CN109321662A - 一种人类Y染色体15个Indel基因座的荧光标记复合扩增试剂盒 - Google Patents
一种人类Y染色体15个Indel基因座的荧光标记复合扩增试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种人类Y染色体15个Indel基因座的荧光标记复合扩增试剂盒，包括Y染色体15个Indel基因座：rs762582194、rs745561109、rs111833592、rs761724116、rs779415702、rs3054886、rs3841328、rs5901134、rs10580089、rs10669694、rs113742007、rs34332882、rs34168743、rs199815934和rs370867958。本发明用于法医学亲权鉴定及个人识别。
Description
技术领域
本发明属于个体鉴定检测试剂盒，尤其涉及一种可应用于法医个体识别、亲权鉴定及DNA家谱构建等方面的人类Y染色体15个Indel基因座的荧光标记复合扩增试剂盒。
背景技术
人类Y染色体是近端着丝粒染色体，根据遗传方式不同可以将其分为两个区，即位于Y染色体两段的拟常染区和男性特异区。减数分裂时，拟常染区要与X染色体进行交换重组，而男性特异区则不发生交换，呈单倍型由父亲独立遗传给儿子，并且存有父系祖先的突变记录，是形成男性特异区多态性的基础。
Y染色体遗传标记具有男性特有、父系遗传及单倍型遗传等三大特征，使其在法医DNA检验、亲权鉴定和追溯人类的起源与进化等方面具有巨大应用潜力。Y染色体遗传标记总体上可分为两类:一类是高突变率的多等位基因(Multi-allelic Markers)，代表是微卫星(STRs)；还有一类是低突变率的双等位基因(Bi-allelic Markers)，代表是单核苷酸多态性(SNPs)和小片段插入/缺失(Indels)。
STR遗传标记，是一类由2～6个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列，可进行法医学个体识别、亲子鉴定及DNA家谱构建等。
Indels遗传标记是基于基因组中插入或缺失位点两侧的序列设计特异性引物进行PCR扩增，目前DNA实验室主要使用基于PCR和毛细管电泳技术分型，该操作简单、快捷。Indel可分为：单个碱基对的插入/缺失、单碱基对重复插入、多碱基多重复插入、转座子插入、随机DNA序列的插入/缺失。
Indels遗传标记，遗传稳定、突变率低，具有很强的群体特异性，能清晰记录群体历史，是研究群体父系祖先迁徙史，适用于群体间遗传关系的研究。同时，Indels遗传标记扩增片段短，可用于提高高度降解检材的检出率。
发明内容
鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提出一种人类Y染色体15个Indel基因座的荧光标记复合扩增试剂盒。本发明可以同时扩增15个Y染色体插入缺失基因座，满足法医检测。
本发明的目的将通过以下技术方案得以实现：
一种人类Y染色体15个Indel基因座的荧光标记复合扩增试剂盒，包括如下Y染色体15个Indel基因座：rs762582194、rs745561109、rs111833592、rs761724116、rs779415702、rs3054886、rs3841328、rs5901134、rs10580089、rs10669694、rs113742007、rs34332882、rs34168743、rs199815934和rs370867958。
在一些实施例中，所述Y染色体15个Indel基因座对应的15组引物对依次分别为：SEQ NO.1-2、SEQ NO.3-4、SEQ NO.5-6、SEQ NO.7-8、SEQ NO.9-10、SEQ NO.11-12、SEQNO.13-14、SEQ NO.15-16、SEQ NO.17-18、SEQ NO.19-20、SEQ NO.21-22、SEQ NO.23-24、SEQNO.25-26、SEQ NO.27-28、SEQ NO.29-30。
在一些实施例中，所述15组引物对的浓度为0.072～0.22μM。
在一些实施例中，所述15组引物对的浓度依次分别为0.072～0.088μM、0.09～0.11μM、0.081～0.099μM、0.117～0.143μM、0.09～0.11μM、0.144～0.176μM、0.081～0.099μM、0.099～0.121μM、0.135～0.165μM、0.18～0.22μM、0.117～0.143μM、0.09～0.11μM、0.108～0.132μM、0.099～0.121μM、0.144～0.176μM。
在一些实施例中，所述每个Indel基因座中的至少一条引物5’的标记有荧光染料。
在一些实施例中，所述引物对标记的荧光染料包括6-FAM和/或Alexa Fluor 488。
在一些实施例中，所述试剂盒包括分子量内标。
在一些实施例中，所述Y染色体15个基因座的扩增方法包括PCR扩增，其扩增产物的检测采用毛细管电泳检测。
在一些实施例中，所述试剂盒进一步包括缓冲液，所述缓冲液包括Tris-HCl、一价阳离子、二价阳离子、或dNTP中的一种或其任意组合。
在一些实施例中，所述每个Y染色体基因座的扩增长度小于200bp。
一种上述的试剂盒的应用，所述试剂盒用于亲权鉴定、个体识别。
在一些实施例中，所述试剂盒用于降解检材的检测、或种族鉴定。
在一些实施例中，所述种族鉴定时，所述每个基因座在不同人群中的等位基因频率的差异大于0.3。
