CN102676645A - 叶酸利用能力基因检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

叶酸利用能力基因检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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CN102676645A CN2011103488418A CN201110348841A CN102676645A CN 102676645 A CN102676645 A CN 102676645A CN 2011103488418 A CN2011103488418 A CN 2011103488418A CN 201110348841 A CN201110348841 A CN 201110348841A CN 102676645 A CN102676645 A CN 102676645A
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陈瑛
毛君
王本敬
李红
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SUZHOU CITY HOSPITAL OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE
Suzhou Municipal Hospital
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叶酸利用能力基因检测试剂盒及检测方法，它涉及基因检测技术领域，叶酸利用能力基因检测试剂盒包含：(1)PCR反应试剂，包括dNTP、5×和10×PCR缓冲液、Mg2+离子、去离子水、FastTaq酶、SNaPshot Mix混合液；(2)按一定比例混合的16对PCR引物混合物；(3)按一定比例混合的16条延伸引物混合物；(4)纯化用SAP酶、Exon I酶及其配套的缓冲液；(5)单个位点纯合、杂合突变的阳性和阴性对照DNA；(6)使用说明书。它能提供一种简单、高通量、高效能、低成本的适合中国人群的叶酸利用能力基因突变筛查方法。

Description

叶酸利用能力基因检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种基因检测技术领域，尤其涉及一种叶酸利用能力基因检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
叶酸是一种B族维生素，人体本身不能合成。从食物中摄取的叶酸只有在叶酸还原酶的作用下，还原为四氢叶酸，才能参与人体许多重要的生化代谢反应，是机体细胞生长和分裂所必需的物质，也是人体内参与合成碱基的关键辅助因子。因此，缺乏叶酸，胎儿、婴幼儿会出现发育缺陷和迟缓。在孕妇中大力推广“叶酸强化”，从某种程度上减少了出生缺陷。孕妇一般采用每天服用一粒叶酸片(400微克)的形式补充叶酸，对于叶酸利用能力正常的孕妇这个用量是充足的，但对于叶酸利用能力不足的孕妇却远远不够。此外，最近发现“叶酸强化”还存在一定负面效应，大范围人群大量补充叶酸，人为地造成未来的人口对于大量维生素产生依赖性，由此，可能导致人口整体的基因组成发生变化，这种人群对于某些致命的疾病将变得十分脆弱。因此，鉴别出叶酸利用能力正常和叶酸利用能力不足的人群，个性化合理的补充叶酸具有重要的现实意义和长远意义。
部分叶酸利用能力不足的孕妇，其叶酸代谢途径相关酶基因发生了突变，导致了酶分子一个氨基酸的替换，使酶活性大大下降而影响叶酸的利用能力。已经报道叶酸代谢途径中一些酶基因的多态性与神经管畸形、心血管疾病、唐氏综合征、流产、淋巴细胞性白血病、乳腺癌、胃癌、Andesophageal肿瘤、阿尔茨海默病等疾病相关联。
在叶酸利用能力相关的基因检测技术临床应用之前，妇产科医师通常只能建议所有孕妇按照标准量、标准时间来服用叶酸。我们提出个体化合理使用叶酸，为此研发了本试剂盒，通过本试剂盒检测，可检测出影响叶酸代谢和利用能力的一些已知的常见的突变，将亚健康人群分为疾病风险高、中、低三个亚群，指导这些人群个性化使用叶酸，对高风险人群进行特异性个性化干预。有针对性的合理补充叶酸，可以消除过度“叶酸强化”带来的负面影响。
本试剂盒以我国常见的叶酸不足引发的疾病(神经管畸形、心血管疾病、唐氏综合征、流产、淋巴细胞性白血病、乳腺癌、胃癌、andesophageal肿瘤、阿尔茨海默病)为代表性目标疾病，对于阻止亚健康向疾病转变以及促进健康恢复起到一定作用，为我国出生缺陷的降低将起到一定作用。
此外，肿瘤生长过程中需要大量合成DNA，由于叶酸对DNA的加工很重要，因此叶酸代谢途径也被作为抗肿瘤治疗的靶点。一个叫甲氨喋呤的化合物就是叶酸的类似物，它可抑制叶酸的代谢，目前仍是临床上多种肿瘤的化疗药物，适用于急性白血病、乳腺癌、绒毛膜上皮癌及恶性葡萄胎、头颈部肿瘤、骨肿瘤、白血病脑膜脊髓浸润、肺癌、生殖系统肿瘤、肝癌、顽固性普通牛皮癣及自身免疫病等。这类化疗药物对叶酸代谢正常的患者疗效较为明显。因此在使用针对叶酸代谢的抗肿瘤药物之前，也可通过本试剂盒检测，筛选出存在叶酸利用能力低下风险的个体，指导临床医生合理选择抗肿瘤药物。
目前，传统基因突变检测方法包括：单链构象多态性分析(SingleStrand Conformation Polymorphism，SSCP)、PCR-限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、变性高效液相色谱(Denaturing High Performance LiquidChromatography，DHPLC)、直接测序、基因芯片等。这些方法或者检测能力有限、或者耗时费力、所需设备和耗材昂贵，更重要的是，除基因芯片外，这些方法难以针对不同基因的多个突变位点同时进行高通量检测。而基因芯片技术平台成本昂贵，对环境和人员素质要求高，难以在我国广大医疗机构中普及，因此有必要建立一种高通量、高效能、低成本的叶酸代谢相关酶基因突变筛查方法，以实现临床快速检测和规模化筛查。
我们研发的试剂盒在临床应用上具有明显的优势。传统的基因检测技术中每个位点都要单独检测，大大浪费了检测的时间、试剂、人力和物力，效率低。使用本试剂盒检测，在一个反应管中可以同时对16个位点进行检测，最终给出16个位点的基因分型结果。
我们开发的利用SNaPshot技术检测叶酸利用能力相关酶基因的技术平台，其原理是：多重PCR扩增目的区域后，经寡核苷酸引物延伸标记扩增，突变位点匹配上一个荧光标记的双脱氧核苷酸后终止延伸。然后通过毛细管电泳进行片段分析，相当于单个位点的微测序，可以检测单核苷酸的突变。延伸位点碱基的类型决定电泳峰的颜色，根据峰的颜色可以清楚方便的判断为野生型(正常)还是突变型；延伸引物的片段长度决定峰的位置；延伸引物的浓度影响电泳检测的峰高。
发明内容：
本发明的目的是提供一种叶酸利用能力基因检测试剂盒及检测方法，它能针对目前中国人群叶酸利用能力相关基因突变的特点，选择覆盖范围广泛的16个突变热点作为筛查目标，弥补目前现有突变筛查方法的不足，提供一种简单、高通量、高效能、低成本的适合中国人群的叶酸利用能力基因突变筛查方法。
为了解决背景技术所存在的问题，本发明是采用以下技术方案：叶酸利用能力基因检测试剂盒包含：
(1)PCR反应试剂，包括dNTP、5×和10×PCR缓冲液、Mg2+离子、去离子水、FastTaq酶、SNaPshot Mix混合液；
(2)按一定比例混合的PCR扩增的正向引物和反向引物；各引物的浓度见图1；
(3)按一定比例混合的的延伸引物；各引物的终浓度参见图1；图1为推荐的使用浓度配比，具体在使用时，如果某个电泳峰的峰高过低，可适当增加引物加入量，如果峰过高，可以适当减少引物用量，以达到最佳检测效果。
(4)纯化用SAP酶、Exon I酶及其配套的缓冲液；
(5)单个位点纯合、杂合突变的阳性和阴性对照DNA；
(6)使用说明书。
它的检测方法为：通过多重PCR扩增，使被检测样本的16个目的片段得到扩增富集；然后进行扩增产物的酶反应纯化，去除多余的引物及dNTP“杂质”；再利用针对突变位点设计的16条延伸引物，对16个富集的片段进行单碱基的延伸反应，仅对突变位点的单个碱基进行荧光标记扩增，突变位点匹配上一个荧光标记的双脱氧核苷酸后终止延伸；然后再进行一次扩增产物的酶反应纯化；最后经毛细管电泳进行扩增片段分析，相当于单个位点的微测序，这样可以检测单核苷酸的突变，延伸位点碱基的类型决定电泳峰的颜色，延伸引物的片段长度决定峰的位置，延伸引物的浓度影响电泳检测的峰高。
所述的试剂盒包含检测CBS基因C699T、DHFR基因c594+59del19、FOLH1基因T1561C、GST01基因C428T、MTHFD1基因G878A、MTHFD基因G1958A、MTHFR基因A1298C、MTHFD基因C677T、MTR基因A2756G、MTRR基因A66G、NAT1基因C1095A、NFE2L2基因ins1+C11108T、RFC1基因G80A、SHMT1基因C1420T、TCN2基因C776G和TYMS基因1494del6十六个基因突变位点的引物：
第一组：所述检测CBS基因C699T位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P1-F：TTTCTATGCAGTACCGCAACG；
P1-R：AATCAAGATGGACAGAGGGAC；
延伸引物：E1：(T)22AGCAACCCCCTGGCTCACTA；
第二组：所述检测DHFR基因c594+59del19位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P2-F：ACTGCATCGTCGCTGTGTC；
P2-R：CGGGCAGAAATCAGCAAC；
延伸引物：E2：(T)34AGGCTGCCCACGGTCGGGGT；
