CN103468815A

CN103468815A - 一种检测cyp2d6基因多态性的试剂盒及方法

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Publication number: CN103468815A
Application number: CN2013104334435A
Authority: CN
Inventors: 刘辉
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-09-22
Filing date: 2013-09-22
Publication date: 2013-12-25
Anticipated expiration: 2033-09-22
Also published as: CN103468815B

Abstract

本发明涉及一种检测CYP2D6基因多态性的试剂盒及方法，属于基因测序技术领域。所述试剂盒包括检测用引物，所述检测用引物包括：CYP2D6基因第1外显子至第9外显子的全长扩增特异性引物，以及CYP2D6基因第1外显子上下游测序引物、CYP2D6基因第2外显子上下游测序引物、CYP2D6基因第3～4外显子上下游测序引物、CYP2D6基因第5～7外显子上下游测序引物和CYP2D6基因第8～9外显子上下游测序引物中的至少一对。应用该试剂盒及方法进行检测的检测时间明显缩短、工作量显著下降，本发明的试剂盒为预测经CYP2D6代谢的药物使用剂量提供了一种全新的快速简便的手段。

Description

一种检测CYP2D6基因多态性的试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及基因测序技术领域，具体涉及一种检测CYP2D6基因多态性的试剂盒及方法。

背景技术

细胞色素P450（CYP450）是由亚铁血红素-硫醇盐蛋白组成的主要分布在内质网和线粒体内膜上一类基因家族，除了参与生物体内的甾醇类激素合成以外，还可以参与体内的内源性物质和外源性物质的代谢。细胞色素P450的结构、功能以及在药物代谢中的作用在国内外均得到了较广泛的研究。在遗传药理学上具有重要意义的细胞色素P450家族中，由CYP2D6基因编码酶是其成员之一，该基因位于22q13.1。研究表明在临床上它参与了如异喹胍(肾上腺素能阻断药物)、司巴丁和普罗帕酮(抗心律失常药物)以及阿米替林（抗抑郁药）等25%以上的常用药物的代谢。CYP2D6是所有参与药物代谢的细胞色素P450基因家族中唯一不能被诱导的酶，已知的等位基因变异就超过了90个，目前已经报道有105种，造成了不同的CYP2D6基因多态性，CYP2D6基因多态性具体详见CYP等位基因数据库（http://www.cypalleles.ki.se），而CYP2D6基因多态性对酶的个体活性有重要影响，其中某些产生弱代谢表型，使代谢能力下降，如CYP2D6*3、CYP2D6*4、CYP2D6*5、CYP2D6*6、CYP2D6*7等基因多态性。CYP2D6基因的两种正常基因型为CYP2D6*1、CYP2D6*2（C2850T突变）。CYP2D6酶对司巴丁、美托洛尔和异喹胍等药物的代谢在高加索和东方人中是独立的，且药物间不存在相互作用，而对一些非洲人群，上述药物之间却存在一定的相互作用，其原因可能是CYP2D6基因多态性和干扰性药物、饮食结构等因素的作用。目前，在欧洲人群中共检测出有53种不同的CYP2D6等位基因。研究表明，异喹胍等药物慢代谢者是具有某些缺陷等位基因，如CYP2D6*3，由于发生2549delA，导致编码蛋白质出现框移，致使酶的活性丧失，还如CYP2D6*9，由于发生三联体密码子2615_2617delAAG缺失，尽管未发生框移，但导致编码氨基酸缺乏使产生的活性较低，再比如CYP2D6*4为C100T和G1846A共同突变，CYP2D6*5为整个基因缺失突变，CYP2D6*10为C100T突变，另外，还有些为整个基因的重复突变。研究表明，CYP2D6基因多态性在不同种族人群中的分布频率具有较大的差异，在东方人中尚未发现CYP2D6*3和CYP2D6*4基因多态性，CYP2D6*5的突变频率与高加索人和非洲人差不多，但在东方人中发现了CYP2D6*10基因多态性，在东方人群中的突变频率高达50%，这种基因多态性是导致东方人CYP2D6酶活性降低的主要原因。

