CN103352080B - 一种遗传性耳聋基因检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可以同时检测17个非综合征遗传性耳聋易感基因荧光检测试剂盒，该试剂盒采用17对特异性引物对聋病易感基因进行基因分型，可在3小时内单管同时检测中国人最常见的四个耳聋相关基因中的17个热点突变。所述试剂盒包括GJB2（CX26）基因、SLC26A4（PDS）基因、GJB3基因和12SrRNA（MTRNR1）基因上17个遗传性耳聋的多态性位点的引物组合物，可用于准确判断17位点的野生型、纯合突变型或者杂合型，实现耳聋基因诊断和筛查。应用本发明的试剂盒可以快速高效检测耳聋基因，是一种快速、简便、经济、高效的耳聋致病基因筛查试剂盒。
Description
技术领域
本发明属于生物体外诊断技术领域，集中体现的是检测第三代遗传标记多态性位点（单核苷酸多态性，single nucleotide polymorphism）ARMS-PCR方法（Amplification RegractoryMutation System，ARMS）和荧光检测技术的结合应用，主要涉及一种对非综合征遗传性耳聋基因的多态性位点荧光标记复合扩增系统。
背景技术
目前，临床上用于耳聋基因检测的试剂盒都是基因芯片方法和PCR测序法，但遗传性耳聋基因检测试剂盒采用的ARMS-PCR和荧光凝胶电泳技术结合方法与芯片技术相比，具有检测位点数量多、灵敏性高、稳定性好、经济高效、耗时短和通量高等优点，其应用于临床耳聋基因筛查的优越性明显，如用于孕前预防、孕期干预和产后筛查等。耳聋是世界范围内最常见的感觉障碍性疾病之一，先天性耳聋可引发言语障碍。据第二次全国残疾人抽样调查显示，我国听力残疾人数约2004万人，占残疾人总数的24.16%；耳聋导致的言语残疾约127万人，占残疾人总数的1.53%。先天性耳聋在新生儿中的发病率约为1/1000，其中一半以上的先天性耳聋与遗传基因有关。直到1993年Prezant等首次发现线粒体12S rRNA Al555G突变与非综合征型耳聋有关，科学家们才开始对耳聋相关基因展开迅速的研究，至1995年第一个引起NSHI的核基因POU3F4被鉴定。随着人类基因组计划的完成及后基因组计划的实施和分子生物学技术的发展，与耳聋相关的基因不断被定位和发现，目前已经确定140余个基因与非综合征型耳聋相关，其中包括DFNA位点52个、DFNB位点79个、DFN位点5个、DFNY位点1个；克隆致病基因58个：其中DFNA相关基因24个、DFNB相关基因40个、DFN相关基因2个、另外2个线粒体基因与非综合征型耳聋相关。这就给非综合征型耳聋基因检测提供了有力的数据支持。
结合ARMS-PCR和荧光凝胶电泳技术的诸多检测优势，希望建立复合荧光检测遗传性耳聋基因筛查系统，具有广阔的应用前景。目前临床上对耳聋基因的检测主要集中在基因DNA分子水平，具有很高的特异识别能力。近年来，随着研究人员对耳聋致病基因的深入研究发现，增加耳聋基因的特异性突变位点，扩大耳聋基因的检测范围，能大大提高耳聋基因的检测筛查能力。目前检测耳聋基因DNA的方法主要基于芯片技术和测序技术，存在操作复杂，耗时长，成本高及对操作人员要求高等不足，因此本发明在GJB2、GJB3、SLC26A4和线粒体基因上同时挑选一些在中国地区热点突变的多态性位点位点，构成复合扩增检测系统，具有操作简便和实用性强，且快速、耗时短、经济高效、直观等优点。
耳聋基因DNA检测的专利几乎集中在GJB2和线粒体基因上的热点突变上，但总体涉及的特异性位点较少，当前国家认证的《一种检测遗传性耳聋的试剂盒》采用的是基因芯片的方法。本发明采用的是荧光标记引物和ARMS-PCR的方法，从全新的角度对耳聋基因DNA进行发明，使耳聋基因检测识别能力大大提高。
为了提高鉴别能力，申请人对全国各地区的人耳聋基因热点突变位点的遗传多态性进行了深入的调查，选择了多态性位点较高的16个多态性位点位点和1个欧洲热点突变位点构成一个PCR多重复合扩增系统，并以此为依据开发了遗传性耳聋基因检测试剂盒，此种试剂盒目前全球未见报道与使用，因此是本领域人员一直期望解决的问题，具有广阔的应用前景。
发明内容
