CN101109018A - Cyp2d6基因第九号外显子的单核苷酸多态性的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种CYP2D6基因第九号外显子的单核苷酸多态性的检测方法，同时涉及一种分离核酸、一种等位基因特异性的核酸引物。方法包括：确定在人CYP2D6基因第九号外显子的SEQ ID NO：1所示序列的第1322位的核苷酸；检测在所述位置是否存在单核苷酸多态性；一种分离核酸，具有SEQ ID NO：1所示的序列，且第1322位为A；一种等位基因特异性的核酸引物，其长度为15－50bp，且特异性地杂交并扩增出含人CYP2D6基因的第九号外显子的SEQ IDNO：1所示序列的第1322位的单核苷酸多态性的扩增产物。本发明可用于研究我国人群中CYP2D6基因多态性与临床用药安全的关系，为新药研发提供指导依据。

Description

CYP2D6基因第九号外显子的单核苷酸多态性的检测方法

技术领域

本发明涉及的是基因技术领域的核酸及其引物和检测方法，具体地讲是一种分离核酸、一种等位基因特异性的核酸引物和CYP2D6基因第九号外显子的单核苷酸多态性的检测方法。

背景技术

细胞色素氧化酶P450 2D6(CYP2D6)也称之为异喹胍羟化酶，是细胞色素P450的一个成员。CYP2D是第一个被发现存在遗传多态性的细胞色素氧化酶P450，目前哺乳动物体内至少发现了21种CYP2D。而人类的CYP2D位于22q13.1，由CYP2D6、CYP2D7P和CYP2D8P共同构成，其中CYP2D7P和CYP2D8P为假基因，仅CYP2D6有功能蛋白表达。CYP2D6主要在肝脏中表达，CYP2D6共有497个氨基酸组成。CYP2D6不仅氧化代谢某些内源性的类固醇激素，而且还是20-25％常用药物的主要代谢酶。CYP2D6的底物包括β受体阻断剂普萘洛尔(Propranolol)等、抗心率失常药奎尼丁(Quinidine)、普罗帕酮(Propafenone)等，降压药异喹胍(Debrisoquine)等，镇痛药曲马多(Tramadol)，抗精神病药奋乃静(Perphenazine)、氟哌丁醇(Haloperidol)等，止咳平喘药可待因(Codeine)、右美沙芬(Dextromethorphan)等，降血糖药苯乙双胍(Phenformine)等，5-HT拮抗剂托烷司琼(Tropisetron)等，三环类抗抑郁药，抗心绞痛药等。CYP2D6的活性受到遗传因素及环境因素的影响，但遗传因素是最主要的原因。多数CYP2D6的单核苷酸突变可以影响基因的后续转录和表达，进而改变了酶的结构和活性，这是造成个体差异的主要原因。鉴于CYP2D6在药物代谢中的作用及活性存在个体差异，因此对解决CYP2D6基因多态性的检测和相关问题是现有技术急需解决的技术难题。

对现有文献的检索，未发现有本发明的CYP2D6基因第九号外显子(G4046A)SNP(单核苷酸多态性)相关的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种CYP2D6基因第九号外显子的单核苷酸多态性的检测方法，同时涉及一种分离核酸、一种等位基因特异性的核酸引物，可用于评估个体患CYP2D6基因的第九号外显子相关疾病的易感性，以及用于CYP2D6基因多态性与临床用药安全关系的研究。

本发明是通过以下技术方案实现的，第一方面，提供了一种检测人CYP2D6基因第九号外显子的单核苷酸多态性的方法，它包括步骤：

(a)采用Primer 5.0等相关软件，以GenBank数据库CYP2D6基因(AY545216)第九号外显子以及外显子与内含子接合部位序列为模板设计一对等位基因特异性的核酸引物，利用引物对来扩增CYP2D6基因的第九号外显子的DNA序列，对扩增产物进行分离纯化，得到相应分离核酸。

(b)检测在所述位置是否存在单核苷酸多态性。采用一些分析技术可用于检测分离核酸的CYP2D6基因第九号外显子的SEQ ID NO：1所示序列的第1322位核苷酸是否存在单核苷酸多态性，即G→A多态性。

