CN103290108A

CN103290108A - 一种线粒体snp荧光标记复合扩增试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN103290108A
Application number: CN2013101194885A
Authority: CN
Inventors: 周怀谷; 焦海涛; 曹渊; 郑卫国
Original assignee: SHANGHAI INSTITUTE OF CRIMINAL SCIENCE AND TECHNOLOGY; Wuxi Agcu Scientech Inc; SHANGHAI JINBO BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI INSTITUTE OF CRIMINAL SCIENCE AND TECHNOLOGY; Wuxi Agcu Scientech Inc; SHANGHAI JINBO BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-04-08
Filing date: 2013-04-08
Publication date: 2013-09-11
Anticipated expiration: 2033-04-08
Also published as: CN103290108B

Abstract

本发明涉及一种可以同时检测35个SNP位点的线粒体SNP荧光标记复合扩增试剂盒及其主要应用，采用35对特异性引物对人类线粒体SNP位点进行基因分型。所述试剂盒包括PCR扩增反应试剂、FAM色复合扩增引物、HEX色复合扩增引物、阳性对照、阴性对照、荧光内标。该试剂盒的使用方法包括，对各种检材提取得到的线粒体DNA进行PCR复合扩增，在遗传分析仪上进行电泳收集荧光信号，能对各位点进行准确的等位基因分型。本发明较现在的线粒体SNP测序方法更简便、经济，模板用量更少，且成功率更高。作为一个线粒体检测系统，分为两管同时扩增，同时电泳，单倍型多样性达到99.64%，可以作为继常染色体STR、Y染色体STR后的同一母系鉴定试剂盒。

Description

一种线粒体SNP荧光标记复合扩增试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物体外诊断技术领域，集中体现的是第三代遗传标记SNP（单核苷酸多态性，single nucleotide polymorphism）和荧光检测技术的结合应用，主要涉及一种对线粒体DNA母系鉴别的SNP荧光标记复合扩增系统。

背景技术

目前法医学上用于个体识别的试剂盒都是基于STR的方法，但作为第三代遗传标记的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）与STR相比，具有数量多、突变率低、遗传稳定、易于自动化、适用于高度降解检材分析等优点，其应用于法医学检案的优越性越来越明显，如用于推测样本的种族来源、识别身体特征等。线粒体作为真核细胞的能量中心，直到第一次发现鸡卵母细胞除了含有核基因组DNA外，也同时存在着线粒体DNA后，科学家们才开始对线粒体展开迅速的研究，至1981年，Anderson首次测定了线粒体DNA的全序列，确定人类线粒体DNA全长16569bp，这个双链闭环分子分为重链（H链）和轻链（L链），主要编码与细胞氧化磷酸化相关的基因。与核DNA相比，线粒体DNA具有母系遗传、拷贝数多、存在范围广等优点，即使是陈旧骨骼、牙齿、毛发或降解的遗骸，对其线粒体DNA的提取都能获得成功，而且来自同一母系的个体mt DNA（mitochondrion DNA的缩写）分型相同，这就给法医学现场快速排查犯罪嫌疑人提供便利，是常染色体STR个体识别和亲权鉴定的有力补充。美国越南战争无名士兵残骸的确认和俄国沙皇尼古拉二世的身世之谜便是线粒体DNA应用最好的例证。

结合SNP和线粒体DNA的诸多检测优势，希望建立同一母系鉴定系统，具有远大的应用前景。目前法医学上对线粒体DNA的研究主要集中在mt DNA控制区（HV I和HV II区），具有很高的母系识别能力。近年来，随着研究人员对线粒体编码区和控制区序列的深入研究发现，增加编码区的特定多态性位点，扩大线粒体的检测范围，能大大提高线粒体的同一母系鉴定能力。目前研究线粒体DNA的方法主要基于DNA测序，存在操作复杂，耗时长，对检案人员要求高等不足，因此本发明在线粒体编码区和控制区同时挑选一些信息含量高的SNP位点，构成复扩系统，具有操作性和实用性强，且快速、简便、直观等优点。

