CN104212894A - 基于26个线粒体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于法医学技术领域，具体涉及基于26个线粒体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒。本发明要解决的技术问题是利用线粒体SNP遗传标记对未知来源的人类生物学检材进行法医学个人识别。本发明的技术方案是基于26个线粒体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒，包括分离包装的复合扩增引物混合物、多重单碱基延伸反应引物混合物、等位基因分型标准物混合物。本发明试剂盒应用了单管内复合扩增和多重单碱基延伸技术，可以一次性获得生物性检材的26个线粒体SNP遗传标记的基因分型，快速进行法医学的个体识别。
Description
技术领域
本发明属于法医学技术领域，具体涉及基于26个线粒体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒。
背景技术
线粒体是存在于细胞质中的一种细胞器，拥有自身的遗传物质—线粒体DNA(mitochondrial DNA；mtDNA)。线粒体DNA是唯一的细胞核外遗传物质，呈闭合双环结构。和核DNA不同，线粒体DNA分子小，仅有16569个碱基对(basePair，bp)；单个细胞内拷贝数多，每个可存在10-1000个mtDNA分子；线粒体DNA突变率高，在不足2万个碱基对的线粒体基因组中具有众多的多态性位点；线粒体DNA不参与重组，其中的各多态位点作为一个整体，以单倍型(haplotype)的形式独立向下传递，表现出母系遗传特征。由于其独特的遗传学特征，线粒体DNA为法医DNA分析提供了新的遗传标记，在母系亲属之间的亲缘关系鉴定以及降解检材、陈旧骨骼、牙齿等检材的个人识别中有重要的应用价值。此外，线粒体DNA也是研究人类起源、进化和迁移的理想工具之一。多个线粒体DNA遗传标记构成的单倍型组合，能清楚的构建谱系树。各个线粒体DNA单倍群的分布具有明显的种族地理特异性，可通过线粒体DNA单倍型分析，推断未知生物样本的种族或地理来源。因此，线粒体DNA分析具有重要的法医学意义。
线粒体DNA根据其功能可分为控制区和编码区两个区域，其大部分碱基变异相对集中在控制区。因此，法医线粒体DNA分析多集中在控制区，且通常采用直接测序的方法。但是，仅对HVRI和HVRII范围内的碱基变异进行检测所获得的多态信息量很低，在法医学个体识别中的识别能力非常有限。而且，常用于检测控制区的sanger直接测序法步骤烦琐，耗时长，成本高，对待测样本DNA的含量和质量依赖性很强。对于现行法医学实验室普遍使用的毛细管电泳设备而言，sanger直接测序法使用的毛细管与常用的短串联重复序列(shorttendem repeat，STR)检测使用的毛细管不同，大多法医实验室并不常备，因此难以广泛应用。为了提高线粒体DNA检测的分辨能力，有研究将控制区与编码区的多态性位点联合进行检测。但与控制区不同的是，编码区的多态性位点分布较为零散，分型一定数量的多态位点需要对较大范围的线粒体DNA进行测序。而线粒体全基因组测序无疑将获得最大的分辨能力，但是其难以应用于法医学实际案件。因此，对广泛存在于线粒体基因组的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)进行检测就成为简便而有效的办法。SNP是基因组特定核苷酸位置上单个碱基变异形成的DNA序列多态性，具有含量丰富、遗传稳定、突变率低，易于高通量检测等特点，是目前广泛应用的第三代DNA遗传标记。在法医学领域，SNP遗传标记的分型首选单碱基延伸反应技术。与sanger直接测序法相比，单碱基延伸反应技术拥有独特的优势。该技术能够一次性复合检测多个SNP，具有扩增片段小(小于200bp)，所需模板DNA量少等优点，特别适用于微量检材，降解检材和骨骼，毛发样本的检测。而且，该技术能够与当今法医遗传学实验室广泛使用的遗传标记(STR)共同应用毛细管电泳平台进行检测。因此，研究人员多采用单碱基延伸反应技术建立可同时分型多个线粒体SNP的法医学检测体系。
