CN102925557B

CN102925557B - 一种检测U BCR融合基因mRNA表达量的试剂盒

Info

Publication number: CN102925557B
Application number: CN201210374358.1A
Authority: CN
Inventors: 童永清; 李艳
Original assignee: 童永清; 李艳
Current assignee: Guangzhou City, Panyu District Huaxin Technology Co. Ltd.
Priority date: 2012-09-29
Filing date: 2012-09-29
Publication date: 2014-06-25
Anticipated expiration: 2032-09-29
Also published as: CN102925557A

Abstract

本发明公开了一种检测U BCR融合基因mRNA表达量的试剂盒，属于生物技术领域。所述试剂盒包括检测用引物、荧光探针、cDNA第一链合成试剂、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，所述检测用引物、荧光探针包括U BCR融合基因引物、内参基因ABL引物及Taqman荧光探针。UBCR融合基因主要见于Ph+的慢性中性粒细胞白血病，该基因编码具有较高的酪氨酸蛋白激酶活性，使细胞在不依赖细胞因子的情况下发生过度增殖、分化，并且使正常的细胞凋亡受到抑制。采用荧光定量PCR检测U BCR融合基因mRNA水平，其检测结果的特异性和敏感度均显著提高。所述试剂盒为慢性中性粒细胞白血病的诊断及预测预后以及化疗方案的确定提供了一种全新的快速简便的基因诊断技术。

Description

一种检测U BCR融合基因mRNA表达量的试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域的荧光定量PCR技术，特别涉及一种检测U BCR融合基因mRNA表达量的试剂盒。

背景技术

慢性粒细胞白血病（Chronic Myelocytic Leukemia，CML）是一种多能干细胞增殖异常引起的恶性肿瘤，对该疾病的真正认识源于费城染色体（Philadelphia Chromosome，Ph）的发现，数据显示90%以上的CML病例中都有Ph的存在，该染色体是由9号染色体和22号染色体相互易位形成，即t（9，22）（q34：q11），易位使9号染色体长臂末端（9q34）的c-abl原癌基因在第2位外显子的5’端发生断裂，然后与22号染色体长臂末端（22q11）的c-BCR融合基因的3’端发生融合形成bcr/abl融合基因，其中部分CML患者BCR融合基因中的断裂点融合成转录成e19a2，称之为U BCR融合基因，主要见于Ph＋的慢性中性粒细胞白血病。该融合基因编码一个嵌合体蛋白质P230，它具有较高的酪氨酸蛋白激酶活性，使一系列底物蛋白磷酸化，由此激活多条信号传导途径，使细胞在不依赖细胞因子的情况下发生过度增殖和分化，并且使正常的细胞凋亡受到抑制。

放疗与二甲磺酸丁酯等药物用于CML的早期治疗，尽管它们可以改善症状，提高患者生命质量，但不能延长患者生命。后来的羟基脲（Hydroxycarbamide，HU）与造血干细胞移植（Hematopoietic stem cell transplantation，HSCT）以及在少数患者中使用的重组体干扰素（recombinant interferon alpha，rIFNα）为延长患者生命起到了很大的作用。一种蛋白激酶抑制剂伊马替尼（Tyrosine Kinase inhibitor，TKI）被证明具有高且相对特异性的生物活性，因此迅速应用于临床，它是通过抑制过度激活的酪氨酸及酶活性来控制白血病细胞生长，诱导其凋亡的一种药物。它对大多数bcr/abl融合基因阳性的CML患者有效。研究表明，CML患者经伊马替尼治疗达到细胞学完全缓解后，随着治疗时间的延长，bcr/abl融合基因定量的结果呈逐渐下降的趋势，最终甚至完全检测不到。然而，bcr/abl融合基因激酶结构突变、bcr/abl融合基因扩增和过度表达会引起患者对伊马替尼耐药。而且相关研究也提到，CML患者处于不同病理期时，骨髓增殖情况也不同，白血病细胞的增殖也存在差异，处于CML慢性期和加速期的患者bcr/abl融合基因表达量显著低于急变期。

因此，通过检测U BCR融合基因水平，可以指导临床针对患者个体水平合理选择药物剂量或是否联合其他药物治疗，同时，也可以为诊断CML的白血病细胞增殖情况和病理分期提供依据。较之使用常规定性PCR方法对U BCR融合基因进行半定量检测或免疫学方法对bcr/abl蛋白进行定量检测，荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）技术也具有较高的灵敏度和特异度。