现有技术中采用直接测序法检测CYP2D6基因多态性，即首先采用PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）扩增不同的目的片段后，回收纯化PCR产物，然后进行测序。

由于直接测序法的检测时间过长，一般需要48个小时以上，使该检测的效率降低，因此，为检测CYP2D6基因多态性带来不便。

发明内容

针对现有技术中检测CYP2D6基因多态性的时间长、步骤繁琐、需要多次PCR的问题，本发明的目的在于提供一种检测CYP2D6基因多态性的试剂盒。

本发明的另一目的在于提供一种检测CYP2D6基因多态性的方法。

为了解决现有技术中检测CYP2D6基因多态性的时间长、步骤繁琐、需要多次PCR的问题，本发明提采用了以下技术方案：

一种检测CYP2D6基因多态性的试剂盒，包括，其特征在于，所述检测用引物包括：CYP2D6基因第1外显子至第9外显子的全长扩增特异性引物，以及CYP2D6基因第1外显子上下游测序引物、CYP2D6基因第2外显子上下游测序引物、CYP2D6基因第3～4外显子上下游测序引物、CYP2D6基因第5～7外显子上下游测序引物和CYP2D6基因第8～9外显子上下游测序引物中的至少一对，其中：

所述CYP2D6基因第1外显子至第9外显子的全长扩增特异性引物的上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；

所述CYP2D6基因第1外显子至第9外显子的全长扩增特异性引物的下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；

所述CYP2D6基因第1外显子测序引物的上游引物序列如序列表中SEQ IDNO:3所示；

所述CYP2D6基因第1外显子测序引物的下游引物序列如序列表中SEQ IDNO:4所示；

所述CYP2D6基因第2外显子测序引物的上游引物序列如序列表中SEQ IDNO:5所示；

所述CYP2D6基因第2外显子测序引物的下游引物序列如序列表中SEQ IDNO:6所示；

所述CYP2D6基因第3～4外显子测序引物的上游引物序列如序列表中SEQID NO:7所示；

所述CYP2D6基因第3～4外显子测序引物的下游引物序列如序列表中SEQID NO:8所示；

所述CYP2D6基因第5～7外显子测序引物的上游引物序列如序列表中SEQID NO:9所示；

所述CYP2D6基因第5～7外显子测序引物的下游引物序列如序列表中SEQID NO:10所示；

所述CYP2D6基因第8～9外显子测序引物的上游引物序列如序列表中SEQID NO:11所示；

所述CYP2D6基因第8～9外显子测序引物的下游引物序列如序列表中SEQID NO:12所示。

在上述试剂盒中，作为一种优选实施方式，所述试剂盒还包括内参基因ACTB以及内参基因ACTB扩增引物，其中，

所述内参基因ACTB扩增引物的上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:13所示；

所述内参基因ACTB扩增引物的下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:14所示；

所述内参基因ACTB的序列如序列表中SEQ ID NO:15所示。

在上述试剂盒中，作为一种优选实施方式，所述试剂盒还包括测序缓冲液，更优选地，所述测序缓冲液为Buffer缓冲液，所述Buffer缓冲液的pH为8.3。

在上述试剂盒中，作为一种优选实施方式，所述试剂盒还包括阴性对照和阳性对照，其中，所述阴性对照为去离子水；所述阳性对照为含有CYP2D6*3型的所述CYP2D6基因全长的基因组DNA样品。

在上述试剂盒中，作为一种优选实施方式，所述试剂盒还包括各种PCR反应试剂或者各种PCR反应试剂的混合物；更优选地，所述各种PCR反应试剂包括PCR预混合液、Mg²⁺（比如氯化镁）、dNTPs dUTP、Taq酶、BSA、T4噬菌体的基因32编码蛋白以及无RNase去离子水。