在已经建立的线粒体SNP检测体系中，有的是基于全球人类线粒体进化树中定义的单倍型类群特异的SNP，用以区分全世界大洲的各主要人群；有的则可以将某些人群中频率最高的单倍型类群划分至更详细的亚群；还有的方案则可以将单独依据控制区无法准确划分单倍型类群的样本，划分至正确的单倍型类群。但在这些方案中，前者几乎完全由单倍型类群特异的SNP构成，这类SNP有的会因为缺乏人群多态性而使整个方案的分辨能力降低；后两者则必须与控制区的检测联合应用。总体上，这些方案都没有在使用一组适当数目SNP的前提下，尽可能的提高分辨能力。因此，这些方案都只能作为控制区测序的补充，单独应用的价值有限，它们并不能解决控制区测序难以广泛应用的问题。
综上所述，筛选一组适宜的线粒体SNP遗传标记，应用单碱基延伸技术，构建一种适于中国人群的、快速、高效能的复合检测体系，将为法医的个人识别提供一种新的技术手段；在此基础上，开发出基于现有法医遗传学实验室通用的毛细管电泳平台的线粒体SNP复合检测试剂盒，将极大推动这种新技术在法医个人识别中的推广和应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是利用线粒体SNP遗传标记对未知来源的人类生物学检材进行法医学个人识别。
本发明的技术方案是基于26个线粒体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒，包括分离包装的复合扩增引物混合物、多重单碱基延伸反应引物混合物、等位基因分型标准物混合物；所述的基于26个线粒体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒中的复合扩增引物混合物包含了26个线粒体SNP遗传标记的共计44条扩增引物，各扩增引物的核苷酸序列分别如表4中SEQ ID No.1至SEQ ID No.44所示：
表4复合扩增引物
上表中，“-”符号前为加尾序列，“-”符号后为特异性引物；其中，SNP位点1719与1736，10397与10398，6392与6455，5417与5460分别采用的是同一对扩增引物。
其中，所述的多重单碱基延伸反应引物混合物包含26个线粒体SNP遗传标记的共计26条单碱基延伸引物，这些单碱基延伸引物的核苷酸序列分别为表5中SEQ IDNo.45至SEQIDNo.70所示：
表5单碱基延伸引物
上表中，“-”符号前为加尾序列，“-”符号后为特异性引物；其中，SNP位点10398采用了两条单碱基延伸引物，即No.51和No.52，分别对应相邻SNP位点10397的两个不同等位基因A和G。而SNP10397的等位基因依赖这两条引物加尾序列长度不同得以区分。
其中，所述的等位基因分型标准物混合物由26个线粒体SNP遗传标记的等位基因分型标准物构成，包括52个荧光素标记DNA片段，对应26个线粒体SNP遗传标记的所有已知52个等位基因；所述52个荧光素标记DNA片段的核苷酸序列、荧光素类型以及各自所对应的SNP基因座在线粒体DNA中的位置如表6所示：
表6等位基因分型标准物
上表中，“-”符号前为加尾序列，“-”符号后为特异性引物。毗邻的SNP位点10397和10398的等位基因分型标准物共含有四个DNA片段。这四个DNA片段具有两种不同的长度，两种不同颜色的荧光标记。片段长度的不同代表10397位点的不同等位基因，荧光颜色的差异代表10398位点的不同等位基因。
本发明的有益效果：本发明试剂盒包含26个线粒体SNP遗传标记，兼顾了单倍型类群的划分和个体之间的区分，以尽可能少的位点数达到了较高的体系分辨能力，既可单独用于生物性检材的线粒体DNA分析，也可和线粒体控制区测序联合应用，一方面作为后者的重要补充，以提高线粒体分析的分辨能力，另一方面旨在进行相互的质量控制，确定各自的检测结果是否准确可靠；本试剂盒应用了单管内复合扩增和多重单碱基延伸技术，可以一次性获得生物性检材的26个线粒体SNP遗传标记的基因分型，快速进行法医学的个体识别；本试剂盒包括了特有的等位基因分型物混合物，可确保分型准确；该试剂盒复合扩增产物长度最短仅78bp，最长不超过200bp，对于法医学常见的降解检材的检测具有优势；本试剂盒以法医遗传实验室通用的毛细管电泳设备为检测平台，具有广泛推广和应用价值。
