CN101445834A

CN101445834A - 基于磁性颗粒和单碱基延伸的snp自动化检测方法

Info

Publication number: CN101445834A
Application number: CNA2008102429548A
Authority: CN
Inventors: 刘洪娜; 何农跃; 李松
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2008-12-30
Filing date: 2008-12-30
Publication date: 2009-06-03

Abstract

本发明公开了一种基于磁性颗粒和单碱基延伸技术的单碱基差异(Single Nucleotide Polynorphisms，SNPs)检测新方法。其特征在于以生物素标记的待检测位点的延伸引物，在Taq酶作用下将特定荧光标记的ddNTP将延伸在引物3’端，通过包含有变性、退火和延伸的热循环反应，将模板的基因型信号放大。然后将延伸引物固定到修饰有亲和素的磁性颗粒表面，检测样本的分型信号。本发明具有简单、准确、低成本、高通量、高灵敏度的特点，并且该方法能够实现自动化运行，与传统方法相比该方法应要具有更高的实用性。

Description

基于磁性颗粒和单碱基延伸的SNP自动化检测方法

一、技术领域

本发明属于基因检测技术领域，特别涉及一种应用磁性颗粒与单碱基延伸技术的单核苷酸多态性自动化检测方法。

二、背景技术

研究与遗传表型相关的DNA序列变异成为了后基因组时代研究的主题之一。单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)人类基因组中最常见的单碱基差异，在基因组中出现频率很高，据估计每300-1000个碱基中即出现一次，分布密度远大于微卫星重复序列等，因而成为目前最常用的第三代遗传标志物。在不同的人群中，SNP的频率分布有差异，这些差异可以代表某一种族或人群间的遗传差异。因此，研究SNP有助于解释个体的表型差异、不同群体和个体对疾病，特别是对复杂疾病的易感性，以及对各种药物的耐受性和对环境因子的反应。另外，比较物种间SNP的差异，可以了解物种间的亲缘关系和进化的生物学信息。SNP的广泛应用前景，使之成为了后基因组时代的主要研究内容之一。其中最为重要的莫过于始于2002年的“国际人类基因组单体型计划”(International Hapmap Project)。该计划为人类基因组计划之后人类基因组研究领域的又一个重大研究计划，通过大规模的基因分型来鉴定来自世界不同地区的四个群体的常见单体型，以及特异识别这些单体型的标签SNPs。如果说基因组序列是一本生命的“百科全书”，那么Hapmap就是方便读者阅读本书的“索引目录”。所有从Hapmap中获得的标签SNPs的信息，均能够被研究者利用将遗传多态位点和特定疾病风险联系起来，从而为预防、诊断和治疗疾病提供新的方法。尽管单个基因对药物作用或疾病的影响已有不少研究。例如，已知一些参与药物代谢的酶的基因和受体基因可以改变药物在体内的代谢和个体对药物的敏感性。但对于常见的复杂疾病的发病，由于有众多基因和环境因素的参与，仅了解单个基因对其的影响是远远不够的，有必要在整体水平上全面认识多个基因的作用，而这只有基因组水平上才有可能做到。SNP以其数量众多和易于批量检测，正好为此提供了条件。SNP标记的确立，不仅便利了遗传病的原因基因的克隆工作，也便利了单基因、多基因病等各种遗传病的研究工作。SNP标记对临床医学也有重大意义，SNP标记首先应该是作为一种有效的遗传多态性标记物为临床医学服务的，比其它的遗传标记物更能真实的反映人种、人群及个体之间的遗传差异。在Hapmap计划、在全基因组关联分析以及疾病易感因子检出等需求的强烈推动下，对大量人群的已知SNP位点检测方法的研究成为热点，越来越多的生命科学研究者投身于相关的研究中，研究领域越来越大。因此，开发出适合于对大量样本已知SNP位点分型的方法具有时间上的紧迫性。因此，为了满足他们持续增长的需求，对SNP分型技术也有了更高的要求。那么满足要求的SNP分型技术需要具有以下特点：