在上述试剂盒中，作为一种优选实施方式，所述试剂盒还包括内部阳性控制序列以及内部阳性控制序列的扩增引物，其中：所述内部阳性控制序列如序列表中SEQ ID NO:16所示；所述内部阳性控制序列的扩增引物的上游引物如序列表中SEQ ID NO:17所示；所述内部阳性控制序列的扩增引物的下游引物如序列表中SEQ ID NO:18所示。

在上述试剂盒中，各种优选实施方式可以任意组合。

一种检测CYP2D6基因多态性的方法，包括如下步骤：

步骤一，提取受检者基因组DNA；

步骤二，以步骤一得到的基因组DNA为模板，采用如序列表中SEQ ID NO:1所示的上游引物和如序列表中SEQ ID NO:2所示的下游引物，对CYP2D6基因第1外显子至第9外显子的全长序列进行PCR扩增；

步骤三，对步骤二的PCR扩增产物进行凝胶电泳，并回收纯化得到的CYP2D6基因第1外显子至第9外显子的DNA片段；

步骤四，以步骤三回收纯化后得到的CYP2D6基因第1外显子至第9外显子的DNA片段为模板，采用如序列表中SEQ ID NO:3所示的上游引物和SEQ IDNO:4所示的下游引物、SEQ ID NO:5所示的上游引物和SEQ ID NO:6所示的下游引物、SEQ ID NO:7所示的上游引物和SEQ ID NO:8所示的下游引物、SEQ IDNO:9所示的上游引物和SEQ ID NO:10所示的下游引物以及SEQ ID NO:11所示的上游引物和SEQ ID NO:11所示的下游引物中的至少一对上下游测序引物进行测序反应；

步骤五，将步骤四得到的测序反应产物纯化后上测序仪进行测序，将测得序列在NCBI核酸数据库中进行比对分析以获得CYP2D6基因多态性。

在上述方法中，作为一种优选实施方式，在所述步骤二中，所述PCR的反应条件如下：先经过95℃3min；然后进入PCR循环，所述PCR循环为95℃30s、57℃3.6min、72℃3min，共35个循环；最后72℃10min。更优选地，所述PCR的反应液中部分组分及浓度如下：1×的PCR预混合液、Mg²⁺：2.5-4.0mM、dNTPs：0.2-0.4mM、dUTP：0.3-0.6mM、Taq酶：0.2U/μL、BSA：1.25wt%、T4噬菌体的基因32编码蛋白：1nmol/L。

在上述方法中，作为一种优选实施方式，在所述步骤四中，所述测序反应的条件如下：先98℃变性2min，然后进行PCR循环，PCR循环参数为96℃10s，50℃5s，60℃4min，共25个循环。

在上述方法中，作为一种优选实施方式，在所述步骤二中，所述PCR反应中还加入了如序列表中SEQ ID NO:16所示的内部阳性控制序列、如序列表中SEQ ID NO:17所示的内部阳性控制序列的扩增引物的上游引物以及如序列表中SEQ ID NO:18所示的内部阳性控制序列的扩增引物的下游引物。

本发明试剂盒及检测方法的优点和效果如下：

（1）敏感性高：可以同时检测出目前报道的105种CYP2D6基因多态性

（2）特异性强：使用特异性引物扩增CYP2D6基因全长，然后进行测序，对特定的分子进行识别，准确性高，特异性好、假阳性低，可达到直接测序法的准确度，甚至比直接测序法更准确。

（3）简便安全：操作简单、安全，只需一次PCR扩增后可以同时进行多个外显子测序检测多态性，极大地减少了检测环节，降低了污染的可能性。

（4）全程监控：本发明实施例提供的试剂盒引入了内部阳性控制质量控制体系，对检测过程进行全程质量监控，有效避免假阳性或者假阴性。

（5）快速：速度快、高通量，只需一次性扩增CYP2D6基因全长，而无需对CYP2D6基因每个外显子进行扩增，极大地降低了劳动强度，节省了检测时间，可在8小时内完成。