第三组：所述检测FOLH1基因T1561C位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P3-F：TCCAACTTCAGAAACCTT；
P3-R：TTAGTATACCGTGCTCTGC；
延伸引物：E3：(T)34GCAAATTGGGATCTGGAAATGAT；
第四组：所述检测GST01基因C428T位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P4-F：ATTCTCTGTCTAGGTGCCATC；
P4-R：CTCCTCTAGCTTGGTAAATTC；
延伸引物：E4：(T)29CCAAAATAAAGAAGACTATG；
第五组：所述检测MTHFD1基因G878A位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P5-F：GCTTGAAACTGAGGTGAG；
P5-R：AGGTTGTTATACTGAATCATCC；
延伸引物：E5：(T)4CACAGTAGAGAGTGCCAAGC；
第六组：所述检测MTHFD基因G1958A位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P6-F：GTTTGCCAACATCGCACATG；
P6-R：CTAACCTACAAACCCTTCTGG；
延伸引物：E6：(T)12CCTCCATCATTGCAGACC；
第七组：所述检测MTHFR基因A1298C位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P7-F：CGAGAGGTAAAGAACGAAGAC；
P7-R：TTCTACCTGAAGAGCAAGTCC；
延伸引物：E7：(T)34GGAGGAGCTGACCAGTGAAG；
第八组：所述检测MTHFD基因C677T位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P8-F：TGAAGCACTTGAAGGAGAAGG；
P8-R：CCTTCACAAAGCGGAAGAATG；
延伸引物：E8：(T)12GGAGAAGGTGTCTGCGGGAG；
第九组：所述检测MTR基因A2756G位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P9-F：CATTGACCATTACTACACCAG；
P9-R：TCTGTTTCTACCACTTACCTTG；
延伸引物：E9：ATGGAAGAATATGAAGATATTAGACAGG；
第十组：所述检测MTRR基因A66G位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P10-F：TATATGCTACACAGCAGGGAC；
P10-R：GGCTCTAACCTTATCGGATTC；
延伸引物：E10：(T)20AAGGCCATCGCAGAAGAAAT；
第十一组：所述检测NAT1基因C1095A位点突变的引物的碱基序列为：扩增引物：P11-F：CTAGACATCAAATCATTTCACC；
P11-R：CTTTCTAGCATAAATCACCAAT；
延伸引物：E11：TAACCACAGGCCATCTTTAAAA；
第十二组：所述检测NFE2L2基因ins1+C11108T位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P12-F：AACTGACTGAGCAACTATTACG；
P12-R：ATTGCTCCTCTGTGTCTCC；
延伸引物：E12：(T)14CTTAGAGGAACTCATATCCTAAG；
第十三组：所述检测RFC1基因G80A位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P13-F：CATGAAGCCGTAGAAGCAAAG；
P13-R：AGAAGCAGGTGCCCGTGGAA；
延伸引物：E13：(T)25CGAGCTCCGGTCCTGGCGGC；
第十四组：所述检测SHMT1基因C1420T位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P14-F：GTTCAAGGAGAGACTGGC；
P14-R：GCTCATCCATCTCTCAGG；
延伸引物：E14：(T)7AGGTTGAGAGCTTCGCCTCT；
第十五组：所述检测TCN2基因C776G位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P15-F：TCCTCACTCTATCACCAGTTC；
P15-R：TCATGAGAGCATTCTGGAAGG；
延伸引物：E15：(T)38CCTCATGACTTCCCCCATGC；
第十六组：所述检测TYMS基因1494del6位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P16-F：AGGAACTGAGCAGATAAGTGG；
