CN103014154A - 一种检测BAALC基因mRNA表达量的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测BAALC基因mRNA表达量的试剂盒，属于生物技术领域。所述试剂盒包括检测用引物、荧光探针、cDNA第一链合成试剂、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，所述检测用引物、荧光探针包括BAALC基因引物、内参基因ABL引物及Taqman荧光探针。BAALC基因是一种早期造血细胞祖细胞的标志，在急性髓系白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)及慢性粒细胞白血病(CML)急变期患者中异常表达。本发明实施例采用敏感性及特异性均较高的荧光定量PCR检测BAALC基因mRNA水平，其检测结果的特异性和敏感度均显著提高。本发明提供的试剂盒为临床评估急性淋巴细胞性白血病的诊断、预后以及复发周期提供了一种全新的快速简便的基因诊断技术。

Description

一种检测BAALC基因mRNA表达量的试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域的荧光定量PCR技术，特别涉及一种检测BAALC基因mRNA表达量的试剂盒。

背景技术

急性髓细胞性白血病（Acute myeloid leukemia，AML）是一种临床分子异质性恶性克隆性疾病，是急性白血病中最常见的类型，其治疗效果差，化疗后完全缓解率为60%-70%，中位生存期约为2年。在美国每年有超过11,900新病例发生，AML的患者大多是中老年人，患者的平均年龄为65岁，其中儿童病例少于10％。大约一半的成年AML患者缺乏染色体畸变，虽然这些患者有一个较长的预后期，但是只有40%能长期存活下来。分子技术能准确区别患者危险程度，从而提高治疗效果。最新研究发现AML患者中存在BAALC（Brain AndAcute Leukemia，Cytoplasmic；脑和急性髓系白血病，胞质）基因的异常高表达，经进一步研究，得知显示其表达的水平与预后存在关系。

BAALC基因是一种早期造血细胞祖细胞的标志，在某些急性白血病患者中异常表达，该基因定位于染色体8q22.3，其DNA序列和表达在哺乳动物中高度保守，主要表达在神经外胚层来源的组织及造血前体细胞中，成熟的骨髓和外周血单个核细胞不表达，编码的蛋白不与任何已知的蛋白或功能域同源，其功能尚不清楚。在造血干细胞中，BAALC基因的表达仅限于祖细胞。急性髓系白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)及慢性粒细胞白血病(chronicmyelogenous leukemia，CML)急变期患者有BAALC基因的表达，而CML慢性期及慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)则检测不到。国外研究显示BAALC基因mRNA高表达是正常核型AML(NC，AML)患者预后不良标志。

目前可用于BAALC基因定量表达的方法有探针杂交法、基因芯片法、质谱法、免疫组化法和基因测序法等。探针杂交法假阳性率较高；基因芯片法成本高、制备方法繁琐；质谱法难以在普通医疗机构开展；基因测序法虽敏感性和特异性高，但价格比较昂贵，而且操作较繁琐，耗时较长。虽然免疫组化法的特异性和敏感性都比较高，但实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）与免疫组化法相比具有更强的特异性、更高的灵敏度而且检测快速、降低了污染，但目前尚未有实时荧光定量PCR方法检测急性髓细胞性白血病中BAALC基因的相关报道。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明实施例提供了一种检测BAALC基因mRNA表达量的试剂盒。所述技术方案如下：

一种检测BAALC基因mRNA表达量的试剂盒，包括检测用引物、荧光探针、cDNA第一链合成试剂、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，所述检测用引物、荧光探针包括BAALC基因引物、内参基因ABL引物及Taqman荧光探针，其中：

BAALC基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；

BAALC基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；

BAALC基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:3所示；

ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:4所示；

ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:5所示；

ABL基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:6所示；

所述cDNA第一链合成试剂含有MgC1₂、逆转录酶缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂、Oligo(dT)₁₅、AMV逆转录酶和无RNase去离子水；所述荧光定量PCR混合液含有PCR预混合液、Mg²⁺、dNTPs、dUTP、Taq酶、UNG酶和无RNase去离子水。