本发明提供的检测CYP2D6基因多态性的试剂盒及方法，利用长片段PCR测序法快速、准确的检测目前报道的105种CYP2D6基因多态性，有效杜绝了假阳性和假阴性的发生，用于经CYP2D6代谢的药物的使用剂量的预测并为药物的选择提供了重要的手段。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例2提供的采用实施例1试剂盒的引物对扩增受检者外周血DNA PCR产物凝胶电泳结果，其片段大小与预计的核酸片段大小一致，其中扩增结果对应为：第一条带为Marker，第二条带为基因全长，第三条带为内参基因ACTB，第四条带为第一外显子，第五条带为第三外显子，第六条带为第五外显子，第七条带为第六外显子，第八条带为第九外显子，第十条带为阴性对照；图2是本发明实施例2提供的采用实施例1试剂盒的CYP2D6基因第1外显子上游测序引物进行测序后所得的结果，在第1外显子核酸序列100碱基处发生了100C>T，提示为CYP2D6基因多态性10*；

图3是本发明实施例2提供的采用实施例1试剂盒的CYP2D6基因第6外显子上游测序引物进行测序后所得的结果，在第6外显子核酸序列2850碱基处发生了2850C>T，提示为CYP2D6基因多态性2*。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法，如按照常规实验条件如Sambrook等人，分子克隆，实验手册（第三版）（科学出版社，2002）中所述的条件，或按照试剂制造厂家所建议的条件。

实施例1.试剂盒的制备

1、内参基因ACTB以及CYP2D6基因的引物设计

根据基因序列内参基因ACTB序列和CYP2D6基因序列来源于美国国家生物技术信息中心核酸数据库（NCBI），其中内参基因ACTB ID为60，参考序列号为NG_007992.1，也可参见本发明序列表中SEQ ID NO:15；CYP2D6基因ID为1565，参考序列号为NG_008376.2，采用Primer5.0引物设计软件分别设计内参基因ACTB和CYP2D6基因的特异引物，包括：CYP2D6基因第1外显子至第9外显子的全长扩增特异性引物的上下游引物；CYP2D6基因第1外显子测序引物的上下游引物；CYP2D6基因第2外显子测序引物的上下游引物；CYP2D6基因第3～4外显子测序引物的上下游引物；CYP2D6基因第5～7外显子测序引物的上下游引物；CYP2D6基因第8～9外显子测序引物的上下游引物；内参基因ACTB扩增上下游引物。其中如CYP2D6基因第1外显子上下游引物和CYP2D6基因第9外显子引物用于鉴别CYP2D6*10基因多态性，CYP2D6基因第3外显子上下游引物用于鉴别CYP2D6*4、CYP2D6*6和CYP2D6*8基因多态性，CYP2D6基因第5外显子上下游引物用于鉴别CYP2D6*9基因多态性，CYP2D6基因第6外显子上下游引物用于鉴别CYP2D6*3基因多态性，CYP2D6基因全长扩增引物除了用于扩增CYP2D6基因全长外，也同时用于鉴别CYP2D6*5基因多态性，共计能够检测105种CYP2D6基因型，其中，105种CYP2D6基因多态性具体详见CYP等位基因数据库（http://www.cypalleles.ki.se）。

通过上述引物设计得到：

CYP2D6基因第1外显子至第9外显子的全长扩增特异性引物的上下游引物分别为5’-TGGCAGCACAGTCAACACAG-3’（如序列表中SEQ ID NO:1所示）、5’-GGAACTACCACATTGCTTTATTG-3’（如序列表中SEQ ID NO:2所示）。

CYP2D6基因第1外显子测序引物的上下游引物分别为5’-TGCTGAGAGTGTCCTGCCT-3’（如序列表中SEQ ID NO:3所示）、5’-TTTCACCCACCACCCATGTTT-3’（如序列表中SEQ ID NO:4所示）。