附图说明
图1为本发明对153号生物检材的毛细管电泳检测结果。图中的横坐标数值提示DNA链长度，纵坐标数值表示荧光强度，1-26代表不同的线粒体SNP编号(与表1的编号对应)。图中所标的GS-120LIZ表示内标(购自AB公司，Applied Biosystems)。A、T、C、G代表四种脱氧核糖核苷酸。从图中可以清晰地观察到该检材的所有26个线粒体SNP的分型结果，证明本发明线粒体SNP复合检测试剂盒可以准确检测生物学样本。
图2为等位基因分型标准物的毛细管电泳检测结果。图中的横坐标数值提示表DNA链长度纵坐标数值表示荧光强度，1-26代表不同的线粒体SNP编号(与表1的编号对应)图中所标的GS-120LIZ为内标；A、T、C、G代表四种脱氧核糖核苷酸。该图可以观察到总共52个荧光标记的DNA片段，证明了本发明中的等位基因分型标准物混合物包括了涉及的26个线粒体SNP所有已知等位基因的单碱基延伸反应产物。
具体实施方式
以下结合附图通过具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明基于线粒体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒是基于筛选得到的26个线粒体SNP遗传标记，利用目前法医遗传学实验室常用的毛细管电泳体系构建的。该试剂盒由分离包装的复合扩增引物混合物、多重单碱基延伸反应引物混合物、等位基因分型标准物混合物、复合扩增反应混合液和单碱基延伸反应混合液构成。
该试剂盒的工作原理是首先通过复合扩增引物混合物和复合扩增反应混合液，在单管内一次性同时扩增获得所有含有26个线粒体SNP的DNA片段。然后以此26个DNA片段为模板，利用单碱基延伸反应混合液和单碱基延伸反应引物混合物进行多重单碱基延伸反应以获得待测样本的26个线粒体SNP的单碱基延伸反应产物。最后将该产物和等位基因分型标准物混合物同时进行毛细管电泳，利用等位基因分型标准物混合物分析待测样本的多重单碱基延伸反应产物，确定待测样本26个线粒体SNP遗传标记的分型结果。
在本发明中，线粒体SNP的选择对复合检测试剂盒的构建极其关键。如前所述，线粒体DNA为单倍型遗传，在人类进化研究中有重要的意义。线粒体DNA系统进化树界定了一些稳定多态位点。共享某个或某些稳定多态位点的所有单倍型(haplotype)的集合被称为单倍型类群(haplogroup；Hg)，其分布具有明显的种族地理特异性。任何合理的线粒体DNA检测体系都不能忽视基于全球人类线粒体系统进化树而进行的单倍型类群(haplogroup,Hg)划分。选择特定单倍型类群中所有单倍型共享的SNP位点，即单倍型类群特定的SNP位点，可避免信息的重复，检测较少的位点即可进行单倍型类群的划分，进而确定样本的种族、地理来源；检测编码区中单倍型类群特定的SNP位点，继而进行单倍型类群的划分，可与控制区测序进行相互的质量控制，通过比较两者获得的单倍型所划分的类群是否一致，评估两种检测方法的结果是否准确可靠。然而，这些单倍型类群特定的SNP位点在同一人群中缺乏多态性，个体识别能力低。在线粒体编码区，除了有前述单倍型类群特定的SNP位点，还存在一组在任何单倍型类群背景下都易于突变的热点SNP。这些位点与单倍型类群特异的位点不同，它们能够区分个体与个体之间的不同。
本发明试剂盒中SNP位点的选择，着重于单倍型类群特异的位点和突变热点这两者之间的平衡，以同时兼顾单倍型类群的划分和个体与个体之间的区分。因此，本发明试剂盒中的位点包括了两类线粒体SNP位点，一类是从全球人类线粒体系统进化树中筛选出的中国汉族人群所属主要单倍型类群(haplogroup,Hp)特异的SNP。这类SNP的选择，需避免各SNP位点所定义的单倍型类群存在重复，力求以尽可能少的位点覆盖中国汉族人群的主要单倍型类群。另一类是从数据库和已报道文献中选取的所有单倍型类群背景下的突变热点SNP。所有纳入本发明试剂盒中的线粒体SNP位点应符合以下标准：1)在中国汉族群体中具有多态性；2)可以设计出合适的多重单碱基延伸引物和单管内复合扩增引物；3)可用单碱基延伸技术获得稳定的分型结果。根据上述标准，本发明中共选取了26个线粒体SNP遗传标记用于建立法医学个人识别的复合检测体系。这些位点包含可覆盖中国汉族人群主要单倍型类群的16个单倍型类群特异SNP，以及10个在中国人群中具有多态性的突变热点SNP。经过群体调查实验证明，本发明的线粒体SNP复合检测体系具有较高的个人识别能力，单倍型多样性值达到0.9626。试剂盒中所涉及的26个线粒体SNP位点信息如表7。
