CN108517364B - 基于56个y染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于法医学技术领域，具体涉及基于56个Y染色体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒。本发明解决的技术问题是利用Y染色体特定SNP遗传标记对中国男性个体检材进行C、G、H、J、N、R族群鉴定，并在Y染色体进化树上进行位置划分，从而进行族源推断。本发明的技术方案是基于56个Y染色体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒，包括分离包装的复合扩增引物混合物和多重单碱基延伸反应引物混合物。本试剂盒应用复合扩增以及单碱基延伸技术，可一次性获得生物检材的56个Y染色体SNP遗传标记的基因分型，并将中国男性个体中的C、G、H、J、N、R族群样本正确归属至现已公认的Y染色体进化树细枝上。
Description
技术领域
本发明属于法医学检测技术领域，具体涉及一种基于56个Y染色体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒。
背景技术
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)是指基因组中特定核苷酸位置上的单个碱基突变引起的DNA序列多态性，其形式包括单个碱基的插入、缺失、转换、颠换等。Lander于1996年正式提出SNP是继SSR和ISSR等后的第三代新型分子标记。其具有突变频率低、遗传稳定性高、分布广泛、位点丰富、易于筛选的特点。上述特点使SNP迅速占领了分子遗传学中心舞台，成为近年来研究热点。
Y染色体是男性特有的染色体。人类Y染色体大约长为5.9kb，其中5％位于重组区，即可与X染色体发生重组、交换。其余区域(95％)不与X染色体发生重组，即非重组区(non-recombination regions of Y chromosome，NRY，以下未做特殊说明的Y染色体均指非重组区)。Y染色体具有非重组、父系遗传、有效群体小和地理分布特殊性等特点。因此Y染色体遗传标记已被广泛应用于法医亲子鉴定及个人识别中。如在性侵案件中，通过从混有女性成分的混合斑中检测Y染色体遗传标记，从而确定嫌疑人数目并进行个人识别。其还可以应用于在群体灾难事件中遇难者身源鉴定和失踪人员调查。Y染色体具有父系遗传的特点，在父系亲权鉴定中也发挥巨大作用，并可应用于人类进化、群体结构的研究。结合SNP突变率低、遗传稳定的特点，可以进行样本来源及祖先来源推断。近年来，随着千人计划及大规模平行测序发展，大量Y染色体SNP位点包括插入/缺失(InDel)和Alu序列被发现。这些遗传标记通过构建单倍群，形成人类Y染色体进化树，进而研究人类进化和群体结构。法医学工作者和人类学家注意到，由于不同人群和不同地区间单倍群的分布存在一定的特征，可以通过对检案中未知来源的男性样本进行单倍群划分以推断其所属群体或地理来源，从而辅助案件侦查。因而，构建Y染色体系统发育树具有重要的法医学意义。而已经构建的Y染色体SNP遗传标记检测体系中，大部分是基于全球人类Y染色体进化树中定义的单倍型类群特异的SNP，其用以区分全世界大洲的各主要人群，因此并不具有较高的分辨率。中国是一个拥有56个民族的国家，因此针对各群体或地区，构建一个具有稳定的、较高分辨率的系统发育树，进而为法医检案提供辅助作用，显得尤为必要。
目前关于SNP检测技术有单碱基延伸反应、大规模平行测序、一代测序(sanger直接测序法)、SNP芯片技术。大规模平行测序虽然可以发现更多的SNP，但其成本较高，存在抽样误差，并且其准确率受测序深度及宽度的影响。而一代测序步骤烦琐、成本高、耗时长、对待测样本DNA的质量和含量依赖性很强，因此也难以广泛应用。在法医学领域，单碱基延伸反应技术已被广泛应用于SNP遗传标记的分型。与一代测序法相比，该技术能够一次性复合检测多个SNP，具有所需模板DNA量少、扩增片段小(小于200bp)等优点，特别适用于骨骼、毛发样本、降解检材和微量检材的检测。与大规模平行测序相比，其具有成本低、操作简单、假阳性率低的优点。该技术可借助于法医学遗传实验室广泛使用平台-毛细管电泳平台进行检测，易于推广。因此，法医研究人员多采用单碱基延伸反应技术建立可同时分型多个线粒体SNP或Y染色体SNP的法医学检测体系。
针对中国男性人群特点筛选适宜的Y染色体SNP遗传标记，应用复合扩增技术、单碱基延伸技术，构建快速、高效的复合检测体系，最终构建适用于中国男性人群的高分辨率Y染色体系统发育树，将为法医的个人识别与族源推断提供一种新的技术手段。
目前，已有研究提供了基于55个Y染色体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒，该试剂盒可将中国男性个体样本正确归属至现已公认的O单倍群的亚群上，但这些群体多位于东亚、东南亚以及部分南亚地区。中国幅员辽阔，和北亚，中亚，南亚等地区接壤，和这些地区有基因交流。北亚，中亚，南亚等地主要Y单倍群是C、G、H、J、N、R族群，为了揭示中国北部和西北地区的人口历史，构建C、G、H、J、N、R族群的高分辨率Y染色体系统发育树，开发针对中国男性人群的C、G、H、J、N、R族群进行精细划分的试剂盒显得尤为重要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种利用Y染色体SNP遗传标记对未知来源的中国男性样本进行C、G、H、J、N、R单倍群详细划分，并推断其族源的法医学复合检测试剂盒。
本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种基于56个Y染色体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒，包括分离包装的复合扩增引物混合物和多重单碱基延伸反应引物混合物；所述的复合扩增引物混合物包含了基于56个Y染色体SNP遗传标记的前后引物，共计112条。各扩增引物的核苷酸序列分别如表3中SEQIDNo.1至SEQIDNo.112所示：
表3复合扩增引物混合物序列
上表中，“-”符号前为加尾序列。
其中，所述的多重单碱基延伸反应引物混合物包含56个Y染色体遗传标记的共计56条单碱基延伸引物，这些单碱基延伸引物的核苷酸序列分别为表4中的SEQIDNO.113至SEQIDNO.168所示：
表4单碱基延伸引物混合物序列
上表中，“-”符号前为加尾序列，括号里面的碱基为重复单位，下标的数字表示该重复单位的重复次数。
所述的法医学复合检测试剂盒还包括标准DNA，所述标准DNA为2800M标准DNA。
本发明还提供了上述基于56个Y染色体SNP法医学复合检测试剂盒在对中国男性人群中C、G、H、J、N、R单倍群精细划分中的用途。
本发明的有益效果为：