针对以上芯片技术和测序技术存在的问题，本发明的目的在于：提供一种遗传性耳聋基因检测试剂盒，该试剂盒可以孕前预防、孕期干预、产后筛查及用药指导中的应用。具体的技术方案是：
一种遗传性耳聋基因检测试剂盒及应用，其特征在于：包括有如下17个多态性位点的引物：35delG，G1975C，GIVS15+5A，T2027A，299-300delAT，167delT，176-191del16，235delC，C538T，T707C，AIVS7-2G，C1229T，G1226A，A1174T，A2168G，C1494T，A1555G。
更进一步地，试剂盒可以包括有如下表1中17个多态性位点位点的引物：
表1各位点引物序列
以上引物中，除了176-191del16位点之外，每个位点都包括有两条等位基因特异性非标记引物，分别用于扩增野生型和突变型碱基序列，另外还有一条反向引物，用于和等位基因特异性非标记引物形成配对，使目标碱基序列能够得到扩增。表1中，“W”编号指等位基因特异性引物扩增时具体位点的野生型，“M”编号指等位基因特异性引物扩增时具体位点的突变型。
所述的17个多态性位点位点的引物分为十组，第一组：35delG、167delT、235delC；第二组：GIVS15+5A；第三组：G1975C、T2027A；第四组：299-300delAT、176-191del16；第五组：C538T；第六组：T707C；第七组：AIVS7-2G；第八组：C1229T、G1226A、A1174T；第九组：A2168G；第十组：C1494T、A1555G。每一组都只使用同一个反向引物，例如：35delG、167delT、235delC这三个位点是共用同一个GJ2F-primer反向引物。如果是一个位点单独在一组，那么该位点的引物中就是独立使用一个反向引物，例如：T707C位点。这样做的好处是：当检测的SNP位点之间距离较小时，共用一个反向引物可以减少复合扩增体系的复杂程度，避免非特异扩增的可能性，提高扩增准确性，同时降低生产成本。
上述的引物中，反向引物最好是经过标记的，就可以用来对引物的扩增产物进行检测，标记的方式较多，可以采用化学，放射性，荧光，发光和荧光共振能量转移的标记等，最好是采用荧光标记。
使用荧光标记时，如表1，“F”编号指5’-末端荧光素标记的引物，“GJ2F、SLCF、SLC-H、12S和rGJF”指5’-末端荧光素标记的共同的反向引物，标记引物与野生型和突变型引物配对来扩增包含多态性位点的靶等位基因，即可单管可同时检测野生型或突变型等位基因。为提高检测特异性，人工错配（序列下划线部分）被引入到等位基因特异性引物中。
突变位点“35delG”指的是GJB2基因编码区自5’-末端第35位核苷酸G的缺失，没有缺失的为野生型，缺失的为突变型；突变位点“167delT”指的是GJB2基因编码区自5’-末端第167位核苷酸T的缺失，没有缺失的为野生型，缺失的为突变型；突变位点“176-191del16”指的是GJB2基因编码区自5’-末端第176位核苷酸到191位核苷酸连续16个碱基的缺失，没有缺失的为野生型，缺失的为突变型；突变位点“235delC”指的是GJB2基因编码区自5’-末端第235位核苷酸C的缺失，没有缺失的为野生型，缺失的为突变型；突变位点“299-300delAT”指的是GJB2基因编码区自5’-末端第299位核苷酸到第300位核苷酸连续2个碱基的缺失，没有缺失的为野生型，缺失的为突变型；突变位点“GIVS15+5A”指的是SLC26A4基因编码区自5’-末端第1803位核苷酸相邻的第15内含子内自5’末端开始第5个核苷酸由G突变为A，该核苷酸为G的是野生型，为A的是突变型；突变位点“G1975C”指的是SLC26A4基因编码区自5’-末端第1975位核苷酸由G突变为C，该核苷酸为G的是野生型，为C的是突变型；突变位点“T2027A”指的是SLC26A4基因编码区自5’-末端第2027位核苷酸由T突变为A，该核苷酸为T的是野生型，为A的是突变型；突变位点“C538T指的是GJB3基因编码区自5’-末端第538位核苷酸由C突变为T，该核苷酸为C的是野生型，为T的是突变型；突变位点“T707C”指的是SLC26A4基因编码区自5’-末端第707位核苷酸由T突变为C，该核苷酸为T的是野生型，为C的是突变型；突变位点“AIVS7-2G”指的是SLC26A4基因编码区自5’-末端第919位核苷酸相邻的第7内含子内自3’末端开始第二个核苷酸由A突变为G，该核苷酸为A的是野生型，为G的是突变型；突变位点“C1229T”指的是SLC26A4基因编码区自5’-末端第1229位核苷酸由C突变为T，该核苷酸为C的是野生型，为T的是突变型；突变位点“G1226A”指的是SLC26A4基因编码区自5’-末端第1226位核苷酸由G突变为A，该核苷酸为G的是野生型，为A的是突变型；突变位点“A1174T”指的是SLC26A4基因编码区自5’-末端第1174位核苷酸由A突变为T，该核苷酸为A的是野生型，为T的是突变型；突变位点“A2168G”指的是SLC26A4基因编码区自5’-末端第2168位核苷酸由A突变为G，该核苷酸为A的是野生型，为G的是突变型；突变位点“C1494T”指的是线粒体基因12S rRNA上第1494位核苷酸由C突变为T，该核苷酸为C的是野生型，为T的是突变型；突变位点“A1555G”指的是线粒体基因12S rRNA上第1555位核苷酸由A突变为G，该核苷酸为A的是野生型，为G的是突变型。
上述的多态性位点位点中，除了176-191del16位点之外，都包括有一条标记引物和两条非标记引物。每两条非标记引物与标记引物配合，即可用来PCR扩增包含多态性位点的DNA片段。上述两条非标记引物的3’端最后一个碱基对野生型和突变型模板进行特异识别，为了进一步提高扩增特异性，在距3’端3～7个碱基处引入错配碱基，遵行以下原则：如果3’端是强错配（T-C、A-G配对），则引入弱错配（A-C、G-T配对）；如果3’端是中度错配（A-A、G-G、C-C、T-T配对），则引入中度错配；如果3’端是弱错配，则引入强错配。另外，为了提高野生型和突变型模板的识别度，其中的一条非标记引物5’末端增加3～4个碱基，通过长度多态性来区分野生型和突变型模板。表1中，两条非标记引物中R1检测野生型样本，R2则检测突变型样本。为了后续引物浓度的优化，在此设计的引物Tm值均在59～64℃之间。
正向引物是可以有修饰的，如肽核酸（Peptide Nucleic Acid，PNA）修饰、锁核酸(LockedNucleic Acid,LNA)修饰、小沟结合分子（Minor Groove Binder，MGB）修饰等各种应用于引物的修饰方式，以提高引物特异性，确保检测准确性。
由于176-191del16缺失位点的多态性表现为长度多态性，只需要分别设计一条正向引物和标记的反向引物，就可以根据产物大小不同加于区分。本发明的试剂盒中的引物经过严格设计和验证，具有高度的特异性。
对于标记引物，用于光学检测目的基因是否存在。经过大量试验，较为优选的标记物为荧光素，且标记方案是：其中35delG、G1975C、GIVS15+5A、T2027A、299-300delAT、167delT、176-191del16、235delC这8个位点的F-primer是由FAM标记；C538T、T707C、AIVS7-2G、C1229T、G1226A、A1174T、A2168G这7个位点的F-primer是由HEX标记；C1494T、A1555G这2个位点的F-primer是由ROX标记。之所以按此分组方式是GJB2、GJB3、SLC26A4本身基因特性决定，以及与模板中线粒体基因DNA的浓度不同决定。人类单个体细胞含有一拷贝的基因组DNA，但却含有上千个拷贝的线粒体基因组DNA，在PCR扩增时效果存在明显差异。本发明通过合理分组能够使得因引物之间相互作用产生的非特异条带不在监测范围内，及避免因模板浓度不同造成线粒体基因荧光信号超过检测范围。通过大量试验后，确定了三组的分组标记方案，实现了尽可能多的位点排布，直接提高了检测率。在实际检测中，还可以将用FAM色标记的引物配制为FAM色复合引物使用；将用HEX色标记的引物配制为HEX色复合引物使用；将用ROX色标记的引物配制为ROX色复合引物使用，这些荧光素可以互换，而且还可以用另外的荧光素，如TAMRA等，或者其它的荧光标记来代替，如化学，放射性，荧光，发光和荧光共振能量转移的标记等。
