CN106399543A - 基于74个y染色体snp遗传标记的法医学二代测序试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于法医学技术领域，具体涉及基于74个Y染色体SNP遗传标记的法医学二代测序试剂盒。本发明要解决的技术问题是使用二代测序技术，利用Y染色体SNP遗传标记对中国群体来源的检材在Y染色体进化树上的位置进行划分。本发明的技术方案是基于74个Y染色体SNP遗传标记的法医学二代测序试剂盒，包含了用于复合扩增的72对引物的混合物，使同时检测74个SNP成为现实。本发明试剂盒应用了单管内复合扩增和二代测序技术，可一次性获得多个生物检材的74个Y染色体SNP遗传标记的基因分型，并将中国群体来源的男性样本正确归属至现已公认的Y染色体进化树分枝上。
Description
技术领域
本发明属于法医学技术领域，具体涉及基于74个Y染色体SNP遗传标记的法医学二代测序试剂盒及其用途。
背景技术
Y染色体是一类仅存在于男性个体的染色体，其非重组区(non-recombinationregions of Y chromosome，NRY，以下未做特殊说明的Y染色体均指非重组区)具有父系遗传、非重组、有效群体小和地理学上的特殊性等特点。由于其仅存在于男性个体，使其在法医学方面发挥着重要作用，如在男性作为嫌疑人的性侵案件中，以及群体灾难事件遇难者身源鉴定和失踪人员调查中。而由于其父系遗传及地理学上的特殊性等特点，也使得其成为研究人类进化、群体结构的重要工具之一。其中，运用包括插入/缺失(InDel)在内的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)位点和Alu序列构建Y染色体系统发育树进行单倍群划分则是长久以来进行人类进化和群体结构研究的主要手段，并已经发现了不同地区、不同人群的主要单倍群。近年来，越来越多的法医学工作者注意到，由于不同人群和不同地区间单倍群的分布存在一定的特征，可以通过对检案中未知来源的男性样本进行单倍群划分以推断其地理来源或所属群体，从而辅助案件侦查，因而，Y染色体系统发育树具有重要的法医学意义。
随着测序技术的发展，越来越多的SNP位点得以被发现，其中包括部分可用于构建进化树的SNP位点，这在极大程度上扩充了Y染色体进化树，使得单倍群的划分可以愈发精细，截至2016年3月27日，国际遗传系谱学会(International Society of GeneticGenealogy，ISOGG)在线提供的可用于构建Y染色体进化树的SNP位点已达31617个。但由于这其中部分位点的遗传地位相同、某些位点的稳定性尚有待考证，且过多的遗传标记不利于快速检测等问题，给其在法医学检案中的应用带来了挑战。如今，van Oven等人用417个SNP位点构建了一个最小参考树，该树可提供全球范围内各主要单倍群的地理分布(其中包括中国在内的亚洲主要单倍群为12个)，这可为法医学检案提供便利，但由于其仅能提供主要单倍群在各大洲的大致分布情况，并不具有较高的分辨率，因而，其在进一步区分某样本的地理来源或所属人群上具有极大的限制。因此，针对各群体或地区，构建一个具有较高分辨率的、稳定的系统发育树显得尤为必要。中国的国土面积位居世界第三，其人口总数则位列世界第一，其中更是包含56个民族，且在此之前，各群体间群体结构的差异就已经得以发现了。在上述背景下，我们有必要构建一个适用于中国群体的、简约的、高分辨率的系统发育树，这将不仅为检案中未知样本的溯源提供便利，在进一步了解中国群体亚结构方面也可提供一定的帮助。
但随着分辨率的提高，势必需要使用更多的Y-SNP位点，其中包括InDel位点，这就意味着需要一种能同时大批量检测包括InDel位点在内的SNP位点的方法，而这个要求是传统的检测方法，如SNaPshot无法满足的。
综上所述，筛选一组适宜的Y染色体SNP遗传标记，应用二代测序技术，构建一个适用于中国人群的、简约的、高分辨率的、可将中国男性个体样本正确归属至现已公认的Y染色体系统发育树分枝上的二代测序体系，将为法医的样本归属问题提供一种新的技术手段。随着二代测序技术的普及，在此基础上开发出基于二代测序检测平台的Y染色体SNP二代测序试剂盒，将极大地推动这种新技术在法医样本溯源中的推广和应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是利用Y染色体系统发育树对未知来源的中国男性样本进行单倍群划分以推断其归属地或所属群体。
本发明的技术方案是基于74个Y染色体SNP遗传标记的法医学二代测序试剂盒，包括复合扩增引物混合物。所述的基于74个Y染色体SNP遗传标记的法医学二代测序试剂盒中的复合扩增引物混合物包含了74个Y染色体SNP遗传标记的共计144条扩增引物，各扩增引物的核苷酸序列分别如表2中SEQ ID No.1至SEQ ID No.144所示：
表2复合扩增引物
上表中，SNP位点M69与M82，M133与M134采用的是同一对扩增引物。
进一步的，所述的法医学二代测序试剂盒还包括复合扩增反应混合液。
更进一步的，上述的法医学二代测序试剂盒还包括标准DNA。
优选的，所述标准DNA为2800M标准DNA。
用二代测序时，用不用标准DNA都是可以的，为了质量控制使结果更为准确，因此使用标准DNA。
本发明还提供了上述的法医学二代测序试剂盒在对未知来源的中国男性样本进行单倍群划分中的用途。