本发明试剂盒包含C、G、H、J、N、R单倍群中的56个Y染色体SNP遗传标记，兼顾系统发育树的稳定性和高分辨率，并以尽可能少的位点达到较高的体系分辨能力，将中国男性样本划分至C、G、H、J、N、R单倍群中更细分枝；本试剂盒应用了单管内复合扩增和多重单碱基延伸技术，可以一次性获得生物检材56个Y染色体SNP遗传标记的基因分型，简单快速进行法医学生物检材族源推断；为确保分型准确性，该试剂盒包括标准DNA 2800M。该试剂盒复合扩增产物长度最短仅80bp，最长不超过220bp，对法医现场的降解检材检测具有优势；本试剂盒以法医遗传实验室通用的毛细管电泳为检测平台，具有广泛应用和推广价值。
附图说明
图1本发明所检测的56个Y染色体SNP遗传标记所构成的进化树，其中分枝末端为单倍群名称，分枝上为检测的位点，从图中可以看出本发明包含了中国人群C、G、H、J、N、R单倍群的大部分亚型，构建了一个高分辨率的检测体系；
图2为基于56个Y染色体SNP遗传标试剂盒的电泳分型结果。a为标准DNA 2800M在体系一的分型结果；b为标准DNA 2800M在体系二的分型结果。图中的横坐标数值提示DNA链长度，纵坐标数值表示荧光强度，各峰上方均标示出了该峰代表的SNP遗传标记。从图中可以清晰地观察到标准DNA 56个SNP位点分型结果，证明本发明检测试剂盒可以准确检测生物学样本。
具体实施方式
以下通过具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明系Y染色体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒，是基于筛选得到的56个从属于C、G、H、J、N、R单倍群亚群，并与中国人群密切相关的Y染色体SNP遗传标记，通过毛细管电泳检测平台，利用复合体系扩增、单碱基延伸技术，进行体系构建。该试剂盒由分离包装的复合扩增引物混合物、多重单碱基延伸反应引物混合物、复合扩增反应混合液和单碱基延伸反应混合液构成。
试剂盒的工作原理是首先通过复合扩增引物混合物和复合扩增反应混合液，两管分别扩增两个体系，获得含有26、30个Y染色体SNP的DNA片段(注：考虑到单管内同时进行50个以上的SNP扩增时，引物间易形成二聚体以及发卡结构，且不易保存，分型结果不稳定。故本研究将筛选得到的56个Y染色体SNP遗传标记分为两个体系进行复合扩增,体系一包括C、G、H、J单倍群的26个位点；体系二包括N、R单倍群的30个位点)。然后分别以此26个和30个DNA片段为模板，分别利用单碱基延伸反应混合液和相应单碱基延伸反应引物混合液进行多重单碱基延伸反应(注：单碱基延伸反应引物混合液同样分为与复合扩增反应引物混合液相对应的两个体系)以获得待测样本的56个Y染色体SNP的单碱基延伸反应产物。最后将产物和含有内标的甲酰胺进行毛细管电泳，利用各SNP位点单碱基延伸反应产物的片段长度和SNP位点的突变类型，确定待测样本56个Y染色体SNP遗传标记的分型结果。
此外，2800M标准DNA作为阳性对照与样本同时进行扩增及延伸反应。首先分析标准DNA的分型结果准确与否，若该标准DNA分型结果准确，表明该次检测结果可靠，则可进一步分析确定待测样本56个Y染色体SNP遗传标记的分型结果。
在本发明中，Y染色体SNP位点选择对复合检测试剂盒的构建极其关键。如前所述，Y染色体具有父系遗传、地理学上的特殊性等特点，因此在人类进化及人群结构研究中具有重要意义。近年来，法医遗传学家运用Y染色体SNP组合成单倍型(haplotype)，而某个或某些稳定的单倍型集合成单倍型类群(haplogroup；Hg)，进而构建系统发育树，并发现进化树上单倍型类群分布具有明显的种族地理特异性。目前，ISOGG(网址www.isogg.org)提供由38,818个Y染色体SNP位点构建的系统发育树，这无疑是已知最完整、分辨率最高的系统发育树，但由于其所含的位点数量极其庞大、位点存在冗余、部分位点的稳定性有待考证，且其是针对全球人群筛选的位点，不具有中国特色，使得其不适用于日常检案。因此针对特定的群体或区域，选择特定单倍型类群中所有单倍型共享的、稳定的SNP位点，可避免信息的重复，保证结果的可靠，进而追溯生物检材的人群或地理来源。
本发明试剂盒中SNP位点的选择旨在针对中国男性人群使用较少SNP位点，同时尽可能地提高系统发育树的分辨率。因此，本发明通过大量研究，制定了纳入本发明试剂盒中的Y染色体SNP位点的筛选标准：1)从属于C、G、H、J、N、R单倍群，且根据在中国C、G、H、J、N、R主要单倍群及其亚群人群中所占百分比而决定下级分枝所包含的SNP位点的数目，即在人群中所占比重越大，则下级分枝所包含的SNP位点越多；2)在中国男性群体中具有良好多态性的SNP位点；3)可以设计出合适的复合扩增引物和多重单碱基延伸引物；5)可用单碱基延伸技术获得稳定的分型结果。根据上述标准，本发明最后筛选出56个SNP位点。
本发明研究确认的56个Y染色体SNP遗传标记位点，可覆盖中国男性个体C、G、H、J、N、R单倍群及其亚群。
基于56个Y染色体SNP遗传标记检测试剂盒中所涉及的56个Y染色体SNP位点信息如表5。
表5 56个Y染色体SNP遗传标记
本发明试剂盒在Y染色体SNP的检测中运用了复合扩增技术。复合扩增技术可以在一个反应体系中运用混合引物一次性扩增多个目的DNA片段，具有方便、快捷、节约样本和成本的优点，适应法医学检测的实际需要。其中，复合扩增引物的设计是该技术的关键和难点，在设计引物时，本发明充分考虑了以下因素：1)GC含量适宜，约在40-60％范围之内；2)适宜的扩增引物退火温度，且所有引物的退火温度必须一致；3)体系一的26条Y染色体SNP遗传标记的各扩增产物片段长度应有差异，这样即可对复合扩增反应是否成功进行检测，同理应用于体系二的30条Y染色体SNP遗传标记扩增产物；4)扩增产物长度短，以减少扩增效率的影响，同时可用于降解检材的检测；5)引物自身、引物与模板之间、引物之间无明显的错配、发卡结构和二聚体结构的形成。根据上述标准，本发明首次设计了56个Y染色体SNP遗传标记位点的组合测序，首次将单倍群C、G、H、J、N、R进行全面系统的细分，以揭示中国北部和西北地区的人口历史。。
本发明通过1000Genomes网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)查找位点所在序列，利用PrimerPremier6.0设计复合扩增引物，结合的实际经验，经过反复筛选、优化，得到了表3中所列的56对复合扩增引物。上述引物是根据所筛选Y染色体SNP遗传标记所在DNA序列设计的、能与相应DNA序列互补结合的特异性引物。引物长度在18-23bp之间，部分引物上游5’端连接了长度不等的重复序列GCCTCC(TCCCC)n，使得两个体系中扩增片段长度各不相同，均在80-220bp之间。所有引物自身、引物与模板之间、引物之间没有形成明显的错配、发卡结构和二聚体结构。
