WO2015154332A1 - 线粒体snp荧光标记复合扩增试剂盒及其应用 - Google Patents

线粒体snp荧光标记复合扩增试剂盒及其应用 Download PDF

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WO2015154332A1
WO2015154332A1 PCT/CN2014/077784 CN2014077784W WO2015154332A1 WO 2015154332 A1 WO2015154332 A1 WO 2015154332A1 CN 2014077784 W CN2014077784 W CN 2014077784W WO 2015154332 A1 WO2015154332 A1 WO 2015154332A1
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mitochondrial
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郑卫国
焦海涛
周怀谷
卢青
杨海峰
葛海鹏
郭育林
葛斌文
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上海锦博生物技术有限公司
无锡中德美联生物技术有限公司
上海市刑事科学技术研究所
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence

Definitions

  • the invention belongs to the field of biological in vitro diagnostic technology, and concentrates on the combined application of the third generation genetic marker SNP (single nucleotide polymorphism) and fluorescence detection technology, and can quickly determine the sample by using a relatively small amount of DNA template.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • fluorescence detection technology and can quickly determine the sample by using a relatively small amount of DNA template.
  • the mtDNA haplotype group is suitable for maternal identification of mitochondrial DNA. Background technique
  • kits for individual identification in forensic science are all detecting autosomal STR genetic markers. Since there is no linkage between them and there is no association between alleles of different genetic markers, the total matching probability of autosomes in personal identification is The product of the matching probabilities of the genetic markers, so that the individual identification does not need to increase the genetic markers indefinitely, and a certain number of genetic markers can meet the requirements of forensic testing.
  • the mitochondrial genetic markers used in forensic practice are haplotype inheritance, and the entire mitochondrial genome is equivalent to a genetic marker. Therefore, the personal recognition ability of mitochondrial DNA genetic markers cannot be calculated by product. The only way to improve the mitochondrial personal recognition ability is It is to find and apply more polymorphic genetic markers in mtDNA to cover more haplotypes.
  • the methods for detecting mtDNA SNP mainly include SnaPshot detection method, probe hybridization colorimetry method, direct sequencing method, etc.
  • SnaPshot detection technology refers to a sequence based on Cambridge standard, and each SNP is designed with 3 primers, 2 of which are purposes.
  • the amplification of the fragment is about 200-500 bp in length and the Tm value is about 60 degrees.
  • the primer of Article 3 is an extended ddNTP designed upstream of the SNP site or downstream of the reverse phase.
  • the target fragment is enriched first, and the excess dNTP, primer and other single-stranded DNA products are removed by enzymatic digestion, and then subjected to a single base extension reaction.
  • the reaction product is subjected to enzyme treatment again and subjected to capillary electrophoresis to obtain SNP information of the site.
  • the primer design of this method is simple, and the synthesis is easy and inexpensive.
  • this method also has obvious limitations: the purification enzyme for partial purification is expensive; the operation steps are cumbersome and the workload is large; the detection success rate of the site with unknown mutation in the primer binding region is low, and the specific detection of the mitochondrial control region is successful. The rate is low.
  • the direct research of mitochondrial SNPs in forensic science mainly uses the direct sequencing method to detect the mtDNA control region (HV I and HV II regions).
  • This sequence is about 1122 bp in length of the mtDNA replication control region. Since it does not encode proteins, it is in the process of evolution. The selection pressure is small, which determines that it has higher polymorphism than other regions. Obviously, a large amount of information can be obtained by sequencing this hypervariable region sequence, but since the region itself is a mutation hotspot, there is genetic instability, so the specificity is not enough. Studies have found that increasing the specific polymorphic loci in the coding region can effectively expand the detection range of mitochondrial haplogroups, and can significantly improve the same maternal identification ability of mitochondria. Full-sequence sequencing is the best method in theory, but the sequencing of mtDNA sequence is large, the workload is high, the technical requirements are high, and it is difficult to promote. It is not suitable for large-scale development in existing forensic laboratories. Applications.
  • mitochondrial SNP fluorescent-labeled complex amplification kits provides a pathway for efficient and rapid detection of single nucleotide mutations.
  • a rapid, efficient and reliable mtDNA haplotype typing strategy and detection method can be established. It has the same operation method as the existing STR kit, meets the current technical level of forensic laboratory personnel, and is suitable for large sample detection, and has great application prospects.
  • the object of the present invention is to provide a mitochondrial SNP fluorescent labeling composite amplification kit, which adopts four-color fluorescent labeling technology, specific fluorescent primer amplification combined with capillary electrophoresis detection, and FAM, HEX, TAMRA, SIZ fluorescence signals as detection signals.
  • the specific mtDNA mutation is detected by the collection of fluorescent signals by a genetic sequencer, so the present invention increases to 61 sites based on the 35 SNP sites previously applied (Patent Publication No.: CN103290108A), which can effectively cover more The haplotype type.
  • a mitochondrial SNP fluorescent labeling complex amplification kit comprising primers for amplifying the following 61 SNP sites: G10398A, Norm9bpDeK C10873T, A3010G, A709G, C7196A, C12705T, C3970T, G13104A, G10310A, C5178A, G13928C, G6446A , C8414T, C8794T, C8793T, C16126T, G16129A, A15043G, C16311T, A8701G, A8697G, C4883T, C10400T, (CA)n, G1719A, C14668T, C12811T, C, T9824A, C9698T, A9123G, C7028T, G11719A, G8584A, A11251G, G8020A, G5460A, G2706A, C11215T, T4216C, G12372A, C16362T, C1541T,
  • primers are preferably as follows:
  • primers are group-labeled, G10398A, Norm9bpDel, C10873T, A3010G, A709G, C7196A, C12705T, C3970T, G13104A, G10310A, C5178A, G13928C, G6446A, C8414T, 87941 ⁇ . 87931 ⁇ .
  • the 9824 site has a case where the base is C, T or A, and is described as C, T9824A in the present invention. Further, the forward primers in the above primers are fluorescently labeled.
  • first set of forward primers in the above primers are labeled by FAM; the second set of forward primers are labeled by HEX; and the third set of forward primers are labeled by TAMRA.
  • the invention also provides a method for using the above kit, and the specific technical solution is:
  • a method for using a mitochondrial SNP fluorescent labeling composite amplification kit comprises the following steps: SI: extracting mitochondrial DNA from a biological sample as a mt DNA template; the biological sample may be hair, cigarette butts, teeth, exfoliated cells, bones, blood, fine spots, saliva, etc.; above DNA extraction method DNA method It may be a magnetic bead method, a Chelex-100 extraction method, a silicon film method, etc., after being simply quantified and diluted to a suitable concentration;
  • S2 preparing a PCR reaction solution, adding a reaction buffer, a Taq enzyme, a composite primer, a water, a DNA template, and amplifying the sample by a three-step amplification method;
  • S3 Electrophoresis of the amplified product, software analysis of the electrophoresis results and haplotype grouping.
  • deionized formamide and molecular weight internal standard should be added to the wells of the sample plate; the internal standard is used for the internal standard indication during electrophoresis.
  • Allelic ladders can also be added to determine genotypes by comparison with unknown samples.
  • Mitochondrial DNA is divided into control region and coding region, in which the HVI and HVII regions of the control region have higher mutation rate, which is the main part of the current forensic mitochondria, but studies have shown that the random coupling probability of HV I is 2%, HV II is 4%. It is sometimes difficult to distinguish two unrelated individuals by relying only on the control area. Therefore, the present invention reasonably avoids this disadvantage in the selection of loci, and adopts 54 coding regions and 7 control region sites.
  • Combined detection combines the high mutation rate of the control region with the stable genetic characteristics of the coding region to greatly increase the identification ability of the kit, optimize the multiplex PCR system for complex amplification of SNP sites, and combine DNA amplification with
  • the combination of capillary electrophoresis technology greatly improves the inspection speed and efficiency, completely surpasses the detection speed of existing detection methods, and can become the main detection method for case inspection and database construction.