1)高通量

当前的SNP研究中往往需要对大量样本的多个位点进行分型研究。如，在疾病关联的研究中，往往需要对来自病人和对照的上千乃至上万个样本的多个SNP位点进行分型研究。如此庞大的分析工作量，对需要检测技术具有高通量的特点。要具有真正高通量的特点，需要具备两个基本要素：首先，该方法能够实现阵列式的信号检测能力；其次，该方法能够实现高并行待检测样本的制备。生物芯片技术的发展，为高通量的检测提供了良好的技术平台，而高并行的样本操作和制备则更具有挑战性。

2)自动化

如果手动完成对大量样本的SNP位点分型，需要研究工作者耗费大量的时间和精力。因此，这就需要我们提供一种能够实现自动化的检测方法，不但能够研究人员从实验台边上解放出来，还可以大大加快研究进程。这种自动化的方法应该可以实现从样本的制备，分型操作，一直到最后的信号检测完全自动进行。

3)准确性

准确是对于SNP分型方法的基本要求。针对SNP二等位基因的特点，不同基因型的样本在SNP位点上仅有一个碱基的差异，这就需要SNP分型方法需要具有较高的特异性和较强的检测信号。

4)简单和易用性

一种检测方法若要被广大用户接受应该具有简单和易用的特点，检测探针设计简单易行，操作者只需要简单的培训就可以利用仪器实现操作。

5)低成本

在满足检测基本需求的情况下，成本是一个方法能够推广的一个重要因素，尤其是需要对大量样本进行分型的时候。

随着纳米技术的迅速发展，纳米材料逐渐被应用到生命科学领域，为其研究和发展提供了新的技术和手段。由于磁性纳米颗粒分离生物分子时具有分离速度快、效率高、可重复使用、操作简单、易实现功能基团、易实现自动化以及不影响分离物质的活性等特殊的物理化学性质和生物相容性，目前已被广泛应用于细胞的分离、免疫测定、蛋白质和酶的固定以及DNA的检测等。

科学研究和临床应用上都亟需能同时进行简单、有效、低成本且能够自动化多样本、多位点的高通量SNP分析技术。但总体来说，现有方法普遍受到样品纯化浓缩、操作复杂，及标记检测技术的限制，能同时检出的SNPs位点数和样本数是很有限的，有的方法分析成本过高或结果的准确性不够，缺乏真正的实用性。这些技术和方法上的瓶颈，妨碍了后基因组研究的深入发展。

三、发明内容

技术问题：本发明针对现有技术缺点，提出了一种将磁性纳米颗粒与单碱基循环延伸技术相结合，建立一种新型的简单、高准确性、低成本、高通量的SNP检测方法，整个方法能够实现从自动化分行，且与传统方法相比该方法应要具有很高的实用性和灵活性。

技术方案：一种基于磁性颗粒和单碱基延伸的SNP自动化检测方法，检测步骤为：a.磁性纳米颗粒的修饰：对无荧光背景的磁性颗粒表面进行功能化修饰，使磁性颗粒表面连接有亲和素或者链酶亲和素；b.设计引物的修饰：选取待检测的重要功能SNP位点或突变位点，根据上述位点碱基序列设计单碱基循环延伸引物，所设计的引物5’端经过功能化修饰有生物素，3’端最后一个碱基与待检测位点的上游一个碱基互补；c.延伸反应：延伸反应的体系中包括步骤b中经修饰的延伸引物，模板DNA，与待检测相关SNP位点相对应的荧光标记的ddNTP，Mg²⁺、1×Taq酶缓冲液、TaqDNA聚合酶，通过95℃变性、退火，靶序列和延伸引物结合，在TaqDNA聚合酶的作用下，与待检测位点相对应的荧光标记的ddNTP将延伸在引物3’端，在新的一个循环中，靶序列通过与另一条引物互补，将荧光标记的ddNTP通过延伸连接在新的引物上，如此若干循环后，延伸引物的3’端都将连接上荧光标记物；d.延伸反应后，加入步骤a制备的亲和素标记的磁性纳米颗粒，通过生物素-亲合素特异性结合，延伸引物即可固定到磁性颗粒表面，得延伸引物-磁性颗粒复合物；e.将延伸引物-磁性颗粒复合物经过充分的洗涤-磁分离若干次后，通过检测磁性颗粒表面的荧光强度来实现对样本的SNP检测。