本发明试剂盒利用上述复合扩增引物，获得56个Y染色体SNP遗传标记的扩增产物，继而以此为模板，进行单碱基延伸反应。单碱基延伸反应技术，也称小测序，是一种基于四种荧光素标记的双脱氧核糖核苷酸，特异性引物延伸反应。多重单碱基延伸反应可以在一个反应体系中通过多条测序引物同时获得多个SNP位点的单碱基延伸产物，实现对多个SNP位点的一次性同时检测。其特点：1)通过设计不同长度的单碱基延伸引物，同时分析多个SNP位点，即根据单碱基延伸反应产物长度的不同区分不同的SNP位点；2)根据不同的双脱氧核糖核苷酸标记的荧光素不同区分SNP的不同等位基因。为了实现对多个SNP位点同时进行单碱基延伸反应，多重单碱基延伸引物的设计是技术关键，应注意以下因素：1)退火温度需大致相同；2)如果单碱基延伸的碱基不同可以根据颜色判别SNP位点，如果颜色相同需通过5’加尾，调节引物长度，并根据不同长度DNA片段的电泳迁移率将不同SNP位点的单碱基延伸产物区别开来；3)引物自身、引物之间、引物与模板之间无明显的错配、发卡结构和二聚体结构。
在本发明试剂盒中，所设计的单碱基延伸引物包括两个部分，第一部分为3’端的特异性序列，可与SNP上游序列互补结合，如SNP位点是插入缺失，则考虑缺失后的连接碱基是否与插入的第一个的碱基相同，以确定所涉及的测序引物应为前引物还是后引物；第二部分为5’端的加尾序列，按照GCCTCC(TCCCC)n的原则进行加尾。加尾序列可使不同SNP位点的单碱基延伸引物长度不同，最终使不同位点的单碱基延伸产物之间存在长度差异。考虑到不同长度的DNA片段在毛细管电泳中的迁移率不同，我们根据以下原则设计SNP基因座的单碱基延伸引物：具有相同等位基因SNP位点20-40bp至少相差5bp；41-60bp至少相差4bp；61-80bp至少相差3bp；80-87bp至少相差2bp。
需要注意的是，试剂盒中M82是-/AT插入缺失位点，由于Indel位点的前一个碱基也为T，因此其只能设计前测序引物，得以保证插入和缺失时检测的结果的准确性，当其缺失延伸碱基为G，否则为A；同理L140是-/T的插入缺失位点，只能设计后引物，当其插入为T，缺失为C。
最后设计出的所有56个Y染色体SNP位点复合扩增引物和多重单碱基延伸引物的序列参见表6(各序列的序列号分别在表3和表4中)。
表6 56个Y染色体SNP遗传标记复合扩增引物和多重单碱基延伸引物参照表
上表中，G代表加尾序列GGCCTCC(TCCCC)n，其中n代表重复次数。
本发明试剂盒引入阳性对照作为质量控制，用以评估单次实验结果是否可靠。本发明中提供的阳性对照包括了2800M标准DNA样本的所有56个Y染色体SNP遗传标记的标准分型结果。同时对未知样本和标准DNA进行扩增和测序，通过对2800M标准DNA分型结果的分析，评估当次检测结果的准确性和可靠性，以决定是否进行后续分析。若结果可靠，则可对未知样本进行分型，并对其所属单倍群进行划分。
本发明试剂盒的结果检测只需在毛细管电泳平台上进行。毛细管电泳法已在法医遗传学实验室广泛应用。本发明选择复合扩增和多重单碱基延伸技术进行Y染色体SNP遗传标记的检测，根据单碱基延伸产物长度差异区分具有相同碱基的SNP位点，根据荧光染料的颜色不同区分SNP的不同等位基因。因此本发明试剂盒可以直接应用于任何一个具有毛细管电泳平台的法医遗传学实验室，具有普适性，并易于推广。
更具体的，本发明试剂盒具体包括的组分可为：
a)复合扩增反应混合液：含有PCR缓冲溶液、MgCl2、dNTPs、DNA聚合酶等常用成分。
b)复合扩增引物混合物：如表1所示的基于56个Y染色体SNP遗传标记的扩增引物对组成的复合扩增引物混合物；复合扩增反应混合液和复合扩增引物混合物用于获得其相应的56个Y染色体SNP遗传标记的DNA片段。
c)扩增产物纯化试剂：含有核酸外切酶1(ExoI)、虾碱性磷酸酶(SAP)；用于将复合扩增的产物进行纯化，以便于进行下一步操作。
d)多重单碱基延伸反应引物混合物：表2所述的56条多重单碱基延伸反应引物组成的混合物。
e)单碱基延伸反应混合液：包括DNA聚合酶、MgCl2、缓冲液、荧光标记双脱氧核糖核酸等成分。
复合扩增反应混合液、扩增产物纯化试剂、单碱基延伸反应混合液可使用商业化的产品。
至于提取待检测样本中的模板DNA，可使用目前本领域的各种常规试剂，提取DNA模板可以参照现有的生物化学或遗传学常规方法即可进行。
利用本发明所述试剂盒，可以对法医DNA样本进行分析。分析方法包括以下步骤；
1)提取待检测样本的DNA，作为扩增模板。
2)利用上述复合扩增引物混合物和复合扩增反应混合液对步骤1提取的DNA进行两个体系复合扩增。所述复合扩增PCR的反应的循环参数为：95℃，15分钟；94℃，30秒，66℃-60℃，90秒，72℃，30秒，12个循环的降落扩增(Touchdown-PCR)；94℃，30秒，60℃，90秒，72℃，30秒，17个循环；然后72℃，10分钟；4℃保存。
3)纯化步骤2的复合扩增产物，并以它为模板，利用多重单碱基延伸引物混合物和单碱基延伸反应混合液进行两个体系的多重单碱基延伸反应。所述单碱基延伸反应的循环参数为：94℃，10秒，50℃，5秒，60℃，30秒，26个循环后4℃保存。
4)用SAP纯化步骤3的产物后进行毛细管电泳分析，根据电泳结果获得样本的基因分型结果。
进一步的，上述方法步骤4中所述的多重单碱基延伸产物分析包括以下步骤：首先对2800M标准DNA分型结果进行分析，认为该次测序结果可靠后，方可对该次测序中的其它样本进行分析，获得待测样本基因分型。
以下用具体实例进一步具体说明本发明，其中所用试剂无特殊说明均使用以下试剂和仪器；
1)基因分析仪3130，ABI公司
2)ProFlexPCR扩增仪，ABI公司
3)台式高速离心机EPPENDORF公司
4)纯水装置Millipore公司
5)移液器EPPENDORF公司
6)Hi-Di甲酰胺ABI公司
7)核酸外切酶1TaKaRaBiotechnology公司
8)虾碱性磷酸酶TaKaRaBiotechnology公司
9)内标(GenescanTMSizeStandardGS-120LIZ)ABI公司
实施例1本发明试剂盒的制备
用于检测的Y染色体SNP复合检测试剂盒可包括分别包装的以下试剂：
a)复合扩增引物混合物。由表3所示的扩增引物混合得到，扩增引物由Invitrogen公司合成，将合成好的扩增引物用超纯水配置为100pM/μL，然后按照表7中的比例混合，制成复合扩增引物混合物。
b)复合扩增反应混合液。本实施例中使用Qiagen公司的PCR反应混合液MultiplexPCRMix。
c)多重单碱基延伸反应引物混合物。由表4所示的单碱基延伸反应引物混合得到，单碱基延伸反应引物均由Invitrogen公司合成。将合成好的56条延伸引物(用超纯水配置为50pM/μL)以表8中给出参数配成多重单碱基延伸引物混合物。
d)单碱基延伸反应混合液。本实施例中使用ABI公司的产品SNaPshot readyreaction mix。
将上述试剂分别按各自常规要求包装后即制得基于Y染色体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒，用于后续的实验。
表7基于56个Y染色体SNP遗传标记体系的复合扩增引物的浓度
表8基于56个Y染色体SNP遗传标记体系的多重延伸引物的浓度
实施例2使用本发明试剂盒检测635份无关个体样本。
使用上述基于56个Y染色体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒，对635份无关个体样本进行检测。具体的检测过程按如下进行：