进一步地，所述试剂盒还包括内部阳性控制序列、内部阳性控制序列的引物和Taqman荧光探针，其中：内部阳性控制序列如序列表中SEQ ID NO:7所示；内部阳性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID NO:8所示；内部阳性控制序列的下游引物如序列表中SEQ ID NO:9所示；内部阳性控制序列的Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:10所示。

具体地，所述BAALC基因的Taqman荧光探针和ABL基因的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团FAM，3’端均连接有荧光淬灭基团TAMRA；所述内部阳性控制序列的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团TET，3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA。

具体地，所述内参基因ABL的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:11所示。

具体地，所述阴性对照为去离子水；所述阳性对照为含有BAALC基因的总RNA样品。

具体地，所述cDNA第一链合成试剂为：25mmol/L MgC1₂4μL，10×逆转录酶缓冲液2μL，10mmol/L dNTP2μL，RNA酶抑制剂0.5μL，Oligo(dT)₁₅0.5μg，AMV逆转录酶1.5U和无RNase去离子水，总体积11μL。

具体地，所述荧光定量PCR的混合液（以反应体系终浓度表示）为：1×的PCR预混合液（原液为2×PCR Premix）、2.5-4.0mM的Mg²⁺、0.2-0.4mM的dNTPs、0.3-0.6mM的dUTP、0.2U/μL的Taq酶和0.01-0.05U/μL的UNG酶以及无RNase去离子水。

本发明试剂盒的优点和效果如下：

（1）敏感度高：可重复敏感度为0.01%，即10000个细胞中有一个含BAALC基因就可以被检测出。

（2）特异性强：使用特异性探针对定量分子进行识别，准确性高。同时，靶序列由引物和探针双重控制，特异性好、假阳性低。

（3）简便安全：操作简单、安全、自动化程度高而且防止污染。扩增和检测可以在同一管内检测，不需要开盖，不易被污染；同时扩增和检测一步完成，不需要后期处理，无需要担心放射性污染。

（4）全程监控：本发明实施例提供的试剂盒引入了内部阳性控制质量控制体系，对检测过程进行全程质量监控，有效避免假阳性或者假阴性。

（5）快速：速度快、高通量，可在3-4小时完成。

本发明的试剂盒能快速、准确的定量检测BAALC基因mRNA水平，有效杜绝了假阳性和假阴性的发生，用于急性髓细胞性白血病的诊断及预后评价，为急性髓细胞性白血病的诊断、鉴别诊断、制定治疗方案及预后提供了重要的检测手段。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1A是本发明实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增1.0x10⁶-1.0x10³拷贝的内部阳性控制序列标准品的荧光曲线图；

图1B是由本发明实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增1.0x10⁶-1.0x10³拷贝的内部阳性控制序列标准品的荧光曲线图得到的标准曲线图；

图2A是本发明实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增1.0x10⁶-1.0x10³拷贝的ABL标准品的荧光曲线图；

图2B是由本发明实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增1.0x10⁶-1.0x10³拷贝的ABL标准品荧光曲线图得到的标准曲线图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

实施例1.本发明试剂盒的制备

1、特异性的引物和荧光探针的设计

根据基因序列（ABL基因序列和BAALC基因序列来源于美国国家生物技术信息中心核酸数据库，其中ABL基因ID分别为25，参考序列号为NM_005157.4；BAALC基因ID分别为79870，参考序列号为NC_000008.10）分别设计对上述各基因序列特异的引物和荧光探针。

2、按照下列试剂盒的组成配制试剂盒的各组分

本发明试剂盒组成如下：

①RNA提取试剂：Trizol试剂（Invitrogen公司，产品货号：15596-026/100ml），每1ml骨髓组织加入1ml Trizol试剂快速提取急性髓系白血病患者骨髓组织RNA。

②cDNA第一链合成试剂盒（RT-PCR）（Fermentas公司，产品货号：K1622）：25mmol/LMgC1₂4μL，10×逆转录酶缓冲液2μL，10mmol/L dNTP 2μL，RNA酶抑制剂（RNasin，一种酸性糖蛋白）0.5μL，Oligo(dT)₁₅0.5μg，AMV逆转录酶1.5U和无RNase去离子水，总体积11μL。