实时荧光定量PCR技术实现了PCR从定性到真正意义的定量的飞跃，为人类疾病基因的定量检测提供了一个行之有效的检测工具，与普通PCR相比具有特异性增强、灵敏度提高和检测快速并降低了污染等特点，但目前尚未有荧光定量PCR方法检测慢性粒细胞白血病中U BCR基因的相关报道。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种检测U BCR融合基因mRNA表达量的试剂盒。所述技术方案如下：

本发明实施例提供的一种检测U BCR融合基因mRNA表达量的试剂盒，包括检测用引物、荧光探针、cDNA第一链合成试剂、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，所述检测用引物、荧光探针包括U BCR融合基因引物、内参基因ABL引物及Taqman荧光探针，所述试剂盒还包括内部阳性控制序列、内部阳性控制序列的引物及内部阳性控制序列的Taqman荧光探针，其中：

U BCR融合基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；

U BCR融合基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；

U BCR融合基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:3所示；

ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:4所示；

ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:5所示；

ABL基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:6所示；

内部阳性控制序列如序列表中SEQ ID NO:7所示；

内部阳性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID NO:8所示；

内部阳性控制序列的下游引物如序列表中SEQ ID NO:9所示；

内部阳性控制序列的Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:10所示；

所述cDNA第一链合成试剂含有MgC1₂、逆转录酶缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂、Oligo(dT)₁₅、AMV逆转录酶和无RNase去离子水；所述荧光定量PCR混合液含有PCR预混合液、Mg²⁺、dNTPs、dUTP、Taq酶、UNG酶和无RNase去离子水。

进一步地，所述U BCR融合基因的Taqman荧光探针和ABL基因的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团FAM，3’端均连接有荧光淬灭基团TAMRA；所述内部阳性控制序列的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团TET，3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA。

进一步地，所述内参基因ABL的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:11所示。

进一步地，所述cDNA第一链合成试剂为：25mmol/L MgC1₂4μL，10×逆转录酶缓冲液2μL，10mmol/L dNTP2μL，RNA酶抑制剂0.5μL，Oligo(dT)₁₅0.5μg，AMV逆转录酶1.5U和无RNase去离子水，总体积11μL。

进一步地，所述阴性对照为去离子水；所述阳性对照为含有U BCR融合基因的总RNA样品。

进一步地，所述荧光定量PCR的混合液（以反应体系终浓度表示）为：1×的PCR预混合液（原液为2×PCR Premix）、2.5-4.0mM的Mg²⁺、0.2-0.4mM的dNTPs、0.3-0.6mM的dUTP、0.2U/μL的Taq酶和0.01-0.05U/μL的UNG酶以及无RNase去离子水。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供的一种检测U BCR融合基因mRNA表达量的试剂盒，应用荧光定量PCR技术检测U BCR融合基因的mRNA水平，可以指导临床针对患者个体水平合理选择药物剂量或是否联合其他药物治疗，同时，也可以为诊断CML的白血病细胞增殖情况和病理分期提供依据。较之使用免疫学方法对bcr/abl蛋白进行定量，其还具有以下的优点：

（1）敏感性高：可重复敏感度为0.01%，即10000个细胞中有一个含U BCR融合基因就可以被检测出。

（2）特异性强：使用特异性探针对定量分子进行识别，具有很高的准确性。同时，靶序列由引物和探针双重控制，特异性好且假阳性低。

（3）简便安全：操作简单、安全、自动化程度高而且防污染。扩增和检测可以在同一管内检测，不需要开盖，不易污染，同时扩增和检测一步完成，不需要后期处理，不再需要担心放射性污染。

（4）全程监控：本发明实施例提供的试剂盒引入了内部阳性控制质量控制体系，对检测过程进行全程质量监控，有效避免假阳性或者假阴性。

（5）快速：速度快、高通量，可在3-4小时完成。

本发明的试剂盒能快速、准确、定量检测U BCR融合基因mRNA水平，有效杜绝了假阳性和假阴性的发生，用于慢性粒细胞白血病的诊断及治疗过程中微小残留病的监测，为慢性粒细胞白血病的诊断、制定治疗方案及疗效评价和预后提供了重要的检测手段。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1A是本发明实施例2提供的荧光实时定量PCR反应体系扩增1.0x10⁶-1.0x10³拷贝的内部阳性控制序列标准品的荧光曲线图；