a、用Chelex-100法提取635份样本的DNA，作为复合扩增模板；
b、以步骤a中的DNA为模板，利用复合扩增引物混合物和复合扩增反应混合液将样本在下述扩增体系中进行复合PCR扩增；复合扩增引物混合物0.3μL，复合扩增反应混合液2.5μL，模板DNA 0.8μL，加ddH2O至1.4μL；95℃，15分钟；94℃，30秒，66℃-60℃，90秒，72℃，30秒，12个循环的降落扩增(Touchdown-PCR)；94℃，30秒，60℃，90秒，72℃，30秒，17个循环；然后72℃，10分钟；4℃保存。
c、多重PCR产物的纯化；每一个样品扩增产物的纯化体系：ExoI(5U/μL)1.2μL，SAP(1U/μL)2.5μL，多重PCR产物5μL；扩增产物纯化反应条件：37℃60分钟，80℃10分钟；4℃保存。
d、以上一步纯化得到的产物为模板，利用多重单碱基延伸引物混合物进行单碱基延伸反应；体系：单碱基延伸反应混合液1.5μL，多重单碱基延伸引物混合物0.3μL，纯化后扩增产物1.5μL，去离子水1.7μL；单碱基延伸反应的热循环参数：96℃10秒，50℃5秒，60℃30秒，循环26次；4℃保存。
e、纯化上一步单碱基延伸反应产物；纯化体系：SAP(1U/μL)1.1μL，，单碱基延伸反应产物5μL；纯化反应条件：37℃60分钟，80℃10分钟，4℃保存；
f、毛细管电泳：
分别取1μL步骤e中得到的纯化后的延伸产物，加入10μL的Hi-Di甲醇胺和0.1μL内标混匀；然后95℃下变性3分钟，4℃下迅速冷却后，用美国ABI公司基因分析仪3130进行电泳检测。电泳条件：1500V电压，36cm毛细管，POP7凝胶，电泳18分钟；应用DataCollection3.0软件收集数据，GeneMapper ID V3.2软件进行结果分析(标准DNA2800结果见图2，a为体系一，b为体系二)。
从635样本中列举200个样本的结果见表9，从表中可以看到共得出42种单倍群。具体划分方法如下：如图1所示，因为进化树是呈树状分布的，不同单倍群即为树的分枝，而各SNP在树上则分布于各自的节点。进行单倍群划分时，从树根部往上看，若该节点SNP为突变型，即，阳性，则可沿分枝往上，若某节点为阴性，则该节点上一个SNP所在节点为终点，其所提示单倍群为该样本所在单倍群。因而，一个单倍群往往由多个SNP分型决定的。
表9基于26个Y染色体SNP遗传标记体系检测结果
续表9
序列表
<110> 四川大学
<120> 基于56个Y染色体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒
<130> A180178K（序）
<141> 2018-03-22
<160> 168
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
catccgactt actattgctg aagaga 26
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
taagccacta ctgtaattta gccactg 27
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gactgtgact aatcaggagg ctac 24
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcttgttaag gtcttcatca tcactt 26
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atttcagcaa gacaaaggga ataaag 26
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aatggcatga agcatgtaag gaa 23
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tggtgattat tggttctaag gtgttac 27
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcattctgtt gatgtctctg aagg 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tagtagggag gctctctggg ta 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aacattaggg atcatagttc ctttgc 26
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agaactaatg aagagaacaa tggtgaa 27
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctgtactcct gggtagcctg tt 22
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcagaattat tgcatgagat attgaatgt 29
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agacctagtg gaggcttctg aac 23
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gggaaacatc gtgatggtta ctttatc 27
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<212> DNA
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agcaaataaa gtagatacag gagaaggat 29
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgtgataatc gcttgtctct tggtta 26
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gctcttaaag cacagggagg ttt 23
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctctttaata ctctgggact cactatctt 29
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gcacagcaac aactaccaca ctact 25
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<211> 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aggcaagacc atgtagagta tagaa 25