上述方法中所使用延伸模板为基因组DNA或者PCR产物作为延伸模板，在Taq酶的作用下，通过热循环延伸后在延伸引物上延伸出荧光标记的ddNTP。

上述方法中循环延伸所使用的荧光标记的ddNTP只与待检测位点互补，所述荧光标记的ddNTP为单色荧光标记或为双色荧光标记。

上述方法步骤e中磁性颗粒表面的荧光强度用生物芯片扫描仪检测或用荧光微孔板检测。

有益效果：

本发明首次提出了一种将磁性颗粒与单碱基延伸技术结合实现自动化、高通量SNP检测的方法。本发明中，生物素标记的单碱基延伸引物，以靶序列为模板，通过单碱基延伸将荧光标记的ddNTP标记到延伸引物的3’端。然后，将连接有荧光标记物的延伸引物固定到磁性颗粒上，从而获取样本的分型信息，实现了对分型信号的二次放大。

在本发明所描述的SNP分型技术中，使用无荧光背景的磁性纳米颗粒来捕获荧光标记的延伸引物。在颗粒表面较小的空间区域内固定更大量的荧光探针，从而实现信号放大。同时，利用磁性颗粒作为反应与检测载体，易于实现自动化，检测快速，灵敏度高等优点。该技术与常规单碱基延伸技术相比，使用基因组DNA代替PCR产物作为延伸模板，避免对靶序列的纯化、浓缩。该方法的分型信号强度大，正错配信号比高。由于实验中仅需要荧光标记的ddNTP，无须其他昂贵的荧光探针，大大降低了实验成本。因而应用该方法能够实现对大量样本多个SNP位点的高准确性、低成本、高通量、自动化的检测。

综上所述，本发明克服了目前SNP检测方法的许多不足，具有操作简单、快速、高通量、高灵敏度等优点，有较高的应用价值。

四、具体实施方式

实施例1：

1、本实施例中我们以检测AGT基因M235T SNP位点为例，所设计的延伸引物为5’端生物素标记。具体引物序列为：Biotin-(N)₁₅-GGTGTC CACACTGGCTCCC。

4、单碱基延伸反应每个样本在两个单独的PCR管中进行，每管反应体系20μL，每管中包含20μM相应的TARMA-ddNTP，TARMA-ddATP加入野生型的反应管中，TARMA-ddGTP加入突变型的反应管中，其余反应成分包括10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mMKCl，2.0mM MgCl2，1.5U of Taq酶，100ng基因组DNA和24pmol生物素标记的延伸引物。

5、延伸反应的具体程序如下：首先95℃保温5分钟，然后进行35个循环的变温热循环，具体包括95℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃30秒.在TaqDNA聚合酶的作用下，与待检测位点相对应的荧光标记的ddNTP将延伸在引物3’端，由于反应体系中只有ddNTP的存在，所以延伸出一个碱基后延伸反应停止。在新的一个循环中，靶序列通过与另一条引物互补，将荧光标记的ddNTP通过延伸连接在新的引物上。如此若干循环后，延伸引物的3’端将都连接上荧光标记物。