P16-R：CGATCATGATGTAGAGTGTGG；
延伸引物：E16：(T)40GAGTGTGGTTATGAACTTTA。
所述的PCR扩增引物及延伸引物用于针对人类基因组中目的区域DNA的扩增以及目的位点的微测序，进而达到基因分型的目的，以实现特定核苷酸变异的检测(其序列参见图1)。
所述的PCR扩增引物和延伸引物浓度的优化配置，使其能够在延伸反应时兼顾各个位点的产量，利于后续检测中各个位点突变情况的判断识别。
本发明中的PCR扩增引物设计时选择目的区域上下游70-150bp的距离作为引物设计的起始部位，引物与之序列匹配的特异性要好，引物间的退火温度要尽量一致(55℃左右)。使在一个多重PCR反应中的各个扩增引物的扩增效率相当。
本发明中16个突变位点的延伸引物在设计时的指导思想是：根据不同序列情况，在突变点的上游或下游选取正向或反向与突变位点5’端或3‘端序列互补结合的17-25bp的序列；避免序列中有难以解链的二级结构；确保延伸的单个碱基不在序列上，并保证缺失型突变下一个碱基与缺失的碱基为不同碱基；各个延伸引物片段全长应该有一定的差异，通过在片段的5‘端加上若干个T，使得延伸引物长度均匀分布在18-70bp之间(参见图1)，以便于通过毛细管电泳分离检测(其序列参见图1)。16个位点的延伸产物长度见图1。这样经过PCR扩增后，带有不同荧光的不同长度的片段经毛细管电泳后就能够分析出相应片段所携带的碱基类型，进而可以判断是否存在该碱基的突变，并区分属于野生型、纯合突变还是杂合突变，使上述16个位点一次性得到精确的基因分型。
本发明中设计的PCR扩增引物和延伸引物序列，通过核酸合成仪人工合成，并与PCR扩增反应试剂，包括：dNTP、5×和10×PCR缓冲液、Mg2+离子、去离子水、FastTaq酶、SNaPshot Mix混合液、纯化用SAP酶、Exon I酶及其配套的缓冲液；16个位点杂合突变型的混合DNA阳性标本，以及说明书组合起来，提供用于体外检测叶酸利用能力基因突变筛查的试剂盒，其主要功能在于，将所需的试剂集成在一个小盒内，使得核酸片段扩增、纯化可以在试剂盒提供试剂的基础上顺序完成。
本发明能针对目前中国人群叶酸利用能力相关基因突变的特点，选择覆盖范围广泛的16个突变热点作为筛查目标，弥补目前现有突变筛查方法的不足，提供一种简单、高通量、高效能、低成本的适合中国人群的叶酸利用能力基因突变筛查方法。
附图说明：
图1为本发明的PCR扩增引物、延伸引物及结果判读的表格图；
图2为本发明的SNaPshot实验流程示意图；
图3为本发明的毛细管电泳结果图。电泳顺序由左向右依次为：NAT1 C1095A、MTHFD1 G878A、SHMT1 C1420T、MTHFD G1958A、MTHFRC677T、MTR A2756G、NFE2L2 ins1+C11108T、MTRR A66G、CBS C699T、RFC1 G80A、GST01 C428T、MTHFR A1298C、DHFR c594+59del19、FOLH1T1561C、TCN2 C776G、TYMS 1494del6。理论上的片段长度分别为22bp、24bp，27bp，30bp，32，33bp，37bp，40bp，42bp，45bp，49bp，51bp，54bp，56bp，57bp，61bp和60bp。实际电泳过程可能会存在飘移现象，即与分子量标记所测片段大小有一定差距，如60bp片段会飘移到61bp片段后面，但不会影响整体结果判读。
具体实施方式：
参照图1-3本具体实施方式采用以下技术方案：叶酸利用能力基因检测试剂盒包含：
(1)PCR反应试剂，包括dNTP、5×和10×PCR缓冲液、Mg2+离子、去离子水、FastTaq酶、SNaPshot Mix混合液；
(2)按一定比例混合的PCR扩增的正向引物和反向引物；各引物的浓度见图1；
(3)按一定比例混合的延伸引物；各引物的终浓度参见图1；图1为推荐的使用浓度配比，具体在使用时，如果某个电泳峰的峰高过低，可适当增加引物加入量，如果峰过高，可以适当减少引物用量，以达到最佳检测效果。
(4)纯化用SAP酶、Exon I酶及其配套的缓冲液；
(5)单个位点纯合、杂合突变的阳性和阴性对照DNA；
(6)使用说明书。
它的检测方法为：通过多重PCR扩增，使被检测样本的16个目的片段得到扩增富集；然后进行扩增产物的酶反应纯化，去除多余的引物及dNTP“杂质”；再利用针对突变位点设计的16条延伸引物，对16个富集的片段进行单碱基的延伸反应，仅对突变位点的单个碱基进行荧光标记扩增，突变位点匹配上一个荧光标记的双脱氧核苷酸后终止延伸；然后再进行一次扩增产物的酶反应纯化；最后经毛细管电泳进行扩增片段分析，相当于单个位点的微测序，这样可以检测单核苷酸的突变，延伸位点碱基的类型决定电泳峰的颜色，延伸引物的片段长度决定峰的位置，延伸引物的浓度影响电泳检测的峰高。
