CN102618624B

CN102618624B - 中国人群耳聋基因筛查用试剂盒及其使用方法

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Publication number: CN102618624B
Application number: CN 201110027435
Authority: CN
Inventors: 陈瑛
Original assignee: SUZHOU CITY HOSPITAL OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE
Current assignee: SUZHOU CITY HOSPITAL OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE
Priority date: 2011-01-26
Filing date: 2011-01-26
Publication date: 2013-10-16
Anticipated expiration: 2031-01-26
Also published as: CN102618624A

Abstract

本发明公开了一种针对中国人群耳聋基因常见的14个突变位点的一次性定性筛查试剂盒及其使用方法，所述试剂盒中国人群耳聋基因的共14个位点为检测对象，针对每个位点的突变类型分别设计出扩增引物和延伸引物，针对各个目的区段同时进行多重PCR扩增和标记延伸，通过毛细管电泳分析，一次获得14个位点的基因型。本发明的筛查方法及试剂盒使用方便，操作简单，成本低，通量高，检测结果直接可靠，适合于中国人群耳聋基因突变的大规模筛查。

Description

中国人群耳聋基因筛查用试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域中基因突变检测领域，具体涉及一种中国人群耳聋基因筛查用试剂盒及其使用方法。

背景技术

耳聋是一种严重影响生活质量和交流的常见疾病。全世界现有7亿多人患有中度以上的听力损失，在我国6,100万残疾人口中，听力语言残疾者达2,700万，并以每年新生3万聋儿的速度增长，其中遗传性NSHL(nonsyndromic hearing loss，非综合征性听力损害)约占40％左右。迄今为止，与非综合征耳聋相关的28个常染色体隐性基因、22个常染色体显性基因、1个X连锁基因已被克隆，而每个基因中又有数目众多的耳聋突变位点，其中以GJB2、SLC26A4基因及mtDNA的突变最为常见，其它型所占比例较小。

国内研究人员也针对中国人群耳聋的基因突变类型进行了较大规模的流行病学调查。根据我们对43篇国内不同地区耳聋突变的分子流行病学调研文献的综合分析，统计了16,704例NSHL患者，上述三个耳聋相关基因的常见突变中GJB2基因突变热点235delC、299-300delAT、SLC26A4基因突变热点IVS7-2A→G、2168A→G、mtDNA突变热点1555A→G、1449C→T共6个突变热点在中国NSHL人群中突变达40％以上，并且存在区域人群突变差异。

根据我们对我国苏南地区非综合征型耳聋患者7个耳聋致病基因突变热点的突变频率调查，125例非综合征型耳聋(Nonsyndromichearing loss，NSHL)患者中，GJB2基因235delC突变频率为24.0％，299-300delAT突变频率为7.0％；SLC26A4基因IVS7-2A＞G突变频率为15.2％，2168A＞G突变频率为3.2％；mtDNA1555A＞G突变频率为4.8％，7445A＞G突变频率为0.8％，未发现mtDNA3243A＞G位点突变，7个热点综合突变频率为53.6％，统计结果见表1。此外GJB2基因35位点delG、109位点G→A突变、176-191位点缺失16个碱基，SLC26A4基因1174位点的A→T突变、1229位点的A→G突变、2027位点的T→A突变，线粒体DNA基因1494位点的C→T突变也有较高的突变频率。

表1 125例NSHL患者热点突变统计

耳聋的早期确诊对保证语言、智商的康复治疗意义重大，无创的耳聋基因筛查，可作为一种更有效的耳聋早期诊断手段，成为常规听力筛查的有力补充。对于线粒体位点突变的个体，指导用药可以完全避免耳聋的发生。因此，通过早期筛查耳聋基因，对于提前预知和早期干预治疗从而预防耳聋的发生具有极其重要的临床应用价值。

目前，传统基因突变检测方法包单链构象多态性分析(SingleStrand Conformation Polymorphism，SSCP)、PCR-限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、变性高效液相色谱(Denaturing High Performance Liquid Chromatography，DHPLC)、直接测序、基因芯片等，这些方法或者检测能力有限、或者通量低、或者耗时费力、所需设备和耗材昂贵。更重要的是这些方法中除基因芯片外难以同时针对不同基因的多个突变位点进行高通量检测，而基因芯片技术平台价钱昂贵，对仪器和人员素质要求高，难以在我国广大医疗机构中普及，因此有必要创立一种高通量、高效能、低成本的耳聋基因突变筛查方法，以实现临床快速检测或规模化人群筛查。