CYP2D6基因第2外显子测序引物的上下游引物分别为5’-ATAGGGTTGGAGTGGGTGGT-3’（如序列表中SEQ ID NO:5所示）、5’-TCACGGCTTTGTCCAAGAGA-3’（如序列表中SEQ ID NO:6所示）。

CYP2D6基因第3～4外显子测序引物的上下游引物分别为5’-TGAGACTTGTCCAGGTGAACG-3’（如序列表中SEQ ID NO:7所示）、5’-TCAACCCACCACCCTTGC-3’（如序列表中SEQ ID NO:8所示）。

CYP2D6基因第5～7外显子测序引物的上下游引物分别为5’-GCAGAATTGGAGGTCATTTGG-3’（如序列表中SEQ ID NO:9所示）、5’-TGTCCCAGCAAAGTTCATGG-3’（如序列表中SEQ ID NO:10所示）。

CYP2D6基因第8～9外显子测序引物的上下游引物分别为5’-TATCACCCAGGAGCCAGG-3’（如序列表中SEQ ID NO:11所示）、5’-CACATTGCTTTATTGTACATTAGAGCC-3’（如序列表中SEQ ID NO:12所示）。

内参基因ACTB扩增上下游引物分别为5’-CGATTTCTCGCAGCTCACCAT-3’（如序列表中SEQ ID NO:13所示）、5’-AATACACACTCCAAGGCCGC-3’（如序列表中SEQ ID NO:14所示）。

2、内部阳性控制序列及其引物的设计

该内部阳性控制序列包含CYP2D6基因部分序列和一部分人工合成序列，如序列表中SEQ ID NO:16所示。

采用Primer5.0引物设计软件并按照上述引物设计原则设计出上述内部阳性控制序列的上下游引物分别为：5’-GCGCGTGACACTGCTACATG-3’（如序列表中SEQ ID NO:17所示）、5’-TCGAGTAGCTGAGACTGCGT-3’（如序列表中SEQ ID NO:18所示）。

3、试剂盒的组成及制备

①基因组DNA提取试剂：该提取试剂为本领域常用试剂，本实施例采用组织基因组DNA提取试剂盒（Qiagen公司，货号：69504）中的试剂。

②引物：包括上述CYP2D6基因第1外显子至第9外显子的全长扩增上下游引物、上述CYP2D6基因第1外显子上下游测序引物、上述CYP2D6基因第2外显子上下游测序引物、上述CYP2D6基因第3～4外显子上下游测序引物、上述CYP2D6基因第5～7外显子上下游测序引物、上述CYP2D6基因第8～9外显子上下游测序引物、上述内部阳性控制序列上下游引物和上述内参基因ACTB的上下游引物。

③上述内参基因ACTB以及内部阳性控制序列。

上述引物序列、内部阳性控制序列和内参基因ACTB序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

④阴性对照和阳性对照：以去离子水为阴性对照，以含有CYP2D6基因CYP2D6*3多态性的基因组DNA样品为阳性对照；

阳性对照的制备：采用组织基因组DNA提取试剂盒（Qiagen公司，货号：69504）快速提取已经确诊的含有CYP2D6基因CYP2D6*3多态性的0.5ml受检者外周血基因组DNA，作为阳性对照。

⑤各种PCR反应试剂：PCR预混合液，本实施例中选用2×PCR Premix（Qiagen公司，产品货号：210212）；Mg²⁺、dNTPs、dUTP、Taq酶、BSA（Albuminfrom bovine serum，牛血清白蛋白）、T4噬菌体的基因32编码蛋白、无RNase去离子水。