  • the sample is highly adaptable. For some samples with little DNA extraction, such as bones, teeth and hair, this kit can still be tested well. Even when the sample is very old or severely degraded, mt DNA in the cytoplasm is still a reliable test substance, which is due to the large number of copies of mt DNA in the cell, and is surrounded by double-layer cell walls, which is not easy to degrade;
  • the size of the detection fragment of the SNP is controlled within 325 bp, which makes the detection success rate greatly improved. Traditional STR detection failures can still be successfully typed;
  • the mitochondrial SNP fluorescence detection kit of the invention is used for the identification of the mother line, which is lower in cost and simple in operation than the conventional sequencing method, and the data analysis is simple, and the experimental result can be obtained within 3 to 4 hours, so that the large-scale corpse can be obtained. Widely used in identification, paternity testing, human origin and evolutionary research. DRAWINGS
  • Figure 1 is a schematic diagram showing the arrangement of 61 sites of mitochondrial SNP and the size of the internal standard siz-500 fragment; 2 is a schematic diagram showing the design principle of primers corresponding to SNP sites and adjacent sites;
  • Figure 3a is a heterogeneity site kit detection map
  • Figure 3b is a sequencing map of a heterogeneous site kit
  • Figure 4a is a sister I sister relationship identification map
  • Figure 4b is a sister II sister relationship identification map
  • Figure 5a is a standard 9947A detection map
  • Figure 5b is a map of the DNA template that was artificially engineered to complement the 9947A typing. Specific form
  • the mitochondrial phylogenetic tree (mtDNA tree Build 16 (19 Feb 2014)), combined with the genetic characteristics of mitochondrial DNA in Chinese population, screened the characteristic loci of major mitochondrial gene haplotypes and their subtypes; The classification of mitochondria in the Chinese population and the literature investigation and database analysis finally screened 61 mtDNA signature sites, all of which have higher GD values, covering the main mtDNA haplotypes in Chinese population. Groups and their major subtypes. Among them, 73.7% of the sites have a GD value above 0.2 and a maximum of 0.5. The ability to identify human mitochondrial DNA testing systems is ensured (see 61 in the 61 sites and GD values of the present invention).
  • GD Genetic diversity
  • Norm refers to the allele with a normal sequence length
  • Del refers to the allele with a 9 bp base deletion
  • each primer is shown in Figure 2, except for a few adjacent sites such as (C8793T and P C8794T), (C16126T and G16129A), (G11719A and G1719A), (G8584A and A8701G and A8697G), (A11251G and C11215T), (CT9824A and C9698T), (G5417A and C5442T), (G9477A and G9545A) sites were detected simultaneously using the common labeled primers, and the remaining sites have their respective labeled primers.
  • sites such as (C8793T and P C8794T), (C16126T and G16129A), (G11719A and G1719A), (G8584A and A8701G and A8697G), (A11251G and C11215T), (CT9824A and C9698T), (G5417A and C5442T), (G9477A and G9545A) sites were detected simultaneously using the common labeled primers, and the
  • the primers for each SNP site are based on the corrected The Cambridge Reference Sequence (rCRS) NC_012920.1 was designed in which the 5' end of one F-primer was labeled with the corresponding fluorescein, and the 3' end of the other two unlabeled primers was specific for the allelic sequence. It is recognized that any of the two non-standard primers introduces 3 to 4 and the template unpaired nucleotides at the 5' end, and generally adds a "TATA" base, which has the least influence on the primer TM value. Due to the different lengths of the two unlabeled primers, the length of the amplified products is different, and the electrophoretic migration rate is different, and finally the detection purpose is achieved.
  • rCRS Cambridge Reference Sequence
  • each site includes two unlabeled primers and one fluorescently labeled primer, and the last base pair allele template at the 3' end of the two primers is specifically recognized to further enhance amplification specificity.
  • Sexuality artificial mismatch is introduced at 2 ⁇ 7 bases from the 3' end. The specificity of the artificial mismatch position from the 3' end is different.
  • HEX Fluorescein-labeled primers have the best primer mismatch specificity when the artificial mismatch is at the 2nd base from the 3' end, and artificially misplaced to the TAMRA fluorescein-labeled primer with poor fluorescence efficiency. The effect at the 3rd base of the end is better.
  • the 3' end is a strong mismatch (TC, AG pairing), a weak mismatch (AC, GT pairing) should be introduced; if the 3' end is a moderate mismatch ( AA, GG, CC, TT pairing), then introduce a medium mismatch; if the 3' end is a weak mismatch, a strong mismatch should be introduced.
  • the two non-labeled primers have a length difference of 3 to 4 bases at the 5' end, and the alleles of each point can be different in length of the amplified product. To achieve the purpose of differentiation. Considering the need for subsequent primer complex amplification, the primer Tm values designed here are between 62 and 64 ° C (the TM value calculation method is the nearest neighbor method).
  • G13928C R2-primer attaCCAACATACTCGGATTCTACCaTAC 22
  • A15043G R2-primer atatTCTaCCTCTTCCTACACATCGtG 28
  • CT9824A R2-primer TATACACAGGCTTCCACGGcCTC 111
  • G1811A R2-primer TATAGGTTAGTCCTTGCTATATTATGCTaGGT 123
  • the working concentration of each primer in the composite primer was obtained by the primer concentration gradient experiment.
  • the concentration of each primer was from ⁇ . ⁇ ⁇ to 0.2 ⁇ ⁇ as the concentration gradient, and the gradient interval was 0.02 ⁇ ⁇ .
  • Single extension was performed to obtain a larger primer.
  • the concentration range and then the complex expansion primer retest further fine-tune the primer concentration.
  • the most important indicator is that no non-specific peak can occur; according to the detection result, the primer concentration of the peak height RFU between 2000 and 2500 is selected as the preferred.
  • the corresponding upstream primer (F-primer) of each SNP site can be labeled by an isotope or fluorescein, and the fluorescein labeling effect is better.
  • the corresponding downstream primer (R-primer) is an unlabeled primer.
  • the invention has identified and selected fluorescent dyes, and selected four fluorescent labels of blue, green, black and orange to construct a four-color fluorescent combination scheme.
  • the final combination of fluorescent dye labels is: where G10398A, Norm9bpDel, C10873T, A3010G, A709G, C7196A, C12705T, C3970T, G13104A, G10310A, C5178A, G13928C, G6446A, C8414T, C8794T, C8793T, C16126T, G16129A, A15043G, C16311T These 20-site F-primers are marked by FAM.
  • the 23-site F-primer is marked by HEX.
  • the FAM-colored primers and their corresponding non-standard primers are formulated as FAM color composite primers; HEX color composite primers and TAMRA color composite primers are prepared in the same manner.
  • the internal standard is orange fluorescent label, and the fluorescent label is SIZ.
  • the preparation method refers to the siz500 fluorescent label internal standard independently developed by the company disclosed in the patent CN101307226. A total of 13 fluorescent label fragments: 75bp, 100bp, 139bp, 150bp, 160bp, 200bp , 250 bp, 300 bp, 340 bp, 350 bp, 400 bp, 450 bp, 500 bp).
  • This combination of SNP sites allows simultaneous detection and analysis of these 61 SNP sites by simply labeling 4 fluorescences.
  • the four-color layout is shown in Figure 1.
  • the kit also includes two sets of positive controls, one set is 9947A, the other set is an artificially modified DNA sequence complementary to the 9947A point type, and the positive control is used as a positive control for each experiment for monitoring PCR.
  • the correctness of the amplification system excludes false negatives; the negative control is used to control the contamination of the formulation system process and eliminate false positives.
  • the artificial sequence prepared by the 9947A typing is as follows: It has been obtained by site-directed mutagenesis, fusion PCR and cloning techniques. First, based on the allele information of 9947A, a site-directed mutagenesis primer for another allele is designed.
  • the mutation point is placed in the middle of the primer, the primer TM value is about 78 ° C and the upstream and downstream primers are just reverse complementarily, so that each fragment amplified by the complementary sequence can be directly used for the next fusion amplification to obtain the fusion product of each fragment.
  • the fusion product was cloned into PMD18-T and transferred to DH5a for storage. The extracted plasmid was used as a standard.
  • the primers in the kits of the invention are rigorously designed and validated to have a high degree of amplification specificity and species specificity. 3. Amplification and product detection
  • the preparation of the PCR reaction system other than the template is completed on ice, and finally the template is added, and the template is added to the sample after the sample to be tested, and the positive control and the negative control are used.
  • the Taq enzyme in the kit of the present embodiment adopts the patent publication number.
  • a molecular weight internal standard (AGCU Marker SIZ-500) equipped with a DNA denaturant deionized formamide and a kit was mixed at a volume ratio of 12:0.5 to form a mixed solution.
  • the 12.5 ⁇ L loading mixture was mixed with the allele analysis standard of the ⁇ amplification product and kit, mixed and centrifuged to remove air bubbles. After denaturation at 98 °C for 5 min, it was placed on ice for 3 min, and the electrophoresis was detected by genetic analyzer ABI 3100. The results were analyzed by GeneMapperlD v3.2 software.
  • each detected site in the first row is:
  • the detected sites in the second row are:
  • the detected sites in the third row are:
  • Example 2 Using the primers, grouping fluorescent labeling and amplification system and parameters in Example 1, a large sample of mitochondrial SNPs was detected. A total of 200 Han and 200 Uyghur population samples were randomly selected, and the samples were extracted and amplified by a kit. The results of electrophoresis showed that the main classification results of the Han nationality D4*, B5, D5a, and D4b2 accounted for 7%, 6.5%, 4.5%, and 4.5%, respectively, and in the Uighur population, D4*, T, and W, respectively. Accounted for 7.5%, 7%, and 6%. Han nationality as an ancient Chinese The descendants of the family, whose diffusion distribution conforms to the Demic diffusion model.