这些分析技术包括(但并不限于)：DNA测序法、杂交测序法；酶促错配切割法、异源双链分析法、点杂交法、寡核苷酸阵列法、微测序法、Taqman技术、分子信标法，变性高效液相色谱法。

在本发明的第二方面，提供了一种分离核酸，它具有SEQ ID NO：1所示的序列，且第1322位为A。

在本发明的第三方面，提供了一种等位基因特异性的核酸引物，其长度为15-50bp，且特异性地杂交并扩增出含人CYP2D6基因第九号外显子的SEQ ID NO：1所示序列的第1322位的单核苷酸多态性的扩增产物。

本发明所述的“分离纯化”是指在基因组DNA水平上，利用引物对来扩增每个多态性位点的基因序列和利用纯化试剂盒对扩增产物进行提纯。

用于本发明的测试样品没有特别限制，对于检测SNP而言，可以是从血液、组织等样品中抽提出的DNA或mRNA。对于CYP2D6基因的第九号外显子活性而言，可以任何含有CYP2D6基因的第九号外显子的样品，如血液等。

本发明的实质性特点和显著进步表现在：是一项原创性的发明。本发明的内容涉及一种分离出的或纯化的CYP2D6基因的第九号外显子多态性位点的基因序列，所说的“分离出的或纯化的”是指在基因组DNA水平上，利用引物对来扩增多态性位点的基因序列和利用纯化试剂盒对扩增产物进行提纯。通过对所取样品CYP2D6基因测序结果，在上海中发现了1个样品含有CYP2D6基因的第九号外显子SNP(即第1322位G→A多态性)，频率为0.003。经分析发现，该SNP导致第441位氨基酸由Arg(R)→His(H)。由于这是不同性质氨基酸的置换，因此，会导致CYP2D6基因的第九号外显子所编码的蛋白活性发生改变，从而引起酶活性发生改变，进一步影响CYP2D6酶代谢的药物。

本发明为研究我国人群中CYP2D6基因多态性与临床用药安全的关系奠定了基础，为药物设计和临床用药个体化提供了基因学理论根据，同时也为基于药物基因组学理念的新药研发提供指导依据，具有重大的理论意义和潜在的实用价值。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

步骤1

一种核酸的分离和测序

引物设计：

采用Primer 5.0软件，以GenBank数据库CYP2D6基因(AY545216)第九号外显子以及外显子与内含子接合部位序列为模板设计一对等位基因特异性的核酸引物，由Invitrogen公司合成。

引物信息：

扩增CYP2D6基因的第九号外显子SNP位点的DNA序列引物信息：

正向引物5’-CAGAGTCCAGCTGTGTGCCA-3’

反向引物5’-TGGGGTCACCAGGAAAGCAAA-3’

PCR扩增条件：(体系各项试剂除DNA外均由Bio-Asia公司提供)

反应体系总体积为15μl，其中

ddH₂O 8.8μl灭菌双蒸水

10X Buffer 1.5μl聚合反应缓冲液包含KCl Tris-HCl溶液

DMSO 0.6μl

2mM dNTP 1.5μl  2mM dNTP溶液

10pM正反向引物各0.9μl

5U Taq 0.3μl DNA合成多聚酶

10ng DNA 0.5μl 10ng人体DNA扩增摸板

PCR反应条件：

94℃ 3mins；94℃ 30seconds；64℃ 30seconds，-0.5℃/CYCLE；72℃1min；14times to 2；30×(94℃ 30seconds；57℃ 30seconds；72℃ 1min；)72℃ 10mins。

测序反应均作正反向，条件如下：

扩增产物酶纯化法：PCR产物2μl加入2μl纯化酶系内含SAP(Shrimpalkaline phosphatase，碱性磷酸酶)0.15u和Exo-nuclease I(核酸外切酶I)0.75u/ul，37℃ 30mins，85℃ 20mins，4℃保存备用。

测序采用ABI Prism BigDye terminator(BDT)cycle sequencing reactionkit(PE Applied Biosystems)，测序总体积为5μl，其中纯化后的PCR产物4μl，BDT 0.5μl，正向或反向引物0.5μl。反应条件是94℃ 2mins，35 X (94℃ 30seconds，55℃ 40seconds，60℃ 1.5mins)，4℃保存备用。