SNaPshot技术是一种基于单碱基延伸原理的SNP分型新方法，以多重PCR扩增目的区域后，经寡核苷酸引物延伸标记扩增，突变位点匹配上一个荧光标记的双脱氧核苷酸后终止延伸，然后通过毛细管电泳进行片段分析，相当于单个位点的微测序，可以检测单核苷酸的突变。延伸位点碱基的类型决定电泳峰的颜色，延伸引物的片段长度决定峰的位置，延伸引物的浓度影响电泳检测的峰高。SNPs作为第三代遗传标记应用于疾病基因的定位、克隆和鉴定，具有快速、简便、高效、高通量的特点。

发明内容

本发明的目的是针对目前中国人群耳聋基因突变的特点，选择覆盖范围广泛的14个突变热点作为筛查目标，弥补目前现有突变筛查方法的不足，提供一种简单、高通量、高效能、低成本的适合中国人群的耳聋基因突变筛查用试剂盒及其使用方法。

为达到上述目的，本发明的技术方案是：一种中国人群耳聋基因突变热点的筛查试剂盒，该试剂盒包括以下内容：

(1)反应试剂，包括dNTP、5×和10×PCR缓冲液、Mg²⁺离子、FastTaq酶、SNaPshot Multiplex混合液、纯化用SAP酶、Exon I酶及其配套的缓冲液、单个位点纯合和杂合突变的阳性及阴性对照标本；

(2)等比例混合的针对耳聋基因8个区段进行多重PCR扩增的正向引物和反向引物；

(3)按一定比例混合的针对耳聋基因14个突变热点的PCR延伸引物；

所述试剂盒以GJB2基因35位点delG、109位点G→A突变、176-191位点缺失16个碱基、235位点delC和299-300位点delAT，SLC26A4基因1174位点的A→T突变、1229位点的A→G突变、2027位点的T→A突变、2168位点的A→G突变和IVS7-2位点的A→G突变，线粒体DNA1494位点的C→T突变、1555位点的A→G突变、3243位点的A→G突变和7445位点A→G突变共14个位点为检测对象，针对每个位点的突变类型分别设计出扩增引物和延伸引物，针对各个目的区段同时进行多重PCR扩增和标记延伸，通过毛细管电泳分析，一次获得14个位点的基因型；

所述GJB2基因235位点的扩增引物序列是ATGCTTGCTTACCCAGAC和GATCTCCTCGATGTCCTTA；

所述GJB2基因299位点的扩增引物序列与所述235位点的扩增引物序列一致；

所述SLC26A4基因2168位点的扩增引物序列是GCCTGGGCAATAGAATGAGACT和CCCTCTTGAGATTTCACTTGGT；

所述SLC26A4基因IVS7-2位点的扩增引物序列是ACAAAATCCCAGTCCCTATTCCTA和TATGGTTGTTTCTTCCAGATCACA；

所述线粒体DNA基因1555位点的扩增引物序列是AAAACTACGATAGCCCTTATGAAAC和AGTGTAAGTTGGGTGCTTTGTGTT；

所述线粒体DNA基因3243位点的扩增引物序列是GGAGTAATCCAGGTCGGTTTCTATC和TGGCGTCAGCGAAGGGTTGT；

所述线粒体DNA基因7445位点的扩增引物序列是ATCTAACTTTCTTCCCACAACACTT和AATGGTTTTTCTAATACCTTTTTGA；

所述GJB2基因35位点的扩增引物序列与所述235位点的扩增引物序列一致，即ATGCTTGCTTACCCAGAC和GATCTCCTCGATGTCCTTA；

所述GJB2基因109位点的扩增引物序列与所述235位点的扩增引物序列一致，即ATGCTTGCTTACCCAGAC和GATCTCCTCGATGTCCTTA；

所述GJB2基因176位点的扩增引物序列与所述235位点的扩增引物序列一致，即ATGCTTGCTTACCCAGAC和GATCTCCTCGATGTCCTTA；

所述SLC26A4基因1174点的扩增引物序列是CCCAAGTACCTATCACGG和CCTTCCTCTGTTGCCATT；

所述SLC26A4基因1229点的扩增引物序列与所述1174位点的扩增引物序列一致，即CCCAAGTACCTATCACGG和CCTTCCTCTGTTGCCATT；