本发明的有益效果：本发明试剂盒包含74个Y染色体SNP遗传标记，兼顾了系统发育树的稳定性和高分辨率，以尽可能少的位点数达到了较高的体系分辨能力，可将任一中国男性个体样本正确地划分至现已公认的Y染色体系统发育树分枝上。本发明是基于筛选得到的74个Y染色体SNP遗传标记构建的法医学检测试剂盒，尤其适用于目前迅速发展的二代测序体系。本试剂盒可采用单管内复合扩增和具有更高通量的二代测序技术，能一次性获得多个男性来源生物检材的74个Y染色体SNP遗传标记的基因分型，快速实现对生物检材的来源地或所属人群溯源。本试剂盒包括了标准DNA的分型结果(指用法医学二代测序试剂盒检测标准DNA获得的其Y染色体SNP遗传标记的分型)，可确保分型准确；该试剂盒复合扩增产物长度最短仅129bp，最长不超过200bp，对于法医学常见的降解检材的检测具有优势，具有好的应用前景和推广价值。
附图说明
图1本发明所检测的72个SNP位点所构成的进化树
具体实施方式
以下通过具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明系基于Y染色体SNP遗传标记的法医学二代测序试剂盒，是基于筛选得到的74个Y染色体SNP遗传标记，利用目前迅速发展的二代测序体系构建的。该试剂盒由复合扩增引物混合物、标准DNA和复合扩增反应混合液构成。
该试剂盒的工作原理是首先通过复合扩增引物混合物和复合扩增反应混合液，分别在单管内一次性同时扩增获得单一样本所有74个Y染色体SNP的72个DNA片段(构建测序文库)。
然后以此72个DNA片段为模板，分别加上接头(此接头是一致的，若要进行多个样本的同时测序，则需要加接头的基础上分别给不同样本加上不同的标签以示区分。接头和标签均为ABI公司产品)。混合包括分型标准DNA样本在内的多个样本后进行乳液PCR扩增(乳液PCR时是将用于测序的多个样本同时扩增的，即将所有的样本混合到一个反应管里面扩增)，以获得各待测样本的74个Y染色体SNP的乳液PCR产物。
最后，2800M标准DNA的扩增产物作为阳性对照与样本同时进行测序反应，得到各样本的测序结果；此后，首先分析分型标准DNA的测序结果准确与否，若该分型标准DNA测序结果正确，表明该次测序结果可靠，则可进一步分析确定待测样本74个Y染色体SNP遗传标记的分型结果。
在本发明中，Y染色体SNP的选择对二代测序试剂盒的构建极其关键。如前所述，Y染色体遗传表现为父系遗传，在人类进化研究中有重要的意义。在运用Y染色体SNP构建的系统发育树中，用单倍群(haplogroup，Hg)表示一组类似的单倍型(haplotype)的集合。现有研究结果表明，其分布具有明显的人群和地理特异性，任何合理的Y染色体DNA检测体系都不能忽视对单倍群的划分。ISOGG(网址www.isogg.org)在线提供的Y染色体系统发育树给定了目前认为可用于划分单倍群的所有位点，这无疑将是目前已知最完整、分辨率最高的系统发育树，但由于其所包含的位点数量极其庞大、部分位点的稳定性有待考证，且各节点上的SNP位点存在冗余，使得其不适用于日常检案。所以针对特定的群体或区域，选择稳定的、单倍群特定的SNP位点，可保证结果可靠，同时避免信息的重复，检测较少的位点即可进行单倍群的划分，进而追溯生物检材的人群或地理来源。van Oven等人在ISOGG和YCC所公布的系统发育树的基础上筛选出了包括各大洲主要单倍群节点在内的417个Y染色体SNP构建了一个最小参考树，但由于其所包含的具有地区或群体针对性的SNP位点有限，使得其分辨率低，不能将未知生物检材进一步溯源。
本发明试剂盒中SNP位点的选择旨在使用较少SNP位点的同时尽可能地提高系统发育树的分辨率。因此，本发明通过大量研究，得出了纳入本发明试剂盒中的Y染色体SNP位点的采纳标准：1)为中国群体特定的SNP位点，且不同主要单倍群的下级分枝中所包含位点数目依照该单倍群在人群中所占百分比而有所差异，在人群中所占比重越大，则下级分枝所包含的SNP位点越多；2)具有多态性的主要中间节点SNP，用以保证树的拓扑结构的稳定性；3)在中国群体中多态性良好的SNP位点；4)可以设计出200bp以内扩增产物。其中，最后一条是每个位点必备条件。根据上述标准，本发明最后确认了74个Y染色体SNP遗传标记用于建立此二代测序体系。
本发明研究确认的74个Y染色体SNP遗传标记位点包含可覆盖所有中国人群主要单倍群及其亚群的共计64个单倍群的特异SNP。经过群体调查实验(即实施例的检测实验)证明，本发明的Y染色体SNP二代测序体系可将任一中国男性样本正确归属至现已公认的Y染色体进化树分枝上。
试剂盒中所涉及的74个Y染色体SNP位点信息如表3。
表3 74个Y染色体SNP位点
本发明试剂盒在Y染色体SNP的检测中运用了复合扩增技术。该技术可以在单个反应体系中同时扩增多个目的DNA片段，具有方便、快捷、节约样本和成本等优点。但这对引物设计有较高的要求，本次引物设计通过赛默飞公司白手套计划完成，设计完成后的72对引物混合在同一引物池(primer pool)中。其中，由于SNP位点M69与M82，M133与M134位置相近，本发明对这四个位点分别设计了两对扩增引物，每对位点上下游扩增引物序列相同，位于同一条扩增产物上。
本发明试剂盒利用上述复合扩增引物，获得了包含74个Y染色体SNP遗传标记的扩增产物(即，文库)，继而以此为模板，进行二代测序反应。