表726个线粒体SNP位点
| 序号 | SNP基因座 | 核苷酸定位 | 多态性 |
| 1 | 1736 | 1736 | A/G |
| 2 | 5147 | 5147 | A/G |
| 3 | 13708 | 13708 | A/G |
| 4 | 1719 | 1719 | A/G |
| 5 | 4883 | 4883 | A/G |
| 6 | 8701 | 8701 | A/G |
| 7 | 10397 | 10397 | A/G |
| 8 | 10398 | 10398 | A/G |
| 9 | 5417 | 5417 | A/G |
| 10 | 14783 | 14783 | A/G |
| 11 | 9090 | 9090 | A/G |
| 12 | 6455 | 6455 | C/T |
| 13 | 5460 | 5460 | C/T |
| 14 | 3010 | 3010 | C/T |
| 15 | 16519 | 16519 | C/T |
| 16 | 3970 | 3970 | C/T |
| 17 | 6392 | 6392 | C/T |
| 18 | 3394 | 3394 | C/T |
| 19 | 8584 | 8584 | C/T |
| 20 | 11914 | 11914 | C/T |
| 21 | 4216 | 4216 | C/T |
| 22 | 14318 | 14318 | C/T |
| 23 | 15487 | 15487 | A/T |
| 24 | 13928 | 13928 | G/C |
| 25 | 12705 | 12705 | C/T |
| 26 | 709 | 709 | C/T |
本发明试剂盒在线粒体SNP的检测中运用了复合扩增技术。复合扩增技术可以在一个反应体系中一次性地扩增多个目的DNA片段，具有方便、快捷、节约样本和成本的优点，适应法医学鉴定的实际需要。其中，复合扩增引物的设计是该技术的关键和难点。在设计引物时，考虑了以下因素：1)GC含量适宜，约在40-50％范围之内；2)扩增引物的退火温度应该适宜，且所有引物的退火温度必须一致；3)分别包含26个线粒体SNP遗传标记的各扩增片段长度应有差异，这样即可对复合扩增反应是否成功进行检测；4)扩增产物长度短，以用于降解检材的检测；5)引物自身、引物之间、引物与模板之间是否有明显的发卡结构、错配和二聚体结构的形成。
本发明根据线粒体DNA修正剑桥参考序列(rCRS)设计了近百条复合扩增引物，结合的实际经验，经过反复筛选、优化，得到了表4中所列的22对复合扩增引物。这些引物中，根据线粒体DNA序列设计的、能与相应线粒体DNA序列互补结合的特异性引物长度在18～23bp之间，部分上游引物5’端连接了长度不等的加尾序列，使得分别包含26个线粒体SNP遗传标记的各扩增片段长度各不相同，且均在78～199bp之间。所有引物、引物之间、引物与模板之间无明显的发卡结构、错配和二聚体结构。
其中，由于四对SNP位点1719和1736、10397和10398、6392和6455、5417和5460位置相近，本发明对这八个位点设计了四对扩增引物，每对位点上下游扩增引物序列相同，故位于同一条扩增产物上。