进一步地，引物浓度的设定原则是：引物合成后，各对引物工作浓度从0.01μM至0.2μM做浓度梯度实验，梯度间隔为0.02μM，以及引物退火温度梯度实验，梯度间隔为2℃，做单扩实验以比较不同引物浓度和不同退火温度的影响，最重要的指标是不能出现非特异峰；根据检测结果，选择峰高在2000～4000RFU之间的引物浓度和退火温度，用来配制成初始的FAM复合扩增引物、HEX复合扩增引物和ROX复合扩增引物。然后，在FAM组内、HEX组内和ROX组内进行引物浓度微调，以2000的产物峰高为标准，调整到合适的复扩引物浓度。作为优选，各引物的浓度如表2所示。
表2各位点的引物的优选浓度
试剂盒中还包括有聚合酶，只要聚合酶可以使目标碱基序列进行PCR扩增反应即可，包括DNA聚合酶，RNA聚合酶，具有多重活性聚合酶。聚合酶耐热或耐高温。另外，酶的混合物也可采用。这些酶包括：DNA聚合酶，比如DNA聚合酶I，Klenow片段，T4酶，T7酶，Tub酶，Taq酶，Tth酶，Pfx酶，Pfu酶，Tsp酶，Tfl酶，Tli酶，GB-DDNA聚合酶；RNA聚合酶，比如大肠杆菌，SP6，T3以及T7RNA聚合酶。这些酶都可以在市场上找到。多重活性聚合酶，包括RAV2酶和Tli(外切)聚合酶。耐热聚合酶，包括Tub酶，Taq酶，Tth酶，Pfx酶，Pfu酶，Tsp酶，Tfl酶，Tli酶和GB-DDNA聚合酶。
试剂盒中还包括有阳性对照(例如9948)和阴性对照(例如超纯水)，阳性对照作为每次实验的阳性质控品，用于监控PCR扩增体系的正确性和准确性，排除假阴性；阴性对照用于控制配制体系过程的污染情况，排除假阳性。
本发明还提供了上述试剂盒的使用方法，具体的技术方案是：
一种遗传性耳聋基因检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
S1：从生物检材中提取人基因组DNA，作为耳聋基因DNA模板；
S2：在耳聋基因DNA模板中加入反应混合物、Taq酶、标记引物、非标记引物、超纯水，采用三步扩增法，对待检测的多态性位点位点进行多重复合扩增；
S3：对扩增产物进行荧光凝胶电泳分析和基因分型。
上述步骤S1中，所述的生物检材可以包含有待检测DNA的血液、精斑、唾液、毛发、牙齿、脱落细胞、骨骼等；提取DNA的方法可以采用常规的磁珠法、Chelex-100提取法、硅膜法等。
上述步骤S2中，优选采用将引物混合物按35delG、G1975C、GIVS15+5A、T2027A、299-300delAT、167delT、176-191del16、235delC、C538T、T707C、AIVS7-2G、C1229T、G1226A、A1174T、A2168G、C1494T、A1555G混于一管中进行PCR扩增。
上述的步骤S3中，可以在管中加入去离子甲酰胺、分子量内标；内标的作用是用于电泳过程中的内标指示。还可以加入等位基因分型标准物，用来与未知样品比对确定野生型与突变型。
该试剂盒可多重单管进行，即多个不同的检测可以单管同时运行，使用不同的引物来针对不同的检测区域；这些检测区域可以是互不相关的靶标片段，来自不同的等位基因，不同的等位基因亚型，或者染色体重排。这意味着允许在一个样本(例如，cDNA文库中的特定基因)对多个靶标多核苷酸进行定量。通过一种独特的捕获序列或一个独特的标记，可以对样品中不同的多核苷酸产物进行区分。
有益效果
对于一些其它相关产品不包含的位点，如G1975C、GIVS15+5A、T2027A、C1229T、G1226A、A1174T、A2168G等，本试剂盒仍可以较好的进行检测，准确分型。因此，一个检测遗传性耳聋的试剂盒在临床上用途广泛，而且本试剂盒对多态性位点的检测片段大小控制在100-500bp以内，使得检测成功率大大提高。应用本发明的遗传性耳聋基因检测试剂盒进行非综合征型耳聋基因检测，较基因芯片方法和传统的测序方法成本低、操作简便、特异性强，可以在4小时内得出实验结果。因此可以在大规模孕前预防、孕期干预、产后筛查及用药指导中得到广泛应用。
附图说明
图1是遗传性耳聋基因多态性位点17个位点排布图及内标siz-500片段大小；
图2是多态性位点位点对应引物设计示意图；
图3是正常人样品扩增图谱；
图4是试剂盒扩增各个位点杂合突变和纯合突变的部分图谱；
其中，
图4a是919、1226两位点杂合突变样本扩增图谱；
图4b是1226、1229两位点杂合突变样本扩增图谱；