3、反应完成后，加入120μg亲和素标记的Invitrogen MyOne磁性颗粒，室温15分钟，将生物素标记的引物全部捕获到磁性颗粒表面。

6、反应后，磁性颗粒-DNA复合物应用去离子水彻底清洗两遍，然后分散到10μL去离子水将磁性颗粒点样在干净的玻片表面，干燥后，利用生物芯片扫描仪进行检测。采用单色荧光标记的ddNTP分型时，样本的分型原理为：野生型样本，来自野生型管的颗粒有较强的荧光信号，而来自突变型管的颗粒无荧光信号；突变型样本，来自野生型管的颗粒无荧光信号，而来自突变型管的颗粒有较强的荧光信号；杂合型样本，来自两管的的颗粒均有较强的荧光信号。

实施例2：

1、按照Shen等的方法(Chemistry Letters Vol.33，No.11，1468-1469，2004)合成Fe₂O₃磁性颗粒。

2、磁性颗粒通过在5％(体积比)APTES的乙醇溶液中浸泡，使之表面修饰上NH₂基团，经乙醇和去离子水洗涤后，磁性颗粒浸泡在5％(体积比)戊二醛的水溶液中，使之表面修饰上醛基基团。最终，将使用PB缓冲液稀释的的亲合素与醛基修饰的磁性颗粒反应，制备得到亲合素修饰的磁性颗粒。

3、本实施例中我们以检测AGT基因M235T SNP位点为例，所设计的延伸引物为5’端生物素标记。具体引物序列为：Biotin-(N)₁₅-GGTGTC CACACTGGCTCCC。

4、按照Liu等的方法(Journal of Nanoscience and Nanotechnology，2008，8：405-409)制备待检测样本的全基因组扩增产物。

5、固相循环延伸反应每个样本在两个单独的PCR管中进行，每管反应体系20μL，每管中包含20μM相应的TARMA-ddNTP，TARMA-ddATP加入野生型的反应管中，TARMA-ddGTP加入突变型的反应管中，其余反应成分包括10mM Tris-HCl(pH 8.3)，50mMKCl，2.0mM MgCl₂，1.5U of Taq酶and 100ng全基因扩增产物。

6、延伸反应的具体程序如下：首先95℃保温5分钟，然后进行35个循环的变温热循环，具体包括95℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃30秒。在TaqDNA聚合酶的作用下，与待检测位点相对应的荧光标记的ddNTP将延伸在引物3’端，由于反应体系中只有ddNTP的存在，所以延伸出一个碱基后延伸反应停止。在新的一个循环中，靶序列通过与另一条引物互补，将荧光标记的ddNTP通过延伸连接在新的引物上。如此若干循环后，延伸引物的3’端将都连接上荧光标记物。

7、反应完成后，加入120μg亲和素标记磁性颗粒，室温15分钟，将生物素标记的引物全部捕获到磁性颗粒表面。

8、反应后，磁性颗粒-DNA复合物应用去离子水彻底清洗两变，然后分散到10μL去离子水，将磁性颗粒点样在干净的玻片表面，快速干燥后，利用生物芯片扫描仪进行检测。采用单色荧光标记的ddNTP分型时，样本的分型原理为：野生型样本，来自野生型管的颗粒有较强的荧光信号，而来自突变型管的颗粒无荧光信号；突变型样本，来自野生型管的颗粒无荧光信号，而来自突变型管的颗粒有较强的荧光信号；杂合型样本，来自两管的的颗粒均有较强的荧光信号。

实施例3：

1、按照Wang等的方法(J.Nanosci.Nanotechnol.2008，8，1797)合成包被有二氧化硅的磁性纳米颗粒。

3、本实施例中我们以检测AGT基因M235T SNP位点为例，所设计的延伸引物为5’端生物标记。具体引物序列为：biotin-(N)₁₅-GGTGTCCACACTGGCTCCC。

4、按照Staessenu等的方法(Journal of Hypertension.17(1)：9-17，1999)制备待检测样本的AGT基因的M235T位点的PCR产物。