所述SLC26A4基因2027位点的扩增引物序列是：GGCAAAGTTCCACAATCA和ACCAGAACCTTACCACCC；

所述线粒体DNA基因1494位点的扩增引物序列与所述1555位点的扩增引物序列一致，即AAAACTACGATAGCCCTTATGAAAC和AGTGTAAGTTGGGTGCTTTGTGTT。

其中，所述针对14个耳聋基因位点的PCR延伸引物的终浓度分别为：GJB2基因35位点、109位点、176位点、235位点和299-300del位点分别为0.1μM、0.2μM、0.2μM、0.2μM和0.1μM，SLC26A4基因的1174位点、1229位点、2027位点、2168位点和IVS7-2位点分别为0.08μM、0.1μM、0.08μM、0.2μM和0.4μM，线粒体DNA基因1494位点、1555位点、3243位点和7445位点分别为0.1μM、0.15μM、0.25μM和0.2μM。

本发明还提出一种用于筛查中国人群耳聋基因的试剂盒的使用方法，所述方法步骤如下：

步骤一，用扩增引物针对耳聋基因进行多重PCR扩增；

步骤二，对扩增产物进行纯化；

步骤三，用延伸引物针对耳聋基因突变位点的扩增和纯化产物进行延伸标记反应和二次纯化；

步骤四，对二次纯化产物进行毛细管电泳；

步骤五，对毛细管电泳结果进行数据采集和分析。

上述中国人群耳聋基因筛查用试剂盒及其使用方法用于中国人群耳聋基因的筛查其原理是，所述试剂盒以GJB2基因35位点delG、109位点G→A突变、176-191位点缺失16个碱基、235位点delC和299-300位点delAT，SLC26A4基因1174位点的A→T突变、1229位点的A→G突变、2027位点的T→A突变、2168位点的A→G突变和IVS7-2位点的A→G突变，线粒体DNA1494位点的C→T突变、1555位点的A→G突变、3243位点的A→G突变和7445位点A→G突变共14个位点为检测对象，针对每个位点的突变类型分别设计出扩增引物和延伸引物，针对各个目的区段同时进行多重PCR扩增和标记延伸，通过毛细管电泳分析，一次获得14个位点的基因型。

本发明所涉及一些具体参数如下：

本发明中试剂盒的PCR延伸引物浓度的优化配置，使其能够在扩增时兼顾各个位点的PCR产量，有利于后续检测中各个位点突变情况的判断识别。

所述中国人群耳聋基因突变热点的筛查试剂盒还可以包含等比例混合的针对耳聋基因8个区段进行多重PCR扩增的正向引物和反向引物，及按一定比例混合的针对耳聋基因14个位点的PCR延伸引物。以GJB2基因35位点delG、109位点G→A突变、176-191位点缺失16个碱基、235位点delC和299-300位点delAT，SLC26A4基因1174位点的A→T突变、1229位点的A→G突变、2027位点的T→A突变、2168位点的A→G突变和IVS7-2位点的A→G突变，线粒体DNA1494位点的C→T突变、1555位点的A→G突变、3243位点的A→G突变和7445位点A→G突变共14个突变热点为检测对象，针对每个位点的突变分别设计出扩增引物和延伸引物，针对各个目的位点在一个反应管中同时进行多重PCR扩增和标记延伸，通过毛细管电泳分析，一次获得14个位点的基因型。

实际应用中，所述针对14个耳聋基因位点的PCR延伸引物的终浓度分别为：GJB2基因35位点、109位点、176位点、235位点和299-300del位点分别为0.1μM、0.2μM、0.2μM、0.2μM和0.1μM，SLC26A4基因的1174位点、1229位点、2027位点、2168位点和IVS7-2位点分别为0.08μM、0.1μM、0.08μM、0.2μM和0.4μM，线粒体DNA基因1494位点、1555位点、3243位点和7445位点分别为0.1μM、0.15μM、0.25μM和0.2μM。