图1B是由本发明实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增1.0x10⁶-1.0x10³拷贝的内部阳性控制序列标准品的荧光曲线图得到的标准曲线图；

图2A是本发明实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增1.0x10⁶-1.0x10³拷贝的ABL标准品的荧光曲线图；

图2B是由本发明实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增1.0x10⁶-1.0x10³拷贝的ABL标准品荧光曲线图得到的标准曲线图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

实施例1.本发明试剂盒的制备

1、特异性的引物和荧光探针的设计

根据基因序列（ABL基因序列、BCR基因序列来源于美国国家生物技术信息中心核酸数据库，其中ABL基因ID分别为25，参考序列号为NM_005157.4；BCR基因ID分别为613，参考序列号为NG_009244.1）分别设计对上述各基因序列特异的引物和荧光探针。

2、按照下列试剂盒的组成配制试剂盒的各组分

本发明试剂盒组成如下：

①RNA提取试剂：Trizol试剂（Invitrogen公司，产品货号：15596-026/100ml），每1ml骨髓组织加入1mlTrizol快速提取慢性粒细胞白血病患者骨髓组织RNA。

②cDNA第一链合成试剂盒（RT-PCR）（Fermentas公司，产品货号：K1622）：25mmol/LMgC1₂4μL，10×逆转录酶缓冲液2μL，10mmol/L dNTP2μL，RNA酶抑制剂（RNasin，一种酸性糖蛋白）0.5μL，Oligo(dT)₁₅0.5μg，AMV逆转录酶1.5U和无RNase去离子水，总体积11μL。

③引物、探针和标准品：包括融合基因U BCR引物、内参基因ABL引物、内部阳性控制序列引物及与引物对应的Taqman荧光探针，具体如下：

U BCR融合基因上游引物序列为：5’-GTGGCCACGGACATCCA-3’（序列表中序列1）；

U BCR融合基因下游引物序列为：5’-GATGCTACTGGCCGCTGAAG-3’（序列表中序列2）；

U BCR融合基因Taqman荧光探针：FAM5’-AGGCAGCCTTCGAC-3’-TAMRA（序列表中序列3）；

内部阳性控制序列为：5’-GUGGCCACGCACAUCGAGGCACUGAAGGCACCGUUCGACGUCAAAGCCCAUGAGCGGCCAGUAGCAUC-3’（序列表中序列7）；

内部阳性控制序列上游引物序列为：5’-GTGGCCACGCACATCGA-3’（序列表中序列8）；

内部阳性控制序列下游引物序列为：5’-GATGCTACTGGCCGCTCTAG-3’（序列表中序列9）；

内部阳性控制序列Taqman荧光探针：TET5’-AGGCACCGTTCGAC-3’TAMRA（序列表中序列10）；

ABL基因序列为：5’-CAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAAGGCTGGGTCCCAAGCAACTACATCACGCCAGTCAACAGTCTGGAGAAACACTCCTGGTACCATGGGCCTGTGTCCCGCAATGCCGCTGAGTATCTGCTGAGCAGCGGGATCAATGGCAGCTTCTTGGTGCGTGAGAGTGAGAGCAGTCCTGGC-3’（序列表中序列11）；

ABL基因上游引物序列为：5’-CCGGGTCTTAGGCTATAATCACA-3’（序列表中序列4）；

ABL基因下游引物序列为：5’-GCCTTGGCCATTTTTGGTT-3’（序列表中序列5）；

ABL基因Taqman荧光探针：FAM5’-TGGTGTGAAGCCC-3’TAMRA（序列表中序列6）。

其中，内部阳性控制序列为人工合成序列，包含一部分已知的U BCR融合基因序列和一部分人工合成序列；内部阳性控制序列和ABL基因序列分别用作标准品。

上述引物序列、控制序列、基因序列和Taqman荧光探针序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