本试剂盒采用的测序可在PGM(Ion Personal Genome来自赛默飞公司)平台上进行。该平台的二代测序技术是一种基于碱基延伸时释放氢离子，从而改变微环境pH值这一原理进行的检测技术。芯片中含有大量的微孔(依型号不同而有所差异)，每个微孔理论上仅容纳单个微珠，而经过乳液PCR反应之后，理论上一个微珠上仅存在一条扩增片段的多个克隆，即，理论上，单个微孔内仅存在一条扩增引物的多个克隆。通过同时检测各个微孔中反应液在加入不同碱基后pH是否变化，即可反映实际得以延伸的碱基类型，直至所有文库的检测完成。其特点在于，可以同时分析多个样本的多个SNP位点，且得到的结果是包括侧翼序列在内的整条核苷酸序列，因而不仅可以了解到目的位置的碱基分布情况，还可以看到侧翼序列的碱基排布，通过对比标准序列，可以更直观地对分型结果的可靠性进行评估。
在每一样本检测SNP位点数一定的情况下，为了实现单次检测更多样本，需要注意各测序模版间量的均衡性，而此均衡性的主要影响因素则为文库构建结果，即在于文库内各扩增产物片段间数量的差异，而导致这一差异的主要原因则在于不同引物扩增效能的差异，因而在进行引物设计和混合引物池时需要尤其注意。
最后设计出的所有74个Y染色体SNP位点复合扩增引物序列参见表2。
本发明试剂盒中引入阳性对照是作为质量控制，用以评估单次测序结果是否可靠。本发明中提供的阳性对照包括了2800M标准DNA样本的所有74个Y染色体SNP遗传标记的标准分型结果。对未知样本进行检测时，并列地进行标准DNA的扩增和测序，通过对2800M标准DNA分型结果的分析，评估当次检测结果的可靠性，决定是否进行后续分析。若结果可靠，则可对未知样本进行分型，并对其所属单倍群进行划分。
更具体的，本发明试剂盒具体包括的组分可为：
a)复合扩增反应混合液：含DNA聚合酶的PCR缓冲液、去核酸酶水。
b)复合扩增引物混合物：如表1所示的74个Y染色体SNP遗传标记的扩增引物对组成的复合扩增引物池。
c)部分消化引物序列试剂：FuPa反应液。
d)接头连接反应试剂：包括接头、标签、转换液及连接酶。
e)文库纯化试剂：包括XP反应液、70％乙醇和低浓度TE缓冲液。
f)文库定量反应试剂：包括E.coli标准品、MasterMix和Assay。分别对各文库进行定量，跟据定量结果，将文库按相应比例稀释，以保证后续用于乳液PCR的模版混合物中来自各样本的模版含量均衡。
g)乳液PCR反应试剂：包括缓冲液、酶、ISP(Ion Sphere Particle)、反应油在内的反应混合物、Ion OneTouchTM反应液和Ion OneTouchTM油以及破乳溶液。
h)文库富集试剂：包括洗脱液、文库富集Beads、NaOH溶液、Beads洗脱液、Tween溶液、中和液、去核酸酶水。
i)测序反应混合物：含有聚合酶、测序引物、内参ISP。
j)测序反应其它试剂：W2溶液、W3溶液、氯片、Annealing缓冲液、NaOH溶液、dNTPs。
k)2800M标准DNA：作为质控指标，从文库构建开始，与其它样本并行处理。
上述a、c、d、f到j中各试剂除纯水和NaOH外，一般需使用配套的商业化的产品，本次所用试剂为Hi-QTM系列，购自赛默飞公司。文库纯化试剂e中的XP反应液购自Beckman公司。试剂k作为男性样本标准品则购自Promega公司。
至于提取待检测样本中的DNA的模板，可使用本领域目前的各种常规试剂，提取DNA模板可以参照现有的常规方法即可进行，亦可使用商业化试剂按指南进行。
利用本发明所述试剂盒，可以对法医DNA样本进行分析。分析方法包括以下步骤；
1)提取待检测样本的DNA，作为扩增模板。
2)利用上述复合扩增反应混合液和复合扩增引物混合物对步骤1提取的DNA以及上述2800M标准DNA进行单管内复合扩增(即，进行文库构建)。
所述复合扩增PCR的反应的循环参数为：99℃，2分钟；99℃，15秒，60℃，4分钟，19个循环后10℃保存。
3)利用上述部分消化引物序列试剂部分消化步骤2)所构建文库的引物。
所述部分消化文库引物的循环参数为：50℃，10分钟，55℃，10分钟，60℃，20分钟。
4)利用上述接头连接反应试剂在上述方法步骤3中所述产物上加接头，并利用文库纯化试剂对其进行纯化。
所述加接头的循环参数为：22℃，30分钟，72℃，10分钟。
5)利用上述文库定量反应试剂对上述方法步骤4中所述产物进行定量，以保证后续的文库混合时各文库间量的均衡。
所述定量反应的循环参数为：50℃，2分钟，95℃，2分钟；95℃，15秒，60℃，1分钟，40个循环。
6)利用上述乳液PCR反应试剂进行乳液PCR反应，并对上述步骤5中的产物进一步富集，以保证测序时的质量和数量均达到较高水平。
所述乳液PCR反应的循环参数依所使用试剂盒而定：仪器预设提供所有可用试剂盒的参数，使用时选择所用试剂盒即可。
7)利用测序反应混合物和测序反应其它试剂对上述步骤6中的产物进行测序，获得标准DNA及样本各位点基因型。
所述加入测序引物后孵育条件为：95℃，2分钟，37℃，2分钟。
所述测序反应的循环参数依所需测序的遗传标记类型及片段长度、所用芯片等而定。
进一步的，上述方法步骤7中所述的测序结果分析包括以下步骤：将富集后的产物加上测序所需试剂后，载入测序芯片内，进行测序反应，反应结束后得到含有该位点测序结果的excel表格，以及测序原始文件(包括序列信息文件bam.和对应的定位信息文件bai.)，在对2800M标准DNA分型结果及序列分析，认为该次测序结果可信后，方可进行对该次测序其它样本进行分析，获得待测样本基因型。
以下用具体实例进一步具体说明本发明，其中所用试剂无特殊说明均使用以下试剂和仪器：
1)Nanodrop-1000微量紫外可见分光光度计，赛默飞公司
2)ProFlexTM PCR扩增仪，赛默飞公司
3)纯水装置，Millipore公司
4)台式高速离心机，赛默飞公司
5)移液器EPPENDORF公司
6)芯片载样所用移液器为Rainin移液器，梅特勒-托利多公司
7)磁力架，赛默飞公司