线粒体DNA研究的专利几乎集中在对线粒体疾病的探讨上，而在母系鉴定方面很少涉及，仅有的一篇《一种检测线粒体基因单倍型类群的方法及应用》采用的是寡核苷酸探针的方法，本发明采用的是荧光标记引物的方法，从全新的角度对线粒体DNA进行发明，使母系同一识别能力大大提高，降低了模板使用量。

由此，为了提高鉴别能力，申请人对全国各地区的人线粒体遗传多态性进行了深入的研究，选择了多态性位点较高的35个SNP位点构成一个PCR多重扩增系统，并以此为依据开发了线粒体SNP荧光标记复合扩增试剂盒，此种试剂盒目前全球未见报道与使用，因此是本领域人员一直期望解决的问题，具有很大的应用前景。

发明内容

针对以上测序技术存在的问题，本发明的目的在于：提供一种线粒体SNP荧光标记复合扩增试剂盒，该试剂盒可以在法医鉴定及亲子鉴定中应用。具体的技术方案是：

一种线粒体SNP荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于，包括有如下35个SNP位点的引物：

表1

本发明提供的试剂盒中，每个SNP位点的对应的上游引物(F-primer)可以通过同位素、荧光素进行标记，比较发现荧光素标记效果较好。对应的下游引物(R-primer)是未被标记的引物。

上述的SNP位点中，除了9bp和(CA)n位点之外，都包括有两条下游引物，上述两条引物的3’端最后一个碱基对等位基因模板进行特异识别，为了进一步提高扩增特异性，在距3’端3～7个碱基处引入错配，遵行以下原则：如果3’端是强错配（T-C、A-G配对），则应引入弱错配（A-C、G-T配对）；如果3’端是中度错配（A-A、G-G、C-C、T-T配对），则就引入中度错配；如果3’端是弱错配，则应引入强错配。另外，为了提高等位基因的识别度，其中的一条下游引物的5’端增加4～6个碱基，通过长度多态性来区分等位基因。为了后续引物浓度的优化，在此设计的引物Tm值均在62～64℃之间。

由于9bp缺失和（CA）n重复两者的多态性表现为长度多态性，只需要分别设计一条上游引物和下游引物，就可以根据产物大小不同加于区分。本发明的试剂盒中的引物经过严格设计和验证，具有高度的特异性。

对于标记引物，其用于光学检测目的基因是否存在。经过大量试验，较为优选的标记物为荧光素，且标记方案是：其中C152T、A709G、A3010G、T3970C、A5178C、T8414C、9bp、C9540T、G10398A、C10873T、T12705C、C13928G、C14783T、A15043G、C16311T、C16362T这16个位点的上游引物是由FAM标记；C195T、（CA）n、A1719G、G2706A、C4216T、T4883C、T7028C、A8584G、G8701A、A9123G、T10400C、G11251A、A11719G、A12372G、T14668C、A15301G、A16129G、T16223C、C16519T这19个位点的上游引物是由HEX标记。之所以按此分组方式是由线粒体DNA的特性决定的，人类线粒体DNA是一个长约16569 bp的环状双链DNA分子，邻近位点引物之间相互作用是无法避免的，本发明通过合理分组能够使得因引物之间相互作用产生的非特异条带不在监测范围内，假如现有A和B两个SNP位点，B位点在A位点的下游，B位点的下游引物和A位点的上游引物相互作用的产物大小可以经公式：（B-引物长）+B位点扩增产物长-（A-引物长）得出，考虑到genemapper软件监测范围是小于800bp的条带，故B位点和A位点的之间产生的非特异条带应该大于800bp才能使得非特异条带不在软件监测范围内，加上B位点扩增产物大小设计区间是100-300bp，从而上式可以简化成：B-A>500～700，出于保守考虑，排布在一色的两位点距离最好相差1000bp左右，另外一种情况是两个位点很接近，比如8584和8701，此时可以考虑将它们排布在同一色里面通过共用标记引物来实现，按照以上两条分组原则实现了尽可能多的位点排布，直接提高了识别率，在实际检测中，可以将用FAM色标记的引物配制为FAM色复合引物使用；将用HEX色标记的引物配制为HEX色复合引物使用。