  • the existence of mtDNA heterogeneity brings uncertainty to the identification of the same maternal lineage in forensic science and should be evaluated in actual cases.
  • the International Society for Forensic Genetics stipulates that if two bases are found to have one base difference and the base position is recognized as a heterogeneous hot spot, it cannot be excluded; When the base positions are different, if the two positions are heterogeneous hot spots, they cannot be excluded, otherwise they cannot be judged; when three positions are different, the exclusion conclusion can be made.
  • the kit provided by the invention can not only realize the detection of general SNP sites, but also can successfully detect when there is heterogeneity of the sites.
  • the kit provided by the present invention plays an auxiliary role in the case identification of a suspected sister relationship, and improves the credibility of the maternal relationship identification case in this example from the perspective of maternal inheritance.
  • Amplification assay SNP detection of mitochondrial DNA was carried out according to the kit implementation procedure in Example 1. The typing results of sister I are shown in Figure 4a, and the results of sister II are shown in Figure 4b. Different sites are shown in bold italics.

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Abstract

本发明提供一种可以同时检测61个SNP位点的线粒体SNP荧光标记复合扩增试剂盒。该试剂盒根据线粒体系统发育树，结合中国人群的遗传特点，挑选出61个多态性高，突变率低，分型能力强的SNP位点，包含编码区位点54个，控制区位点7个，采用特异性引物对这61个SNP位点进行检测。

Description

线粒体 SNP荧光标记复合扩增试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物体外诊断技术领域， 集中体现的是第三代遗传标记 SNP (单核苷酸多态 性， single nucleotide polymorphism)和荧光检测技术的联合应用， 能够利用相对微量的 DNA 模板快速确定样本的 mtDNA单倍型类群， 适用于线粒体 DNA母系鉴定。 背景技术
目前法医学上用于个体识别的试剂盒都是检测常染色体 STR遗传标记， 由于它们之间不 存在连锁关系且不同遗传标记的等位基因间不存在关联， 所以个人识别时常染色体的总匹配 概率是各遗传标记的匹配概率的乘积， 因此进行个体识别时不需要无限地增加遗传标记， 一 定数量的遗传标记就可以满足法医学检测的要求。 而应用于法医学实践的线粒体遗传标记呈 单倍型遗传， 整个线粒体基因组相当于一个遗传标记， 因此线粒体 DNA遗传标记的个人识 别能力不能通过乘积来计算， 要提高线粒体的个人识别能力， 唯一的办法就是在 mtDNA 中 发现并应用更多的多态遗传标记以覆盖更多的单倍群类型。
目前， 用于 mtDNA SNP检测方法主要有 SnaPshot检测法、 探针杂交显色法、 直接测序 法等， SnaPshot检测技术指的是基于剑桥标准序列， 每个 SNP设计 3条引物， 其中 2条是目 的片段的扩增，长度在 200— 500bp左右， Tm值在 60度左右。第 3条的引物的是延伸 ddNTP, 设计在 SNP位点的上游或者是反向的下游。先富集得到目的片段，经酶消化去除多余的 dNTP， 引物和其他单链 DNA产物后再进行单碱基延伸反应， 反应产物再次经过酶处理后进行毛细 管电泳检测得到位点的 SNP信息。 这种方法引物设计简单， 合成容易价格便宜。 但这种方法 也有明显的局限性： 部分纯化用的消化酶价格昂贵； 操作步骤繁琐， 工作量大； 引物结合区 存在未知突变的位点检测成功率低， 具体表现在线粒体控制区位点检测成功率低。
目前法医学上对线粒体 SNP的研究主要采用直接测序法， 主要检测 mtDNA控制区（HV I和 HV II区）， 这段序列处于 mtDNA复制控制区长度约 1122bp， 由于其不编码蛋白质， 因 此在进化过程中选择压力小， 决定其相比其他区域有更高的多态性。 显然对这段高变区序列 测序可以获得大量的信息， 但由于该区域本身为突变热点区， 存在遗传不稳定性， 所以特异 性尚显不够。研究发现增加编码区的特定多态性位点， 能有效扩大线粒体单倍群的检测范围， 能显著提高线粒体的同一母系鉴定能力。 全序列测序理论上是最好的方法， 但进行 mtDNA 全序列测序， 工作量大， 技术要求较高， 难于推广， 不适合在现有法医实验室中展开大规模 的应用。
线粒体 DNA研究的专利几乎集中在对线粒体疾病的探讨上， 而在母系鉴定方面很少涉 及， 仅有的一篇 《一种检测线粒体基因单倍型类群的方法及应用》 采用的是寡核苷酸探针的 方法， 实时定量检测方法具有灵敏度高， 特异性好， 但同时存在通量低， 引物探针设计复杂 等缺点， 不适合进行大样本检测。 发明内容
线粒体 SNP荧光标记复合扩增试剂盒的出现，为高效快速检测单核苷酸突变提供了途径。 通过建立 mtDNA高变区和编码区联合检测的模式，可以建立一种快速、高效、可靠的 mtDNA 单倍型分型策略和检测方法。 和现有的 STR试剂盒操作方法相同， 符合当前法医实验室人员 技术水平， 且适合大样本检测， 具有很大的应用前景。
本发明的目的是提供一种线粒体 SNP荧光标记复合扩增试剂盒，采用四色荧光标记技术， 特异性荧光引物扩增结合毛细管电泳检测， 以 FAM、 HEX, TAMRA、 SIZ荧光信号为检测 信号。 通过遗传测序仪对荧光信号的收集来检测特定的 mtDNA 突变， 因此本发明在之前申 请的 35个 SNP位点 （专利公开号： CN103290108A) 的基础上增加至 61个位点， 可以有效 覆盖更多的单倍群类型。
技术方案是：
一种线粒体 SNP荧光标记复合扩增试剂盒，包括有用于扩增如下 61个 SNP位点的引物： G10398A、 Norm9bpDeK C10873T、 A3010G、 A709G、 C7196A、 C12705T、 C3970T、 G13104A、 G10310A、 C5178A、 G13928C、 G6446A、 C8414T、 C8794T、 C8793T、 C16126T、 G16129A、 A15043G、 C16311T、 A8701G、 A8697G、 C4883T、 C10400T、 （CA)n、 G1719A、 C14668T、 C12811T、 C,T9824A、 C9698T、 A9123G、 C7028T、 G11719A、 G8584A、 A11251G、 G8020A、 G5460A、 G2706A、 C11215T、 T4216C、 G12372A、 C16362T、 C1541T、 C8684T、 G9477A、 A4491G、 G1811A、 G16316A、 A16319G、 G9545A、 C11944T、 C152T、 G14569A、 C8964T、 G10397A、 G3348A、 G4833A、 G7600A、 G5417A、 C5442T、 C15784T。
进一步地， 上述的引物优选如下：
A709G, SEQ ID NO.1-3; A3010G, SEQ ID NO.4-6; C5178A, SEQ ID NO.7-9; Norm9bpDel, SEQ ID NO.10-11; G10398A, SEQ ID NO.12-14; C10873T, SEQ ID NO.15-17; C12705T, SEQ ID NO.18-20; G13928C, SEQ ID NO.21-23; C 1631 IT, SEQ ID NO.24-26; A15043G, SEQ ID NO.27-29; C3970T, SEQ ID NO.30-32; C8414T, SEQ ID NO.33-35; G6446A, SEQ ID NO.36-38; C7196A, SEQ ID NO.39-41; G10310A, SEQ ID NO.42-44; G13104A, SEQ ID NO.45-47; C8793T 和 C8794T, SEQ ID NO.48-51; C16126T和 G16129A, SEQ ID NO.52-55; C4883T, SEQ ID NO.56-58; C10400T, SEQ ID NO.59-61; (CA)n, SEQ ID NO.62-63; G11719A, SEQ ID NO.64-66; G1719A和 C1541T, SEQ ID NO.67-71; G8584A和 A8701G和 A8697G, SEQ ID NO.72-77; A9123G, SEQ ID NO.78-80; C7028T, SEQ ID NO.81-83; C14668T, SEQ ID NO.84-86; G2706A, SEQ ID NO.87-89; G12372A, SEQ ID NO.90-92; T4216C, SEQ ID NO.93-95; A11251G和 C11215T, SEQ ID NO.96-100; G5460A, SEQ ID NO.101-103; C 1281 IT, SEQ ID NO.104- 106; G8020A, SEQ ID NO.107-109; CJ9824A, SEQ ID NO.110-112; C9698T, SEQ ID NO.113-115; C16362T, SEQ ID NO.116-118; C152T, SEQ ID NO.119-121; G1811A, SEQ ID NO.122-124; A4491G, SEQ ID NO.125-127; G4833A, SEQ ID NO.128-130; G5417A和 C5442T, SEQ ID NO.131-135; G7600A, SEQ ID NO.136-138; C8684T, SEQ ID NO.139-141; C8964T, SEQ ID NO.142-144; G9477A和 G9545A, SEQ ID NO.145-149; G10397A, SEQ ID NO.150- 152; G3348A: SEQ ID NO.153-155; C11944T, SEQ ID NO.156-158; G14569A, SEQ ID NO.159-161; C15784T, SEQ ID NO.162-164; G16316A和 A16319G, SEQ ID N0.165-168。
以上的引物中， C8793T和 C8794T、C16126T和 G16129A、G16316A和 A16319G、G11719A 和 G1719A、 G8584A和 A8701G和 A8697G、 A11251G和 C11215T、 C,T9824A和 C9698T、 G5417A和 C5442T、 G9477A和 G9545A位点共用同一个正向引物。
进一步， 以上的引物是分组标记的， G10398A、 Norm9bpDel、 C10873T、 A3010G、 A709G、 C7196A、 C12705T、 C3970T、 G13104A、 G10310A、 C5178A、 G13928C、 G6446A、 C8414T、 87941\。87931\。161261\016129八、八150430、 1631111位点对应的引物为第一组；八87010、 A8697G、 C4883T、 C10400T、 （CA)n、 G1719A、 C14668T、 C12811T、 C,T9824A、 C9698T、 A9123G、 C7028T、 G11719A、 G8584A、 A11251G、 G8020A、 G5460A、 G2706A、 C11215T、 T4216C、 G12372A、 C16362T、 C1541T位点对应的引物为第二组； C8684T、 G9477A、 A4491G、 G1811A、 G16316A、 A16319G、 G9545A、 C11944T、 C152T、 G14569A、 C8964T、 G10397A、 G3348A、 G4833A、 G7600A、 G5417A、 C5442T、 C15784T位点对应的引物为第三组。 以上 所述的 "第一"、 "第二"和 "第三"不构成对先后次序的限制。
其中， 9824位点存在有碱基是 C、 T或者 A的情况， 在本发明中描述为 C,T9824A。 进一步， 以上引物中的正向引物是荧光标记的。
进一步， 以上引物中第一组的正向引物是由 FAM标记的； 第二组的正向引物是由 HEX 标记； 第三组的正向引物是由 TAMRA标记。
本发明还提供了上述试剂盒的使用方法， 具体的技术方案是：
一种线粒体 SNP荧光标记复合扩增试剂盒的使用方法， 包括如下步骤： SI : 从生物检材提取线粒体 DNA， 作为 mt DNA模板； 所述的生物检材可以是毛发、 烟 蒂、 牙齿、 脱落细胞、 骨骼、 血液、 精斑、 唾液等； 以上的 DNA提取方法 DNA的方法可以 是磁珠法、 Chelex-100提取法、 硅膜法等经简单定量后稀释到合适浓度；
S2: 配制 PCR反应液， 加入反应缓冲液、 Taq酶、 复合引物、 水， DNA模板， 采用三步 扩增法， 对样本进行扩增；
S3： 对扩增产物进行电泳， 软件分析电泳结果并进行单倍型类群分型。 电泳时需在跑样 板孔中加入去离子甲酰胺、 分子量内标； 内标的作用是用于电泳过程中的内标指示。 还可以 加入等位基因分型标准物， 用来与未知样品比对确定基因型。
以上试剂盒在案件排査、 亲子鉴定及尸源认定中的应用。 有益效果
1、 线粒体 DNA分为控制区和编码区， 其中控制区的 HVI及 HVII区突变率较高， 为当 前法医线粒体主要检测的部分， 但有研究表明， HV I的随机偶合概率为 2%， HV II为 4%， 仅仅依靠控制区有时很难将两个无关个体区分开来， 故本发明在位点的选取上合理避开了这 一缺点， 采用了 54个编码区和 7个控制区位点联合检测， 把控制区的位点高突变率和编码区 位点稳定遗传的特点相结合，大大增加试剂盒的鉴别能力，优化复合扩增 SNP位点的多重 PCR 体系； 并将 DNA复合扩增与毛细管电泳技术相结合， 极大地提高了检验速度和效率， 完全 超越了现有检测方法的检测速度， 可以成为案件检验和数据库建设的主要检测方法。
2、本发明方法设计合理， 建立了一种新型的利用荧光标记引物特异性扩增结合毛细管电 泳技术的 mtDNA单倍型类群分型方法；
3、 样本适应性强， 对于一些 DNA提取量很少的检材， 如骨骼、 牙齿和毛发， 本试剂盒 仍可以较好的进行检测。 甚至检材非常陈旧或严重降解时， 细胞质中的 mt DNA依旧是可靠 的检测物质， 这得益于细胞中 mt DNA拷贝数多， 且被双层细胞壁包裹着， 不易降解；
4、 本试剂盒对 SNP的检测片段大小控制在 325bp以内， 使得检测成功率大大提高。 传 统 STR检测失败的情形仍可以成功分型；
5、 应用本发明的线粒体 SNP荧光检测试剂盒进行母系鉴定， 较传统的测序方法成本低、 操作简便， 数据分析简单， 可以在 3〜4小时内得出实验结果， 因此可以在大规模尸源认定、 亲子鉴定、 人类起源及进化研究中得到广泛应用。 附图说明
图 1是线粒体 SNP 61个位点排布图及内标 siz-500片段大小的位置示意图; 图 2是 SNP位点和邻近位点对应引物设计原理示意图；
图 3a是异质性位点试剂盒检测图谱；
图 3b是异质性位点试剂盒测序图谱；
图 4a是 sister I姐妹关系鉴定图谱；
图 4b是 sister II姐妹关系鉴定图谱；
图 5a是标准品 9947A检测图谱；
图 5b是经人工改造与 9947A分型互补的 DNA模板的检测图谱。 具体实 式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。 但本领域技术人员将会理 解， 下列实施例仅用于说明本发明， 而不应视为限定本发明的范围。 实施例中未注明具体技 术或条件者， 按照本领域内的文献所描述的技术或条件（ 例如参考 J. 萨姆布鲁克等著， 黄培 堂等译的 《分子克隆实验指南》， 第三版， 科学出版社） 或者按照产品说明书进行。 所用试剂 或仪器未注明生产厂商者， 均为可以通过市购获得的常规产品。 实施例 1 本发明线粒体 SNP位点的选取、 分组、 引物设计及反应体系的建立
1、 SNP位点筛选
参考线粒体系统发育树（mtDNA tree Build 16 (19 Feb 2014))， 结合中国人群线粒体 DNA 遗传特点， 筛选出主要线粒体基因单倍型类群及其亚型的特征性位点； 根据中国人群 mtDNA 单倍型类群分型树结合线粒体在中国人群中的多态性调査和文献调研、 数据库分析最后筛 选出 61个 mtDNA特征性位点， 均具有较高 GD值， 涵盖了中国人群主要 mtDNA单倍型类 群及其主要亚型。 其中 73.7%的位点 GD值位于 0.2以上， 最大值达到了 0.5。 保证人类线粒 体 DNA检验系统的鉴别能力 （入选本发明的 61个位点及 GD值见附表 3 )。
基因多样性 （GD)， 按公式 GD=N ( 1- Σ Ρ,2) I (N-1 ) 计算， n为样本例数， 为等位基 因频率。
表 1本发明涉及的所有 61个位点的等位基因及位点 GD值
Figure imgf000007_0001
3970 C,T 0.21 4216 T,C 0.09
13104 G,A 0.12 12372 QA 0.14
10310 G,A 0.13 16362 C,T 0.36
5178 C,A 0.20 1541 C,T 0.30
13928 G,C 0.21 9698 C,T 0.17
6446 G,A 0.25 8684 T,C 0.23
8414 C,T 0.18 9477 QA 0.23
8794 C,T 0.34 4491 A,G 0.14
8793 C,T 0.30 1811 QA 0.16
15043 A,G 0.41 16319 QA 0.18
16311 C,T 0.30 16316 QA 0.19
16129 A,G 0.27 9545 QA 0.40
16126 C,T 0.25 11944 C,T 0.12
8701 A,G 0.45 152 C,T 0.43
8697 A,G 0.50 14569 QA 0.14
4883 C,T 0.20 8964 C,T 0.16
10400 C,T 0.39 10397 QA 0.44
CA 3,4,5,6,7,8 0.51 3348 QA 0.04
1719 G,A 0.34 4833 QA 0.11
14668 C,T 0.18 7600 QA 0.12
12811 C,T 0.42 5417 QA 0.14
9824 T,C,A 0.35 5442 C,T 0.18
9123 A,G 0.11 15784 C,T 0.24
7028 C,T 0.19
注： Norm指序列长度正常的等位基因， Del指缺失 9bp碱基的等位基因。
2、 引物设计
在确定了 SNP位点之后， 根据突变位点设计特异性检测引物（试剂盒特征性位点引物序 列见表 2)。 通过设置人工突变， 对每条引物的人工突变最佳位置进行了逐一摸索， 并构建出 各 SNP位点对应的质粒进行引物测试和筛选， 最后保留效率高且特异性强的引物， 用来组配 复合扩增体系。