8)实时定量PCR仪7500型，赛默飞公司
9)PGM二代测序系统，赛默飞公司
10)Ion 318芯片，赛默飞公司
11)漩涡振荡器，赛默飞公司
实施例1本发明试剂盒的制备
用于检测的Y染色体SNP二代测序试剂盒可包括分别包装的以下试剂：
a)复合扩增引物混合物。由表3所示的扩增引物混合得到，由赛默飞公司合成并混合至一个引物池。
b)复合扩增反应混合液、部分消化引物序列试剂。本实施例中使用赛默飞公司IonAmpliSeqTM Library Kit 2.0提供的PCR反应混合液。
c)接头连接反应试剂。本实施例中使用赛默飞公司的Ion XpressTM BarcodeAdapter，将接头和标签按1：1混合为标签-接头混合物，2倍稀释备用。需要说明的是，由于标签的主要作用为区分不同样本，因而在单次测序样本数仅为1的情况下可不使用标签。
d)文库纯化试剂。本实施例中使用XP反应液，70％乙醇溶液按乙醇和水230：100的体积比进行配置，此溶液需新鲜配置。
e)文库定量反应试剂。本实施例中使用Ion Library TaqManTM定量试剂盒，其中MasterMix和Assay试剂以10：1的比例混合备用。
f)乳液PCR反应试剂及文库富集试剂。本实施例中使用Ion PGMTM Hi-Q OT2试剂盒，其中，文库富集所用的Melt-off溶液需用1M NaOH溶液40μL和试剂盒提供的Tween溶液280μL混合备用。
g)测序反应所用试剂。本实施例中除1M NaOH溶液外，均使用Ion PGMTM Hi-QTM测序试剂盒。
将上述试剂分别按各自常规要求包装后即制得基于Y染色体SNP遗传标记的法医学二代测序试剂盒，用于后继的实验。
实施例2使用本发明试剂盒检测100个无关汉族男性个体检材
使用上述基于Y染色体SNP遗传标记的法医学二代测序试剂盒，进行了100个无关汉族成年男性志愿者个体检材的检测。具体的检测过程按如下步骤进行：
a、用试剂盒或盐析法从100个无关汉族男性个体血样中提取DNA，作为复合扩增模板(盐析法所提取DNA来自实验室已有DNA)；
b、以步骤a中的DNA模版，利用上述复合扩增反应混合液和复合扩增引物混合物将DNA模版及2800M标准DNA进行单管内复合扩增，构建各样本文库。体系为20μL：扩增引物混合物10μL，复合扩增反应混合液4μL，模版DNA1μL，加入去核酸酶水补足20μL；循环条件：99℃2分钟，99℃15秒、60℃4分钟、循环19次。
c、引物的部分消化：步骤b中的产物中分别加入2μL FuPa反应液，使总体积为22μL，然后50℃10分钟，55℃10分钟，60℃20分钟。
d、加接头：在步骤c的各产物中分别加入转换液4μL，以及上述稀释好的标签-接头混合物2μL，充分混合后分别加入DNA连接酶2μL，使体积达30μL，然后22℃30分钟，72℃10分钟。
e、文库纯化：将步骤d中得到的产物分别完全转移至含有45μLXP反应液的EP管中，室温孵育5分钟。然后将其置于磁力架上约2分钟，弃上清液后分别用150μL 70％乙醇溶液润洗三次，最后一次洗涤完成后，分别将其从磁力架上移下，晾干，并加入50μL低浓度TE溶液充分重悬，然后静置后吸取上清液备用。
f、文库定量：将步骤e中的产物分别取5μL，稀释100倍后，分别取9μL，加入MasterMix、Assay混合液11μL，使总体积为20μL，进行定量。循环参数为：50℃2分钟，95℃2分钟；95℃15秒，60℃1分钟，循环40次。
g、乳液PCR反应：文库混合物的准备：步骤f中定量后的文库按原浓度最低者进行稀释、混合，使混合后各文库含量均一，取稀释后的文库混合物200pM，加入去核酸酶水至25μL。乳液PCR体系：Ion PGMTMHi-QTM Reagent Mix 800μL,Ion PGMTM Hi-QTM Enzyme Mix 50μL,Ion PGMTM Hi-QTM ISPs 100μL,前述文库25μL，加入去核酸酶水至1000μL，转移至反应容器中，加上1.7mLOneTouchTM反应用油。在仪器OneTouch2的相应位置按操作手册指示加入Ion OneTouchTM反应液和Ion OneTouchTM油以及破乳溶液。
h、文库富集：将步骤g中回收得到的产物洗涤、离心回收(回收后弃上清至100μL)后按操作指南进行富集。此步骤需在富集所用容器中依次加入前述回收的产物100μL、Beads130μL、洗脱液300μL(连续3孔)以及Melt-off溶液300μL，最后在回收用扩增管中加入中和液10μL。依次经Beads结合，洗脱液洗涤和Melt-off溶液解离后，最终的回收产物被转移至中和液中。
i、使用赛默飞公司的PGM二代测序系统进行测序：充分混合步骤h中得到的产物后，加入内参ISP5μL，混匀，离心，从对侧弃上清至剩余15μL，加入测序引物12μL，使体积达27μL，然后95℃2分钟，37℃2分钟孵育。在孵育完的产物中加入聚合酶3μL，使体积达30μL，室温孵育5分钟。
其间，按操作手册安装及润洗测序反应用W1、W2及W3等配件，加入相应试剂，初始化PGM测序系统，准备好dNTP，以及测试好待用芯片。然后将前述30μL载入测试好的芯片中，进行测序反应。
测序条件：按提示选择所用试剂盒，设置flow数为500，本实施例的原始文件收集使用Torrent_Suite Server(v4.6)，数据分析选用VariantCaller(v4.6.0.7)和CoverageAnalysis(v4.6.0.3)。后续分析使用IGV(Integrative Genomics Viewer)v2.3.72.