③引物、探针和标准品：包括BAALC基因引物、内部阳性控制序列引物、内参基因ABL引物及与引物对应的Taqman荧光探针，具体如下：

BAALC基因引物和探针序列：

上游引物序列为：5’-GCCCTCTGACCCAGAAACAG-3’（序列表中序列1）；

下游引物序列为：5’-GGCATTCTCTTAGCATCTCTTTTAGC-3’（序列表中序列2）；

Taqman荧光探针：FAM5’-TGGCCTTCAGACCACAGA-3’TAMRA（序列表中序列3）。

ABL基因序列为：5’-CAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAAGGCTGGGTCCCAAGCAACTACATCACGCCAGTCAACAGTCTGGAGAAACACTCCTGGTACCATGGGCCTGTGTCCCGCAATGCCGCTGAGTATCTGCTGAGCAGCGGGATCAATGGCAGCTTCTTGGTGCGTGAGAGTGAGAGCAGTCCTGGC-3’（序列表中序列11）。

ABL基因引物和探针序列：

上游引物序列为：5’-CCGGGTCTTAGGCTATAATCACA-3’（序列表中序列4）；

下游引物序列为：5’-GCCTTGGCCATTTTTGGTT-3’（序列表中序列5）；

Taqman荧光探针：FAM5’-TGGTGTGAAGCCC-3’TAMRA（序列表中序列6）。

内部阳性控制序列为：5’-GCCCUCUGACCCAGAAAGACAAUGGCCUUCACAGCACAGAGCGUAAAAGAGAUGCUAAGAGAAUGCCUGCAAAAG-3’（序列表中序列7）。

内部阳性控制序列的引物和探针序列：

上游引物序列为：5’-GCCCTCTGACCCAGAAAGAC-3’（序列表中序列8）；

下游引物序列为：5’-GGCATTCTCTTAGCATCTCTTTTACG-3’（序列表中序列9）；

Taqman荧光探针：TET5’-TGGCCTTCACAGCACAGA-3’TAMRA（序列表中序列10）。

其中，内部阳性控制序列为人工合成序列，包含一部分已知的BAALC基因序列和一部分人工合成序列；内部阳性控制序列和ABL基因序列分别用作标准品。

上述引物序列、控制序列、基因序列、探针序列均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

④阴性对照和阳性对照：以去离子水为阴性对照，以含有BAALC基因的总RNA样品为阳性对照，采用上述实施例1中提供的本发明试剂盒组成①RNA提取试剂：Trizol试剂（Invitrogen公司，产品货号：15596-026/100ml），按每1ml骨髓组织加入1ml Trizol试剂的比例，快速提取已经确诊的含有BAALC基因的急性髓细胞性白血病患者的骨髓组织RNA，作为阳性对照。

⑤BAALC基因荧光定量PCR混合液：由荧光定量PCR混合液和检测BAALC基因的引物、探针组成：1×的PCR预混合液（Qiagen公司，产品货号：210212，2×PCR Premix）、2.5-4.0mM的Mg²⁺、0.2-0.4mM的dNTPs和0.3-0.6mM的dUTP、0.2U/μL的Taq酶和0.01-0.05U/μL的UNG酶、0.25pmol/μL的BAALC基因上游引物（序列表中序列1）、0.25pmol/μL的BAALC基因下游引物（序列表中序列2）、0.3pmol/μL的BAALC基因Taqman荧光探针（序列表中序列3）、0.25pmol/μL的内部阳性控制序列上游引物（序列表中序列8）、0.25pmol/μL的内部阳性控制序列下游引物（序列表中序列9）、0.3pmol/μL的内部阳性控制序列Taqman荧光探针（序列表中序列10）（以上所有的浓度都是指PCR反应体系的终浓度）。通常取1-2μL的模板（包括被测样品RNA反转录合成的cDNA和内部阳性控制序列RNA反转录合成的cDNA），其余为无RNase去离子水，反应总体积通常为20μL。