④阴性对照和阳性对照：以去离子水为阴性对照，以含有U BCR融合基因的总RNA样品为阳性对照，采用上述实施例1中提供的本发明试剂盒组成①RNA提取试剂：Trizol试剂（Invitrogen公司，产品货号：15596-026/100ml），按每1ml骨髓组织加入1ml Trizol试剂的比例，快速提取已经确诊的含有U BCR融合基因的慢性粒细胞白血病的骨髓组织RNA，作为阳性对照。

⑤U BCR融合基因荧光定量PCR反应液：由荧光定量PCR混合液和检测U BCR融合基因的引物、探针组成：1×的PCR预混合液（Qiagen公司，产品货号：210212，2×PCR Premix）、2.5-4.0mM的Mg²⁺、0.2-0.4mM的dNTPs和0.3-0.6mM的dUTP、0.2U/μL的Taq酶和0.01-0.05U/μL的UNG酶、0.25pmol/μL的U BCR融合基因上游引物（序列表中序列1）、0.25pmol/μL的U BCR融合基因下游引物（序列表中序列2）、0.3pmol/μL的U BCR融合基因Taqman荧光探针（序列表中序列3）、0.25pmol/μL的内部阳性控制序列上游引物（序列表中序列8）、0.25pmol/μL的内部阳性控制序列下游引物（序列表中序列9）、0.3pmol/μL的内部阳性控制序列Taqman荧光探针（序列表中序列10）（以上所有的浓度都是指PCR反应体系的终浓度）。通常取1-2μL的模板（包括被测样品RNA反转录合成的cDNA和内部阳性控制序列RNA反转录合成的cDNA），其余为无RNase去离子水，反应总体积通常为20μL。

⑥ABL内参基因荧光定量PCR反应液：由荧光定量PCR混合液和检测ABL内参基因的引物、探针组成：1×的PCR预混合液（Qiagen公司，产品货号：210212，2×PCR Premix）、2.5-4.0mM的Mg²⁺、0.2-0.4mM的dNTPs、0.3-0.6mM的dUTP、0.2U/μL的Taq酶和0.01-0.05U/μL的UNG酶、0.25pmol/μL的ABL内参基因上游引物（序列表中序列4）、0.25pmol/μL的ABL内参基因下游引物（序列表中序列5）、0.3pmol/μL的ABL基因Taqman荧光探针（序列表中序列6）（以上所有的浓度都是指PCR反应体系的终浓度）。检测时，加入ABL基因标准品模板2μL，其余为无RNase去离子水，反应总体积通常为20μL。

⑦内部阳性控制序列荧光定量PCR反应液：由荧光定量PCR混合液和检测内部阳性控制序列的引物、探针组成：1×的PCR预混合液（Qiagen公司，产品货号：210212，2×PCRPremix）、2.5-4.0mM的Mg²⁺、0.2-0.4mM的dNTPs和0.3-0.6mM的dUTP、0.2U/μL的Taq酶和0.01-0.05U/μL的UNG酶、0.25pmol/μL的内部阳性控制序列上游引物（序列表中序列8）、0.25pmol/μL的内部阳性控制序列下游引物（序列表中序列9）、0.3pmol/μL的内部阳性控制序列Taqman荧光探针（序列表中序列10）（以上所有的浓度都是指PCR反应体系的终浓度）。检测时，通常取1-2μL的模板（内部阳性控制序列RNA反转录合成的cDNA），其余为无RNase去离子水，反应总体积通常为20μL。