各引物设计原理如图 2所示， 除个别邻近位点如 （C8793T禾 P C8794T)、 (C16126T和 G16129A)、（G11719A和 G1719A)、（G8584A和 A8701G禾口 A8697G)、（A11251G和 C11215T)、 (CT9824A和 C9698T)、 (G5417A和 C5442T)、 ( G9477A和 G9545A)位点采用共用标记引 物同时检测外， 其余位点均有各自对应的标记引物， 每一个 SNP位点的引物是根据修正后的 剑桥参考序列 (revised Cambridge Reference Sequence, rCRS) NC_012920.1进行设计，其中一条 F-primer的 5' 端用相应的荧光素进行标记， 另外两条非标记引物的 3 ' 端对等位基因序列特 异识别，两条非标引物的其中任一条 5'端引入 3〜4个和模板不配对核苷酸，一般添加" TATA" 碱基， 对引物 TM值影响最小。 由于两条非标记引物的长度不同导致扩增产物长度不同， 电 泳迁移速率不同， 最终达到检测的目的。
由于 9bp 缺失和 (CA)n 重复两者的多态性表现为长度多态性， 只需要分别设计一条 F-primer和非标记引物， 就可以根据产物大小不同加于区分。 对于大多数的位点， 每个位点包括两条非标记引物和一条荧光标记引物， 上述两条引物 的 3 ' 端最后一个碱基对等位基因模板进行特异识别， 为了进一步提高扩增特异性， 在距 3 ' 端 2〜7个碱基处引入人工错配， 人工错配位置离 3 ' 端距离不同引物的特异性也不同， 经过 反复摸索发现， 对于荧光效率较高的 FAM， HEX荧光素标记的引物， 当人工错配在离 3 ' 端 第 2个碱基处时引物错配特异性最好， 对于荧光效率差的 TAMRA荧光素标记的引物， 则将 人工错配置于离 3 ' 端第 3个碱基处效果较好。 至于引入什么类型的碱基则遵循如下原则： 如果 3 ' 端是强错配 （T-C、 A-G配对）， 则应引入弱错配 （A-C、 G-T配对）； 如果 3 ' 端是 中度错配 （A-A、 G-G、 C-C、 T-T配对）， 则就引入中度错配； 如果 3 ' 端是弱错配， 则应引 入强错配。 另外， 为了提高等位基因的识别度， 两条非标记引物通过在 5' 端外挂 3〜4个碱 基使扩增产物存在长度差异， 各位点的等位基因则可以通过扩增产物长度不同达到区分的目 的。 考虑到后续引物复合扩增的需要， 在此设计的引物 Tm值均在 62〜64°C之间 （TM值计 算方法是最邻近法 (the nearestneighbor method) )。
表 2 各个位点对应的引物
SEQ ID
SNP位点 引物类型 序列 (5 '-3')
NO
Rl -primer tataTTACACATGCAAGCATCCaCA 1
A709G R2- primer TTACACATGCAAGCATCCCaG 2
F- primer TTTATTGCTAAAGGTTAATCACTGCTGT 3
Rl -primer GgTGTTGGATCAGGACATCgCG 4
A3010G R2- primer attaGATGTTGGATCAGGACATCtCA 5
F- primer GTCCTTTCGTACAGGGAGGAATT 6
Rl -primer attaCTACTATCTCGCACCTGAAACAtGA 7
C5178A R2- primer CTACTATCTCGCACCTGAAACAAcC 8
F- primer GGCGTAGGTAGAAGTAGAGGTTAAGGAG 9
F- primer TTAATGCTAAGTTAGCTTTACAGTGGG 10
Norm9bpDel
Rl -primer AAACCACAGTTTCATGCCCATC 11
Rl -primer aGTGACTACAAAAAGGATTAGACTGcG 12
G10398A R2- primer acatGTGACTACAAtAAGGATTAGACTtRA 13
F- primer GAGAGTAGCTATAATGAACAGCGATAGT 14
Rl -primer ttaCAGCCTAATTATTAGaATCATgCTC 15
C10873T R2- primer CAGCaTAATTATTAGCATCAgCCTT 16
F- primer GGGGTAGGAGTCAGGTAGTTAGTATTAGG 17
Rl -primer CATTAATCAGTTCTTCAAATATCTACTCcTC 18
C12705T R2- primer cataCATTAATCAGTTCTTCAAATATCTACTaATT 19
F- primer GAATGGCTGCTGTGTTGGC 20
Rl -primer CCAACATACTCGGATTCTACCCaAG 21
G13928C R2- primer attaCCAACATACTCGGATTCTACCaTAC 22
F- primer GGGAAGAAGAAAGAGAGGAAGTAAAGTT 23
Rl -primer tataCCTACTCaCCCTTAACAGTACATcGT 24
C16311T R2- primer CCTACTCACCCTTAACAGTACcTAGC 25
F- primer TGTCTTATTTAAGGGGAACGTGTG 26
Rl -primer cCTGCCTCTTCCTAgACATQGA 27
A15043G R2- primer atatTCTaCCTCTTCCTACACATCGtG 28
F- primer TAAAGAATCGTGTGAGGGTGGGACT 29
C3970T Rl -primer attaGTTTaTGTATTCGGCTATGAAGAATtA 30
Figure imgf000010_0001
Rl -primer AtaaTaTTCTCGTCTTGCTGTGgC 87
G2706A R2- primer attaAtaGTCTTCTCGTaTTGCTGTGaT 88
F- primer AAAGGAACTCGGCAAATCTTACCC 89
Rl -primer tataGATGGGGGGAATTAGGGAAcTC 90
G12372A R2- primer GATGGGGGGAATTAGGGAtGTT 91
F- primer CCGACATCATYACCGGGTTTTC 92
Rl -primer CcCTCACCCTAGCATTACTTATATcAT 93
T4216C R2- primer atttCACTCACCCTAGCATTACTTATATaAC 94
F- primer GGGTATAACCAACATTTTCGGG 95
Rl -primer CTTCCCCTACTCATCGCcCTA 96
A11251G
R2- primer tataCTTCCCCTACTCATCGCtCTG 97
Rl -primer aGCAGGCACATACTTCCTATTCTtC 98
C11215T R2- primer AtCGCAGGCACATACTTCCTATTaTAT 99
F- primer CGGCAAGTACTATTGACCCAGC 100
Rl -primer tataCATTCCTCCCCACACTCAcCA 101
G5460A R2- primer CATTCCTCCCCACACTCtTCG 102
F- primer AGTGTTTGTGGGTTTAAGTCCCAT 103
Rl -primer attaGGCATCTGCTCGGGCcTA 104
C12811T R2- primer aGGCATCTGCTCGGGgGTG 105
F- primer CCCAAACATTAATCAGTTCTTCAA 106
Rl -primer tataACGTTGACAATCGAGTAGTACTtCCA 107
G8020A R2- primer ACGTTGACAATCGAGTAGTACTCtCG 108
F- primer AGGGGAATTAATTCTAGGACGATGG 109
Rl -primer ataAtaCACAGGCTTCCACGGtCTA 110
CT9824A R2- primer TAtaCACAGGCTTCCACGGcCTC 111
R3 -primer atACAGGCTTCCACGGgCTT 112
Rl -primer cAAATAGAGACCCAGTAAAATTGTAtTG 113
C9698T R2- primer taGTAAAATAGAGACCCAGTAAAATTGTcATA 114
F- primer GAGACATACAGAAATAGTCAAACCACAT 115
Rl -primer ACATTACAGTCAAATCCCTTCTtGT 116
C16362T R2- primer AtatCATTACAGTCAAATCCCTTCTaGC 117
F- primer ATACCAAATGCATGGAGAGCTCC 118
Rl -primer ATATTGAACGTAGGTGCGATAAATAtTA 119
C152T R2- primer TTGAACGTAGGTGCGATAAATAcTG 120
F- primer ATAAGACATCACGATGGATCACAGG 121
Rl -primer atGTTAGTCCTTGCTATATTATGCTTtGC 122
G1811A R2- primer TAtaGGTTAGTCCTTGCTATATTATGCTaGGT 123
F- primer ACCTTACTACCAGACAACCTTAGCC 124
Rl -primer CTGCAAAGATGGTAGAGTAGAcGAT 125
A4491G R2- primer aTtCCTGCAAAGATGGTAGAGTAGATtAC 126
F- primer ACCCCATCCTAAAGTAAGGTCAGC 127
Rl -primer aCCCAGAGGTTACCCAAGtCG 128
G4833A R2- primer tAtaCCCAGAGGTTACCCAAtGCA 129
F- primer TATGTTAGGGTTGTACGGTAGAACTG 130
Rl -primer GGGTGGGTTTTGTATGTTCAtAC 131
G5417A
R2- primer tataGGTGGGTTTTGTATGTTCtAAT 132
Rl -primer aGCGATGAGTGTGGGGAGcAG 133