⑥ABL内参基因荧光定量PCR反应液：由荧光定量PCR混合液和检测ABL内参基因的引物、探针组成：1×的PCR预混合液（Qiagen公司，产品货号：210212，2×PCR Premix）、2.5-4.0mM的Mg²⁺、0.2-0.4mM的dNTPs、0.3-0.6mM的dUTP、0.2U/μL的Taq酶和0.01-0.05U/μL的UNG酶、0.25pmol/μL的ABL内参基因上游引物（序列表中序列4）、0.25pmol/μL的ABL内参基因下游引物（序列表中序列5）、0.3pmol/μL的ABL基因Taqman荧光探针（序列表中序列6）（以上所有的浓度都是指PCR反应体系的终浓度）。检测时，加入ABL基因标准品模板2μL，其余为无RNase去离子水，反应总体积通常为20μL。

⑦内部阳性控制序列荧光定量PCR反应液：由荧光定量PCR混合液和检测内部阳性控制序列的引物、探针组成：1×的PCR预混合液（Qiagen公司，产品货号：210212，2×PCRPremix）、2.5-4.0mM的Mg²⁺、0.2-0.4mM的dNTPs和0.3-0.6mM的dUTP、0.2U/μL的Taq酶和0.01-0.05U/μL的UNG酶、0.25pmol/μL的内部阳性控制序列上游引物（序列表中序列8）、0.25pmol/μL的内部阳性控制序列下游引物（序列表中序列9）、0.3pmol/μL的内部阳性控制序列Taqman荧光探针（序列表中序列10）（以上所有的浓度都是指PCR反应体系的终浓度）。检测时，通常取1-2μL的模板（内部阳性控制序列RNA反转录合成的cDNA），其余为无RNase去离子水，反应总体积通常为20μL。

3、PCR扩增程序的设定：在lightcycler仪器上先经过50℃10s，95℃10min，然后再经过95℃15s，60℃1min，共40个循环。

实施例2.用实施例1制备的试剂盒检测BAALC基因mRNA的表达量

以检测30例急性髓细胞性白血病患者骨髓组织标本结果为例。

用实施例1提供的本发明的试剂盒检测BAALC基因mRNA表达量的检测流程为：首先根据基因序列设计特异性的引物和荧光探针。其次获取临床急性髓细胞性白血病患者骨髓组织样本，快速提取组织RNA，进行逆转录PCR合成cDNA第一链；先配制ABL内参基因和内部阳性控制序列的荧光定量PCR反应液，将内部阳性控制序列标准品和ABL标准品分别稀释至拷贝数/mL为1.0x10³、1.0x10⁴、1.0x10⁵和1.0x10⁶，分别制作内部阳性控制序列标准品的标准曲线（如图1A和图1B所示）和ABL标准品标准曲线（如图2A和图2B所示），然后再配制BAALC基因荧光定量PCR反应液，进行荧光定量PCR检测样品，在荧光定量PCR仪数据分析系统中读出CT值结果。PCR扩增结束后，首先分析内部阳性控制序列扩增结果，如果其Ct值小于33，提示整个检测过程有效，如果其Ct值大于35，提示检测失败，则需要重新进行检测，如果其Ct值位于33~35之间，需要重复检测。当内部阳性控制序列Ct值小于33时，将实时荧光定量PCR所得数据进行计算，分别计算BAALC基因及ABL基因的Ct值，两者之差即为ΔCt值。最后，荧光定量PCR结果采用软件分析，并标化计算样本数据。

具体步骤如下：

①急性髓细胞性白血病患者骨髓组织总RNA的抽提：按RNA抽提纯化的方法抽提急性髓细胞性白血病患者骨髓组织样品的总RNA。提取的RNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，通过紫外分光光度计测定260nm与280nm光密度值计算RNA的纯度与浓度，用0.1％DEPC处理的水调节抽提的各样品RNA至相同浓度。

②反转录合成cDNA：取2μL上述RNA提取液，在70℃保温10min，随后加入实施例1提供的本发明试剂盒组成②cDNA第一链合成试剂盒，即：25mmol/L MgC1₂4μL，10×逆转录酶缓冲液2μL，10mmol/L dNTPs2μL，RNA酶抑制剂0.5μL，Oligo(dT)₁₅0.5μg和AMV逆转录酶1.5U，补加无RNase去离子水至总体积20μL，于42℃保温15min，进行逆转录反应，合成cDNA第一链。反应结束后，加热至99℃，5min以灭活逆转录酶，加20μL无菌水混匀置冰箱-20℃保存。