进一步地，引物浓度的设定原则是：引物合成后，各对引物工作浓度从0.01μM至0.2μM做浓度梯度，梯度间隔为0.02μM，做单扩实验以比较不同引物浓度的影响，最重要的指标是不能出现非特异峰；根据检测结果，选择峰高RFU在2000～4000之间的引物浓度，用来配制成初始的FAM复合扩增引物和HEX复合扩增引物，下一步在FAM组内和HEX组内进行引物浓度微调，以2000的产物峰高为标准，调整到合适的复扩引物浓度。作为优选，各引物的浓度如表2所示。

表2各位点的引物的优选浓度

进一步地，试剂盒中还包括有阳性对照(例如9947A)和阴性对照(例如超纯水)，阳性对照作为每次实验的阳性质控品，用于监控PCR扩增体系的正确性，排除假阴性；阴性对照用于控制配制体系过程的污染情况，排除假阳性。

本发明还提供了上述试剂盒的使用方法，具体的技术方案是：

一种线粒体SNP荧光标记复合扩增试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

S1：从生物检材中提取线粒体DNA，稀释，作为mt DNA模板；

S2：在mt DNA模板中加入PCR缓冲液、Mg²⁺、dNTPs、Taq酶、上游引物、下游引物、水，采用三步扩增法，对待检测的SNP位点进行扩增；

S3：对扩增产物进行电泳分析和基因分型。

上述步骤S1中，所述的生物检材可以包含有待检测DNA的血液、精斑、唾液、毛发、牙齿、脱落细胞、骨骼等；提取DNA的方法可以采用常规的磁珠法、Chelex-100提取法、硅膜法等；应用本方法时，最好要将提取的DNA稀释50～100倍，实际操作中，一般可以取1～2μl的mt DNA模板进行扩增。

上述步骤S2中，优选采用将引物混合物按C152T、A709G、A3010G、T3970C、A5178C、T8414C、9bp、C9540T、G10398A、C10873T、T12705C、C13928G、C14783T、A15043G、C16311T、C16362T位点的引物混合于一个管中，而C195T、（CA）n、A1719G、G2706A、C4216T、T4883C、T7028C、A8584G、G8701A、A9123G、T10400C、G11251A、A11719G、A12372G、T14668C、A15301G、A16129G、T16223C、C16519T位点的引物混合物于另一个管中进行扩增。

上述的步骤S3中，可以在管中加入去离子甲酰胺、分子量内标；内标的作用是用于电泳过程中的内标指示。还可以加入等位基因分型标准物，校正PCR产物在电泳过程中产生的迁移速度偏差，以保证获得正确的待检样品基因型。

有益效果

对于一些DNA提取量很少的检材，如骨骼、牙齿和毛发，本试剂盒仍可以较好的进行检测。甚至检材非常陈旧或严重降解时，细胞质中的mt DNA依旧是可靠的检测物质，这得益于细胞中mt DNA拷贝数多，且被双层细胞壁包裹着，不易降解。因此，一个检测线粒体的试剂盒在法医学上应用广泛，而且本试剂盒对SNP的检测片段大小控制在300bp以内，使得检测成功率大大提高。应用本发明的线粒体SNP荧光检测试剂盒进行同一母系鉴定，较传统的测序方法成本低、操作简便，可以在3～4小时内得出实验结果，因此可以在大规模尸源认定、亲子鉴定、人类起源及进化研究中得到广泛应用。

附图说明

图1是线粒体SNP35个位点排布图及内标siz-500片段大小；

图2是SNP位点对应引物设计示意图；

图3a和图3b分别是犯罪嫌疑人和受害人扩增图谱；

图4a和图4b分别是外孙和姨的亲子鉴定图谱

具体实施方式

实施例1

1、SNP位点的确定

本发明选择的SNP位点均具有很高的多态性信息含量，整体上使单倍型多样性大大提升。通过大规模的测序筛查，入选本发明的35个位点及GD值见表3。通过对线粒体在中国人群中的多态性调查和文献调研、数据库分析，最后确定共35个高多态性SNP位点，其中75%的位点GD值(基因差异性，Gene Diversity，