本发明试剂盒利用上述复合扩增引物，获得了包含26个线粒体SNP遗传标记的扩增产物，继而以此为模板，进行单碱基延伸反应。单碱基延伸反应技术是一种基于四种荧光素标记的双脱氧核糖核苷酸进行的等位基因特异性引物延伸反应。多重单碱基延伸反应可以在一个反应体系中同时获得多个SNP位点的单碱基延伸产物，实现对多个SNP位点的一次性同时检测。其特点在于，通过设计不同长度的单碱基延伸引物，可以同时分析多个SNP位点，即根据单碱基延伸反应产物长度的不同区分不同的SNP位点，根据不同的双脱氧核糖核苷酸标记的荧光素不同区分SNP的不同等位基因。为了实现对多个SNP位点同时进行单碱基延伸反应，多重单碱基延伸引物的设计应注意以下因素：1)退火温度应该大致相同；2)引物自身、引物之间、引物与模板之间无明显的发卡结构、错配和二聚体结构；3)多重单碱基延伸引物之间长度必须有适当的差异，才能根据不同长度DNA片段电泳迁移率的不同将不同SNP位点的单碱基延伸产物区别开来。
在本发明试剂盒中，设计的单碱基延伸引物包括两个部分，第一部分为3’端的特异性序列，可与SNP上游序列互补结合，第二部分为5’端的加尾序列，为长度有差异的非人源DNA序列。加尾序列的应用使不同位点的单碱基延伸引物长度不同，最终使不同位点的单碱基延伸产物之间有长度差异。考虑到不同长度范围的DNA片段在毛细管电泳中电泳行为的差异，在我们设计的拥有相同等位基因的SNP基因座的单碱基延伸引物中，30bp以下的引物之间相差5bp，31至50bp的引物之间相差4bp，51bp至60bp的引物之间至少相差3bp，61bp以上的引物之间至少相差2bp。
需要注意的是，在所检测的SNP位点中，10397和10398位置毗邻，且所具有的两个等位基因均为A和G，二者的单碱基延伸产物难以区别。为了能同时检测这两个SNP位点的多态性，本发明根据二者共同的轻链侧翼序列，为SNP10398位点设计了二条末端碱基不同的单碱基延伸引物，其3＇末端的最后一个碱基分别为SNP10397的两种等位基因A和G。此外，本发明还在上述两条引物的5＇末端加上了不同的加尾序列，使其具有不同的长度，得到序列表中的序列No.51和No.52。前述设计的意义为，当10397的等位基因为A时，序列No.51能结合到DNA模板上，并根据DNA模板在10398位点上所具有的等位基因延伸一个碱基，而序列No.52不能，此时电泳峰的位置在58bp左右。反之当10397的等位基因为G时，序列No.52能结合到DNA模板上并延伸一个碱基，而序列No.52不能，此时电泳峰的位置为66bp左右。因此，10397的等位基因可根据延伸产物的长度判断，而10398的等位基因则可由电泳峰的荧光染料颜色判定。
本发明试剂盒中引入了等位基因分型标准物混合物，其目的是为了准确地分析样本基因型。本发明中提供的等位基因分型标准物混合物包括了所有26个线粒体SNP遗传标记的等位基因分型标准物，各个SNP遗传标记的等位基因分型标准物是利用其单碱基延伸引物对该SNP在群体中观察到的二个等位基因进行单碱基延伸反应得到的产物。因此本试剂盒中的等位基因分型物混合物包括52个荧光素标记DNA片段，对应26个线粒体SNP遗传标记的所有已知52个等位基因。对未知样本进行毛细管电泳分析时，并列地进行等位基因分型标准物混合物的毛细管电泳分析，通过未知样本和已知等位基因分型标准物混合物的电泳结果比对，可以确定未知样本的基因分型。
本发明试剂盒的结果分析在毛细管电泳平台上进行。毛细管电泳法已在法医遗传学实验室广泛应用。本发明选择复合扩增和单碱基延伸技术进行线粒体SNP遗传标记的检测，根据单碱基延伸反应产物长度的不同区分不同的SNP位点，根据荧光素的不同区分SNP的不同等位基因，利用目前法医遗传学实验室通用的毛细管电泳平台即可进行分析。因此本发明建立的基于线粒体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒可以直接应用于任何一个有毛细管电泳平台的法医遗传实验室，具有普适性，易于推广应用。
更具体的，本发明试剂盒具体包括的组分可为：
a)复合扩增反应混合液：含有PCR缓冲溶液、MgCl2、dNTPs、DNA聚合酶等常用成分。
b)复合扩增引物混合物：如表4所示的26个线粒体SNP遗传标记的扩增引物对组成的复合扩增引物混合物；复合扩增反应混合液和复合扩增引物混合物用于获得含有26个线粒体SNP遗传标记的DNA片段。
c)扩增产物纯化试剂：含有核酸外切酶1(Exo I)及其缓冲溶液(Exo I Buffer)、虾碱性磷酸酶(SAP)及其缓冲溶液(SAP Buffe)等成分；用于将复合扩增的产物进行纯化，以便于进行下一步操作。