上样前纯化：5μl测序产物中加入25μl无水乙醇和3.0mol/L醋酸钠混合液(V∶V＝25∶1)，室温、避光、静置15min，4000rpm/min 45mins，700rpm/min5seconds弃上清；2×(75％Alcohol 25μl，4000rpm/min 10mins，700rpm/min5seconds弃上清)；室温、避光、静置、风干20mins；上样8μl于3100测序仪进行测序。

步骤2

SNP的获得

对CYP2D6基因进行直接测序。将测定的各样本序列与GenBank数据库CYP2D6基因序列(AY545216)进行比较，从而得出序列的差异。在上海中发现了1个样品含有CYP2D6基因第九号外显子SNP(即第1322位G→A多态性)，而其它样品的基因型均为GG，只有这1个样品的基因型为GA，基因频率为0.003。经分析发现，该SNP导致第441位氨基酸由Arg(R)→His(H)。由于这是不同性质氨基酸的置换，因此，会导致CYP2D6基因第九号外显子所编码的蛋白活性发生改变。

CYP2D6基因CDS及其多态性位点的CDS序列如SEQ NO.1所示：

(a)序列特征：

*长度：1494碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

(b)反义：否

(c)最初来源：人

(d)SEQ ID NO.1核酸序列描述如下：

  1 atggggctag aagcactggt gcccctggcc gtgatagtgg ccatcttcct gctcctggtg

 61 gacctgatgc accggcgcca acgctgggct gcacgctacc caccaggccc cctgccactg

121 cccgggctgg gcaacctgct gcatgtggac ttccagaaca caccatactg cttcgaccag

181 ttgcggcgcc gcttcgggga cgtgttcagc ctgcagctgg cctggacgcc ggtggtcgtg

241 ctcaatgggc tggcggccgt gcgcgaggcg ctggtgaccc acggcgagga caccgccgac

301 cgcccgcctg tgcccatcac ccagatcctg ggtttcgggc cgcgttccca aggggtgttc

361 ctggcgcgct atgggcccgc gtggcgcgag cagaggcgct tctccgtgtc caccttgcgc

421 aacttgggcc tgggcaagaa gtcgctggag cagtgggtga ccgaggaggc cgcctgcctt

481 tgtgccgcct tcgccaacca ctccggacgc ccctttcgcc ccaacggtct cttggacaaa

 541 gccgtgagca acgtgatcgc ctccctcacc tgcgggcgcc gcttcgagta cgacgaccct

 601 cgcttcctca ggctgctgga cctagctcag gagggactga aggaggagtc gggctttctg

 661 cgcgaggtgc tgaatgctgt ccccgtcctc ctgcatatcc cagcgctggc tggcaaggtc

 721 ctacgcttcc aaaaggcttt cctgacccag ctggatgagc tgctaactga gcacaggatg

 781 acctgggacc cagcccagcc cccccgagac ctgactgagg ccttcctggc agagatggag

 841 aaggccaagg ggaaccctga gagcagcttc aatgatgaga acctgcgcat agtggtggct

 901 gacctgttct ctgccgggat ggtgaccacc tcgaccacgc tggcctgggg cctcctgctc

 961 atgatcctac atccggatgt gcagcgccgt gtccaacagg agatcgacga cgtgataggg

1021 caggtgcggc gaccagagat gggtgaccag gctcacatgc cctacaccac tgccgtgatt