位于0.2以上，最大值达到了0.5。保证人类线粒体DNA检验系统的鉴别能力。

表3本发明涉及的所有35个位点等位基因及GD值

位点	等位基因	rCRS	GD值	位点	等位基因	rCRS	GD值
								152	C	T	0.33	195	C	T	0.15
709	A	G	0.27	2706	G	A	0.19
								3010	A	G	0.32	4216	C	T	0.09
3970	T	C	0.21	4883	T	C	0.20
								5178	A	C	0.20	7028	T	C	0.19
8414	T	C	0.18	8584	A	G	0.24
								9540	C	T	0.45	8701	G	A	0.45
10398	G	A	0.50	9123	A	G	0.11
								10873	C	T	0.45	10400	T	C	0.39
12705	T	C	0.50	11251	G	A	0.09
								13928	C	G	0.21	11719	A	G	0.22
14783	C	T	0.39	11719	A	G	0.22
								15043	A	G	0.41	12372	A	G	0.14
16311	C	T	0.30	14668	T	C	0.18
								16362	C	T	0.36	15301	A	G	0.44
9bp	del	Norm	0.30	16129	A	G	0.27
												16223	T	C	0.50

[0038]

16519

C

T

0.48

(CA)n

(CA)₆

(CA)₅

0.51

注：Norm指序列长度正常的等位基因，Del指缺失9bp碱基的等位基因。

2、荧光标记复合扩增体系的SNP组合方案设计

本发明对荧光染料进行了鉴别、遴选，选用了蓝、绿、橙三种荧光标记物，构建了3色荧光组合方案。

在确定3色荧光组合方案的基础上，通过大量反复实验，摸索出SNP位点组合方式以及荧光标记类型。结合生产成本及荧光效率等因素，将35个SNP位点分成2组，使用FAM和HEX分组标记，分子量内标用橙色的荧光染料SIZ进行标记。经过筛选，最终确定一种优选的荧光染料标记的组合：C152T、A709G、A3010G、T3970C、A5178C、T8414C、9bp、C9540T、G10398A、C10873T、T12705C、C13928G、C14783T、A15043G、C16311T、C16362T采用FAM标记；C195T、（CA）n、A1719G、G2706A、C4216T、T4883C、T7028C、A8584G、G8701A、A9123G、T10400C、G11251A、A11719G、A12372G、T14668C、A15301G、A16129G、T16223C、C16519T采用HEX标记；按此种方式分组一方面可以排布下更多的位点，增加单倍型的多样性，提高识别率；另一方面能够使得因引物之间相互作用产生的非特异条带不在监测范围内；内标选用橙色荧光标记，荧光标记物为SIZ(制备方法参照专利CN101307226中披露的本公司自主研发的siz500荧光标记内标，总共13条荧光标记片段：75bp、100bp、139bp、150bp、160bp、200bp、250bp、300bp、340bp、350bp、400bp、450bp、500bp)。这种SNP位点组合方式使得仅需标记3种荧光就可实现这35个SNP位点同时检测分析。三色排布图见图1。

3、35个SNP位点对应引物设计及其浓度的优化

如图2所示，每一个SNP位点的引物是根据修正后的剑桥参考序列(revised Cambridge Reference Sequence,rCRS)NC_012920.1进行设计，其中一条上游引物的5’端用相应的荧光素进行标记，另外下游引物的3’端对等位基因序列特异识别，而其中一条下游引物的5’端再加4～6个核苷酸，用于指示等位基因，引物的序列如表1所示。