所得的所有100个男性样本及2800M标准DNA的分型的结果见表4，从表中可以看到，共划分至18个单倍群。具体划分方法如下：如图1(图1中72个SNP节点均在现有进化树上存在，针对中国群体选择图1所示的72个；另有两个位点，rs172763451、rs20756401，现有树中没有，尚不知晓其所在节点，故构建进化树时未包含此二位点)所示，因为进化树是呈树状分布的，不同单倍群即为树的分枝，而各SNP在树上则分布于各自的节点。进行单倍群划分时，从树根部往上看，若该节点SNP为突变型，即阳性，则可沿分枝往上；若某节点为阴性，则该节点上一个SNP所在节点为终点，其所提示单倍群为该样本所在单倍群。因而，一个单倍群往往系由多个SNP分型决定的。
表4检测结果
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学
<120> 基于74个Y染色体SNP遗传标记的法医学二代测序试剂盒
<130> A160821KN
<160> 144
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增SRY10831.1/SRY10831.2位点的上游引物
<400> 1
acacagaaac agattttcta caacagga 28
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增SRY10831.1/SRY10831.2位点的下游引物
<400> 2
gatcattcag tatctggcct cttgtat 27
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M168位点的上游引物
<400> 3
tgatgaaatc tgctttttgt tttgcag 27
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M168位点的下游引物
<400> 4
taggtctctg actgttcagt tttattcc 28
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M145位点的上游引物
<400> 5
tgcaaagagg gtaggcttaa tagga 25
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M145位点的下游引物
<400> 6
acacagagtc taatttttat agcggcat 28
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增P153位点的上游引物
<400> 7
ttctcactat gatccaggca atgtattt 28
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增P153位点的下游引物
<400> 8
cataaattac ccagattcgg gaagtttg 28
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M174位点的上游引物
<400> 9
gttcttctcc gtcacagcaa aaatg 25
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M174位点的下游引物
<400> 10
cttgcaagga aaagtgtgca ataaac 26
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M15位点的上游引物
<400> 11
aaatcctgaa caatcgccat cac 23
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M15位点的下游引物
<400> 12
tctacctcat gcgcatatac aatcaaa 27
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增N1位点的上游引物
<400> 13
gtacatgatc tgctagcaaa gttgg 25
<210> 14
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增N1位点的下游引物
<400> 14
acactagcta taagcaaaag aaatctaacg aa 32
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增P99位点的上游引物
<400> 15
gtggtaggtt cctttagtcc ca 22
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增P99位点的下游引物
<400> 16
agaatagaag atgtagtcag catgtagag 29
<210> 17
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增p47位点的上游引物
<400> 17
cagaatttct acactgtcat ctgaatcc 28
<210> 18
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增p47位点的下游引物
<400> 18
ttgctgtaaa ggtattttta gatgagattg ag 32
<210> 19
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M55的上游引物
<400> 19
agtaccattc cacagaagaa cagaaata 28
<210> 20
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M55位点的下游引物
<400> 20
aaagctacta cttctgaatc ctaatggc 28
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M125位点的上游引物
<400> 21
cccaagcaga agtcaacttg agactat 27
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M125位点的下游引物
<400> 22
cccaagggat caggagttat gtga 24
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增P143位点的上游引物
<400> 23
cacaagtgaa cagatcccaa cttc 24
<210> 24
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增P143位点的下游引物
<400> 24
gtctttgatt ttgaggcaaa ttttcgtg 28
<210> 25
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M130位点的上游引物
<400> 25
gctggctatt aatgtgaagg aaggtatg 28
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M130位点的下游引物
<400> 26
ctctcttcag caacagtaag tcgaa 25
<210> 27
<211> 31
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M131位点的上游引物
<400> 27
atcacatttt atcttactaa tgccttttcc t 31
<210> 28
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M131位点的下游引物
<400> 28
aaaggtcaat ttagagcaga gaaattattc tt 32
<210> 29
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M217位点的上游引物
<400> 29
caaaatcctc tcgtacagat ctgtttc 27
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M217位点的下游引物
<400> 30
atttgataaa gctgctgtgg ctttc 25
<210> 31
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M48位点的上游引物
<400> 31
tttgttttat cccttccact cttagctt 28
<210> 32
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M48位点的下游引物
<400> 32
tccaagtttc agtgtcacat ataagtca 28
<210> 33
<211> 33
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增P133位点的上游引物
<400> 33
caggtggtgt tacaggttag aatttatata tac 33
<210> 34
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增P133位点的下游引物
<400> 34
acgagacgtg tagttaattg gagatttt 28
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M89的上游引物
<400> 35
ctggattcag ctctcttcct aaggt 25
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M89的下游引物
<400> 36
agctgtgtga agtcttggca gaata 25
<210> 37
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增P141的上游引物
<400> 37
aaaatgacag tcttgacctc taaacatt 28
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增P141的下游引物
<400> 38
gtcaacaaag gagtgtgact gtgta 25
<210> 39
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增P151位点的上游引物
<400> 39
tcttttgtgc ctatttttct atgtaggg 28
<210> 40
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增P151的下游引物
<400> 40
taagacaagc tgcaaaattg agtgag 26
<210> 41
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增F1329位点的上游引物
<400> 41
ccaagatata aactgcttgt gcgat 25
<210> 42
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增F1329位点的下游引物
<400> 42
gacattgagt gtgagctgca ataatg 26
<210> 43
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M201位点的上游引物
<400> 43
tgtcaaattg tgacactgca atagttac 28
<210> 44
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M201位点的下游引物
<400> 44
ctatcagctt catccaacac taagtacc 28
<210> 45