取1μL浓度为2μg/ml的内部阳性控制序列RNA(序列表中序列7)，在70℃保温10min，随后加入实施例1提供的本发明试剂盒组成②cDNA第一链合成试剂盒，即：25mmol/L MgC1₂4μL，10×逆转录酶缓冲液2μL，10mmol/L dNTPs2μL，RNA酶抑制剂0.5μL，Oligo(dT)₁₅0.5μg和AMV逆转录酶1.5U，补加无RNase去离子水至总体积20μL，于42℃保温15min，进行逆转录反应，合成cDNA。反应结束后，加热至99℃，5min以灭活逆转录酶，加20μL无菌水混匀置冰箱-20℃保存。

取1μL浓度为2μg/ml的阳性对照RNA，在70℃保温10min，随后加入实施例1提供的本发明试剂盒组成②cDNA第一链合成试剂盒，即：25mmol/L MgC1₂4μL，10×逆转录酶缓冲液2μL，10mmol/L dNTPs2μL，RNA酶抑制剂0.5μL，Oligo(dT)₁₅0.5μg和AMV逆转录酶1.5U，补加无RNase去离子水至总体积20μL，于42℃保温15min，进行逆转录反应，合成cDNA。反应结束后，加热至99℃，5min以灭活逆转录酶，加20μL无菌水混匀置冰箱-20℃保存。

③将内部阳性控制基因序列标准品和ABL标准品分别稀释至拷贝数/mL为1.0x10³、1.0x10⁴、1.0x10⁵和1.0x10⁶，用实施例1提供的内部阳性控制序列和ABL内参基因的荧光定量PCR反应液，分别制作内部阳性控制序列标准品标准曲线（如图1A和图1B所示）和ABL标准品标准曲线（如图2A和图2B所示）。

④BAALC基因荧光定量PCR扩增：PCR反应体系为20μL：含1×PCR预混合液（Qiagen公司，产品货号：210212，2×PCR Premix）10.0μL，2.5-4.0mM的Mg²⁺、0.2-0.4mM的dNTPs和0.3-0.6mM的dUTP、0.2U/μL的Taq酶和0.01-0.05U/μL的UNG酶，BAALC基因上游引物终浓度0.2mol/L，BAALC基因下游引物终浓度0.2μmol/L，BAALC基因Taqman荧光探针浓度0.3μmol/L，被测样品RNA反转录合成的cDNA1.0μL，同时加入内部阳性控制序列上游引物终浓度为0.2μmol/L、内部阳性控制序列的下游引物终浓度为0.2mol/L、内部阳性控制序列Taqman荧光探针终浓度为0.3μmol/L和终浓度为0.2μmol/L的内部阳性控制序列RNA反转录合成的cDNA（②中反转录合成的cDNA），加入超纯至总体积20μL。在lightcycler荧光定量PCR仪上反应：扩增条件为95℃10min预变性，然后95℃15s，60℃1min扩增40个循环，扩增过程中仪器自动收集荧光信号。

⑤ABL内参基因荧光定量PCR扩增：PCR反应体系为20μL：含2×PCR混合液（Qiagen公司，产品货号：210212，2×PCR Premix）10.0μL，2.5-4.0mM的Mg²⁺、0.2-0.4mM的dNTPs和0.3-0.6mM的dUTP、0.2U/μL的Taq酶和0.01-0.05U/μL的UNG酶，ABL基因上、下游引物终浓度均为0.2μmol/L，ABL基因的Taqman荧光探针终浓度0.2μmol/L，ABL基因cDNA1.0μL，加入无RNase去离子水补至总体积20μL。在lightcycler荧光定量PCR仪上反应：扩增条件为95℃10min预变性，然后95℃15s，60℃1min扩增40个循环，扩增过程中仪器自动收集荧光信号。

⑥阳性对照、阴性对照荧光定量PCR扩增：PCR反应体系为20μL：含2×PCR混合液（Qiagen公司，产品货号：210212，2×PCR Premix）10.0μL，2.5-4.0mM的Mg²⁺、0.2-0.4mM的dNTPs和0.3-0.6mM的dUTP、0.2U/μL的Taq酶和0.01-0.05U/μL的UNG酶，BAALC基因上、下游引物终浓度均为0.2μmol/L，BAALC基因的Taqman荧光探针终浓度0.3μmol/L，阳性对照RNA反转录合成的cDNA1.0μL或者阴性对照去离子水1.0μL，加入无RNase去离子水补至总体积20μL。在lightcycler荧光定量PCR仪上反应：扩增条件为95℃10min预变性，然后95℃15s，60℃1min扩增40个循环，扩增过程中仪器自动收集荧光信号。