⑥测序缓冲液，pH为8.3的Buffer缓冲液，其Buffer缓冲液的配制：1μlBigdye和3μl5x含10mM MgCl₂的400mM Tris溶液。

实施例2.用实施例1制备的试剂盒检测CYP2D6基因多态性

以随机检测30例受检者外周血标本结果为例。

用本发明的试剂盒检测人群中CYP2D6基因多态性的检测流程为：首先，获取临床受检者外周血样本，快速提取基因组DNA；其次，先配制内参基因ACTB的PCR反应液，然后加入浓度均为2ng/μl的内参基因ACTB序列和内部阳性控制序列各2μl，进行PCR扩增，PCR结束后在浓度为2%的琼脂糖DNA凝胶中进行电泳，查看PCR扩增情况。如果内参基因ACTB的PCR扩增产物中存在390bp和800bp左右的两个条带，提示整个检测过程有效，如果缺少一条或二条带，提示检测失败，则需要重新进行检测。再次，如果通过内参基因ACTB的PCR结果证明检测过程有效，则配制CYP2D6基因全长扩增PCR反应液和阴性、阳性反应液，前者中加入2μl提取的受检者外周血基因组DNA，后者分别加入2ul去离子水和阳性样品DNA，并各加入浓度为2ng/ul内部阳性控制序列2ul，进行PCR扩增，PCR扩增结束后在浓度为2%的琼脂糖DNA凝胶电泳上成像，查看PCR扩增情况。受检者外周血标本应为4500bp和390bp左右条带各一个，阳性对照组为300bp和390bp左右条带各一个，阴性对照组为390bp条带1个。最后，PCR扩增结果采用软件分析，并标化计算样本数据。

最后，回收纯化PCR产物以得到受检者CYP2D6基因第1外显子至第9外显子的DNA片段，将该DNA片段用于测序反应的模板，配制PCR测序反应液后进行PCR测序反应，将PCR测序反应物纯化后上测序仪进行测序。

CYP2D6基因多态性的具体检测步骤如下：

①受检者外周血基因组DNA的抽提：采用实施例1试剂盒中的基因组DNA提取试剂按DNA抽提纯化的方法快速提取0.5ml受检者外周血基因组DNA。

②将上述提取的受检者外周血基因组DNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，通过紫外分光光度计测定260nm与280nm光密度值计算DNA的纯度与浓度，用无菌去离子水调节抽提的DNA至相同浓度，置冰箱-20℃保存。

③将实施例1试剂盒中的内部阳性控制序列标准品和内参基因ACTB标准品分别稀释至浓度为2ng/μl。

④内参基因ACTB的PCR扩增：

PCR反应体系为20μL，在该反应体系中各成分及终浓度如下：1×的PCR预混合液（Qiagen公司，产品货号：210212，2×PCR Premix，10.0μL）、Mg²⁺：3mM；dNTPs：0.3mM；dUTP：0.5mM；Taq酶：0.2U/μL；BSA：1.25wt%；T4噬菌体的基因32编码蛋白：1nmol/L；内参基因ACTB上、下游引物均为：0.25pmol/μL；内部阳性控制序列上、下游引物均为：0.25pmol/μL；内部阳性控制序列：0.3pmol/μL；内参基因ACTB序列:0.2ng/μl；其余为无RNase去离子水。

在ABI9700PCR仪器上进行PCR扩增，PCR反应程序为：先经过95℃3min,然后95℃30s，57℃3.6min，72℃3min，35个循环，最后72℃10min。

PCR扩增结束后在浓度为2%的琼脂糖DNA凝胶电泳上成像。如图1的第三条带所示，存在390bp和800bp左右的两个条带，提示整个检测过程有效，因此可以进行以下操作。

⑤CYP2D6基因第1外显子至第9外显子的全长PCR扩增：

PCR反应体系为20μL，在该反应体系中各成分及终浓度如下：1×的PCR预混合液（Qiagen公司，产品货号：210212，2×PCR Premix，10.0μL）；Mg²⁺：3mM；dNTPs：0.3mM；dUTP：0.5mM；Taq酶：0.2U/μL；BSA：1.25wt%；T4噬菌体的基因32编码蛋白：1nmol/L；CYP2D6基因第1外显子至第9外显子的全长扩增特异性上、下游引物均为0.25pmol/μL；内部阳性控制序列上、下游引物均为0.25pmol/μL；内部阳性控制序列：0.3pmol/μL；受检者外周血基因组DNA的用量为2μL；其余为无RNase去离子水。