图4c是919、299、235三位点杂合样本扩增图谱；
图4d是1229、2168两位点杂合样本扩增图谱；
图4e是1555位点纯合突变样本扩增图谱；
图5是试剂盒灵敏性扩增图谱；
图6是等位基因分型标准物图谱；
图7是对照例1所得的样品扩增图谱；
图8是对照例2所得的样品扩增图谱。
具体实施方式
实施例1
1、多态性位点位点的确定
本发明选择的多态性位点位点均具有很高的多态性信息含量，包含中国人群中耳聋基因热点突变位点，整体上使单倍型多样性大大提升。通过大规模的测序筛查，入选本发明的17个位点见表3。通过对耳聋致病基因在中国人群中的多态性调查和文献调研、数据库分析，最后确定共17个遗传性耳聋突变位点，其中235delC、299-300delAT、176-191del16、AIVS7-2G和A1555G为中国耳聋人群中热点突变位点。保证人类遗传性耳聋基因DNA检验系统的鉴别能力。
表3本发明涉及的所有17个多态性位点
| 位点 | 等位基因 | rCRS | 位点 | 等位基因 | rCRS |
| 35delG | G | Del | T707C | T | C |
| G1975C | G | C | AIVS7-2G | A | G |
| GIVS15+5A | G | A | C1229T | C | T |
| T2027A | T | A | G1226A | G | A |
| 299-300delAT | AT | Del | A1174T | A | T |
| 167delT | T | Del | A2168G | A | G |
| 176-191del16 | Norm | Del | C1494T | C | T |
| 235delC | C | Del | A1555G | A | G |
| C538T | C | T |
注：Norm指序列长度正常的等位基因，Del指缺失碱基的等位基因。
2、荧光标记复合扩增体系的多态性位点组合方案设计
本发明对荧光染料进行了鉴别、遴选，选用了蓝、绿、红、橙四种荧光标记物，构建了四色荧光组合方案。
在确定四色荧光组合方案的基础上，通过大量反复实验，摸索出多态性位点位点组合方式以及荧光标记类型。结合生产成本及荧光效率等因素，将17个多态性位点位点分成3组，使用FAM、HEX和ROX分组标记，分子量内标用橙色的荧光染料SIZ进行标记。经过筛选，最终确定一种优选的荧光染料标记的组合：35delG、G1975C、GIVS15+5A、T2027A、299-300delAT、167delT、176-191del16、235delC采用FAM标记；C538T、T707C、AIVS7-2G、C1229T、G1226A、A1174T、A2168G采用HEX标记；C1494T、A1555G采用ROX标记。按此种方式分组一方面可以排布下更多的位点，增加遗传性耳聋位点的多样性，提高识别率；另一方面能够使得因引物之间相互作用产生的非特异条带不在监测范围内，以及确保扩增峰值在检测范围内。内标选用橙色荧光标记，荧光标记物为SIZ(制备方法参照专利CN101307226中披露的本公司自主研发的siz500荧光标记内标，总共13条荧光标记片段：75bp、100bp、139bp、150bp、160bp、200bp、250bp、300bp、340bp、350bp、400bp、450bp、500bp)。这种多态性位点位点组合方式使得仅需标记四种荧光就可实现这17个多态性位点位点同时检测分析。四色排布图见图1。
3、17个多态性位点位点对应引物设计及其浓度的优化
如图2所示，每一个多态性位点位点是根据BCBI下载GJB2全长、GJB3全长、SLC26A4全长及线粒体基因全长（修正后的剑桥参考序列(revised Cambridge Reference Sequence,rCRS)NC_012920.1）进行设计，其中一条F-primer的5’端用相应的荧光素进行标记，另外两条非标记引物的3’端对突变碱基序列特异识别，而其中一条非标引物的5’端再加3～4个核苷酸，用于指示等位基因，引物的序列如表1所示。引物浓度如表2所示。