d)多重单碱基延伸反应引物混合物：表5所述的26条多重单碱基延伸反应引物组成的混合物。
e)单碱基延伸反应混合液：包括DNA聚合酶、缓冲液、MgCl2、荧光标记双脱氧核糖核酸等成分。
f)等用_位基因分型标准物混合物：由表6所述的52个荧光素标记DNA片段组成，对应26个线粒体SNP遗传标记的所有已知52个等位基因。
复合扩增反应混合液、扩增产物纯化试剂可按本领域常用的配方或按分子生物学手册进行配制，也可直接使用商业化的产品。单碱基延伸反应混合液则一般需使用商业化的产品。至于提取待检测样本中的DNA的模板，可使用本领域目前的各种常规试剂，提取DNA模板可以参照现有的常规方法即可进行。
利用本发明所述试剂盒，可以对法医DNA样本进行分析。分析方法包括以下步骤；
1)提取待检测样本的DNA，作为扩增模板。
2)利用上述复合扩增引物混合物和复合扩增反应混合液对步骤1提取的DNA进行单管内复合扩增。
所述复合扩增PCR的反应的循环参数为：94℃，5分钟；94℃，30秒，60℃，30秒，72℃，30秒，35个循环；然后72℃，10分钟。
3)纯化步骤2的复合扩增产物，并以它为模板，利用多重单碱基延伸引物混合物和单碱基延伸反应混合液进行单管内多重单碱基延伸反应。
所述单碱基延伸反应的循环参数为：94℃，10秒，50℃，5秒，60℃，30秒，25个循环后4℃保存。
4)纯化步骤3的产物后进行毛细管电泳分析，根据电泳结果获得样本的基因型。
进一步的，上述方法步骤4中所述的多重单碱基延伸产物分析包括以下步骤：将多重单碱基延伸反应产物纯化后和等位基因分型标准物混合物进行毛细管电泳分析，通过与等位基因分型标准物混合物比对，获得待检测样本的基因型。
以下用具体实例进一步具体说明本发明，其中所用试剂无特殊说明均使用以下试剂和仪器；
1)自动激光荧光毛细管电泳DNA测序仪310型，ABI公司
2)PCR扩增仪9600型，ABI公司
3)台式高速离心机EPPENDORF公司
4)紫外分光光度计岛津公司
5)纯水装置Millipore公司
6)移液器EPPENDORF公司
7)Hi-Di甲酰胺ABI公司
8)核酸外切酶1TaKaRa Biotechnology公司
9)虾碱性磷酸酶TaKaRa Biotechnology公司
10)内标(GenescanTM Size Standard GS-120LIZ)ABI公司
实施例1本发明试剂盒的制备
用于检测的三等位基因SNP复合检测试剂盒可包括分别包装的以下试剂：
a)复合扩增引物混合物。由表4所示的扩增引物混合得到，由Invitrogen公司合成，将合成好的22对扩增引物用超纯水配置为10pM/μL，然后按照表8中的比例混合，制成复合扩增引物混合物。
b)复合扩增反应混合液。本实施例中使用Qiagen公司的PCR反应混合液Multiplex PCRMix。
c)多重单碱基延伸反应引物混合物。由表5所示的单碱基延伸反应引物混合得到，由Invitrogen公司合成。将合成好的26个单碱基延伸反应引物用超纯水配置为10pM/μL，以表9中给出参数配成多重单碱基延伸引物混合物。
d)单碱基延伸反应混合液。本实施例中使用ABI公司的产品SNaPshot readyreaction mix。
e)等位基因分型标准物混合物。由按表6所示的52条荧光标记DNA片段组成，标记等位基因分型标准物的绿色、黑色、蓝色和红色荧光标记物分别为dR6G、dTAMRATM、dR110和dROXTM，由ABI公司提供荧光标记物并按其手册标记。
将上述试剂分别按各自常规要求包装后即制得基于线粒体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒，用于后继的实验。
表8复合扩增引物的浓度
| 序号 | SNP基因座 | 引物浓度(μM) | 扩增片段大小(bp) |
| 1 | 8584 | 0.1 | 78 |
| 2 | 13708 | 0.1 | 81 |
| 3 | 3394 | 0.1 | 84 |
| 4 | 5147 | 0.1 | 90 |
| 5 | 9090 | 0.1 | 96 |