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M578位点的上游引物
<400> 45
agagtagttc atattgaaac cttgtggt 28
<210> 46
<211> 31
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M578下游位点的引物
<400> 46
agggagatat ctattagaga taggatggag t 31
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M69和M82位点的上游引物
<400> 47
gcttcaggag gctgtttaca ctc 23
<210> 48
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M69和M82位点的下游引物
<400> 48
actgaagaaa caaacctacc tgga 24
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M522位点的上游引物
<400> 49
gccttagatg aggatgtcct tcg 23
<210> 50
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M522位点的下游引物
<400> 50
ggaggaagta cagtgcagaa aatcac 26
<210> 51
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M170位点的上游引物
<400> 51
tttcatgttt gttcaaataa ttgcagctct 30
<210> 52
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M170位点的下游引物
<400> 52
accacacaaa aacaggtcct catttta 27
<210> 53
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M304位点的上游引物
<400> 53
aaaccacttc ctaattattc agactcaaga 30
<210> 54
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M304位点的下游引物
<400> 54
actttcaaaa cgtcttatac caaaatatca cc 32
<210> 55
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增P209位点的上游引物
<400> 55
ggagtttgct tatgaagcca agga 24
<210> 56
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增P209位点的下游引物
<400> 56
cacttattta agcattggtt ggtcacg 27
<210> 57
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M267位点的上游引物
<400> 57
cctgtgtttc catttctctt ttcctcat 28
<210> 58
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M267位点的下游引物
<400> 58
tcagctagat tgtgttcttc cacac 25
<210> 59
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M172位点的上游引物
<400> 59
ctgcctctca gtatcaacag gtaaaaa 27
<210> 60
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M172位点的下游引物
<400> 60
ccatgttggt ttggaacagt ttatcc 26
<210> 61
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M9位点的上游引物
<400> 61
caaggaattc gctgcagcat ataa 24
<210> 62
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M9位点的下游引物
<400> 62
aatgcataat gaagtaagcg ctacct 26
<210> 63
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增P326位点的上游引物
<400> 63
gaggtcaaaa tttttagggt ccctca 26
<210> 64
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增P326位点的下游引物
<400> 64
cctgtgtaag cacaaagtag gttct 25
<210> 65
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M526位点的上游引物
<400> 65
atcaaggaaa tttgtgtttt ccaaactgta aa 32
<210> 66
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M526位点的下游引物
<400> 66
tactttggga ggctgctgtt g 21
<210> 67
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增P193位点的上游引物
<400> 67
gaaaaggtaa acaccatttc caccaat 27
<210> 68
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增P193位点的下游引物
<400> 68
tagctttgtg ttttcagtag cacct 25
<210> 69
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M214位点的上游引物
<400> 69
tcaaaaacta ctggttactt tcgttcgt 28
<210> 70
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M214位点的下游引物
<400> 70
tgtcctatag gcccaggtac gc 22
<210> 71
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M231位点的上游引物
<400> 71
tggaaaatgt gggctcgttt taattat 27
<210> 72
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M231位点的下游引物
<400> 72
acagcaagtt tattcgttgt gtttga 26
<210> 73
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增TAT位点的上游引物
<400> 73
atatggactc tgagtgtaga cttgtga 27
<210> 74
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增TAT位点的下游引物
<400> 74
acaagaagaa cttcagcatt gggtat 26
<210> 75
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M178位点的上游引物
<400> 75
actccgaaag tctgcatgga ttag 24
<210> 76
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M178位点的下游引物
<400> 76
agtactgaat gcagcaatac tgtct 25
<210> 77
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M175位点的上游引物
<400> 77
gatttaaact ctctgaatca ggcacatg 28
<210> 78
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M175位点的下游引物
<400> 78
cttgattgac tgtaatccat gtactttgtc 30
<210> 79
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增L466的下游引物
<400> 79
aattgccata tgagagtcat cataggtg 28
<210> 80
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增L466位点的下游引物
<400> 80
ctctttcacc atagtaaaga cttggatg 28
<210> 81
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M119位点的上游引物
<400> 81
aaaaatgtta tgggttattc caattcagca 30
<210> 82
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M119位点的下游引物
<400> 82
ccaaggtaaa tgactcaccc taagga 26
<210> 83
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增P203.1位点的上游引物
<400> 83
agttgttaac ctgtgctcaa atcct 25
<210> 84
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增P203.1位点的下游引物
<400> 84
cgaatgtgct gtattgtgct gtatt 25
<210> 85
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增F140位点的上游引物
<400> 85
ggatcatgaa tctgcagcga aca 23
<210> 86
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增F140位点的下游引物
<400> 86
caggacaatg aaacattgag agatgttg 28
<210> 87
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增F78位点的上游引物
<400> 87
gacatacaca caggcataga aaagaaag 28
<210> 88
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增F78位点的下游引物
<400> 88
cactttttca agtgatgttt taggcact 28
<210> 89
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增P31位点的上游引物
<400> 89
gggaacaggt aggtggtatt tgg 23
<210> 90
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增P31位点的下游引物
<400> 90
ctgatacacg agaatcgctt ggg 23
<210> 91
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M95位点的上游引物
<400> 91
ccagcaatag tgttgcacct tct 23