<210> 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcctttattt gaaataatta acatgacagg aa 32
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cctctgaacg tctaaccaca at 22
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gttttatccc ttccactctt agcttgac 28
<210> 28
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tataaggatg aaacactgag ggcaacta 28
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcctcctcct tgtactcttg taatgtggtg tctt 34
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
agcaaggatt gtctcttaga acaga 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcctcgctag tagtggtgct tgataattga 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaagtaccag aagaaggctg aaatc 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcctccttcc tgtaagcaag gtccatct 28
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gctgtatgaa atcctcgggt ctc 23
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gctcatacac tatcttgttg aatgc 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caaatggaac ataatattta tctgtagcc 29
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctgtatgtgt cttcctgtgt gttt 24
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cttctttccc tcaacatagt tatctca 27
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
cagcatcgcc tgaataccta ga 22
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 66
<211> 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
gcctcctccc agagaacacg gctccacatt g 31
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<400> 69
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 22
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 24
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 22
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcagacagaa gttgacataa ttcac 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcagattgtg tcatcactga gt 22
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtagagacat ctgaaaccca cataca 26
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ggaagcaatg acccacaacc t 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gctggatgtg actgcctctc 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agtgatttat gttgagtctt gaatgatga 29
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gccccttctt gtgctagaac ctgctta 27
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccatatcatt catttgctaa acctgtc 27
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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catactactt tggtgctcag ttcc 24
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
aacaaggaca agtatcaggt ctc 23
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctctatctcc acggttgcat ctatc 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
aatggtggaa gcagattggc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
atatcccaag gtttatgaaa gaatgtg 27
<210> 101
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
aagaaagaaa gaaagaatga aagaggg 27
<210> 102
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
gcctccacaa ctatcagatt tatctacttc tcctt 35
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