本发明的引物设计除遵循普通引物的设计原则外，同时为了增加两条非标记引物的特异性，在距引物3’端3～7个碱基处增加错配，引入错配的原则：若3’端为强错配（G-A，T-C）,则引入弱错配（G-T，A-C）；若3’端为中度错配（A-A，C-C，G-G，T-T），则引入中度错配；若3’端为弱错配，则引入强错配。17对引物均按此特定规则进行设计，为了后续引物浓度的优化，在此设计的引物Tm值均在59～64℃之间。
4、扩增及其产物检测的实验过程
（1）PCR反应体系，需在超净台内配制完成，阳性对照采用9948和阴性对照采用超纯水，本实施例试剂盒中的Taq酶是采用专利公开号CN101050453中披露的热启动耐高温酶。具体加量如表4所示。
表4反应体系
（2）上述体系配制后立即离心，置于热循环仪上，照如表5所示的程序进行扩增。
表5耳聋基因检测扩增程序表
（3）扩增产物在遗传分析仪上荧光检测
由去离子甲酰胺与试剂盒中分子量内标（AGCU Marker SIZ-500）组成上样混合物〔（0.5μLAGCU Marker SIZ-500）×（进样数）＋（12μL去离子甲酰胺）×（进样数）〕。将12.5μL上样混合物与1μL扩增产物和试剂盒中等位基因分析标准物混合，离心，避免产生气泡。95℃变性3分钟，冰浴3分钟，用遗传分析仪ABI3100检测分析。
对照例1
如图7所示。在位点的排布过程中，需要根据序列特征及位点距离合理安排。如果设置不当，安排的扩增序列中GC含量过高、容易形成二级结构或者容易产生非特异，则会影响检测效率。
其他引物及组分均保持不变，仅将GJB3基因上C538T位点所采用的荧光引物改为F:HEX-AGCTTGTTATTGCCTGGGTCTG，扩增产物大小变为260bp左右时，会在240bp位置出现非特异的扩增。
对照例2
如图8所示，运用ARMS方法检测SNP过程中，ARMS引物的特异性对检测结果的准确性尤为重要。为了提高准确性，我们通常采取的策略是在ARMS引物3’末端第3-5位人为引入错配。如果不引入错配，则容易出现分型错误的现象。
35、1975不人为引入错配的情况
其他引物和组分保持不变，仅对35delG和G1975C两个位点的ARMS引物进行修改，保持引物与序列完全配对（突变引物5’端外挂的碱基除外），进行扩增。
具体引物序列如下
35delG:
GJ2F-primer CCCTGTTCTGTCCTAGCTAGTGATT
W-primer GTGTTTGTTCACACCCCCCA
M-primer TGGAGTGTTTGTTCACACCCCCA
G1975C
SLCF-primer TTGAGCCTGATGAGGATATTGAAG
W-primer AAGATATAGCTCCACAGTCAAGCAC
M-primer AtatAAGATATAGCTCCACAGTCAAGCAG
扩增正常样本时，正确的分型应该是单一的峰型，但是如图8所示，不人为引入错配的ARMS引物进行扩增得到的结果为双扩增峰，即突变引物也参与PCR扩增获得部分产物，导致分型错误。
本发明所提供试剂盒在耳聋检测中的应用
本发明所提供试剂盒的一个重要应用就是对耳聋人群样本检测，为耳聋人群做耳聋基因筛查。
1、使用本发明提供的试剂盒能同时检测17个耳聋基因突变位点，能更大的满足耳聋人群检测范围。
在检测者知情同意的情况下，检测口腔拭子样本，各样本均获自无锡特殊教育学校。样本数量是149例。所有位点均经过直接测序检测，结果与上述基因分型方法的检测结果完全一致，说明了本试剂盒及其检测方法的有效性。
①多重等位基因特异性PCR
磁珠法提取各样本的基因组DNA，按表4配制反应体系，在热循环仪上按表5程序进
行多重等位基因特异性PCR，得到PCR扩增产物。
②荧光凝胶电泳
将12.5μL上样混合物与1μL扩增产物和试剂盒中等位基因分析标准物混合，离心，避免产生气泡。95℃变性3分钟，冰浴3分钟，用遗传分析仪ABI3100检测分析。结果如图4所示，检测的突变情况与测序结果完全一致。
遗传性耳聋诊断标准：本次检测包含4个耳聋基因（GJB2、GJB3、SLC26A4和12S rRNA）中的17个突变位点，在所检测的基因中，GJB2和SLC26A4基因属于隐性遗传；GJB3基因属于显性遗传；12S rRNA基因属于线粒体基因母系遗传。