本发明使用Primer Premier5引物设计程序(加拿大PREMIER生物软件公司提供软件)协助设计引物，通过多重PCR扩增，使被检测样本的7个目的位点得到扩增富集。PCR扩增引物设计时选择目的区域上下游100-200bp的距离引物设计的起始部位，引物与序列匹配的特异性要好，引物间的退火温度要尽量一致，且保持在55℃左右。使在一个多重PCR反应中的各个扩增引物的扩增效率相当。8个扩增片段包含所要检测的14个突变位点，GJB2基因35位点、109位点、176位点、235位点和299-300位点共同扩增片段长度为469bp、SLC26A4基因1174位点和1229位点共同扩增片断长度为329bp、2027位点扩增片断长度为479bp、2168位点扩增片段长度为214bp、IVS7-2位点扩增片段长度为367bp、线粒体DNA1494位点和1555位点共同扩增片段长度为258bp、线粒体DNA3243位点扩增片段长度为扩增384bp、7445位点扩增片段长度为扩增370bp。扩增结束后可通过8％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行扩增片段检测，发现8条扩增条带。

然后进行扩增产物的酶反应纯化，去除多余的引物及dNTP等杂质。再对8个富集的片段进行寡核苷酸引物的PCR扩增，又进一步针对经过扩增的14个突变位点进行延伸引物设计，引物设计的指导思想是：仅在突变点的上下游设计正反向的延伸引物，引物设计长度较扩增片段长度少1个碱基，延伸的单个碱基为带有相应颜色荧光标记的双脱氧核苷酸ddNTP。各个引物扩增片段长度应该有一定的差异，均匀分布在18-60bp之间，以便于毛细管电泳能检测。理论上，GJB2基因的176位点、SCL26A4基因的1229位点、GJB2基因的235位点、SCL26A4基因的2168位点、SCL26A4基因的1174位点、GJB2基因的35位点、SCL26A4基因的IVS7-2位点、SCL26A4基因的2027位点、线粒体基因的3243，1555，7445，1494位点、GJB2基因的299位点、GJB2基因的109位点的延伸引物片段在经过毛细管电泳后的长度为依次为18bp、22bp、25bp、29bp、32bp、34bp、36bp、38bp、40bp、44bp、49bp、52bp、54bp、56bp、58bp，如表2所示。实际电泳过程可能会存在飘移现象，尤其是发生了突变的位点的峰漂移更多，即与分子量marker所测片段大小有差距，但不会影响整体结果判读。

表2 耳聋基因14个位点延伸片段理论长度

这样，经过对突变位点的单个碱基进行荧光标记PCR延伸扩增后，再进行一次扩增产物的酶反应纯化，带有不同荧光的不同长度的片段经遗传分析仪毛细管电泳后就能够分析出相应片段所携带的碱基类型，延伸位点碱基的类型决定电泳峰的颜色，延伸引物的片段长度决定峰的位置，延伸引物的浓度影响电泳检测的峰高。峰的颜色为绿色，则代表A碱基，蓝色为G碱基，红色为T碱基，黑色为C碱基，如表3所示。

表3 荧光标记颜色

根据峰的颜色可以清楚方便的判断为野生型(正常)还是突变型，如表4所示。

表4 突变热点野生型与突变型颜色标记

*所示设计为反向测序反应，因此在毛细管电泳结果中野生型与突变型均要按反向测序去判断。GJB2基因的109位点，正向测序突变类型为G→A，反向测序即为C→T；IVS7-2正向测序突变类型为A→G，反向测序即为T→C；mtDNA1555位点正向测序突变类型为A→G，反向测序即为T→C。

电泳顺序由左向右依次为：176-191、1229、235delC、2168delAT、1174、35、IVS7-2A＞G、2027、3243A＞G、mtDNA1555A＞G、7445A＞G、1494、299-300delAT、109，如图2a所示。

本发明将上述14个位点集中在一个反应中检测，大大节省了检测的时间、试剂、人力和物力，提高了诊断效率。

PCR扩增引物序列见表5所示。

表5 耳聋基因14个突变热点PCR扩增引物

PCR延伸引物见表6所示。

表6 耳聋基因14个突变热点PCR延伸引物

为了使检测准确可靠、简单易行，本试剂盒含有PCR扩增反应试剂，包括dNTP、5×和10×PCR缓冲液、Mg²⁺离子、FastTaq酶、引物混合液、延伸引物混合液、SNaPshot Mix混合液、纯化用SAP酶、Exon I酶及其配套的缓冲液；阳性对照标本、阴性对照标本以及说明书。其主要功能在于，将所需的试剂集成在一个小盒内，核酸片段扩增、纯化可以在试剂盒提供试剂的基础上顺序而简便地完成。