ttcaatgtta tgattaaggt cctgctaa 28
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
tgacttcaga tccagtgctc att 23
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
catattcagc agacagtaca aagc 24
<210> 106
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
aagccttaat gacacaagtt gc 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
aaacagtttg gcagtgcttc aa 22
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
tgtttaaaga attgcattta cttctgtagg 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
ctctcagttc tccatctcaa caaga 25
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
aatgaccacc actagcacct g 21
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
catatgtaac aaacctgcac tttgc 25
<210> 112
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
gcactccatc tctgtggttc at 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
gcctcgccac tgctctgttt ggc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
gcctgcttgc agacaaaaca tttggc 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
gcctccttgc aataattctg cattttcat 29
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcctcctcca atgcttgagg ttctgaatct ta 32
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
gcctcctccc ccagtatggc ttcagaaagg aaag 34
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<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
gcctcctccc ctcgtcctcc tggaattatc tgaaacca 38
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<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
gcctcctccc ctcccaaaac aaggtgatgg actggatgat a 41
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
gcctcctccc ctcccctcca ggaggctgtt tacactcctg aaa 43
<210> 121
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
gcctcctccc ctcccctcct tgggagaaac atcttgagtt tctg 44
<210> 122
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
gcctcctccc ctcccctccc ctggcactaa atcaacttct cctttgg 47
<210> 123
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
gcctcctccc ctcccctcct taattgttaa atataaagcc tgcagagga 49
<210> 124
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
gcctcctccc ctcccctccc ctccccattt taaactttga tttttttggt g 51
<210> 125
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
gcctcctccc ctcccctccc ctcttttgga actattgttt tacaatactg cag 53
<210> 126
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctttt cagatttcag tcatgaaatt tgaca 55
<210> 127
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 127
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctcca aaagttcttc gttagttttc tcacaga 57
<210> 128
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 128
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc aatccaatct gtaaatttta tgtaaactt 59
<210> 129
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 129
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc cccttttatg cagtctgaaa ccttcctact 60
a 61
<210> 130
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 130
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctccagagtt cggcctccct 60
ttct 64
<210> 131