C5442T R2- primer AtaGtGATGAGTGTGGGGAcGAA 134
F- primer GCACCTGAAACAAGCTAACATGA 135
Rl -primer GAAGTAGCGTCTTGTAGACCTACTaGT 136
G7600A R2- primer GTAGCGTCTTGTAGACCTACTgGC 137
F- primer GTAGAAGAACCCTCCATAAACCTG 138
Rl -primer tACCCAACAATGACTAATCAAACTcAC 139
C8684T R2- primer CCAACAATGACTAATCAAACgAAT 140
F- primer CATTTTTAATCTTAGAGCGAAAGCC 141
C8964T Rl -primer aGGTTGAATGAGTAGGCTGtTG 142 R2- primer atTTGGTTGAATGAGTAGGCTtATA 143
F- primer TTTATTGCCACAACTAACCTCCTC 144
Rl -primer atAAAATCCTGCGAAGAAAAAcAC 145
G9477A
R2- primer atAGAAAAATCCTGCGAAGAAAAcAAT 146
Rl -primer aTGTTGGGGGCCAGTGaCCC 147
G9545A R2- primer ataaTaTTGGGGGCCAGTGtCCT 148
F- primer CAAAGCACATACCAAGGCCAC 149
Rl -primer GAGTGACTACAAAAAGGATTAGACTtG 150
G 10397 A R2- primer ataGAGTGACTACAAAAAGGATTAGACTcA 151
F- primer GAGAGTAGCTATAATGAACAGCGATAGT 152
Rl -primer atTCCTACTCCTCATTGTACCCATaCTA 153
G3348A R2- primer CCTACTCCTCATTGTACCCATTgTG 154
F- primer GGGGTTCATAGTAGAAGAGCGAT 155
Rl -primer TCCTGATCAAATATCACTCTCCTAaTC 156
C11944T R2- primer taTaCCTGATCAAATATCACTCTCCTcCTT 157
F- primer AGAATGGGGGATAGGTGTATGAAC 158
Rl -primer aGGGGTTTAGTATTGATTGTTcGC 159
G14569A R2- primer TATcGGGGTTTAGTATTGATTGTgAGT 160
F- primer CTAACCCCACTAAAACACTCACCA 161
Rl -primer TGCTACTTGTCCAATGATGGTAAtG 162
C15784T R2- primer atATGCTACTTGTCCAATGATGGTcAAA 163
F- primer GGCGACCCAGACAATTATACC 164
Rl -primer TGCTATGTACGGTAAATGGCTgC 165
G16316A R2- primer AtTGTGCTATGTACGGTAAATGGTTgT 166 A16319G R3 -primer taTGCTATGTACGATAAATGGTgTC 167
F- primer CCCCATGCTTACAAGCAAGTACA 168 由于每条引物效率之 l¾存在差异， 至使每条引物要达到同样的扩增峰值时在体系中的加 量不同， 各引物的合适工作浓度采用引物浓度梯度实验进行摸索， 最终获得了各引物的工作 浓度， 如表 3所示。
复合引物中每条引物的工作浓度是通过引物浓度梯度实验获得， 每条引物浓度从 Ο.ΟΙμ Μ至 0.2μ Μ做浓度梯度， 梯度间隔为 0.02μ Μ， 做单扩获得一个较大的引物浓度范围然后 组复扩引物复测试进一步微调引物浓度， 最重要的指标是不能出现非特异峰； 根据检测结果， 选择峰高 RFU在 2000〜2500之间的引物浓度作为优选。
表 3试剂盒各位点的引物的在扩增体系中的终浓度
SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID
浓度 (； μΜ) 浓度 (； μΜ) 浓度 (； μΜ) 浓度 (μΜ) NO NO NO NO
1 0.20 43 0.41 85 0.44 127 0.05
2 0.34 44 0.32 86 0.08 128 0.33
3 0.23 45 0.09 87 0.07 129 0.16
4 0.25 46 0.26 88 0.22 130 0.23
5 0.11 47 0.12 89 0.42 131 0.15
6 0.43 48 0.31 90 0.36 132 0.48
7 0.22 49 0.22 91 0.36 133 0.48
8 0.14 50 0.25 92 0.27 134 0.50
9 0.43 51 0.08 93 0.14 135 0.21
10 0.23 52 0.31 94 0.26 136 0.09
11 0.36 53 0.18 95 0.30 137 0.15
12 0.10 54 0.42 96 0.06 138 0.43 13 0.44 55 0.08 97 0.12 139 0.31
14 0.30 56 0.31 98 0.04 140 0.34
15 0.40 57 0.24 99 0.41 141 0.23
16 0.38 58 0.30 100 0.24 142 0.04
17 0.44 59 0.11 101 0.05 143 0.41
18 0.17 60 0.06 102 0.44 144 0.21
19 0.08 61 0.38 103 0.08 145 0.05
20 0.38 62 0.34 104 0.11 146 0.07
21 0.08 63 0.08 105 0.19 147 0.40
22 0.47 64 0.15 106 0.62 148 0.11
23 0.45 65 0.35 107 0.44 149 0.32
24 0.19 66 0.13 108 0.14 150 0.15
25 0.12 67 0.24 109 0.37 151 0.50
26 0.31 68 0.23 110 0.30 152 0.06
27 0.21 69 0.06 111 0.13 153 0.21
28 0.27 70 0.09 112 0.48 154 0.08
29 0.25 71 0.16 113 0.04 155 0.40
30 0.36 72 0.41 114 0.28 156 0.12
31 0.06 73 0.05 115 0.07 157 0.40
32 0.08 74 0.37 116 0.15 158 0.07
33 0.25 75 0.39 117 0.12 159 0.07
34 0.21 76 0.38 118 0.16 160 0.45
35 0.38 77 0.04 119 0.36 161 0.14
36 0.10 78 0.15 120 0.08 162 0.19
37 0.08 79 0.34 121 0.39 163 0.53
38 0.26 80 0.17 122 0.33 164 0.17
39 0.40 81 0.09 123 0.24 165 0.44
40 0.21 82 0.11 124 0.44 166 0.18
41 0.29 83 0.37 125 0.35 167 0.29
42 0.42 84 0.34 126 0.42 168 0.21
3、 荧光标记复合扩增体系的 SNP组合方案设计
本发明提供的试剂盒中，每个 SNP位点的对应的上游引物 (F-primer)可以通过同位素、荧 光素进行标记，比较发现荧光素标记效果较好。对应的下游引物 (R-primer)是未被标记的引物。
本发明对荧光染料进行了鉴别、 遴选， 选用了蓝、 绿、 黑、 橙四种荧光标记物， 构建了 四色荧光组合方案。
在确定 4色荧光组合方案的基础上， 通过大量反复实验， 遵循引物效率高的使用荧光效 率低的荧光素标记如 TAMRA, 引物效率低的使用荧光效率高的荧光素标记如 FAM， 引物效 率持中的标记为 HEX的原则。 摸索出 61个 SNP位点组合方式以及各位点的荧光标记类型， 将 61个 SNP位点分成 3组， 分子量内标用橙色的荧光染料 SIZ进行标记。 最终确定的荧光 染料标记的组合为： 其中 G10398A、 Norm9bpDel、 C10873T、 A3010G、 A709G、 C7196A、 C12705T、 C3970T、 G13104A、 G10310A、 C5178A、 G13928C、 G6446A、 C8414T、 C8794T、 C8793T、 C16126T、 G16129A、 A15043G、 C16311T这 20个位点的 F-primer是由 FAM标记。 A8701G、 A8697G、 C4883T、 C10400T、 （CA)n、 G1719A、 C14668T、 C12811T、 C,T9824A、 C9698T、 A9123G、 C7028T、 G11719A、 G8584A、 A11251G、 G8020A、 G5460A、 G2706A、 C11215T、 T4216C、 G12372A、 C16362T、 C1541T这 23个位点的 F-primer是由 HEX标记。 C8684T、 G9477A、 A4491G、 G1811A、 G16316A、 A16319G、 G9545A、 C11944T、 C152T、 G14569A、 C8964T、 G10397A、 G3348A、 G4833A、 G7600A、 G5417A、 C5442T、 C15784T 这 18个位点的 F-primer是由 TAMRA标记。 按此分组方式一方面可以尽可能多的排布位点， 覆盖更多的单倍型类群； 另一方面能够使得因引物之间相互作用而产生的非目的条带在软件 监测范围之外， 在实际使用中， 将 FAM色标记的引物及其对应非标引物配制为 FAM色复合 引物； 同理配制 HEX色复合引物和 TAMRA色复合引物。 内标选用橙色荧光标记， 荧光标记 物为 SIZ (制备方法参照专利 CN101307226中披露的本公司自主研发的 siz500荧光标记内标， 总共 13条荧光标记片段： 75bp、 100bp、 139bp、 150bp、 160bp、 200bp、 250bp、 300bp、 340bp、 350bp、 400bp、 450bp、 500bp)。 这种 SNP位点组合方式使得仅需标记 4种荧光就可实现这 61个 SNP位点同时检测分析。 四色排布图见图 1。