所述的试剂盒包含检测CBS基因C699T、DHFR基因c594+59del19、FOLH1基因T1561C、GST01基因C428T、MTHFD1基因G878A、MTHFD基因G1958A、MTHFR基因A1298C、MTHFD基因C677T、MTR基因A2756G、MTRR基因A66G、NAT1基因C1095A、NFE2L2基因ins1+C11108T、RFC1基因G80A、SHMT1基因C1420T、TCN2基因C776G和TYMS基因1494del6十六个基因突变位点的引物：
第一组：所述检测C699T位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P1-F：TTTCTATGCAGTACCGCAACG；
P1-R：AATCAAGATGGACAGAGGGAC；
延伸引物：E1：(T)22AGCAACCCCCTGGCTCACTA；
第二组：所述检测DHFR基因c594+59del19位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P2-F：ACTGCATCGTCGCTGTGTC；
P2-R：CGGGCAGAAATCAGCAAC；
延伸引物：E2：(T)34AGGCTGCCCACGGTCGGGGT；
第三组：所述检测FOLH1基因T1561C位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P3-F：TCCAACTTCAGAAACCTT；
P3-R：TTAGTATACCGTGCTCTGC；
延伸引物：E3：(T)34GCAAATTGGGATCTGGAAATGAT；
第四组：所述检测GST01基因C428T位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P4-F：ATTCTCTGTCTAGGTGCCATC；
P4-R：CTCCTCTAGCTTGGTAAATTC；
延伸引物：E4：(T)29CCAAAATAAAGAAGACTATG；
第五组：所述检测MTHFD1基因G878A位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P5-F：GCTTGAAACTGAGGTGAG；
P5-R：AGGTTGTTATACTGAATCATCC；
延伸引物：E5：(T)4CACAGTAGAGAGTGCCAAGC；
第六组：所述检测MTHFD基因G1958A位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P6-F：GTTTGCCAACATCGCACATG；
P6-R：CTAACCTACAAACCCTTCTGG；
延伸引物：E6：(T)12CCTCCATCATTGCAGACC；
第七组：所述检测MTHFR基因A1298C位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P7-F：CGAGAGGTAAAGAACGAAGAC；
P7-R：TTCTACCTGAAGAGCAAGTCC；
延伸引物：E7：(T)34GGAGGAGCTGACCAGTGAAG；
第八组：所述检测MTHFD基因C677T位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P8-F：TGAAGCACTTGAAGGAGAAGG；
P8-R：CCTTCACAAAGCGGAAGAATG；
延伸引物：E8：(T)12GGAGAAGGTGTCTGCGGGAG；
第九组：所述检测MTR基因A2756G位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P9-F：CATTGACCATTACTACACCAG；
P9-R：TCTGTTTCTACCACTTACCTTG；
延伸引物：E9：ATGGAAGAATATGAAGATATTAGACAGG；
第十组：所述检测MTRR基因A66G位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P10-F：TATATGCTACACAGCAGGGAC；
P10-R：GGCTCTAACCTTATCGGATTC；
延伸引物：E10：(T)20AAGGCCATCGCAGAAGAAAT；
第十一组：所述检测NAT1基因C1095A位点突变的引物的碱基序列为：扩增引物：P11-F：CTAGACATCAAATCATTTCACC；
P11-R：CTTTCTAGCATAAATCACCAAT；
延伸引物：E11：TAACCACAGGCCATCTTTAAAA；
第十二组：所述检测NFE2L2基因ins1+C11108T位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P12-F：AACTGACTGAGCAACTATTACG；
P12-R：ATTGCTCCTCTGTGTCTCC；
延伸引物：E12：(T)14CTTAGAGGAACTCATATCCTAAG；