3、PCR扩增程序的设定：在lightcycler仪器上先经过50℃10s，95℃10min，然后再经过95℃15s，60℃1min，共40个循环。

实施例2.用实施例1制备的试剂盒检测U BCR融合基因mRNA的表达量

以检测30例慢性粒细胞白血病患者骨髓组织标本结果为例。

用实施例1提供的本发明的试剂盒检测U BCR融合基因mRNA表达量的检测流程为：首先根据基因序列设计特异性的引物和荧光探针。其次获取临床慢性粒细胞白血病患者骨髓组织样本，快速提取组织RNA，进行逆转录PCR合成cDNA第一链；先配制ABL内参基因和内部阳性控制序列的荧光定量PCR反应液，将内部阳性控制序列标准品和ABL标准品分别稀释至拷贝数/mL为1.0x10³、1.0x10⁴、1.0x10⁵和1.0x10⁶，分别制作内部阳性控制序列标准品标准曲线（如图1A和图1B所示）和ABL标准品标准曲线（如图2A和图2B所示），然后再配制U BCR融合基因荧光定量PCR反应液进行荧光定量PCR检测样品，在荧光定量PCR仪数据分析系统中读出CT值结果。PCR扩增结束后，首先分析内部阳性控制序列扩增结果，如果其Ct值小于33，提示整个检测过程有效，如果其Ct值大于35，提示检测失败，则需要重新进行检测，如果其Ct值位于33～35之间，需要重复检测。当内部阳性控制序列Ct值小于33时，将实时荧光定量PCR所得数据进行计算，分别计算U BCR融合基因及ABL基因的Ct值，两者之差即为ΔCt值。最后，荧光定量PCR结果采用软件分析，并标化计算样本数据。

具体步骤如下：

①慢性粒细胞白血病患者骨髓组织总RNA的抽提：按RNA抽提纯化的方法抽提慢性粒细胞白血病患者骨髓组织样品的总RNA。提取的RNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，通过紫外分光光度计测定260nm与280nm光密度值计算RNA的纯度与浓度，用0.1％DEPC处理的水调节抽提的各样品RNA至相同浓度。

②反转录合成cDNA：取2μL上述RNA提取液，在70℃保温10min，随后加入实施例1提供的本发明试剂盒组成②cDNA第一链合成试剂盒，即：25mmol/L MgC1₂4μL，10×逆转录酶缓冲液2μL，10mmol/L dNTPs2μL，RNA酶抑制剂0.5μL，Oligo(dT)₁₅0.5μg和AMV逆转录酶1.5U，补加无RNase去离子水至总体积20μL，于42℃保温15min，进行逆转录反应，合成cDNA第一链。反应结束后，加热至99℃，5min以灭活逆转录酶，加20μL无菌水混匀置冰箱-20℃保存。

取1μL浓度为2μg/ml内部阳性控制序列RNA(序列表中序列7)，在70℃保温10min，随后加入实施例1提供的本发明试剂盒组成②cDNA第一链合成试剂盒，即：25mmol/L MgC1₂4μL，10×逆转录酶缓冲液2μL，10mmol/L dNTPs2μL，RNA酶抑制剂0.5μL，Oligo(dT)₁₅0.5μg和AMV逆转录酶1.5U，补加无RNase去离子水至总体积20μL，于42℃保温15min，进行逆转录反应，合成cDNA。反应结束后，加热至99℃，5min以灭活逆转录酶，加20μL无菌水混匀置冰箱-20℃保存。

取1μL浓度为2μg/ml的阳性对照RNA，在70℃保温10min，随后加入实施例1提供的本发明试剂盒组成②cDNA第一链合成试剂盒，即：25mmol/L MgC1₂4μL，10×逆转录酶缓冲液2μL，10mmol/L dNTPs2μL，RNA酶抑制剂0.5μL，Oligo(dT)₁₅0.5μg和AMV逆转录酶1.5U，补加无RNase去离子水至总体积20μL，于42℃保温15min，进行逆转录反应，合成cDNA。反应结束后，加热至99℃，5min以灭活逆转录酶，加20μL无菌水混匀置冰箱-20℃保存。

③将内部阳性控制基因序列标准品和ABL标准品分别稀释至拷贝数/mL为1.0x10³、1.0x10⁴、1.0x10⁵和1.0x10⁶，用实施例1提供的内部阳性控制序列和ABL内参基因的荧光定量PCR反应液，分别制作内部阳性控制序列标准品标准曲线（如图1A和图1B所示）和ABL标准品标准曲线（如图2A和图2B所示）。

④U BCR融合基因荧光定量PCR扩增：PCR反应体系为20μL：含1×PCR预混合液（Qiagen公司，产品货号：210212，2×PCR Premix）10.0μL，2.5-4.0mM的Mg²⁺、0.2-0.4mM的dNTPs和0.3-0.6mM的dUTP、0.2U/μL的Taq酶和0.01-0.05U/μL的UNG酶，U BCR融合基因上游引物终浓度0.2μmol/L，U BCR融合基因下游引物终浓度0.2μmol/L，U BCR融合基因Taqman荧光探针终浓度0.3μmol/L，被测样品RNA反转录合成的cDNA1.0μL，同时加入内部阳性控制序列上、下游引物终浓度均为0.2μmol/L，内部阳性控制序列Taqman荧光探针终浓度0.3μmol/L，终浓度为0.2μmol/L的内部阳性控制序列RNA反转录合成的cDNA（②中反转录合成的cDNA），加入超纯水至总体积20μL。在lightcycler荧光定量PCR仪上反应：扩增条件；95℃10min预变性，然后95℃15s，60℃1min扩增40个循环，扩增过程中仪器自动收集荧光信号。