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 131
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctgttcaggc ctcagctgtt 60
gaatac 66
<210> 132
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 132
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccccaaa agtctggcac 60
tacagtga 68
<210> 133
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 133
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctccccactt gttcgtggac 60
ccctctatat 70
<210> 134
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 134
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctctctgtga atgacaatga 60
aaggaaaaat aa 72
<210> 135
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 135
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctgga ttcgatggaa 60
gcatttttgt aaata 75
<210> 136
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 136
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctggagaatg 60
aaaaagttgg gtgacac 77
<210> 137
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 137
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctcca aaaattactt 60
ttgagaacca agtaatctg 79
<210> 138
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 138
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc 60
cccaaaccca ttttgatgct t 81
<210> 139
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 139
ttctacaggc acctcgtcca tc 22
<210> 140
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 140
ggggaatgat cagggtttgg ttaat 25
<210> 141
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 141
gcctcctatg aacactggac cacggtgt 28
<210> 142
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 142
gcctcctcga atagcaaatc ccaaagctcc a 31
<210> 143
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 143
gcctcctccc cttctcctgg cacactaagg agct 34
<210> 144
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 144
gcctcctccc ctcccctatg gggggaacag ggaagt 36
<210> 145
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 145
gcctcctccc ttgagaggct gagtcaggag aatc 34
<210> 146
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 146
gcctcctccc ctcccctccg cctctggggt ctcaggtatg att 43
<210> 147
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 147
gcctcctccc ctcccctccc tgccagggaa taaattccat ttgat 45
<210> 148
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 148
gcctcctccc ctcccctccc ctctttctgg gggccataag atactgt 47
<210> 149
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 149
gcctcctccc ctcccctccc ctactcatct cttggaacag tcttcaagt 49
<210> 150
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 150
gcctcctccc ctcccctccc ctcagacata agtcacatgg atacaacaat g 51
<210> 151
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 151
gcctcctccc ctcccctccc ctcttgttat aaaacctcct aataaaaatt cct 53
<210> 152
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 152
gcctcctccc ctcccctccc ctcccacttt tttgtataaa attcattaat gcctc 55
<210> 153
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 153
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctcaa gatatgagtg ttcttcctgt aagcaag 57
<210> 154
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 154