在过去的十几年中，虽然已有多种突变检测的技术得到发展，但总的来说，尚缺乏一种适用于耳聋热点突变筛查的技术方法，本发明是一种准确、简便、高通量又经济的基因突变检测的方法。

附图说明

图1是本发明中不同样本DNA进行多重PCR后反应产物琼脂糖凝胶结果图；

图2是本发明部分SNaPshot筛查及验证结果图；

图3是中国人群耳聋基因突变热点SNaPshot筛查过程；

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

实施实例1，如图2和图3所示，耳聋患者基因突变热点筛查检测：

样本选择：样本来源于苏州市立医院生殖与遗传中心非综合征型患者DNA文库，均是苏州大市为主的苏南地区患者，其中男71例，女54例，库中所有患者样本收集前均签署了知情同意书，并承诺配合后续的诊疗和随访。

步骤一，针对耳聋基因8个区段进行多重PCR扩增反应。

PCR反应体系10μl，含步骤一提取的基因组DNA10ng，dNTP2mM，10×Buffer(含Mg²⁺)1.0μl，MgCl₂25mM，FastTaq酶0.15U，各扩增引物对的终浓度为0.1μM。PCR反应条件为：95℃预变性4min；94℃变性30s，66℃退火50s，每循环降0.5℃，72℃延伸50s，11个循环；94℃变性30s，61℃退火50s，72℃延伸50s，24个循环；72℃充分延伸10min，4℃保存，PCR反应在9700热循环仪(ABI公司)中进行。扩增引物序列见表5。

步骤二，扩增产物的纯化

取1.0μl步骤二的扩增产物，加入2.0U SAP酶，2.0U Exon I酶，去离子水2.6μl，反应总体系为6μl，混匀后37℃反应80min，80℃终止反应15min，4℃保存。

步骤三，延伸标记、纯化

PCR反应体系为6.0μL，含纯化产物1μl，5×Seq Buffer1.2μL，SNaPshot Mix1.0μl，去离子水1.8μl，14个位点的延伸引物及终浓度分别为：GJB2基因35位点、109位点、176位点、235位点和299-300del位点分别为0.1μM、0.2μM、0.2μM、0.2μM和0.1μM，SLC26A4基因的1174位点、1229位点、2027位点、2168位点和IVS7-2位点分别为0.08μM、0.1μM、0.08μM、0.2μM和0.4μM，线粒体DNA基因1494位点、1555位点、3243位点和7445位点分别为0.1μM、0.15μM、0.25μM和0.2μM。PCR反应条件为：96℃预变性1min；96℃变性10s，52℃退火5s，60℃延伸30s，28个循环，4℃保存，PCR反应在9700热循环仪(ABI公司)中进行。反应结束后进行第二次纯化，每反应产物中加入1U SAP酶，37℃反应60min，75℃灭活反应15min，4℃保存。延伸引物序列见表6。

步骤四，毛细管电泳

每反应体系中加入Hi-Di甲酰胺(ABI公司)9μl，内标LIZ-120(ABI公司)0.22μl，步骤四的第二次纯化产物1μl，混匀离心后，95℃变性5min，立即置冰上5min，在ABI公司遗传分析仪进行毛细管电泳，电泳结果用GeneMaper系列软件进行数据的采集和分析。

步骤五，测序和酶切法可靠性的检测

通过突变检测金标准“基因测序”的方法对各突变热点同时进行测序，对GJB2基因235位点行ApaI酶切检测，结果显示应用此技术检测的特异性和敏感性均达到了100％。

步骤六，检测结果

根据野生型电泳峰型颜色和突变峰型颜色不同进行判断，125例NSHL样本中，发现67例存在位点突变。

图2中，a.正常功能对照样本14个位点的电泳图；b1.GJB2基因235位点野生型；b2.GJB2基因235位点纯和突变型；b3.GJB2基因235位点杂合突变型；c.GJB2基因235位点PCR-RFLP电泳图；d1.GJB2基因235位点纯和突变测序图；d2.GJB2基因235位点杂合突变测序图；e1.mtDNA7445位点野生型；e2.mtDNA7445位点异质性突变型。