⑦数据收集处理和分析：PCR扩增结束后，首先分析内部阳性控制序列扩增结果，如果其Ct值小于33，提示整个检测过程有效，如果其Ct值大于35，则需要重新进行检测。当内部阳性控制序列Ct值小于33时，将实时荧光定量PCR所得数据进行计算，得出BAALC基因相对于ABL内参基因的相对表达量后再进行统计分析，以比值大于或等于0.0001为阳性表达，小于0.0001为阴性表达（具体参见表1）：

表1为荧光定量PCR分析BAALC基因在急性髓细胞性白血病中的表达

样品	BAALC模板	ABL模板	BAALC/ABL
				急性髓细胞性白血病	89649078	298565890	0.30027
急性髓细胞性白血病	4347497	281537187	0.01544
				急性髓细胞性白血病	9456114	268977310	0.03516
急性髓细胞性白血病	95436	319458540	0.00030
				急性髓细胞性白血病	24333	334561573	0.00007
急性髓细胞性白血病	34746	260645734	0.00013
				急性髓细胞性白血病	87343652	246698765	0.35405
急性髓细胞性白血病	24367584	316876506	0.07690
				急性髓细胞性白血病	18644436	324579017	0.05744
急性髓细胞性白血病	42305682	237556842	0.17809
				急性髓细胞性白血病	198157590	306671049	0.64616
急性髓细胞性白血病	18793684	315787518	0.05951
				急性髓细胞性白血病	4234385	256451487	0.01651
急性髓细胞性白血病	3560465	319652351	0.01114
				急性髓细胞性白血病	23709	298546190	0.00008
急性髓细胞性白血病	2977900	317650194	0.00937
				急性髓细胞性白血病	85634681	316406153	0.27065
急性髓细胞性白血病	41569043	256487947	0.16207
				急性髓细胞性白血病	137596260	229839543	0.59866
急性髓细胞性白血病	163769821	286631489	0.57136

急性髓细胞性白血病	42050645	248654321	0.16911
				急性髓细胞性白血病	91021709	248546156	0.36622
急性髓细胞性白血病	20590	236671049	0.00009
				急性髓细胞性白血病	163519078	298565890	0.54768
急性髓细胞性白血病	95310794	279537187	0.34096
				急性髓细胞性白血病	4234816	208976590	0.02026
急性髓细胞性白血病	73869853	328506467	0.22487
				急性髓细胞性白血病	17940	327517465	0.00005
急性髓细胞性白血病	85310645	318654321	0.26772
				急性髓细胞性白血病	8751709	308546156	0.02836

上述表中BAALC模板和ABL模板中的数值均表示荧光累计值。

试剂盒检测能力评价：

以免疫组化法作为比较的检测方法，同时对上述30例急性髓细胞性白血病患者骨髓组织标本进行检测，比较结果显示，采用本发明本试剂盒进行检测其敏感性、特异性及灵敏度较免疫组化法更为精确，完全符合目前临床诊疗实用要求（具体参见表2）：

表2为两种不同方法检测急性髓细胞性白血病中BAALC基因表达的比较

由上表可知，通过免疫组化法检验荧光定量法，免疫组化法作为参照，荧光定量法和免疫组化法同时检测到19例高表达，而免疫组化法检测到了2例低表达，由此得出，荧光定量法的阳性预测值为90.5%；荧光定量法和免疫组化法同时检测到9例低表达，均未检测检测出高表达，由此得出，荧光定量法的阴性预测值为100%。

其中：

①特异性：81.8%；

②灵敏度：100%；

③阳性预测值：阳性预测值达到90.5%；

④阴性预测值：阴性预测值达到100%；

⑤重复性：多次重复实验结果一致；

⑥耗时：一份临床标本的检测时间约为4h，耗时短，而免疫组化法耗时约72h。

上述实验可以说明，采用敏感性及特异性均较高的荧光定量PCR检测BAALC基因mRNA水平，其检测结果的特异性和敏感度均显著提高，采用内部阳性控制序列监控整个检测过程，有效地保证了每次检测的质量。