在CYP2D6基因第1外显子至第9外显子的全长PCR扩增的同时设置阳性对照和阴性对照，阳性对照和阴性对照的反应体系均为20μL，在该反应体系中各成分及终浓度如下：1×的PCR预混合液（Qiagen公司，产品货号：210212，2×PCR Premix，10.0μL）；Mg²⁺：3mM；dNTPs：0.3mM；dUTP：0.5mM；Taq酶：0.2U/μL；BSA：1.25wt%；T4噬菌体的基因32编码蛋白：1nmol/L；内参基因ACTB扩增上、下游引物均为：0.25pmol/μL；内部阳性控制序列上、下游引物均为0.25pmol/μL；内部阳性控制序列：0.3pmol/μL；阳性样品或者阴性样品的用量为2μL，其余为无RNase去离子水。

PCR扩增结束后在浓度为2%的琼脂糖DNA凝胶电泳上成像。以其中一个受检者的PCR结果为例，如图1第二条带所示，受检者外周血标本有4500bp和390bp左右条带各一个，阳性对照组有300bp和390bp左右条带各一个，阴性对照组有390bp条带1个。

⑥分别切取CYP2D6基因全长PCR产物和内部阳性控制序列PCR产物，利用Axy公司DNA凝胶回收试剂盒回收纯化扩增的DNA片段。

⑦测序反应液的配制：取4μl Buffer测序缓冲液，浓度均为1pmol/l的CYP2D6基因第1外显子上下游测序引物各1μl、浓度均为1pmol/l的CYP2D6基因第2外显子上下游测序引物各1μl、浓度均为1pmol/l的CYP2D6基因第3～4外显子上下游测序引物各1μl、浓度均为1pmol/l的CYP2D6基因第5～7外显子上下游测序引物各1μl、浓度均为1pmol/l的CYP2D6基因第8～9外显子上下游测序引物各1μl，再加入1μl2ng/μl的步骤⑥纯化得到的CYP2D6基因全长DNA；

在ABI9700仪器上先98℃变性2min，然后进行PCR循环，PCR循环参数为96℃10s，50℃5s，60℃4min，25个循环，扩增结束后设置4℃保温。

⑧采用醋酸钠/乙醇法纯化步骤⑦的测序反应产物，按照ABI3130测序仪的操作说明进行测序⑨数据收集处理和分析：将所测得序列在NCBI核酸数据库中进行比对分析，分析CYP2D6基因多态性，结果参见表1。

表1为长片段PCR测序法分析受检者外周血基因组中CYP2D6基因多态性

本发明试剂盒检测能力评价：

以直接测序法作为本发明的比较检测方法，同时对上述30例受检者外周血标本进行检测，分析结果与表1相同，因此，采用本发明本试剂盒进行检测的敏感性、特异性及灵敏度与直接测序法一致，但检测时间明显缩短、劳动强度明显下降，完全符合实用要求（具体参见表2）。

表2为两种不同方法检测受检者外周血中CYP2D6基因多态性的比较

由上表可知，通过长片段PCR扩增测序法检验CYP2D6基因多态性，以直接测序法作为参照，长片段PCR扩增测序法和直接测序法同时检测到17例突变型和13例野生型，二者检测结果一致，由此得出，长片段PCR扩增测序法的阳性预测值为100%；长片段PCR扩增测序法和直接测序法同时检测到13例野生型，均未检测出突变型，由此得出，长片段PCR扩增测序法的阴性预测值为100%，同时，特异性和灵敏度均为100%，阳性预测值和阴性预测值也达到100%，且多次重复实验结果一致，采用本发明方法一份临床标本的检测时间约为10h，耗时短，而直接测序法法耗时约48h。