⑤ABL内参基因荧光定量PCR扩增：PCR反应体系为20μL：含2×PCR混合液（Qiagen公司，产品货号：210212，2×PCR Premix）10.0μL，2.5-4.0mM的Mg²⁺、0.2-0.4mM的dNTPs和0.3-0.6mM的dUTP、0.2U/μL的Taq酶和0.01-0.05U/μL的UNG酶，ABL基因引物终浓度0.2μmol/L，探针终浓度0.2μmol/L，ABL基因cDNA1.0μL，加入无RNase去离子水补至总体积20μL。在lightcycler荧光定量PCR仪上反应：扩增条件为95℃10min预变性，然后95℃15s，60℃1min扩增40个循环，扩增过程中仪器自动收集荧光信号。

⑥阳性对照、阴性对照荧光定量PCR扩增：PCR反应体系为20μL：含2×PCR混合液（Qiagen公司，产品货号：210212，2×PCR Premix）10.0μL，2.5-4.0mM的Mg²⁺、0.2-0.4mM的dNTPs和0.3-0.6mM的dUTP、0.2U/μL的Taq酶和0.01-0.05U/μL的UNG酶，U BCR融合基因上、下游引物终浓度均为0.2μmol/L，U BCR融合基因Taqman荧光探针终浓度0.3μmol/L，阳性对照RNA反转录合成的cDNA1.0μL或者阴性对照去离子水1.0μL，加入无RNase去离子水补至总体积20μL。在lightcycler荧光定量PCR仪上反应：扩增条件为95℃10min预变性，然后95℃15s，60℃1min扩增40个循环，扩增过程中仪器自动收集荧光信号。

⑦数据收集处理和分析：PCR扩增结束后，首先分析内部阳性控制序列扩增结果，如果其Ct值小于33，提示整个检测过程有效，如果其Ct值大于35，则需要重新进行检测。当内部阳性控制序列Ct值小于33时，将实时荧光定量PCR所得数据进行计算，得出融合基因UBCR相对于ABL内参基因的相对表达量后再进行统计分析，以比值大于或等于0.0001为阳性表达，小于0.0001为阴性表达（具体参见表1）：

表1为荧光定量PCR分析U BCR融合基因在慢性粒细胞白血病中的表达

样品	U BCR模板	ABL模板	U BCR/ABL
				慢性粒细胞白血病	3795436	319458540	0.01188
慢性粒细胞白血病	414746	260645734	0.00159
				慢性粒细胞白血病	19533	334561573	0.00006
慢性粒细胞白血病	149078	298565890	0.00050
				慢性粒细胞白血病	243584	316876506	0.00077
慢性粒细胞白血病	298190	306671049	0.00097
				慢性粒细胞白血病	2975500	317650194	0.00937
慢性粒细胞白血病	4354097	281537187	0.01547
				慢性粒细胞白血病	4994514	268977310	0.01857

慢性粒细胞白血病	38733652	246698765	0.15701
				慢性粒细胞白血病	85634681	316406153	0.27065
慢性粒细胞白血病	4069043	256487947	0.01586
				慢性粒细胞白血病	18626	219839543	0.00008
慢性粒细胞白血病	108644436	324579017	0.33472
				慢性粒细胞白血病	43056782	237556842	0.18125
慢性粒细胞白血病	2569821	286631489	0.00897
				慢性粒细胞白血病	1639078	298565890	0.00549
慢性粒细胞白血病	95794	279537187	0.00034
				慢性粒细胞白血病	20416	288976590	0.00007
慢性粒细胞白血病	18653	328506467	0.00006
				慢性粒细胞白血病	3921709	248546156	0.01578
慢性粒细胞白血病	412645	248654321	0.00166
				慢性粒细胞白血病	20465	319652351	0.00006
慢性粒细胞白血病	3875709	308546156	0.01256
				慢性粒细胞白血病	18759384	315787518	0.05941
慢性粒细胞白血病	42013590	236671049	0.17752
				慢性粒细胞白血病	1526940	327517465	0.00466
慢性粒细胞白血病	8530645	318654321	0.02677
				慢性粒细胞白血病	26840709	298546190	0.08990
慢性粒细胞白血病	26407	296451487	0.00009