第十三组：所述检测RFC1基因G80A位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P13-F：CATGAAGCCGTAGAAGCAAAG；
P13-R：AGAAGCAGGTGCCCGTGGAA；
延伸引物：E13：(T)25CGAGCTCCGGTCCTGGCGGC；
第十四组：所述检测SHMT1基因C1420T位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P14-F：GTTCAAGGAGAGACTGGC；
P14-R：GCTCATCCATCTCTCAGG；
延伸引物：E14：(T)7AGGTTGAGAGCTTCGCCTCT；
第十五组：所述检测TCN2基因C776G位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P15-F：TCCTCACTCTATCACCAGTTC；
P15-R：TCATGAGAGCATTCTGGAAGG：
延伸引物：E15：(T)38CCTCATGACTTCCCCCATGC；
第十六组：所述检测TYMS基因1494del6位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P16-F：AGGAACTGAGCAGATAAGTGG；
P16-R：CGATCATGATGTAGAGTGTGG；
延伸引物：E16：(T)40GAGTGTGGTTATGAACTTTA。
所述的PCR扩增引物及延伸引物用于针对人类基因组中目的区域DNA的扩增以及目的位点的微测序，进而达到基因分型的目的，以实现特定核苷酸变异的检测(其序列参见图1)。
所述的PCR扩增引物和延伸引物浓度的优化配置，使其能够在延伸反应时兼顾各个位点的产量，利于后续检测中各个位点突变情况的判断识别。
本具体实施方式中(1)Touchdown多重PCR：反应体系总体积10μL，10×PCR缓冲液1.0μL、MgCl2(25mM)1.0μL、dNTP(2mM)1.5μL、Primer Mix 4.0μL、FastTaqE(5U/μL)、模板DNA 2.35μL；反应程序，95℃预变性4min；94℃变性30s，66℃退火50s，每循环降0.5℃，72℃延伸50s，11个循环；94℃变性30s，61℃退火50s，72℃延伸50s，24个循环；72℃充分延伸10min，4℃保存，PCR反应在9700热循环仪(ABI公司)中进行。
(2)PCR产物纯化：反应体系总体积6μL，ddH2O 2.6μL、SAP酶(1.0U/μL)2μL、Exon I酶(5.0U/μL)0.4μL、上述PCR产物1.0μL；反应程序，37℃反应80min，80℃终止反应15min，4℃保存。
(3)标记延伸：反应体系总体积6.0μL，ddH2O 1.8μL，5×SeqBuffer 1.2μL，混合延伸引物(E-Primer)1.0μL、SNaPshot Mix 1.0μL，上述纯化产物1μL；PCR反应程序：96℃预变性1min；96℃变性10s，52℃退火5s，60℃延伸30s，28个循环，4℃保存，PCR反应可选择在9700热循环仪(ABI公司)中进行。
(4)二次纯化：反应总体积7μL，反应结束后每反应产物中加入SAP酶(1.0U/μL)1μL；反应程序：37℃反应60min，75℃灭活反应15min，4℃保存，反应可选择在9700热循环仪(ABI公司)中进行。
(5)毛细管电泳：反应体系总体积10.2μL，Hi-Di甲酰胺(ABI公司)9μL，内标LIZ-120(ABI公司)0.2μL，第二次纯化产物1μL；反应程序：95℃变性5min，立即置冰上5min。在ABI公司遗传分析仪进行毛细管电泳，应用GeneMapper系列软件进行数据的采集和分析。
(6)结果分析：根据峰颜色来区分野生型、杂合突变和纯合突变，得出其多态图谱(图3)，分析其基因型。
本具体实施方式中的PCR扩增引物设计时选择目的区域上下游70-150bp的距离作为引物设计的起始部位，引物与之序列匹配的特异性要好，引物间的退火温度要尽量一致(55℃左右)。使在一个多重PCR反应中的各个扩增引物的扩增效率相当。
本具体实施方式具有高通量、高效能、低成本、简单适用，适合中国人群的叶酸利用能力基因检测。采用多重PCR加上引物延伸微测序技术，在一个反应管中同时完成14个基因16个位点的基因分型的优点：
1、相对于传统Sanger直接测序法，本检测方法可同时检测不同基因的16个多态位点，技术稳定，结果容易判读，成本低廉。
2、相对于SSCP和RFLP两种方法，本方法不受是否存在限制性酶切位点的限制，且可同时检测多个位点。
3、相对于DHPLC检测方法，本检测方法不但可以同时检测多个位点，而且突变具体类型判断更加准确。
4、相对于基因芯片技术，本检测方法成本低廉，操作简单，凡是具有分子生物学实验相关经验的人员均可完成。
实施例一：先天性心脏病患者叶酸利用能力基因检测
1、检测样本
样本来源于苏州市立医院生殖与遗传中心非综合征型患者DNA文库，均是苏州大市为主的苏南地区患者，其中男71例，女54例，库中所有患者样本收集前均签署了知情同意书。