本发明提供了一种能够监测整个检测过程的急性淋巴细胞白血病基因BAALC实时荧光定量PCR检测试剂盒，采用人工设计与合成的内部阳性控制序列，监测急性髓细胞性白血病BAALC基因实时荧光定量PCR检测的整个过程，能有效地解决目前急性髓细胞性白血病BAALC基因实时荧光定量PCR检测过程中的假阳性和假阴性问题，使得检测结果更可靠，该试剂盒为临床评估急性淋巴细胞性白血病的诊断、预后以及复发周期提供了一种全新的快速简便的基因诊断技术。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<160>11

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gccctctgac ccagaaacag           20

<210>2

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ggcattctct tagcatctct tttagc    26

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

tggccttcag accacaga             18

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ccgggtctta ggctataatc aca     23

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gccttggcca tttttggtt          19

<210>6

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

tggtgtgaag ccc                13

<210>7

<211>75

<212>RNA

<213>人工序列

<400>7

gcccucugac ccagaaagac aauggccuuc acagcacaga gcguaaaaga gaugcuaaga    60

gaaugccugc aaaag                                                     75

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

gccctctgac ccagaaagac           20

<210>9

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

ggcattctct tagcatctct tttacg    26

<210>10

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

tggccttcac agcacaga             18

<210>11

<211>360

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

cagggtctga gtgaagccgc tcgttggaac tccaaggaaa accttctcgc tggacccagt     60

gaaaatgacc ccaacctttt cgttgcactg tatgattttg tggccagtgg agataacact    120

ctaagcataa ctaaaggtga aaagctccgg gtcttaggct ataatcacaa tggggaatgg    180

tgtgaagccc aaaccaaaaa tggccaaggc tgggtcccaa gcaactacat cacgccagtc    240

aacagtctgg agaaacactc ctggtaccat gggcctgtgt cccgcaatgc cgctgagtat    300

ctgctgagca gcgggatcaa tggcagcttc ttggtgcgtg agagtgagag cagtcctggc    360

Claims (7)

1.一种检测BAALC基因mRNA表达量的试剂盒，包括检测用引物、荧光探针、cDNA第一链合成试剂、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，其特征在于，所述检测用引物、荧光探针包括BAALC基因引物、内参基因ABL引物及Taqman荧光探针，其中：

BAALC基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；

BAALC基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；

BAALC基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:3所示；

ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:4所示；

ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:5所示；

ABL基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:6所示；

所述cDNA第一链合成试剂含有MgC1₂、逆转录酶缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂、Oligo(dT)₁₅、AMV逆转录酶和无RNase去离子水；所述荧光定量PCR混合液含有PCR预混合液、Mg²⁺、dNTPs、dUTP、Taq酶、UNG酶和无RNase去离子水。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内部阳性控制序列、内部阳性控制序列的引物和Taqman荧光探针，其中：内部阳性控制序列如序列表中SEQ IDNO:7所示；内部阳性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID NO:8所示；内部阳性控制序列的下游引物如序列表中SEQ ID NO:9所示；内部阳性控制序列的Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:10所示。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的BAALC基因的Taqman荧光探针和ABL基因的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团FAM，3’端均连接有荧光淬灭基团TAMRA；所述内部阳性控制序列的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团TET，3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述内参基因ABL的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:11所示。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为去离子水；所述阳性对照为含有BAALC基因的总RNA样品。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述cDNA第一链合成试剂为：25mmol/LMgC1₂4μL，10×逆转录酶缓冲液2μL，10mmol/L dNTP 2μL，RNA酶抑制剂0.5μL，Oligo(dT)₁₅0.5μg，AMV逆转录酶1.5U和无RNase去离子水，总体积11μL。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR的混合液为：1×的PCR预混合液、2.5-4.0mM的Mg²⁺、0.2-0.4mM的dNTPs、0.3-0.6mM的dUTP、0.2U/μL的Taq酶、0.01-0.05U/μL的UNG酶和无RNase去离子水。

Images