上述表中U BCR模板和ABL模板中的数值均表示荧光累计值。

试剂盒检测能力评价：

以定性PCR法作为比较的检测方法，同时对上述30例慢性粒细胞白血病患者骨髓组织标本进行检测，比较结果显示，采用本发明本试剂盒进行检测其敏感性、特异性及灵敏度较免疫组化法更为精确，完全符合目前临床诊疗实用要求（具体参见表2）：

表2为两种不同方法检测慢性粒细胞白血病患者中U BCR融合基因表达的比较

由上表可知，通过定性PCR法检验荧光定量法，定性PCR法作为参照，荧光定量法和定性PCR法同时检测到17例阳性，而定性PCR法检测到了1例阴性，由此得出，荧光定量法的阳性预测值为94.4%；荧光定量法和定性PCR法同时检测到12例阴性，均未检测检测出阳性，由此得出，荧光定量法的阴性预测值为100%。

其中：

①特异性：92.3%；

②灵敏度：100%；

③阳性预测值：阳性预测值达到94.4%；

④阴性预测值：阴性预测值达到100%；

⑤重复性：多次重复实验结果一致；

⑥耗时：一份临床标本的检测时间约为4h，耗时短，而免疫组化法耗时约72h。

上述实验可以说明，采用敏感性及特异性均较高的荧光定量PCR检测U BCR融合基因mRNA水平，其检测结果的特异性和敏感度均显著提高，采用内部阳性控制序列监控整个检测过程，有效地保证了每次检测的质量。

本发明实施例提供了一种能够监测整个检测过程的慢性粒细胞白血病U BCR融合基因实时荧光定量PCR检测试剂盒，采用人工设计与合成的内部阳性控制序列，监测慢性粒细胞白血病U BCR融合基因实时荧光定量PCR检测的整个过程，能有效地解决目前慢性粒细胞白血U BCR病融合基因实时荧光定量PCR检测过程中的假阳性和假阴性问题，使得检测结果更可靠，该试剂盒为慢性粒细胞白血病的基因分型及化疗和预后提供了一种全新的快速简便的基因诊断技术。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种检测U BCR融合基因mRNA表达量的试剂盒，包括检测用引物、荧光探针、cDNA第一链合成试剂、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，其特征在于，所述检测用引物、荧光探针包括U BCR融合基因引物、内参基因ABL引物及Taqman荧光探针，所述试剂盒还包括内部阳性控制序列、内部阳性控制序列的引物及内部阳性控制序列的Taqman荧光探针，其中：

U BCR融合基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；

U BCR融合基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；

U BCR融合基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:3所示；

ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:4所示；

ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:5所示；

ABL基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:6所示；

内部阳性控制序列如序列表中SEQ ID NO:7所示；

内部阳性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID NO:8所示；

内部阳性控制序列的下游引物如序列表中SEQ ID NO:9所示；

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述U BCR融合基因的Taqman荧光探针和ABL基因的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团FAM，3’端均连接有荧光淬灭基团TAMRA；所述内部阳性控制序列的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团TET，3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述内参基因ABL的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:11所示。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述cDNA第一链合成试剂为：25mmol/LMgC1₂4μL，10×逆转录酶缓冲液2μL，10mmol/L dNTP2μL，RNA酶抑制剂0.5μL，Oligo(dT)₁₅0.5μg，AMV逆转录酶1.5U和无RNase去离子水，总体积11μL。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为去离子水；所述阳性对照为含有U BCR融合基因的总RNA样品。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR的混合液为：1×的PCR预混合液、2.5-4.0mM的Mg²⁺、0.2-0.4mM的dNTPs、0.3-0.6mM的dUTP、0.2U/μL的Taq酶、0.01-0.05U/μL的UNG酶和无RNase去离子水。