<210> 92
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M95位点的下游引物
<400> 92
ccacattttg gtagtgcacc tgtt 24
<210> 93
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M88位点的上游引物
<400> 93
gctatggcct aggtgctttt cttat 25
<210> 94
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M88位点的下游引物
<400> 94
tatggtcttc catgtgatgg tcagta 26
<210> 95
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M176位点的上游引物
<400> 95
cattcttgag tgtgtggctt tcgta 25
<210> 96
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M176位点的下游引物
<400> 96
atgcacagag agaaataccc gaatt 25
<210> 97
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M122位点的上游引物
<400> 97
aggcgatgct gatatgctag ttc 23
<210> 98
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M122位点的下游引物
<400> 98
caaacttggt aaactctact tagttgcc 28
<210> 99
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M324位点的上游引物
<400> 99
cagaaacact gtcaatctga tttgatct 28
<210> 100
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M324位点的下游引物
<400> 100
tgtcatgata ttcacatttc tgaaatgctc 30
<210> 101
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增P197位点的上游引物
<400> 101
ggccagcgaa atgatgacta attg 24
<210> 102
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增P197位点的下游引物
<400> 102
tgaatccact agagaaagct acatagga 28
<210> 103
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增P200位点的上游引物
<400> 103
cccattctat ctgttcctct ctcatgta 28
<210> 104
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增P200位点的下游引物
<400> 104
cttgactgtt gaatggagat acatcttg 28
<210> 105
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增L467(KL2)位点的上游引物
<400> 105
accatctgtc ctcatccatt taaagg 26
<210> 106
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增L467(KL2)的下游引物
<400> 106
tgtgctccat gaaaaacatc gtaac 25
<210> 107
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增JST002611位点的上游引物
<400> 107
ccaacatact cgccaatcca atg 23
<210> 108
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增JST002611位点的下游引物
<400> 108
cagataccca gcagtattag ctgtg 25
<210> 109
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增F11位点的上游引物
<400> 109
tacggtgcaa agtagcttga gatttta 27
<210> 110
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增F11位点的下游引物
<400> 110
actgtactat cacacaattt tgtcagc 27
<210> 111
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增P201位点的上游引物
<400> 111
aatatttact gagcatgatg tgctgtg 27
<210> 112
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增P201位点的下游引物
<400> 112
cactaacccc aaatcccaag gtag 24
<210> 113
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M133和M134位点的上游引物
<400> 113
tgtggagaga tacttttgat cccc 24
<210> 114
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M133和M134位点的下游引物
<400> 114
ggctttctga agcaaatacc agctt 25
<210> 115
<211> 33
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M117位点的上游引物
<400> 115
tcactaaaga gcttattaga tgatagaaaa aca 33
<210> 116
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M117位点的下游引物
<400> 116
accagcaaaa cttttcctat agaagca 27
<210> 117
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增F444位点的上游引物
<400> 117
gtcacatgtc ttttggatac aaaccttc 28
<210> 118
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增F444位点的下游引物
<400> 118
ggcattcgct cttaataaaa catgct 26
<210> 119
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增F629位点上游引物
<400> 119
acctgctcca cttgtacata ctactc 26
<210> 120
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增F629位点的下游引物
<400> 120
aaaaatctgt ttgctggtgc acaa 24
<210> 121
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增F46位点的上游引物
<400> 121
attaggattt cagtataccc cttggga 27
<210> 122
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增F46位点的下游引物
<400> 122
ctccttttca ctgcaatgac cgt 23
<210> 123
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M45位点的上游引物
<400> 123
tctaggagag aggatatcaa aaattggc 28
<210> 124
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M45位点的下游引物
<400> 124
tacaactctc ctactctgat gagca 25
<210> 125
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M242位点的上游引物
<400> 125
ctacggcata gaaagtttgt gcaaaa 26
<210> 126
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M242位点的下游引物
<400> 126
tatttcgctt taagggcttt cagca 25
<210> 127
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M346位点的上游引物
<400> 127
ggaagagtaa atctgtccct ctatcct 27
<210> 128
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M346位点的下游引物
<400> 128
tgtaggagga tattcttcca ctcactc 27
<210> 129
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M3位点的上游引物
<400> 129
taagggcatc tttcatttta ggtacca 27
<210> 130
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M3位点的下游引物
<400> 130
gacacatctg aacactagtg gatttgc 27
<210> 131
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M207位点的上游引物
<400> 131
aggaaaaatc agaagtatcc ctgaagaa 28
<210> 132
<211> 29
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M207位点的下游引物
<400> 132
tcacttcaac ctcttgttgg aagattatt 29
<210> 133
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M173位点的上游引物
<400> 133
cacagtactc actttaggtt tgccata 27
<210> 134
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M173位点的下游引物
<400> 134
tttcccagat cctgaaaaca aaacact 27
<210> 135
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M17位点的下游引物
<400> 135
gccttgtctt gaagtggtat tggg 24
<210> 136
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M17位点的下游引物
<400> 136
catctgaaac ccacatacaa cagtc 25
<210> 137
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M343位点的上游引物
<400> 137