本发明的引物设计除遵循普通引物的设计原则外，同时为了增加除了9bp和(CA)n位点之外位点的两条下游引物的特异性，在距引物3’端3～7个碱基处增加错配，引入错配的原则：若3’端为强错配（G-A，T-C）,则引入弱错配（G-T,A-C）；若3’端为中度错配（A-A，C-C，G-G，T-T），则引入中度错配；若3’端为弱错配，则引入强错配。35对引物均按此特定规则进行设计，为了后续引物浓度的优化，在此设计的引物Tm值均在62～64℃之间。

4、扩增及其产物检测的实验过程

（1）PCR反应体系，需在冰上配制完成，阳性对照采用9947A和阴性对照采用超纯水，本实施例试剂盒中的Taq酶是采用专利公开号CN101050453中披露的热启动耐高温酶。具体加量如表4和表5所示。

表4FAM色反应体系

表5HEX色反应体系

（2）上述体系配制后瞬间离心，置于热循环仪上，照如表6所示的程序进行扩增。

表6线粒体SNP检测扩增程序表

（3）扩增产物在遗传分析仪上荧光检测

由去离子甲酰胺与系统中分子量内标（AGCU Marker SIZ-500）组成上样混合物〔（0.5μLAGCU Marker SIZ-500）×（进样数）＋（12μL去离子甲酰胺）×（进样数）〕。将12.5μL上样混合物与1μL扩增产物和系统中等位基因分析标准物混合，避免产生气泡。95℃变性3分钟，冰浴3分钟，用遗传分析仪ABI3100检测分析。

实施例2本发明所提供试剂盒在司法鉴定中的应用

本发明所提供试剂盒的一个重要应用就是对犯罪嫌疑人样本检测，且用常染色体STR扩增失败时，结合案情可以选择mt DNA进行检测。

1、使用本发明提供的能同时检测35个mt SNP位点的试剂盒对已腐败的受害人尸体进行确认

在某案件中受害人尸体高度腐败，采用磁珠法提取DNA后，用常规STR试剂盒扩增许多基因座丢失，故尝试用线粒体SNP荧光检测试剂盒。按照实施例1进行PCR扩增和遗传分析仪检测，选用本发明的线粒体SNP荧光检测试剂盒，同时对现场收集到的可疑头发进行检测，最后获得两份样本的基因分型数据，通过比较得出两份样本在11个位点处存在差异，可以判定为来自不同的个体，分型结果对比见下表7，分型图谱见图3a和图3b，其中，图3a为犯罪嫌疑人的分型图，图3b为受害人的分型图。

表7受害人与嫌疑人35个位点分型

样本

受害人

嫌疑人

样本

受害人

嫌疑人

样本

受害人

嫌疑人

152

T

C

9bp

NORM

12705

T

195

T

8414

C

13928

G

(CA)n

5

6

8584

G

14668

C

709

G

A

8701

A

G

14783

T

1719

G

9123

G

15043

G

A

2706

G

9540

T

C

15301

G

A

3010

G

10398

A

G

16129

G

3970

C

10400

C

T

16223

T

4216

T

10873

T

C

16311

T

4883

C

11251

A

16362

C

5178

C

11719

A

16519

T

C

7028

T

12372

G

2、使用AB公司的BigDye测序试剂盒进行检测

用BigDye法对上述两例样本进行线粒体测序，结果与本试剂盒得出的结果一致，再一次验证本发明的可靠性。但BigDye测序法需要经过片段富集反应，片段纯化，测序反应，测序产物纯化，电泳跑样和繁重的数据分析工作。步骤多容易出错，且大部分数据没被用到。相对来说本发明所使用的筛查方法只需经过一步扩增后直接电泳跑样分析，结果直观可读性强，省去了多个繁琐步骤，具有工作量小，成本低，快速排除不匹配样本，节省时间等优势。

mt DNA异质性的存在，给法医学的同一母系鉴定带来了不确定性，应在实际案件中进行相应的评价。国际法医遗传学会（International Society for Forensic Genetics，ISFG）规定，如果遇到两个样本出现一个碱基不同，而且这个碱基位置被公认是异质性热点，则不能排除；当遇到两个碱基位置不同时，如果两个位置都是异质性热点，则不能排除，否则不能判断；当出现三个位置不同时，可以做出排除结论。本发明所提供试剂盒，SNP位点达到35个，可以达到排除嫌疑人属于某个母系的可能，成为法医学案件排查中的另一工具。