试剂盒中还包括有两套阳性对照， 一套是 9947A, 另一套是与 9947A各位点分型互补的 人工改造的 DNA序列， 阳性对照作为每次实验的阳性质控品， 用于监控 PCR扩增体系的正 确性， 排除假阴性； 阴性对照用于控制配制体系过程的污染情况， 排除假阳性。 与 9947A分 型互补的人工序列制备方法如下： 先后采用定点突变、 融合 PCR和克隆技术获得， 首先根据 9947A 的各位点等位基因信息， 设计出各位点另一个等位基因的定点突变引物， 将突变点置 于引物中间， 引物 TM值约 78°C且上下游引物刚好反向互补， 这样扩增出各个片段由于含有 互补序列， 可直接用于下一步融合扩增获得各个片段的融合产物， 将融合产物经克隆至 PMD18-T转入 DH5a 中保存， 提取质粒即为标准品。
本发明的试剂盒中的引物经过严格设计和验证， 具有高度的扩增特异性和种属特异性。 3、 扩增及产物检测
( 1 )首先在冰上完成除模板外的 PCR反应体系的配制， 最后加入模板， 模板加入顺序先 待检样本后阳性对照和阴性对照， 本实施例试剂盒中的 Taq 酶是采用专利公开号 CN101050453中披露的热启动耐高温酶； 提取线粒体 DNA模板时， 最好要将提取的 DNA稀 释 50〜100倍， 实际操作中， 一般可以取 1〜2μ1的 mt DNA模板进行扩增。 具体加量如表 4 所示。
表 4试剂盒扩增体系
Figure imgf000014_0001
反应混合物 （含 2.5xPCR 缓冲液、 MgCl2
10.0 μΐ
1.2-3.0 mM和 dNTPs 200 μΜ)
复合引物 5.0 μL 热启动 Taq酶 （5U/ ^iL) 0.8- 1.0 μL 超纯水 补足至 25.0μΙ^
(2) 上述体系配制后瞬时离心， 置于热循环仪上， 照表 5所示的程序进行扩增。
表 5 线粒体 SNP检测试剂盒扩增扩增程序
Figure imgf000015_0001
(3 ) 扩增产物检测及结果分析
采用 DNA变性剂去离子甲酰胺与试剂盒配套的分子量内标（AGCU Marker SIZ-500)按 体积比为 12: 0.5混合组成上样混合液。 将 12.5μί上样混合液与 Ιμί扩增产物和试剂盒配套 的等位基因分析标准物混合， 混匀后瞬时离心去除气泡。 98°C变性 5 min后立即冰上放置 3 min， 用遗传分析仪 ABI 3100进行电泳检测， GeneMapperlD v3.2软件对结果进行分析。
对标准品 9947A和经人工改造与 9947A分型互补的 DNA模板分别进行扩增的结果如图 5a和图 5b所示， 可以看出各个位点之间的扩增产物峰明显， 无其它非特异性扩增产物出现。
在图 5a中， 第一行的各个检测出的位点是：
10398、 9bp、 10873、 3010、 709、 7196、 12705、 3970、 13104、 10310、 5178、 13928、 6446、 8414、 8794、 15043、 16311、 (16126和 16129)。
第二行的各个检测出的位点是：
8701、 4883、 10400、 （CA)n、 1719、 14668、 12811、 9824、 9123、 7028、 11719、 8584、 11251、 8020、 5460、 2706、 11215、 4216、 12372、 16362、 9698、 1541。
第三行的各个检测出的位点是：
8684、 9477、 4491、 1811、 (16316和 16319)、 9545、 11944、 152、 14569、 8964、 10397、 3348、 4833、 7600、 5417、 5442、 15784。
实施例 2本发明线粒体 SNP检测试剂盒的准确性验证和大样本测试
采用实施例 1中的引物、 分组荧光标记以及扩增体系和参数， 进行大样本线粒体 SNP检 测， 共随机选取 200个汉族和 200个维吾尔族人群样本， 样本经过提取后用试剂盒进行扩增， 经电泳检测结果显示： 汉族主要分型结果 D4*， B5, D5a,禾卩 D4b2分别占 7%, 6.5%, 4.5%,和 4.5%, 同样在维吾尔族人群中 D4*， T, 和 W分别占 7.5%, 7%, 和 6%。 汉族作为古老的华夏 族的后代， 它的扩散分布符合德米奇扩散模型。 在人口爆发时期， 它与多个民族之间存在基 因交流；对于维吾尔族而言，它们的分型至少有 12个单倍型是和欧洲人和其他人种所共有的， 这显示出维吾尔族拥有欧洲人和东亚人混合血统。 400份样本共分成了 106种单倍型， 分辨 力达到了 98.6%。 为了验证试剂盒的准确性， 每个位点随机挑选三个样本使用 AB 公司的 BigDye测序试剂盒直接测序， 结果显示二者完全一致， 充分证明了该试剂盒的准确性， 能够 用于 mtDNA SNP检测分析。 实施例 3本发明所提供试剂盒对 mtDNA SNP位点异质性的检测
mtDNA异质性的存在， 给法医学的同一母系鉴定带来了不确定性， 应在实际案件中进行 相应的评价。 国际法医遗传学会 ( International Society for Forensic Genetics , ISFG )规定， 如 果遇到两个样本出现一个碱基不同， 而且这个碱基位置被公认是异质性热点， 则不能排除； 当遇到两个碱基位置不同时， 如果两个位置都是异质性热点， 则不能排除， 否则不能判断； 当出现三个位置不同时， 可以做出排除结论。 本发明所提供试剂盒， 不仅可以实现一般 SNP 位点的检测， 而且当位点存在异质性时仍能够成功检测。 在实际样本检测中， 发现维吾尔族 200份样本中某些样本 16319位点存在异质性， 并采用直接测序方法验证， 二者结果一致， 试剂盒检测电泳图谱和测序图谱见附图 3， 其中 3a为异质性位点试剂盒检测图谱， 3b为异质 性位点测序图谱。 实施例 4本发明所提供试剂盒在母系关系鉴定中的应用
本发明所提供的试剂盒在一例疑似姐妹的关系鉴定案件中起到了辅助作用， 从母系遗传 角度提高了本例母系关系鉴定案件的可信度。
1、 测定步骤如下：
( 1 ) 收集待鉴定案件中的头发样本： 姐妹关系鉴定样本由某法庭科学实验室提供。
( 2) 检材线粒体 DNA提取： 采取 DTT消化结合 Chelex法提取。
( 3 ) 扩增检测： 按照实施例 1中试剂盒实施步骤进行线粒体 DNA的 SNP检测， sister I 的分型结果见图 4a， sister II的分型结果见图 4b， 其对比结果见下表 6， 不同的位点由粗斜体 显示出来。
表 6 sister I和 sister II的线粒体 61个位点基因分型
Figure imgf000016_0001
10873 C C 11251 A A
3010 G G 8020 G G
709 A G 5460 G G
7196 C A 2706 G G
12705 T T 11215 C C
3970 c c 4216 T T
13104 A A 12372 G G
10310 G G 16362 C T
5178 C C 9698 T T
13928 G G 1541 T T
6446 G G 8684 c C
8414 C C 9477 G G
8794 C C 4491 G G
15043 A A 1811 A A
16311 T T 16316 A A
16126 T T 16319 G G
16129 G G 9545 A G
8701 G G 11944 T T
4883 C C 152 T T
10400 T T 14569 A G
CA 5 5 8964 C C
1719 G G 10397 A A
14668 C C 3348 A A
12811 T T 4833 G A
9824 T T 7600 G G
9123 G G 5417 G G
7028 T T 5442 T T
15784 T T
结果显示： sister I和 sister II的线粒体 SNP的检测结果 61个位点有 7个不同， 根据线粒 体系统发育树进行单倍型分析显示 sister I为 G型， sister II为 C型， 结合这两点足可以排除 他们来自同一个母系家族的可能。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。 应当指出， 对于本技 术领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以对本发明进行若干改进 和修饰， 这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。 对所公开的实施例的上述说 明， 使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。 对这些实施例的多种修改对本领域的专 业技术人员来说将是显而易见的， 本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范 围的情况下， 在其它实施例中实现。 因此， 本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中， 而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。

Claims

权利要求书
1. 一种线粒体 SNP荧光标记复合扩增试剂盒， 其特征在于： 包括有用于扩增如下 61个 SNP 位点的引物： G10398A、 Norm9bpDeK C10873T、 A3010G、 A709G、 C7196A、 C12705T、 C3970T、 G13104A、 G10310A、 C5178A、 G13928C、 G6446A、 C8414T、 C8794T、 C8793T、 C16126T、 G16129A、 A15043G、 C16311T、 A8701G、 A8697G、 C4883T、 C10400T、（CA)n、 G1719A、 C14668T、 C12811T、 C,T9824A、 C9698T、 A9123G、 C7028T、 G11719A、 G8584A、 A11251G、 G8020A、 G5460A、 G2706A、 C11215T、 T4216C、 G12372A、 C16362T、 C1541T、 C8684T、 G9477A、 A4491G、 G1811A、 G16316A、 A16319G、 G9545A、 C11944T、 C152T、 G14569A、 C8964T、 G10397A、 G3348A、 G4833A、 G7600A、 G5417A、 C5442T、 C15784T。