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctccccggca cacagacacc aaaagga 57
<210> 155
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 155
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctcca aagacaatta ttattaaggg tttggaagc 59
<210> 156
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 156
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcagagtgc cctcgtgttc 60
ca 62
<210> 157
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 157
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcgtggttg ctggttgtta 60
cggg 64
<210> 158
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 158
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctccccagga agcctaccca 60
cagtcg 66
<210> 159
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 159
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccaacct gcttagctcc 60
accattca 68
<210> 160
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 160
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctttt gtttgtccct 60
gagaagttgc 70
<210> 161
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 161
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctgaacatcc 60
atcactttca cca 73
<210> 162
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 162
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctccccgctt taagcatctt 60
ttcattggtt tctaa 75
<210> 163
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 163
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctaaagaggg 60
aatatcacaa caggcaa 77
<210> 164
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 164
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctccctcctg 60
ctaatgtatc tgctgcactg 80
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 165
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctgctaaggc 60
ctacagaata ttcgctagat aa 82
<210> 166
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 166
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctccccaaga 60
attgcattta cttctgtagg ggaa 84
<210> 167
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 167
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc 60
ctcggttcat gggcagattt tttttcttt 89
<210> 168
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 168
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc 60
ctccctcgag gacccctaga ctgaacc 87
Claims (4)
1.基于56个Y染色体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒，其特征在于：包括分离包装的复合扩增引物混合物和多重单碱基延伸反应引物混合物；所述的复合扩增引物混合物包含了基于56个Y染色体SNP遗传标记的前后扩增引物，共计112条；所述的多重单碱基延伸反应引物混合物包含56个Y染色体SNP遗传标记的共计56条单碱基延伸引物；
所述的复合扩增引物混合物各扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1至SEQ IDNo.112所示：
所述的多重单碱基延伸反应引物混合物中各引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.113至SEQ ID NO.168所示。
2.根据权利要求1所述的基于56个Y染色体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒，其特征在于：还包括标准DNA。
3.根据权利要求2所述的基于56个Y染色体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒，其特征在于：所述标准DNA为2800M标准DNA。
4.权利要求1-3任一项所述的基于56个Y染色体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒在对中国男性人群的C、G、H、J、N、R族群进行精细划分中的用途。
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