实施例3本发明所提供试剂盒在亲子鉴定中的应用

本发明所提供的试剂盒在一例姨-外孙的亲子鉴定案件中起到了辅助作用，从母系遗传角度提高了本例亲子鉴定案件的可信度。

1、测定步骤如下：

（1）收集亲子鉴定案件中的头发样本：亲子鉴定样本由某法庭科学实验室提供。

（2）各种检材的线粒体DNA提取：采取Chelex法提取。

（3）扩增检测：按照实施例1所述步骤进行线粒体DNA的SNP检测，外孙的分型结果见图4a，阿姨的分型结果见图4b，其对比结果见下表8。

表8外孙和姨的线粒体35个位点基因分型

结果显示：姨-外孙线粒体SNP的检测结果完全一致，说明不排除他们来自同一个母系家族的可能。但是由于线粒体SNP检测信息含量的限制，并不能确定他们之间姨-外孙关系，需要进一步对常染色体进行检测，甚至更多家庭成员进行检测。所以，本发明提供的试剂盒在亲子鉴定中一般作为常染色体鉴定结果的补充与佐证。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海锦博生物技术有限公司

无锡中德美联生物技术有限公司

上海市刑事科学技术研究院

<120> 一种线粒体SNP荧光标记复合扩增试剂盒及其应用

<130> none

<160> 103

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tttttgttat gatgtctgtg tggaaagt 28

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgtctttgat tcctgcctca tccc 24

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaaatgtctt tgattcctgc ctcatgct 28

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tttattgcta aaggttaatc actgctgt 28

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ttttttacac atgcaagcat cctca 25

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttacacatgc aagcatcacc g 21

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gtcctttcgt acagggagga att 23

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttttgatgtt ggatcaggac atacca 26

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gatgttggat caggacatca cg 22

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

acaagaacac ctctgattac tcctgc 26

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

aaaagtttgt gtattcggct atgaagtata a 31

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gtttgtgtat tcggctatga agaaaag 27

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ggcgtaggta gaagtagagg ttaaggag 28

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ttttctacta tctcgcacct gaaacaaga 29

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ctactatctc gcacctgaaa caagc 25

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

aagttaaaga ttaagagaac caacacc 27

<210> 17

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tatagggtga tgaggaatag tgtaagcaa 29

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gggtgatgag gaatagtgta aagag 25

<210> 19

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ttaatgctaa gttagcttta cagtggg 27

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

aaaccacagt ttcatgccca tc 22

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

tggtgaaggg agactcgaag tac 23

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

cctagcccct accccacaac 20

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

aaaacctagc ccctacccac caat 24

<210> 24

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gagagtagct ataatgaaca gcgatagt 28

<210> 25

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gtgactacaa aaaggattag accgag 26