2. 根据权利要求 1所述的线粒体 SNP荧光标记复合扩增试剂盒， 其特征在于， 所述的引物 是： A709G, SEQ ID NO.1-3; A3010G, SEQ ID NO.4-6; C5178A, SEQ ID NO.7-9; Norm9bpDel, SEQ ID NO.10-11; G10398A, SEQ ID NO.12-14; C10873T, SEQ ID NO.15-17; C12705T, SEQ ID NO.18-20; G13928C, SEQ ID NO.21-23; C16311T, SEQ ID NO.24-26; A15043G, SEQ ID NO.27-29; C3970T, SEQ ID NO.30-32; C8414T, SEQ ID NO.33-35; G6446A, SEQ ID NO.36-38; C7196A, SEQ ID NO.39-41; G10310A, SEQ ID NO.42-44; G13104A, SEQ ID NO.45-47; C8793T和 C8794T, SEQ ID NO.48-51; C16126T和 G16129A, SEQ ID NO.52-55; C4883T, SEQ ID NO.56-58; C10400T, SEQ ID NO.59-61; (CA)n, SEQ ID NO.62-63; G11719A, SEQ ID NO.64-66; G1719A和 C1541T, SEQ ID NO.67-71; G8584A和 A8701G 禾卩 A8697G, SEQ ID NO.72-77; A9123G, SEQ ID NO.78-80; C7028T, SEQ ID NO.81-83; C14668T, SEQ ID NO.84-86; G2706A, SEQ ID NO.87-89; G12372A, SEQ ID NO.90-92; T4216C, SEQ ID NO.93-95; A11251G和 C11215T, SEQ ID NO.96-100; G5460A, SEQ ID NO.101-103; C12811T, SEQ ID NO.104-106; G8020A, SEQ ID NO.107-109; CT9824A, SEQ ID NO.110-112; C9698T, SEQ ID NO.113-115; C16362T, SEQ ID NO.116-118; C152T, SEQ ID NO.119-121; G1811A, SEQ ID NO.122- 124; A4491G, SEQ ID NO.125-127; G4833A, SEQ ID NO.128-130; G5417A 禾卩 C5442T, SEQ ID NO.131-135; G7600A, SEQ ID NO.136-138; C8684T, SEQ ID NO.139-141; C8964T, SEQ ID NO.142-144; G9477A和 G9545A, SEQ ID NO.145-149; G10397A, SEQ ID NO.150-152; G3348A, SEQ ID NO.153-155; C11944T, SEQ ID NO.156-158; G14569A, SEQ ID NO.159-161; C15784T, SEQ ID NO.162-164; G16316A和 A16319G, SEQ ID NO.165-168。
3. 根据权利要求 1所述的线粒体 SNP荧光标记复合扩增试剂盒， 其特征在于， 所述的引物 是分组标记的， G10398A、 Norm9bpDeK C10873T、 A3010G、 A709G、 C7196A、 C12705T、 C3970T、 G13104A、 G10310A、 C5178A、 G13928C、 G6446A、 C8414T、 C8794T、 C8793T、 C16126T、 G16129A、 A15043G、 C16311T位点对应的引物为第一组； A8701G、 A8697G、 C4883T、 C10400T、（CA)n、 G1719A、 C14668T、 C12811T、 C,T9824A、 C9698T、 A9123G、 C7028T、 G11719A、 G8584A、 A11251G、 G8020A、 G5460A、 G2706A、 C11215T、 T4216C、 G12372A、 C16362T、 C1541T位点对应的引物为第二组； C8684T、 G9477A、 A4491G、 G1811A、 G16316A、 A16319G、 G9545A、 C11944T、 C152T、 G14569A、 C8964T、 G10397A、 G3348A、 G4833A、 G7600A、 G5417A、 C5442T、 C15784T位点对应的引物为第三组。
4. 根据权利要求 1所述的线粒体 SNP荧光标记复合扩增试剂盒， 其特征在于， 所述的引物 中的正向引物是荧光标记的。
5. 根据权利要求 1所述的线粒体 SNP荧光标记复合扩增试剂盒， 其特征在于， 引物中第一 组的正向引物是由 FAM标记的；第二组的正向引物是由 HEX标记；第三组的正向引物是 由 TAMRA标记。
6. 根据权利要求 1所述的线粒体 SNP荧光标记复合扩增试剂盒， 其特征在于， 引物的在扩 增体系中的终浓度是:
SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID
浓度 (； μΜ) 浓度 (； μΜ) 浓度 (； μΜ) 浓度 (； μΜ) NO NO NO NO
1 0.20 43 0.41 85 0.44 127 0.05
2 0.34 44 0.32 86 0.08 128 0.33
3 0.23 45 0.09 87 0.07 129 0.16
4 0.25 46 0.26 88 0.22 130 0.23
5 0.11 47 0.12 89 0.42 131 0.15
6 0.43 48 0.31 90 0.36 132 0.48
7 0.22 49 0.22 91 0.36 133 0.48
8 0.14 50 0.25 92 0.27 134 0.50
9 0.43 51 0.08 93 0.14 135 0.21
10 0.23 52 0.31 94 0.26 136 0.09
11 0.36 53 0.18 95 0.30 137 0.15
12 0.10 54 0.42 96 0.06 138 0.43
13 0.44 55 0.08 97 0.12 139 0.31
14 0.30 56 0.31 98 0.04 140 0.34
15 0.40 57 0.24 99 0.41 141 0.23
16 0.38 58 0.30 100 0.24 142 0.04
17 0.44 59 0.11 101 0.05 143 0.41
18 0.17 60 0.06 102 0.44 144 0.21
19 0.08 61 0.38 103 0.08 145 0.05
20 0.38 62 0.34 104 0.11 146 0.07
21 0.08 63 0.08 105 0.19 147 0.40
22 0.47 64 0.15 106 0.62 148 0.11
23 0.45 65 0.35 107 0.44 149 0.32
24 0.19 66 0.13 108 0.14 150 0.15
25 0.12 67 0.24 109 0.37 151 0.50
26 0.31 68 0.23 110 0.30 152 0.06
27 0.21 69 0.06 111 0.13 153 0.21
28 0.27 70 0.09 112 0.48 154 0.08
29 0.25 71 0.16 113 0.04 155 0.40
30 0.36 72 0.41 114 0.28 156 0.12
31 0.06 73 0.05 115 0.07 157 0.40
32 0.08 74 0.37 116 0.15 158 0.07
33 0.25 75 0.39 117 0.12 159 0.07
34 0.21 76 0.38 118 0.16 160 0.45
35 0.38 77 0.04 119 0.36 161 0.14
36 0.10 78 0.15 120 0.08 162 0.19
37 0.08 79 0.34 121 0.39 163 0.53
38 0.26 80 0.17 122 0.33 164 0.17
39 0.40 81 0.09 123 0.24 165 0.44
40 0.21 82 0.11 124 0.44 166 0.18
41 0.29 83 0.37 125 0.35 167 0.29
42 0.42 84 0.34 126 0.42 168 0.21
7. —种线粒体 SNP荧光标记复合扩增试剂盒的使用方法， 其特征在于， 包括如下步骤： S 1 : 从生物检材提取线粒体 DNA， 作为 mt DNA模板；
S2: 配制 PCR反应液， 加入反应缓冲液、 Taq酶、 复合引物、 水， DNA模板， 采用三步 扩增法， 对样本进行扩增；
S3： 对扩增产物进行电泳， 软件分析电泳结果并进行单倍型类群分型。
8. 根据权利要求 7所述的线粒体 SNP荧光标记复合扩增试剂盒的使用方法， 其特征在于， 所述的生物检材可以是毛发、 烟蒂、 牙齿、 脱落细胞、 骨骼、 血液、 精斑、 唾液。
9. 根据权利要求 7所述的线粒体 SNP荧光标记复合扩增试剂盒的使用方法， 其特征在于： PCR扩增中的程序是： （1 )初始变性、 95 °C 3min; (2) 热循环、 94 °C 30s, 共 10循环； 60 °C 45s ; 72 °C lmin; 94 °C 30s, 共 20循环； 58 °C 45s; 72 °C lmin; ( 3 )终延伸、 72°C lOmin; ( 4 ) 保温、 4°C。
10.权利要求 1所述的线粒体 SNP荧光标记复合扩增试剂盒在案件排査、 亲子鉴定及尸源认 定中的应用。
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