扩增反应，获得分别对应的第一扩增反应体系和第二扩增反应体系；

对所述第一扩增反应体系和所述第二扩增反应体系进行消化处理，获得分别对应的第一消化反应体系和第二消化反应体系；

配置包含SEQ ID NO.29～49所示的单碱基延伸引物的第一单碱基延伸反应体系，以及包含SEQ ID NO.50～69所示的单碱基延伸引物第二单碱基延伸反应体系；

对加入所述第一单碱基延伸反应体系后的所述第一消化反应体系和加入所述第二单碱基延伸反应体系后的所述第二消化反应体系进行延伸反应，获得分别对应的第一延伸反应体系和第二延伸反应体系；

对所述第一延伸反应体系和所述第二延伸反应体系进行脱盐纯化处理，获得分别对应的第一纯化产物和第二纯化产物；

利用包括有质谱仪的检测仪器，通过预设的检测条件检测所述第一纯化产物和所述第二纯化产物，确定所述待测样本CYP2D6基因的SNP位点的基因型。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述第一PCR扩增体系，包括：

蒸馏水8～10份，10*PCR buffer 4～6份，25mmol的MgSO₄或MgCl₂ 3～5份，20mmol的脱氧核糖核苷三磷酸混合物1～2份，SEQ ID NO.1～14所示的特异性扩增引物的混合物8～12份，DNA聚合酶1～2份和DNA模板19～21份，其中，各组分按体积比计，8～12份的SEQ IDNO.1～14所示的特异性扩增引物的混合物中的每条特异性扩增引物的浓度均为0.1～2μmol，1～2份的所述DNA聚合酶的浓度为0.5～3U/μl，19～21份的所述DNA模板的量为5～500ng

所述第二PCR扩增体系，包括：

蒸馏水8～10份，10*PCR buffer 4～6份，25mmol的MgSO₄或MgCl₂ 3～5份，20mmol的脱氧核糖核苷三磷酸混合物1～2份，SEQ ID NO.15～28所示的特异性扩增引物的混合物8～12份，DNA聚合酶1～2份和DNA模板19～21份，其中，各组分按体积比计，8～12份的SEQ IDNO.15～28所示的特异性扩增引物的混合物中的所述每条扩增引物(SEQ ID NO15～28)的浓度均为0.1～2μmol，1～2份的所述DNA聚合酶的浓度为0.5～3U/μl，19～21份的所述DNA模板的量为5～500ng；

和/或，

所述第一单碱基延伸反应体系，包括：

蒸馏水5～7份，10*PCR buffer 1～3份，20mmol的双脱氧核苷三磷酸混合物1～3份，SEQ ID NO.29～49所示的单碱基延伸引物的混合物8～12份，以及DNA聚合酶0.3～0.5份，其中，各组分按体积比计，0.3～0.5份的所述DNA聚合酶的浓度为0.5～2U/μl，8～12份SEQID NO.29～49所示的单碱基延伸引物的混合物中的每条单碱基延伸引物的浓度均为1～20μmol；

所述第二单碱基延伸反应体系，包括：

蒸馏水5～7份，10*PCR buffer 1～3份，20mmol的双脱氧核苷三磷酸混合物1～3份，SEQ ID NO.50～69所示的单碱基延伸引物的混合物8～12份，以及DNA聚合酶0.3～0.5份，其中，各组分按体积比计，0.3～0.5份的所述DNA聚合酶的浓度为0.5～2U/μl，8～12份SEQID NO.50～69所示的单碱基延伸引物的混合物中的每条单碱基延伸引物的浓度均为1～20μmol。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述利用PCR仪对所述第一PCR扩增体系和所述第二PCR扩增体系进行扩增反应，获得分别对应的第一扩增反应体系和第二扩增反应体系，包括：

利用PCR仪执行：

步骤A1：在90～98℃下，分别对所述第一PCR扩增体系和所述第二PCR扩增体系预热0.5～10min；

步骤A2：在90～98℃下，分别对预热后的所述第一PCR扩增体系和所述第二PCR扩增体系进行变性反应0.17～1min；

步骤A3：在45～60℃下，分别对变性反应后的所述第一PCR扩增体系和所述第二PCR扩增体系进行退火反应0.17～1min；

步骤A4：在60～72℃下，分别对退火反应后的所述PCR扩增体系进行延伸反应0.1～10min；

步骤A5：将步骤A2、步骤A3和步骤A4循环25～45次，分别对延伸反应后的所述第一PCR扩增体系和所述第二PCR扩增体系分别进行循环反应；

步骤A6：在60～72℃下，分别对循环反应后的所述第一PCR扩增体系和所述第二PCR扩增体系进行终延伸反应0～10min，获得所述第一PCR扩增体系扩增反应后的第一扩增反应体系和所述第二PCR扩增体系扩增反应后的第二扩增反应体系，并在2～10℃下，保存所述第一扩增反应体系和所述第二扩增反应体系。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述对所述第一扩增反应体系和所述第二扩增反应体系进行消化处理，获得所述第一扩增反应体系消化处理后的第一消化反应体系和所述第二扩增反应体系消化处理后的第二消化反应体系，包括：