| 6 | 16519 | 0.1 | 99 |
| 7 | 13928 | 0.1 | 102 |
| 8 | 11914 | 0.1 | 105 |
| 9 | 15487 | 0.1 | 113 |
| 10 | 4216 | 0.1 | 117 |
| 11 | 1719/1736 | 0.1 | 120 |
| 12 | 14318 | 0.1 | 123 |
| 13 | 3970 | 0.1 | 130 |
| 14 | 10397/10398 | 0.1 | 133 |
| 15 | 709 | 0.1 | 138 |
| 16 | 12705 | 0.1 | 150 |
| 17 | 14783 | 0.1 | 155 |
| 18 | 3010 | 0.1 | 160 |
| 19 | 6392/6455 | 0.1 | 174 |
| 20 | 4883 | 0.1 | 178 |
| 21 | 5417/5460 | 0.1 | 185 |
| 22 | 8701 | 0.1 | 199 |
表9多重单碱基延伸引物的浓度
| 序号 | SNP基因座 | 引物浓度(μM) | 引物长度(bp) |
| 1 | 1736 | 0.028 | 23 |
| 2 | 5147 | 0.014 | 28 |
| 3 | 13708 | 0.018 | 40 |
| 4 | 1719 | 0.018 | 44 |
| 5 | 4883 | 0.071 | 43 |
| 6 | 8701 | 0.142 | 53 |
| 7 | 10397-10398A | 0.071 | 56 |
| 8 | 5417 | 0.071 | 62 |
| 9 | 10397-10398G | 0.071 | 64 |
| 10 | 14783 | 0.071 | 78 |
| 11 | 9090 | 0.071 | 80 |
| 12 | 6455 | 0.036 | 20 |
| 13 | 5460 | 0.213 | 25 |
| 14 | 3010 | 0.071 | 34 |
| 15 | 16519 | 0.071 | 36 |
| 16 | 3970 | 0.071 | 42 |
| 17 | 6392 | 0.071 | 46 |
| 18 | 3394 | 0.036 | 49 |
| 19 | 8584 | 0.071 | 52 |
| 20 | 11914 | 0.071 | 55 |
| 21 | 4216 | 0.071 | 58 |
| 22 | 14318 | 0.213 | 61 |
| 23 | 15487 | 0.071 | 66 |
| 24 | 13928 | 0.071 | 69 |
| 25 | 12705 | 0.142 | 73 |
| 26 | 709 | 0.071 | 79 |
实施例2使用本发明试剂盒检测200个无关汉族个体检材
使用上述基于线粒体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒，进行了200个无关汉族个体检材的检测。具体的检测过程按如下进行：
a、用Chelex-100法从200个无关汉族个体血样中提取DNA，作为复合扩增模板；
b、以步骤a中的DNA模板，利用复合扩增引物混合物和复合扩增反应混合液将样本在下述扩增体系中进行复合PCR扩增；复合扩增引物混合物10.5μL，复合扩增反应混合液12.5μL，模板DNA2μL，加ddH2O至25μL；94℃5分钟，94℃30秒、60℃30秒、72℃30秒、循环35次，72℃10分钟；
c、多重PCR产物的纯化；每一个样品扩增产物的纯化体系：Exo I(10U/μL)1μL，SAP(1U/μL)1μL，10倍Exo I Buffer1μL，10倍SAP Buffer1μL，多重PCR产物5μL；扩增产物纯化反应条件：37℃60分钟，80℃10分钟，4℃保存；
d、以上一步纯化得到的产物为模板，利用多重单碱基延伸引物混合物进行单碱基延伸反应；体系：单碱基延伸反应混合液3μL，多重单碱基延伸引物混合物2μL，纯化后扩增产物1μL，去离子水4μL；单碱基延伸反应的热循环参数：96℃10秒，50℃5秒，60℃30秒，循环25次；