实施例2，体外检测新生儿耳聋基因突变热点筛查

适用于新生儿足跟血片的一型试剂盒(96人份)包含以下组分：

(1)PCR反应试剂组I，包括2mM的dNTP150μl、10×PCR缓冲液100μl、25mM MgCl₂溶液100μl、去离子水200μl、引物混合物I400μl、5U/μl的FastTaq酶15μl；

(2)纯化试剂组，包括1U/μl SAP酶300μl，5U/μl的Exon I酶40μl，去离子水260μl；

(3)PCR反应试剂组II，5×seq Buffer120μl、引物混合物II100μl、SNaPShot Mix100μl、去离子水180μl；

(4)GJB2基因235delC纯合、杂合突变阳性对照DNA样本各10μl、阴性对照标本10μl；

(5)使用说明书。

样本选择：样本来源于苏州市立医院生殖与遗传中心常规新生儿遗传代谢性疾病筛查后剩余的干血片标本223份，所有患者样本收集前均签署了知情同意书。

步骤一，针对8个区段进行多重PCR扩增反应。

PCR反应体系10μl，用步骤一提取的基因组DNA10ng作为模板，加入2mM的dNTP1.50μl、10×PCR缓冲液1.00μl、25mM MgCl₂溶液1.00μl、去离子水1.55μl、引物混合物I4.00μl、5U/μl的FastTaq酶0.15μl。PCR采用touch-down程序：95℃预变性4min；94℃变性30s，66℃退火50s，每循环降0.5℃，72℃延伸50s，11个循环；94℃变性30s，61℃退火50s，72℃延伸50s，24个循环；72℃再延伸10min。按照同样的PCR反应条件，用试剂盒提供的GJB2基因235delC纯合、杂合突变阳性和阴性DNA样本PCR反应，并设立无模板PCR空白对照管。

步骤二，扩增产物的纯化

取步骤三的扩增产物1.0μl，加入2.0μl SAP酶，0.4μlExon I酶，去离子水2.6μl，反应总体系为6μl，混匀后37℃反应80min，80℃终止反应15min，4℃保存。

步骤三，延伸标记、纯化

对步骤二的扩增产物进行延伸标记，PCR反应体系为6.0μl，含纯化产物1μl，5×Seq Buffer1.2μl，SNaPshot Mix1.0μl，去离子水1.8μl，7个位点的引物混合物II1.0μl。PCR反应条件为：96℃预变性1min；96℃变性10s，52℃退火5s，60℃延伸30s，28个循环。反应结束后进行第二次纯化，每反应产管中加入1U SAP酶，37℃反应60min，75℃灭活反应15min，4℃保存。

步骤四，毛细管电泳

每反应体系中加入Hi-Di甲酰胺(ABI公司)9μl，内标LIZ-120(ABI公司)0.22μl，步骤四的第二次纯化产物1μl，混匀离心后，95℃变性5min，立即置冰上5min，于ABI公司3130遗传分析仪进行毛细管电泳，电泳结果用GeneMaper系列软件进行数据的采集和分析。

步骤五，测序和酶切法可靠性的检测

通过突变检测金标准“基因测序”的方法对各突变热点同时进行测序，对GJB2基因235位点行ApaI酶切检测。应用此试剂盒检测的特异性和敏感性均达到了100％。

步骤六，检测结果

根据野生型电泳峰型颜色和突变峰型颜色不同进行判断，检测240例样本中共发现GJB2基因235位点杂合突变4例(17.93‰)，SLC26A4基因2168位点杂合突变1例(4.48‰)，线粒体DNA7445位点突变2例(8.97‰)。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种中国人群耳聋基因突变热点的筛查试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括以下内容：

2.根据权利要求1所述的中国人群耳聋基因突变热点的筛查试剂盒，其特征在于，所述针对14个耳聋基因位点的PCR延伸引物的终浓度分别为：GJB2基因35位点、109位点、176位点、235位点和299-300del位点分别为0.1μM、0.2μM、0.2μM、0.2μM和0.1μM，SLC26A4基因的1174位点、1229位点、2027位点、2168位点和IVS7-2位点分别为0.08μM、0.1μM、0.08μM、0.2μM和0.4μM，线粒体DNA基因1494位点、1555位点、3243位点和7445位点分别为0.1μM、0.15μM、0.25μM和0.2μM。