2、检测方案
见具体实施方式的检测方法。
3、检测结果
根据野生型和突变型峰的颜色不同进行判断，88例先心病样本中，发现DHFR、MTR、SHMT、TCN2、TYMS基因突变分布频率与正常对照组有显著差异，参见附件4。
Figure BSA00000607177400161
附件4：先天性心脏病和对照样本(各88例)突变分布频率
  RFC1   G80A   20(22.73％)*   13(14.77％)   55(62.50％)   31(35.23％)   10(11.36％)   47(53.41％)
  SHMT1   C1420T   74(84.09)*   0(0.00％)   14(15.91％)   38(43.18％)   0(0.00％)   50(56.82％)
  TCN2   C766G   28(31.82％)*   13(14.77％)   47(53.41％)   36(40.91％)   11(12.50％)   41(46.59％)
  TYMS   A149del16T   5(6.02％)*   41(46.59％)   42(47.73％)   11(12.50％)   34(38.64％)   43(48.86％)
4、本方法的检测准确度
此技术检测的结果与突变检测金标准“基因测序”的结果完全相符。

Claims (5)

1.叶酸利用能力基因检测试剂盒及检测方法，其特征在于叶酸利用能力基因检测试剂盒包含：
(1)PCR反应试剂，包括dNTP、5×和10×PCR缓冲液、Mg2+离子、去离子水、FastTaq酶、SNaPshot Mix混合液；
(2)按一定比例混合的16对PCR引物混合物；
(3)按一定比例混合的16条延伸引物混合物；
(4)纯化用SAP酶、Exon I酶及其配套的缓冲液；
(5)单个位点纯合、杂合突变的阳性和阴性对照DNA；
(6)使用说明书。
2.根据权利要求1所述的叶酸利用能力基因检测试剂盒及检测方法，其特征在于它的检测方法为：使用Primer 5、Gene runner和MassARRAY Assay Design引物设计软件协助设计引物，通过多重PCR扩增，使被检测样本的16个目的片段得到扩增富集；然后进行扩增产物的酶反应纯化，去除多余的引物及dNTP“杂质”；再利用针对突变位点设计的16条延伸引物，对16个富集的片段进行单碱基的延伸反应，仅对突变位点的单个碱基进行荧光标记扩增，突变位点匹配上一个荧光标记的双脱氧核苷酸后终止延伸；然后再进行一次扩增产物的酶反应纯化；最后经毛细管电泳进行扩增片段分析，相当于单个位点的微测序，这样可以检测单核苷酸的突变，延伸位点碱基的类型决定电泳峰的颜色，延伸引物的片段长度决定峰的位置，延伸引物的浓度影响电泳检测的峰高。
3.根据权利要求1所述的叶酸利用能力基因检测试剂盒及检测方法，其特征在于所述的试剂盒包含检测CBS基因C699T、DHFR基因c594+59del19、FOLH1基因T1561C、GST01基因C428T、MTHFD1基因G878A、MTHFD基因G1958A、MTHFR基因A1298C、MTHFD基因C677T、MTR基因A2756G、MTRR基因A66G、NAT1基因C1095A、NFE2L2基因ins1+C11108T、RFC1基因G80A、SHMT1基因C1420T、TCN2基因C776G和TYMS基因1494del6十六个基因突变位点的引物：
第一组：所述检测CBS基因C699T位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P1-F：TTTCTATGCAGTACCGCAACG；
P1-R：AATCAAGATGGACAGAGGGAC；
延伸引物：E1：(T)22AGCAACCCCCTGGCTCACTA；
第二组：所述检测DHFR基因c594+59del19位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P2-F：ACTGCATCGTCGCTGTGTC；
P2-R：CGGGCAGAAATCAGCAAC；
延伸引物：E2：(T)34AGGCTGCCCACGGTCGGGGT；
第三组：所述检测FOLH1基因T1561C位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P3-F：TCCAACTTCAGAAACCTT；
P3-R：TTAGTATACCGTGCTCTGC；
延伸引物：E3：(T)34GCAAATTGGGATCTGGAAATGAT；
第四组：所述检测GST01基因C428T位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P4-F：ATTCTCTGTCTAGGTGCCATC；
P4-R：CTCCTCTAGCTTGGTAAATTC；
延伸引物：E4：(T)29CCAAAATAAAGAAGACTATG；