分别向所述第一扩增反应体系和所述第二扩增反应体系中加入0.5～2U的碱性磷酸酶和对应的碱性磷酸酶缓冲液；

利用所述PCR仪，在25～40℃下，分别对加入所述碱性磷酸酶和所述碱性磷酸酶缓冲液的所述第一扩增反应体系和所述第二扩增反应体系进行消化处理10～60min，并在70～85℃下，分别对消化处理后的所述第一扩增反应体系和所述第二扩增反应体系进行加热变性处理5～30min，获得所述第一扩增反应体系消化处理后的第一消化反应体系和所述第二扩增反应体系消化处理后的第二消化反应体系，并在2～8℃下，保存所述第一消化反应体系和所述第二消化反应体系。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，

所述碱性磷酸酶，包括：虾碱性磷酸酶、小牛肠碱性磷酸酶、大肠杆菌碱性磷酸酶、大鼠碱性磷酸酶和热敏性碱性磷酸酶中的任意一种。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述对加入所述第一单碱基延伸反应体系后的所述第一消化反应体系和加入所述第二单碱基延伸反应体系后的所述第二消化反应体系进行延伸反应，获得分别对应的第一延伸反应体系和第二延伸反应体系，包括：

利用所述PCR仪执行：

步骤B1：在90～98℃下，分别对加入所述第一单碱基延伸反应体系后的所述第一消化反应体系和加入所述第二单碱基延伸反应体系后的所述第二消化反应体系预热0.1～10min；

步骤B2：在90～98℃下，分别对预热后的所述第一消化反应体系和所述第二消化反应体系进行变性反应5～10s；

步骤B3：在48～58℃下，分别对变性反应后的所述第一消化反应体系和所述第二消化反应体系进行退火反应5～30s；

步骤B4：在65～82℃下，分别对退火反应后的所述第一消化反应体系和所述第二消化反应体系进行延伸反应5～30s；

步骤B5：将步骤B3至步骤B4循环5次，分别对延伸反应后的所述第一消化反应体系和所述第二消化反应体系进行退火、延伸循环反应；

步骤B6：将步骤B2至步骤B5循环35-45次，分别对退火、延伸循环反应后的所述第一消化反应体系和所述第二消化反应体系进行扩增循环反应；

步骤B7：在68～75℃下，分别对扩增循环反应后的所述第一消化反应体系和所述第二消化反应体系进行终延伸反应0～10min，获得所述第一消化反应体系延伸反应后的第一延伸反应体系和所述第一消化反应体系延伸反应后的第二延伸反应体系，并在2～8℃下，保存所述第一延伸反应体系和所述第二延伸反应体系。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述对所述第一延伸反应体系和所述第二延伸反应体系进行脱盐纯化处理，获得分别对应的第一纯化产物和第二纯化产物，包括：

分别向所述第一延伸反应体系和所述第二延伸反应体系中加入树脂，再分别加入蒸馏水，并分别将加入所述树脂和所述蒸馏水的所述第一延伸反应体系和所述第二延伸反应体系混匀，将混匀后的所述第一延伸反应体系的上清液作为第一纯化产物，将混匀后的所述第二延伸反应体系的上清液作为第二纯化产物。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述对所述第一延伸反应体系和所述第二延伸反应体系进行脱盐纯化处理，获得分别对应的第一纯化产物和第二纯化产物，包括：

通过层析、超滤和分子筛中的任意一种或多种方式，分别去除所述第一延伸反应体系和所述第二延伸反应体系中的盐离子，获得所述第一延伸反应体系纯化后的第一纯化产物和所述第二延伸反应体系纯化后的第二纯化产物。

9.根据权利要求1至8中任一所述的方法，其特征在于，

所述检测仪器的检测条件，包括：所述质谱仪的喷雾电压为3500～4500V，鞘气为20～50Arb，辅气为10～50Arb，离子传输管温度为260～400℃，离子源雾化温度为300～400℃，离子源温度为300～400℃，分辨率为3000～140000。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，

所述检测仪器，进一步包括：高效液相色谱仪；

所述检测条件，进一步包括：C18反相色谱柱，所述C18反相色谱柱的柱温为：40～70℃，所述纯化产物的进样量为：5～100μl；

所述高效液相色谱仪的流动相为：A相：蒸馏水，B相：甲醇；

其中，色谱梯度为：0-2min，5％-20％B；2-5min，20％-55％B；5-7min，55％-95％B；7-8.5min，95％-5％B；8.5-10min，5％B。