accctagcct tttaaatatg caaatgc 27
<210> 138
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M343位点的下游引物
<400> 138
acctttaata tgcaaatgcc agcgtta 27
<210> 139
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M124位点的上游引物
<400> 139
tgatcaactt ctttccctca acatagtt 28
<210> 140
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增M124位点的下游引物
<400> 140
ggcaacacca gaatctaaca aagcaa 26
<210> 141
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增rs17276345位点的上游引物
<400> 141
attattacca tcacctggca ctgaga 26
<210> 142
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增rs17276345的下游引物
<400> 142
ggaaaagggt ggaacaagac atttag 26
<210> 143
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增rs2075640位点的上游引物
<400> 143
ggttagttca gctgagcact cttc 24
<210> 144
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 扩增rs2075640位点的下游引物
<400> 144
gcatttcctc ggtcagagaa gg 22
Claims (5)
1.基于74个Y染色体SNP遗传标记的法医学二代测序试剂盒，其特征在于：包括复合扩增引物混合物；所述的复合扩增引物混合物包含了74个Y染色体SNP遗传标记的共计144条扩增引物，各扩增引物的核苷酸序列分别如表1中SEQ ID No.1至SEQ ID No.144所示：
表1复合扩增引物
上表中，SNP位点M69与M82，M133与M134在Y染色体上物理位置接近，故采用的是同一对扩增引物。
2.根据权利要求1所述的基于74个Y染色体SNP遗传标记的法医学二代测序试剂盒，其特征在于：还包括复合扩增反应混合液。
3.根据权利要求1所述的基于74个Y染色体SNP遗传标记的法医学二代测序试剂盒，其特征在于：还包括标准DNA。
4.根据权利要求3所述的基于74个Y染色体SNP遗传标记的法医学二代测序试剂盒，其特征在于：所述标准DNA为2800M标准DNA。
5.权利要求1～4任一项所述的基于74个Y染色体SNP遗传标记的法医学二代测序试剂盒在对未知来源的中国男性样本进行单倍群划分中的用途。
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|---|---|
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Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107012226A (zh) * | 2017-04-20 | 2017-08-04 | 司法部司法鉴定科学技术研究所 | 一种基于高通量测序的snp位点的检测试剂盒及其检测方法 |
| CN107153776A (zh) * | 2017-03-30 | 2017-09-12 | 深圳市早知道科技有限公司 | 一种y单倍群检测方法 |
| CN108060237A (zh) * | 2018-01-12 | 2018-05-22 | 四川大学 | 基于55个y染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒 |
| CN108220413A (zh) * | 2018-02-05 | 2018-06-29 | 浙江省公安物证鉴定中心 | 联合检测人Y染色体STR和Indel基因座的荧光复合扩增试剂盒及其应用 |
| CN108300790A (zh) * | 2018-01-12 | 2018-07-20 | 四川大学 | 基于165个y-snp的法医学二代测序试剂盒 |
| CN108517364A (zh) * | 2018-03-22 | 2018-09-11 | 四川大学 | 基于56个y染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒 |
| CN108531561A (zh) * | 2017-03-01 | 2018-09-14 | 云南序源生物技术开发有限公司 | 一种快速检测用于鉴定y染色体单倍型谱系的snp特征位点的试剂盒及方法 |
| CN108841968A (zh) * | 2018-06-28 | 2018-11-20 | 北京水母科技有限公司 | 一种使用高通量dna杂交芯片的人类y染色体snp分型方法 |
| CN108950005A (zh) * | 2018-05-06 | 2018-12-07 | 朱波峰 | 一种常染色体始祖30个snp位点的法医学检测系统及其应用 |
| CN109321662A (zh) * | 2018-10-31 | 2019-02-12 | 浙江省公安物证鉴定中心 | 一种人类Y染色体15个Indel基因座的荧光标记复合扩增试剂盒 |
| CN111575386A (zh) * | 2020-05-27 | 2020-08-25 | 广州市刑事科学技术研究所 | 一种检测人y-snp基因座的荧光复合扩增试剂盒及应用 |
| CN111647668A (zh) * | 2020-07-06 | 2020-09-11 | 苏州市公安局刑事科学技术研究所 | 一种检测人类50个y-snp基因座的快速荧光复合扩增试剂盒及应用 |
| CN112342303A (zh) * | 2020-12-04 | 2021-02-09 | 郑州高新生物技术有限公司 | 一种基于ngs的人类y染色体str和snp遗传标记联合检测体系及检测方法 |
| CN112695100A (zh) * | 2021-01-12 | 2021-04-23 | 郑州高新生物技术有限公司 | 一种基于ngs的str和snp遗传标记联合检测体系及检测方法 |
| WO2023030260A1 (zh) * | 2021-08-30 | 2023-03-09 | 司法鉴定科学研究院 | 一种基于二代测序技术检测y-snp单倍群的引物组合物、试剂盒和方法及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101914628A (zh) * | 2010-09-02 | 2010-12-15 | 深圳华大基因科技有限公司 | 检测基因组目标区域多态性位点的方法及 系统 |
| CN103131787A (zh) * | 2013-03-11 | 2013-06-05 | 四川大学 | 基于y染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒 |
| CN104164504A (zh) * | 2014-08-05 | 2014-11-26 | 广东华美众源生物科技有限公司 | 一种人类y染色体27个str基因座的荧光标记复合扩增试剂盒 |
-
2016
- 2016-10-26 CN CN201610948456.XA patent/CN106399543B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101914628A (zh) * | 2010-09-02 | 2010-12-15 | 深圳华大基因科技有限公司 | 检测基因组目标区域多态性位点的方法及 系统 |
| CN103131787A (zh) * | 2013-03-11 | 2013-06-05 | 四川大学 | 基于y染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒 |
| CN104164504A (zh) * | 2014-08-05 | 2014-11-26 | 广东华美众源生物科技有限公司 | 一种人类y染色体27个str基因座的荧光标记复合扩增试剂盒 |
Cited By (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108531561A (zh) * | 2017-03-01 | 2018-09-14 | 云南序源生物技术开发有限公司 | 一种快速检测用于鉴定y染色体单倍型谱系的snp特征位点的试剂盒及方法 |
| CN107153776B (zh) * | 2017-03-30 | 2020-05-12 | 深圳市早知道科技有限公司 | 一种y单倍群检测方法 |
| CN107153776A (zh) * | 2017-03-30 | 2017-09-12 | 深圳市早知道科技有限公司 | 一种y单倍群检测方法 |
| CN107012226A (zh) * | 2017-04-20 | 2017-08-04 | 司法部司法鉴定科学技术研究所 | 一种基于高通量测序的snp位点的检测试剂盒及其检测方法 |
| CN108060237A (zh) * | 2018-01-12 | 2018-05-22 | 四川大学 | 基于55个y染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒 |
| CN108300790A (zh) * | 2018-01-12 | 2018-07-20 | 四川大学 | 基于165个y-snp的法医学二代测序试剂盒 |
| CN108300790B (zh) * | 2018-01-12 | 2021-01-26 | 四川大学 | 基于165个y-snp的法医学二代测序试剂盒 |
| CN108220413A (zh) * | 2018-02-05 | 2018-06-29 | 浙江省公安物证鉴定中心 | 联合检测人Y染色体STR和Indel基因座的荧光复合扩增试剂盒及其应用 |
| CN108220413B (zh) * | 2018-02-05 | 2021-06-29 | 浙江省公安物证鉴定中心 | 联合检测人Y染色体STR和Indel基因座的荧光复合扩增试剂盒及其应用 |
| CN108517364A (zh) * | 2018-03-22 | 2018-09-11 | 四川大学 | 基于56个y染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒 |
| CN108517364B (zh) * | 2018-03-22 | 2021-01-15 | 四川大学 | 基于56个y染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒 |
| CN108950005A (zh) * | 2018-05-06 | 2018-12-07 | 朱波峰 | 一种常染色体始祖30个snp位点的法医学检测系统及其应用 |
| CN108841968A (zh) * | 2018-06-28 | 2018-11-20 | 北京水母科技有限公司 | 一种使用高通量dna杂交芯片的人类y染色体snp分型方法 |
| CN109321662A (zh) * | 2018-10-31 | 2019-02-12 | 浙江省公安物证鉴定中心 | 一种人类Y染色体15个Indel基因座的荧光标记复合扩增试剂盒 |
| CN109321662B (zh) * | 2018-10-31 | 2022-03-29 | 浙江省公安物证鉴定中心 | 一种人类Y染色体15个Indel基因座的荧光标记复合扩增试剂盒 |
| CN111575386A (zh) * | 2020-05-27 | 2020-08-25 | 广州市刑事科学技术研究所 | 一种检测人y-snp基因座的荧光复合扩增试剂盒及应用 |
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