第五组：所述检测MTHFD1基因G878A位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P5-F：GCTTGAAACTGAGGTGAG；
P5-R：AGGTTGTTATACTGAATCATCC；
延伸引物：E5：(T)4CACAGTAGAGAGTGCCAAGC；
第六组：所述检测MTHFD基因G1958A位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P6-F：GTTTGCCAACATCGCACATG；
P6-R：CTAACCTACAAACCCTTCTGG；
延伸引物：E6：(T)12CCTCCATCATTGCAGACC；
第七组：所述检测MTHFR基因A1298C位点突变的引物的碱基序列为：扩增引物：P7-F：CGAGAGGTAAAGAACGAAGAC；
P7-R：TTCTACCTGAAGAGCAAGTCC；
延伸引物：E7：(T)31GGAGGAGCTGACCAGTGAAG；
第八组：所述检测MTHFD基因C677T位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P8-F：TGAAGCACTTGAAGGAGAAGG；
P8-R：CCTTCACAAAGCGGAAGAATG；
延伸引物：E8：(T)12GGAGAAGGTGTCTGCGGGAG；
第九组：所述检测MTR基因A2756G位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P9-F：CATTGACCATTACTACACCAG；
P9-R：TCTGTTTCTACCACTTACCTTG；
延伸引物：E9：ATGGAAGAATATGAAGATATTAGACAGG；
第十组：所述检测MTRR基因A66G位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P10-F：TATATGCTACACAGCAGGGAC；
P10-R：GGCTCTAACCTTATCGGATTC；
延伸引物：E10：(T)20AAGGCCATCGCAGAAGAAAT；
第十一组：所述检测NAT1基因C1095A位点突变的引物的碱基序
列为：扩增引物：P11-F：CTAGACATCAAATCATTTCACC；
P11-R：CTTTCTAGCATAAATCACCAAT；
延伸引物：E11：TAACCACAGGCCATCTTTAAAA；
第十二组：所述检测NFE2L2基因ins1+C11108T位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P12-F：AACTGACTGAGCAACTATTACG；
P12-R：ATTGCTCCTCTGTGTCTCC；
延伸引物：E12：(T)14CTTAGAGGAACTCATATCCTAAG；
第十三组：所述检测RFC1基因G80A位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P13-F：CATGAAGCCGTAGAAGCAAAG；
P13-R：AGAAGCAGGTGCCCGTGGAA；
延伸引物：E13：(T)25CGAGCTCCGGTCCTGGCGGC；
第十四组：所述检测SHMT1基因C1420T位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P14-F：GTTCAAGGAGAGACTGGC；
P14-R：GCTCATCCATCTCTCAGG；
延伸引物：E14：(T)7AGGTTGAGAGCTTCGCCTCT；
第十五组：所述检测TCN2基因C776G位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P15-F：TCCTCACTCTATCACCAGTTC；
P15-R：TCATGAGAGCATTCTGGAAGG；
延伸引物：E15：(T)38CCTCATGACTTCCCCCATGC；
第十六组：所述检测TYMS基因1494del6位点突变的引物的碱基序列为：
扩增引物：P16-F：AGGAACTGAGCAGATAAGTGG；
P16-R：CGATCATGATGTAGAGTGTGG；
延伸引物：E16：(T)40GAGTGTGGTTATGAACTTTA。
4.根据权利要求1所述的叶酸利用能力基因检测试剂盒及检测方法，其特征在于所述的PCR引物及延伸引物，用于针对人类基因组中目的DNA区域进行扩增以及目的位点进行微测序，进而达到基因分型的目的，以实现特定核苷酸变异的检测。
5.根据权利要求1所述的叶酸利用能力基因检测试剂盒及检测方法，其特征在于所述的PCR扩增引物和延伸引物浓度的优化配置，使其能够在延伸反应时兼顾各个位点的产量，利于后续检测中各个位点突变情况的判断识别。
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