A.对于GJB2和SLC26A4基因所涉及的突变位点：若出现一个纯合突变（碱基突变和缺失）的峰型，即可确定该患者的耳聋属于遗传性耳聋，该位点突变为致聋原因；若在同一基因中仅出现一个杂合突变（一个突变峰型和一个正常峰型），而受检者本身确为耳聋患者，则说明该位点为导致患者耳聋的部分原因，还可能存在不在检测范围内的突变位点；若所检测位点均为正常峰型而受检者确为耳聋患者，则说明该患者可能是其他基因突变、非遗传性耳聋、综合征型耳聋或存在罕见的突变导致。
B.对于GJB3基因所涉及的突变位点：若出现一个杂合突变或纯合突变的峰型，即可确定该患者的耳聋属于遗传性耳聋，该位点突变为致聋原因；若所检测位点均为正常峰型而受检者确为耳聋患者，则说明该患者可能是其他基因突变、非遗传性耳聋、综合征型耳聋或存在罕见的突变导致。
C.对于12S rRNA基因所涉及的突变位点：若出现一个位点突变（线粒体基因通常为纯合突变），则确定该患者属于遗传性耳聋，且在幼儿时期接受氨基糖甙类抗生素药物为其致聋原因；若所检测位点均为正常峰型而受检者确为耳聋患者，则说明该患者可能是其他基因突变、非遗传性耳聋、综合征型耳聋或存在罕见的突变导致。
上述149例样本经本试剂盒检测，有235杂合缺失15例，235纯合缺失18例，299杂合缺失9例，35杂合缺失1例，176杂合缺失2例，1226杂合突变3例，1229杂合突变2例，2168杂合突变3例，1975杂合突变1例，919杂合突变10例，919纯合突变7例，1555突变2例，538突变1例。检测结果与测序结果100%一致，也与各样本实际的患病情况一致。
另外，对30名正常人群进行样品取样检测，均显示出阴性。
2.选择已确定上述各个多态性位点的基因型的32种样品（取自不同个体的口腔上皮细胞），其中常染色体位点纯合子和杂合子各15种，线粒体两个位点的突变型2种，来检验该试剂盒的分型结果特异性。其PCR结果使用ABI遗传分析仪3100进行分析，杂合子为同时包含多态性位点的野生型和突变型。结果表明，本发明的试剂盒的检测结果都完全正确，即对每个样品的每个基因型的分型结果都正确。
3.对一个已确定上述各个多态性位点的基因型的耳聋患者口腔上皮细胞基因组DNA进行分型，分型中采用不同量的基因组DNA，以测试试剂盒的灵敏度。结果表明，分型结果完全正确，其荧光凝胶电泳结果见图5。经过测试得出，对0.16ng以上的基因组DNA进行检测，均能正常分型。故本试剂盒的最低检出限是0.16ng的基因组DNA。
4.另外，对耳聋患者相关的血液样本、血斑样本都采用本试剂盒进行分型检测。其分型结果经DNA测序验证为100%正确，表明此平台具有高特异性和高灵敏性的性能，适用于临床检测筛查。对这些不同途径来源的样品的成功检测，特别是口腔拭子和血液样本，为此平台广泛应用于其它遗传疾病的基因检测分析铺平了道路。由于此平台检测的高灵敏性，也可用来检测DNA含量低的复杂样品。
5.为了避免不同遗传分析仪之间的差异导致分型过程产生误差，在每次检测过程中增加等位基因分型标准物（图6），作为分型参照增加检测的精确度。
SEQUENCE LISTING
<110> 无锡中德美联生物技术有限公司
<120> 一种遗传性耳聋基因检测试剂盒
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atgaaatggc agtagcaatt agcgt 25
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tttccagtac acttaccatg ttacgaattg c 31
Claims (6)
1.一种遗传性耳聋基因检测试剂盒，其特征在于：包括有如下17个多态性位点的引物：35delG，G1975C，GIVS15+5A，T2027A，299-300delAT，167delT，176-191del16，235delC，C538T，T707C，AIVS7-2G，C1229T，G1226A，A1174T，A2168G，C1494T，A1555G；所述的17个多态性位点的分为十组：第一组：35delG、167delT、235delC；第二组：GIVS15+5A；第三组：G1975C、T2027A；第四组：299-300delAT、176-191del16；第五组：C538T；第六组：T707C；第七组：AIVS7-2G；第八组：C1229T、G1226A、A1174T；第九组：A2168G；第十组：C1494T、A1555G；每组使用相同的反向引物；所述的17个多态性位点的引物是指：