<210> 26

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

aaaagtgact acaaaaagga ttagactcaa 30

<210> 27

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

ggggtaggag tcaggtagtt agtattagg 29

<210> 28

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

ttttcagcct aattattagc atcattccc 29

<210> 29

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

cagcctaatt attagcatca accct 25

<210> 30

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

gaatggctgc tgtgttggc 19

<210> 31

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

ttttcattaa tcagttcttc aaatatctac tcatt 35

<210> 32

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

cattaatcag ttcttcaaat atctactcat c 31

<210> 33

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

gggaagaaga aagagaggaa gtaaagtt 28

<210> 34

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

aaaaccaaca tactcggatt ctactctac 29

<210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

ccaacatact cggattctac cctag 25

<210> 36

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

aagaaaaccc cacaaacccc at 22

<210> 37

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

aggtcgatga atgagtggtt aaatg 25

<210> 38

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

ttttaggtcg atgaatgagt ggttagtta 29

<210> 39

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

taaagaatcg tgtgagggtg ggact 25

<210> 40

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

tctgcctctt cctacacacc gga 23

<210> 41

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

aaaatctgcc tcttcctaca catcagg 27

<210> 42

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

tgtcttattt aaggggaacg tgtg 24

<210> 43

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

cctacccacc cttaacagta catagc 26

<210> 44

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

ttttcctacc cacccttaac agtacaaagt 30

<210> 45

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

tgtcttattt aaggggaacg tgtg 24

<210> 46

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

ttttcattac agtcaaatcc cttctagc 28

<210> 47

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

cattacagtc aaatcccttc tcgt 24

<210> 48

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

aaagataaaa tttgaaatct ggttaggc 28

<210> 49

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

gttcaatatt acaggcgaac ttacc 25

<210> 50

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

aaaagttcaa tattacaggc gaacacact 29

<210> 51

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

ttcccctccc actcccatac ta 22

<210> 52

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

atgtgagccc gtctaaacat cttc 24

<210> 53

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

agtccttgct atattatgct tggttat 27

<210> 54

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

ttttcacctt actaccagac aaccataa 28

<210> 55

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

caccttacta ccagacaacc tcag 24

<210> 56

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

aaaggaactc ggcaaatctt accc 24

<210> 57

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

aaaggaactc ggcaaatctt accc 24

<210> 58

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

aaaaagggtc ttctcgtctt gctttgtt 28

<210> 59

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

gggtataacc aacattttcg gg 22

<210> 60

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

ttttcactca ccctagcatt acttatataa c 31

<210> 61

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

cactcaccct agcattactt atatgat 27

<210> 62

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

ctgcctgcta tgatggataa gattg 25

<210> 63

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 63

tacatctcac atgacaaaaa ctagctcct 29

<210> 64

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

tctcacatga caaaaactag ccgcc 25

<210> 65

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 65

cgagaaagtg ttgtgggaag aaag 24

<210> 66

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 66

aaaaacacga cacgtactac gttctagct 29

<210> 67

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 67

acacgacacg tactacgttg tttcc 25

<210> 68

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 68

ggttagttgt ggcaataaaa atgat 25

<210> 69

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 69

ttttaatcct aggcctaccc gcca 24

<210> 70

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 70

aatcctaggc ctactcgccg 20

<210> 71

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 71

ggttagttgt ggcaataaaa atgat 25

<210> 72

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 72

ttttcaaact aacctcaaaa caaattatag 30

<210> 73

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 73

caaactaacc tcaaaacaaa tggtaa 26

<210> 74

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 74

gaaaccatca gcctactcat tcaacc 26

<210> 75