1081 catgaggtgc agcgctttgg ggacatcgtc cccctgggtg tgacccatat gacatcccgt

1141 gacatcgaag tacagggctt ccgcatccct aagggaacga cactcatcac caacctgtca

1201 tcggtgctga aggatgaggc cgtctgggag aagcccttcc gcttccaccc cgaacacttc

1261 ctggatgccc agggccactt tgtgaagccg gaggccttcc tgcctttctc agcaggccgc

1321 cgtgcatgcc tcggggagcc cctggcccgc atggagctct tcctcttctt cacctccctg

1381 ctgcagcact tcagcttctc ggtgcccact ggacagcccc ggcccagcca ccatggtgtc

1441 tttgctttcc tggtgagccc atccccctat gagctttgtg ctgtgccccg ctag

CYP2D6基因CDS及其多态性位点的氨基酸序列如SEQ NO.2所示：

SEQ ID NO.2氨基酸序列描述如下：

(a)序列特征：

*长度：497氨基酸

*类型：蛋白质

(b)反义：否

(c)最初来源：人

(d)SEQ ID NO.2核酸序列描述如下：

  1 mglealvpla vivaiflllv dlmhrrqrwa aryppgplpl pglgnllhvd fqntpycfdq

 61 lrrrfgdvfs lqlawtpvvv lnglaavrea lvthgedtad rppvpitqil gfgprsqgvf

121 larygpawre qrrfsvstlr nlglgkksle qwvteeaacl caafanhsgr pfrpnglldk

181 avsnviaslt cgrrfeyddp rflrlldlaq eglkeesgfl revlnavpvl lhipalagkv

241 lrfqkafltq ldelltehrm twdpaqpprd lteaflaeme kakgnpessf ndenlrivva

301 dlfsagmvtt sttlawglll milhpdvqrr vqqeiddvig qvrrpemgdq ahmpyttavi

361 hevqrfgdiv plgvthmtsr dievqgfrip kgttlitnls svlkdeavwe kpfrfhpehf

421 ldaqghfvkp eaflpfsagr raclgeplar melflfftsl lqhfsfsvpt gqprpshhgv

481 faflvspspy elcavpr

本发明实施例中采用的样品包括上海(100例，男女各50例，年龄为18-53岁)、汕头(100例，男女各50例，年龄为18-53岁)、和西安(100例，男女各50例，年龄为18-53岁)，沈阳(100例，男女各50例，年龄为18-53岁)，均为正常人。全体参与者均在正式的知情同意书上同意签字。

对所取样品进行CYP2D6基因的PCR扩增与测序，根据对所取样品CYP2D6基因测序结果，在上海中发现了1个样品含有CYP2D6基因的第九号外显子SNP(即第1322位G→A多态性)，频率为0.003经分析发现，该SNP导致第441位氨基酸由Arg(R)→His(H)。由于这是不同性质氨基酸的置换，因此，会导致CYP2D6基因所编码的蛋白活性发生改变。

CYP2D6基因的第九号外显子的cDNA序列列于SEQ ID NO：1，其中开放阅读框为第1-1494位，其所编码的氨基酸序列列于SEQ ID NO：2。CYP2D6基因的第九号外显子的基因组序列可以从GenBank中获得。

序列表

<110>上海交通大学

<120>CYP2D6基因第九号外显子的单核苷酸多态性的检测方法

<160>3

<210>1

<211>1494

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1322)

<223>n＝g或a

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(1494)