上述实验可以说明，采用敏感性及特异性均较高的本发明提供的试剂盒并利用长片段PCR测序法检测CYP2D6基因多态性，其检测结果的特异性和敏感度不降低的条件下，检测时间明显缩短及劳动强度明显降低，该试剂盒为受检者外周血CYP2D6基因多态性的分型提供了一种全新的快速简便的技术，同时，具有检测快速以及降低了污染等特点，而且目前尚未有长片段PCR测序法检测CYP2D6基因多态性试剂盒的相关报道，本发明提供的试剂盒有利于预测药物疗效，指导药物的选择性用药。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种检测CYP2D6基因多态性的试剂盒，包括检测用引物，其特征在于，所述检测用引物包括：CYP2D6基因第1外显子至第9外显子的全长扩增特异性引物，以及CYP2D6基因第1外显子上下游测序引物、CYP2D6基因第2外显子上下游测序引物、CYP2D6基因第3～4外显子上下游测序引物、CYP2D6基因第5～7外显子上下游测序引物和CYP2D6基因第8～9外显子上下游测序引物中的至少一对，其中：

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内参基因ACTB以及内参基因ACTB扩增引物，其中，

所述内参基因ACTB的序列如序列表中SEQ ID NO:15所示。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括测序缓冲液，优选地，所述测序缓冲液为Buffer缓冲液，所述Buffer缓冲液的pH为8.3。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照和阳性对照，其中，所述阴性对照为去离子水；所述阳性对照为含有CYP2D6*3型的所述CYP2D6基因全长的基因组DNA样品。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括各种PCR反应试剂或者各种PCR反应试剂的混合物，优选地，所述各种PCR反应试剂包括PCR预混合液、Mg²⁺、dNTPs、dUTP、Taq酶、BSA、T4噬菌体的基因32编码蛋白以及无RNase去离子水。

6.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内部阳性控制序列以及内部阳性控制序列的扩增引物，其中：

所述内部阳性控制序列如序列表中SEQ ID NO:16所示；

所述内部阳性控制序列的扩增引物的上游引物如序列表中SEQ ID NO:17所示；所述内部阳性控制序列的扩增引物的下游引物如序列表中SEQ ID NO:18所示。

7.一种检测CYP2D6基因多态性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，提取受检者基因组DNA；

步骤三，对步骤二的PCR扩增产物进行凝胶电泳，并回收纯化得到的CYP2D6基因第1外显子至第9外显子的DNA片段；步骤四，以步骤三回收纯化后得到的CYP2D6基因第1外显子至第9外显子的DNA片段为模板，采用如序列表中SEQ ID NO:3所示的上游引物和SEQ ID NO:4所示的下游引物、SEQID NO:5所示的上游引物和SEQ ID NO:6所示的下游引物、SEQ ID NO:7所示的上游引物和SEQ ID NO:8所示的下游引物、SEQ ID NO:9所示的上游引物和SEQID NO:10所示的下游引物以及SEQ ID NO:11所示的上游引物和SEQ ID NO:11所示的下游引物中的至少一对上下游测序引物进行测序反应；

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在所述步骤二中，所述PCR的反应条件如下：先经过95℃3min；然后进入PCR循环，所述PCR循环为95℃30s、57℃3.6min、72℃3min，共35个循环；最后72℃10min。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在所述步骤四中，所述测序反应的条件如下：先98℃变性2min，然后进行PCR循环，PCR循环参数为96℃10s，50℃5s，60℃4min，共25个循环。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在所述步骤二中，所述PCR反应中还加入了如序列表中SEQ ID NO:16所示的内部阳性控制序列、如序列表中SEQ ID NO:17所示的内部阳性控制序列的扩增引物的上游引物以及如序列表中SEQ ID NO:18所示的内部阳性控制序列的扩增引物的下游引物。