35delG，反向引物，SEQ NO：1，正向引物，SEQ ID NO：2～3；
G1975C，反向引物，SEQ ID NO：4，正向引物，SEQ ID NO：5～6；
GIVS15+5A，反向引物，SEQ ID NO：7，正向引物，SEQ ID NO：8～9；
T2027A，反向引物，SEQ ID NO：10，正向引物，SEQ ID NO：11～12；
299-300delAT，反向引物，SEQ ID NO：13，正向引物，SEQ ID NO：14～15；
167delT，反向引物，SEQ ID NO：16，正向引物，SEQ ID NO：17～18；
176-191del16，反向引物，SEQ ID NO：19，正向引物，SEQ ID NO：20；
235delC，反向引物，SEQ ID NO：21，正向引物，SEQ ID NO：22～23；
C538T，反向引物，SEQ ID NO：24，正向引物，SEQ ID NO：25～26；
T707C，反向引物，SEQ ID NO：27，正向引物，SEQ ID NO：28～29；
AIVS7-2G，反向引物，SEQ ID NO：30，正向引物，SEQ ID NO：31～32；
C1229T，反向引物，SEQ ID NO：33，正向引物，SEQ ID NO：34～35；
G1226A，反向引物，SEQ ID NO：36，正向引物，SEQ ID NO：37～38；
A1174T，反向引物，SEQ ID NO：39，正向引物，SEQ ID NO：40～41；
A2168G，反向引物，SEQ ID NO：42，正向引物，SEQ ID NO：43～44；
C1494T，反向引物，SEQ ID NO：45，正向引物，SEQ ID NO：46～47；
A1555G，反向引物，SEQ ID NO：48，正向引物，SEQ ID NO：49～50。
2.根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因检测试剂盒，其特征在于：所述的反向引物是有荧光标记的。
3.根据权利要求2所述的遗传性耳聋基因检测试剂盒，其特征在于：所述的反向引物是按照如下的分组进行荧光标记的，第一组：35delG、G1975C、GIVS15+5A、T2027A、299-300delAT、167delT、176-191del16、235delC；第二组：C538T、T707C、AIVS7-2G、C1229T、G1226A、A1174T、A2168G；第三组：C1494T、A1555G。
4.根据权利要求3所述的遗传性耳聋基因检测试剂盒，其特征在于：所述的反向引物的荧光标记选自FAM色标记、HEX色标记、ROX色标记、TAMRA色标记；且每组之间的荧光标记色都不相同。
5.根据权利要求1～4任一项所述的遗传性耳聋基因检测试剂盒，其特征在于：所述的引物工作浓度是：
6.根据权利要求1～4任一项所述的遗传性耳聋基因检测试剂盒，其特征在于：还包括有阳性对照和阴性对照。
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| Title |
|---|
| 张华等.遗传性耳聋基因芯片检测及其临床意义.《临床耳鼻喉头颈外科杂志》.2009,第23卷(第22期),1032-1035. |
| 遗传性耳聋基因芯片检测及其临床意义;张华等;《临床耳鼻喉头颈外科杂志》;20091130;第23卷(第22期);1032-1035 * |
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| Publication number | Publication date |
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| CN103352080A (zh) | 2013-10-16 |
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