5、固相循环延伸反应每个样本在一个PCR管中进行，每管反应体系20μL，管中包含20μM Cy3-ddATP Cy5-ddGTP，10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，2.0mM MgCl₂，1.5U of Taq酶and10μL步骤4中扩增获得的PCR产物。

6、延伸反应的具体程序如下：首先95℃保温5分钟，然后进行35个循环的变温热循环，具体包括95℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 30秒。在TaqDNA聚合酶的作用下，与待检测位点相对应的荧光标记的ddNTP将延伸在引物3’端，由于反应体系中只有ddNTP的存在，所以延伸出一个碱基后延伸反应停止。在新的一个循环中，靶序列通过与另一条引物互补，将荧光标记的ddNTP通过延伸连接在新的引物上。如此若干循环后，延伸引物的3’端将都连接上荧光标记物。

7、反应完成后，加入120μg亲和素标记磁性颗粒，室温反应15分钟，将生物素标记的引物全部捕获到磁性颗粒表面。

8、反应后，磁性颗粒-DNA复合物应用去离子水彻底清洗两变，然后分散到10μL去离子水，将磁性颗粒点样在干净的玻片表面，快速干燥后，利用生物芯片扫描仪进行检测。采用双色荧光标记的ddNTP分型时，样本的分型原理为：野生型样本，有较强的Cy3荧光信号，Cy5信号很弱；突变型样本有较强的Cy5荧光信号，Cy3信号很弱；杂合型样本，两种荧光信号均比较强。

Claims

1.一种基于磁性颗粒和单碱基延伸的SNP自动化检测方法，其特征在于检测步骤为：

a.磁性纳米颗粒的修饰：对无荧光背景的磁性颗粒表面进行功能化修饰，使磁性颗粒表面连接有亲和素或者链酶亲和素；

b.设计引物的修饰：选取待检测的重要功能SNP位点或突变位点，根据上述位点碱基序列设计单碱基循环延伸引物，所设计的引物5’端经过功能化修饰有生物素，3’端最后一个碱基与待检测位点的上游一个碱基互补；

c.延伸反应：延伸反应的体系中包括步骤b中经修饰的延伸引物，模板DNA，与待检测相关SNP位点相对应的荧光标记的ddNTP，Mg²⁺、1×Taq酶缓冲液、TaqDNA聚合酶，通过95℃变性、退火，靶序列和延伸引物结合，在TaqDNA聚合酶的作用下，与待检测位点相对应的荧光标记的ddNTP将延伸在引物3’端，在新的一个循环中，靶序列通过与另一条引物互补，将荧光标记的ddNTP通过延伸连接在新的引物上，如此若干循环后，延伸引物的3’端都将连接上荧光标记物；

d.延伸反应后，加入步骤a制备的亲和素标记的磁性纳米颗粒，通过生物素-亲合素特异性结合，延伸引物即可固定到磁性颗粒表面，得延伸引物-磁性颗粒复合物；

e.将延伸引物-磁性颗粒复合物经过充分的洗涤-磁分离若干次后，通过检测磁性颗粒表面的荧光强度来实现对样本的SNP检测。

2、根据权利要求1所述的基于磁性颗粒和单碱基延伸的SNP自动化检测方法，其特征在于使用延伸模板为基因组DNA或者PCR产物作为延伸模板，在Taq酶的作用下，通过热循环延伸后在延伸引物上延伸出荧光标记的ddNTP。

3、根据权利要求1所述的基于磁性颗粒和单碱基延伸的SNP自动化检测方法，其特征在于循环延伸所使用的荧光标记的ddNTP只与待检测位点互补，所述荧光标记的ddNTP为单色荧光标记或为双色荧光标记。

4、根据权利要求1所述的基于磁性颗粒和单碱基延伸的SNP自动化检测方法，其特征在于所述步骤e中磁性颗粒表面的荧光强度用生物芯片扫描仪检测或用荧光微孔板检测。