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 75

gcgacagcga tttctaggat agtt 24

<210> 76

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 76

ttttgcgaca gcgatttcta ggataatc 28

<210> 77

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 77

gccactaata gttatgtcat ccctcttat 29

<210> 78

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 78

aaaattcgtt ttgtttaaac tatataccaa atca 34

<210> 79

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 79

ttcgttttgt ttaaactata taccatttcg 30

<210> 80

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 80

cggcaagtac tattgaccca gc 22

<210> 81

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 81

aaaacttccc ctactcatcg cattg 25

<210> 82

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 82

cttcccctac tcatcgctct a 21

<210> 83

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 83

cccttccttg tactatccct atgag 25

<210> 84

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 84

aaaaggcaga atagtaatga ggatgttagt 30

<210> 85

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 85

ggcagaatag taatgaggat gtaagc 26

<210> 86

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 86

cgaacaatgc tacagggatg aata 24

<210> 87

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 87

aaaacacact actataacca ccctaacctt a 31

<210> 88

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 88

cacactacta taaccaccct aaccctg 27

<210> 89

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 89

ttttcagaat aataacacac ccgacc 26

<210> 90

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 90

aaaatgtagt ccgtgcgaga ataatgata 29

<210> 91

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 91

tgtagtccgt gcgagaatat tgatg 25

<210> 92

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 92

gccgagggcg tctttgatt 19

<210> 93

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 93

ttttgattct ttacctttca cttcatctta 30

<210> 94

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 94

gattctttac ctttcacttc atcatg 26

<210> 95

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 95

gattctttac ctttcacttc atcgtg 26

<210> 96

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 96

ttttccagcc accatgaata ttgaaca 27

<210> 97

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 97

ccagccacca tgaatattgt tcg 23

<210> 98

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 98

ggatttgact gtaatgtgct atgtacgg 28

<210> 99

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 99

aaaacaagca agtacagcaa tcaacct 27

<210> 100

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 100

caagcaagta cagcaatcag ccc 23

<210> 101

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 101

cgtgaaatca atatcccgca caaga 25

<210> 102

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 102

ttttcgtgtg ggctatttag gctctatga 29

<210> 103

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 103

cgtgtgggct atttaggctt taagg 25

Claims

1.一种线粒体SNP荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于，包括有如下35个SNP位点的引物：C152T，SEQ ID NO：1～3；A709G，SEQ ID NO：4～6；A3010G，SEQ ID NO：7～9；T3970C，SEQ ID NO：10～12；A5178C，SEQ ID NO：13～15；T8414C，SEQ IDNO：16～18；9bp，SEQ ID NO：19～20；C9540T，SEQ ID NO：21～23；G10398A，SEQID NO：24～26；C10873T，SEQ ID NO：27～29；T12705C，SEQ ID NO：30～32；C13928G，SEQ ID NO：33～35；C14783T，SEQ ID NO：36～38；A15043G，SEQ ID NO：39～41；C16311T，SEQ ID NO：42～44；C16362T，SEQ ID NO：45～47；C195T，SEQ ID NO：48～50；（CA）n，SEQ ID NO：51～52；A1719G，SEQ ID NO：53～55；G2706A，SEQID NO：56～58；C4216T，SEQ ID NO：59～61；T4883C，SEQ ID NO：62～64；T7028C，SEQ ID NO：65～67；A8584G，SEQ ID NO：68～70；G8701A，SEQ ID NO：71～73；A9123G，SEQ ID NO：74～76；T10400C，SEQ ID NO：77～79；G11251A，SEQ ID NO：80～82；A11719G，SEQ ID NO：83～85；A12372G，SEQ ID NO：86～88；T14668C，SEQ ID NO：89～91；A15301G，SEQ ID NO：92～94；A16129G，SEQ ID NO：95～97；T16223C，SEQ ID NO：98～100；C16519T，SEQ ID NO：101～103。

2.根据权利要求1所述的线粒体SNP荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：所述的35个SNP位点的引物分为两组，第一组：C152T、A709G、A3010G、T3970C、A5178C、T8414C、9bp、C9540T、G10398A、C10873T、T12705C、C13928G、C14783T、A15043G、C16311T、C16362T；第二组：C195T、（CA）n、A1719G、G2706A、C4216T、T4883C、T7028C、A8584G、G8701A、A9123G、T10400C、G11251A、A11719G、A12372G、T14668C、A15301G、A16129G、T16223C、C16519T。

3.根据权利要求2所述的线粒体SNP荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：所述的第一组中的引物通过FAM标记；所述的第二组中的引物通过HEX标记。

4.根据权利要求1任一项所述的线粒体SNP荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：所述的引物的浓度是：

5.根据权利要求1所述的线粒体SNP荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：还包括有阳性对照和阴性对照。

6.根据权利要求1所述的线粒体SNP荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：还包括有分子量内标，所述的分子量内标用SIZ标记。

7.根据权利要求1～6任一项所述的线粒体SNP荧光标记复合扩增试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

S1：从生物检材中提取线粒体DNA，稀释，作为mt DNA模板；

S3：对扩增产物进行电泳分析和基因分型。

8.根据权利要求7所述的线粒体SNP荧光标记复合扩增试剂盒的使用方法，其特征在于：所述的生物检材是包含有待检测DNA的血液、精斑、唾液、毛发、牙齿、脱落细胞或骨骼。

9.根据权利要求1～6任一项所述的线粒体SNP荧光标记复合扩增试剂盒在案件排查、亲子鉴定及尸源认定中的应用。