<400>1

  1 atggggctag aagcactggt gcccctggcc gtgatagtgg ccatcttcct gctcctggtg

 61 gacctgatgc accggcgcca acgctgggct gcacgctacc caccaggccc cctgccactg

121 cccgggctgg gcaacctgct gcatgtggac ttccagaaca caccatactg cttcgaccag

181 ttgcggcgcc gcttcgggga cgtgttcagc ctgcagctgg cctggacgcc ggtggtcgtg

241 ctcaatgggc tggcggccgt gcgcgaggcg ctggtgaccc acggcgagga caccgccgac

301 cgcccgcctg tgcccatcac ccagatcctg ggtttcgggc cgcgttccca aggggtgttc

361 ctggcgcgct atgggcccgc gtggcgcgag cagaggcgct tctccgtgtc caccttgcgc

421 aacttgggcc tgggcaagaa gtcgctggag cagtgggtga ccgaggaggc cgcctgcctt

481 tgtgccgcct tcgccaacca ctccggacgc ccctttcgcc ccaacggtct cttggacaaa

541 gccgtgagca acgtgatcgc ctccctcacc tgcgggcgcc gcttcgagta cgacgaccct

601 cgcttcctca ggctgctgga cctagctcag gagggactga aggaggagtc gggctttctg

661 cgcgaggtgc tgaatgctgt ccccgtcctc ctgcatatcc cagcgctggc tggcaaggtc

 721 ctacgcttcc aaaaggcttt cctgacccag ctggatgagc tgctaactga gcacaggatg

 781 acctgggacc cagcccagcc cccccgagac ctgactgagg ccttcctggc agagatggag

 841 aaggccaagg ggaaccctga gagcagcttc aatgatgaga acctgcgcat agtggtggct

 901 gacctgttct ctgccgggat ggtgaccacc tcgaccacgc tggcctgggg cctcctgctc

 961 atgatcctac atccggatgt gcagcgccgt gtccaacagg agatcgacga cgtgataggg

1021 caggtgcggc gaccagagat gggtgaccag gctcacatgc cctacaccac tgccgtgatt

1081 catgaggtgc agcgctttgg ggacatcgtc cccctgggtg tgacccatat gacatcccgt

1141 gacatcgaag tacagggctt ccgcatccct aagggaacga cactcatcac caacctgtca

1201 tcggtgctga aggatgaggc cgtctgggag aagcccttcc gcttccaccc cgaacacttc

1261 ctggatgccc agggccactt tgtgaagccg gaggccttcc tgcctttctc agcaggccgc

1321 cgtgcatgcc tcggggagcc cctggcccgc atggagctct tcctcttctt cacctccctg

1381 ctgcagcact tcagcttctc ggtgcccact ggacagcccc ggcccagcca ccatggtgtc

1441 tttgctttcc tggtgagccc atccccctat gagctttgtg ctgtgccccg ctag

<210>2

<211>497

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>2

  1 mglealvpla vivaiflllv dlmhrrqrwa aryppgplpl pglgnllhvd fqntpycfdq

 61 lrrrfgdvfs lqlawtpvvv lnglaavrea lvthgedtad rppvpitqil gfgprsqgvf

121 larygpawre qrrfsvstlr nlglgkksle qwvteeaacl caafanhsgr pfrpnglldk

181 avsnviaslt cgrrfeyddp rflrlldlaq eglkeesgfl revlnavpvl lhipalagkv

241 lrfqkafltq ldelltehrm twdpaqpprd lteaflaeme kakgnpessf ndenlrivva

301 dlfsagmvtt sttlawglll milhpdvqrr vqqeiddvig qvrrpemgdq ahmpyttavi

361 hevqrfgdiv plgvthmtsr dievqgfrip kgttlitnls svlkdeavwe kpfrfhpehf

421 ldaqghfvkp eaflpfsagr raclgeplar melflfftsl lqhfsfsvpt gqprpshhgv

481 faflvspspy elcavpr

Claims (5)

1.一种CYP2D6基因第九号外显子的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于包括如下步骤：

(a)采用Primer 5.0软件，以GenBank数据库CYP2D6基因第九号外显子以及外显子与内含子接合部位序列为模板设计一对等位基因特异性的核酸引物，利用引物对来扩增CYP2D6基因的第九号外显子的DNA序列，对扩增产物进行分离纯化，得到相应分离核酸；

(b)检测分离核酸的CYP2D6基因第九号外显子的SEQ ID NO：1所示序列的第1322位核苷酸是否存在单核苷酸多态性，即G→A多态性。

2.根据权利要求1的CYP2D6基因第九号外显子的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于步骤(b)检测多态性时采用的方法包括：DNA测序法、杂交测序法；酶促错配切割法、异源双链分析法、点杂交法、寡核苷酸阵列法、微测序法、Taqman技术、分子信标法，变性高效液相色谱法。

3.权利要求1的检测方法的应用，其特征在于用于评估个体患CYP2D6基因的第九号外显子相关疾病的易感性，用于研究我国人群中CYP2D6基因多态性与临床用药安全的关系，用于新药的研究开发。

4.一种分离核酸，其特征在于，它具有SEQ ID NO：1所示的序列，且第1322位为A。

5.一种等位基因特异性的核酸引物，其特征在于，其长度为15-50bp，且特异性地杂交并扩增出含人CYP2D6基因的第九号外显子的SEQ ID NO：1所示序列的第1322位的单核苷酸多态性的扩增产物。