e、纯化上一步单碱基延伸反应产物；纯化体系：SAP(1U/μL)1μL，10倍SAP Buffer1μL，单碱基延伸反应产物8μL；纯化反应条件：37℃60分钟，80℃10分钟，4℃保存；
f、毛细管电泳：
分别取1μL步骤e中得到的纯化后的延伸产物和等位基因分型标准物混合物(每次加入1.5μL)，加入10μL的Hi-Di甲醇胺和0.1μL内标混匀；然后95℃下变性3min，4℃下迅速冷却后，用美国ABI公司的DNA自动分析仪(自动激光荧光毛细管电泳DNA测序仪，310型)进行电泳检测。
电泳条件：1500V电压，36cm毛细管，POP4凝胶，电泳20min；应用DataCollection3.0软件收集数据，Genemapper ID V3.2软件进行结果分析。
由于检测了200个样本，以153号样本为例，参见图1、图2。图1表示第153号样本的分型结果，可以清晰地分辨该样本具有的所有等位基因；图2为等位基因分型物混合物的结果，可以清晰地分辨这26个线粒体SNP遗传标记在人群中观察到的所有已知等位基因。
所得的所有200个样本的结果见表10，从表中可以看到共有51个单倍型。
表10检测结果
Claims (3)
1.基于26个线粒体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒，其特征在于：包括分离包装的复合扩增引物混合物、多重单碱基延伸反应引物混合物、等位基因分型标准物混合物；所述的基于26个线粒体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒中的复合扩增引物混合物包含了26个线粒体SNP遗传标记的共计44条扩增引物，各扩增引物的核苷酸序列分别如表1中SEQ ID No.1至SEQ ID No.44所示：
表1复合扩增引物
上表中，“-”符号前为加尾序列，“-”符号后为特异性引物；其中，SNP位点1719与1736，10397与10398，6392与6455，5417与5460分别采用的是同一对扩增引物。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的多重单碱基延伸反应引物混合物包含26个线粒体SNP遗传标记的共计26条单碱基延伸引物，这些单碱基延伸引物的核苷酸序列分别为表2中SEQ IDNo.45至SEQID No.70所示：
表2单碱基延伸引物
上表中，“-”符号前为加尾序列，“-”符号后为特异性引物；其中，SNP位点10398采用了两条单碱基延伸引物，即No.51和No.52，分别对应相邻SNP位点10397的两个不同等位基因A和G，而SNP10397的等位基因依赖这两条引物加尾序列长度不同得以区分。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述的等位基因分型标准物混合物由26个线粒体SNP遗传标记的等位基因分型标准物构成，包括52个荧光素标记DNA片段，对应26个线粒体SNP遗传标记的所有已知52个等位基因；所述52个荧光素标记DNA片段的核苷酸序列、荧光素类型以及各自所对应的SNP基因座在线粒体DNA中的位置如表3所示：
表3等位基因分型标准物
上表中，“-”符号前为加尾序列，“-”符号后为特异性引物；毗邻的SNP位点10397和10398的等位基因分型标准物共含有四个DNA片段，这四个DNA片段具有两种不同的长度，两种不同颜色的荧光标记，片段长度的不同代表10397位点的不同等位基因，荧光颜色的差异代表10398位点的不同等位基因。
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| CN104212894B (zh) | 2016-02-10 |
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Granted publication date: 20160210 |
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