与现有技术相比，本发明提供的一种人类Y染色体15个Indel基因座的荧光标记复合扩增试剂盒，达到的技术效果是：1、本试剂盒检测所需的扩增片段短，适合与高度降解DNA模板的检测，尤其是在STR分型结果失败或仅获得部分STR基因座分型的情况下使用；2、Y-Indel与STR相比，本质上属于长度多态性，本申请可以应用目前法医DNA实验室普及的PCR-毛细管电泳平台进行检测分析，检测技术易于掌握；3、本申请可在单管反应中同时扩增15个Y染色体插入缺失基因座；4、本申请为法医学亲权鉴定及个人识别提供了一种新的技术手段，特别适用于法医学常见的降解检材的检测及未知来源的男性样本所属种族来源的辅助推断，具体的：a.Y-Indel源于单突变事件，其突变频率较低，约为10-8，基因座遗传稳定性高，本申请可以作为亲权关系鉴定的辅助性工具；b.Y-Indel可以作为始祖多态性基因座，即在不同地理起源的人群中等位基因频率存在显著性差异的遗传标记，本申请在法医学应用中可以用来辅助推断未知DNA样本的种族来源。
附图说明
图1是根据本申请一些实施例所示的Data Y30试剂盒降解样本分型图；
图2是根据本申请一些实施例所示的Y-Indel试剂盒降解样本分型图；
图3是根据本申请一些实施例所示的Ladder分型图。
以下便结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步的详述，以使技术方案更易于理解、掌握。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，下面实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本专利保护范围中。
可以理解的是，便于说明的目的，本申请中“Y染色体Indel基因座”简称“Y-Indel基因座”；“Y染色体Indel基因座名称”使用“Y-IndelXX”代替，其中，XX使用阿拉伯数字编号表示；“引物名称”使用“Y-IndelXXX”代替，其中，前两个“XX”使用阿拉伯数字编号表示，第三个“X”使用英文字母A-Z表示。
实施例1 15个Y-Indel基因座的筛选
1、利用1000 Genomes Project、cluster、YSNP进化树和其它数据库中的遗传数据，按照东亚人群中MAF：0.2-0.5之间、剔除具有重复多态性的位点及剔除没有RS号(reference number)的位点等原则，筛选可用于个体识别的Y-Indel基因座。按照在东亚与欧洲、东亚与非洲、欧洲与非洲人群两两之间的等位基因频率差异大于0.3的原则，筛选可用于辅助推断男性样本所属种族来源的Y-Indel基因座，从以上数据库中共筛选出22个Y-Indel基因座。所有测试基因座如下：Y-Indel01(rs762582194)、Y-Indel02(rs745561109)、Y-Indel03(rs111833592)、Y-Indel04(rs761724116)、Y-Indel05(rs779415702)、Y-Indel06(rs3054886)、Y-Indel07(rs3841328)、Y-Indel08(rs5901134)、Y-Indel09(rs10580089)、Y-Indel10(rs10669694)、Y-Indel11(rs113742007)、Y-Indel12(rs34332882)、Y-Indel13(rs34168743)、Y-Indel14(rs199815934)、Y-Indel15(rs370867958)、Y-Indel16(rs761572000)、Y-Indel17(rs779815914)、Y-Indel18(rs779708038)、Y-Indel19(rs3830300)、Y-Indel20(rs5901176)、Y-Indel21(rs6151240)、Y-Indel22(rs10552339)。
具体的，22个Y-Indel基因座在不同人群中的等位基因频率如表1：
表1 22个Y-Indel基因座在不同人群中的等位基因频率
最后，通过PCR测试，对表1进行筛选出测试结果较好基因座，共筛选15个基因座，具体的，本申请中所包含的每个基因座在不同人群中的等位基因频率如表2所述：
表2每个基因座在不同人群中的等位基因频率
实施例2、Y-Indel基因座引物序列及相应浓度的确定
(1)Y-Indel基因座引物序列的确定
首先，根据基因座的RS序列号，利用NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行基因座序列下载；其次，根据UCSC网站(http://genome.ucsc.edu/)查找每个基因座检测序列外存在的其他突变位点。
引物设计时需要注意一下几点：a、避免引物间二聚体和发卡结构，以免影响引物的扩增效率；b、确保引物序列中不包含SNP位点，特别是引物3’端序列尤为重要，如果存在SNP点可能会出现扩增丢失；c、引物序列需要利用NCBI进行blast比对，保证序列的特异性；d、确保所有引物具有相近的熔炼温度，确保同一退火温度下，具有相近的扩增效率。
随着复合扩增系统中引物数量的增加，不同基因座引物之间的相互干扰也越来越严重，反应体系的动力学变得越来越复杂，因此需要设计大量的引物序列进行复杂的测试，最终保证试剂盒的扩增特异性及效率。
便于说明的目的，本申请仅仅提供一个实施例来保证试剂盒的扩增特异性及效率。首先，进行引物的单扩实验，排除有非特异、扩增效率低的引物，通过调整引物序列的方式，对引物序列重新设计合成；其次，逐个添加15个基因座的引物，和单扩一样，需要排除产生非特异及扩增效率低的引物，若存在非特异和效率问题，同样通过调整引物序列的方式，对引物序列加以改进。
基于上述说明及其方法，本申请提供所有Y-Indel基因座的特异性扩增引物，各基因座的引物序列如表2所示。
表2 15个Y-Indel基因座的引物序列
(2)Y-Indel基因座引物浓度的确定
复合扩增试剂盒中由于每个基因座的引物序列、扩增子大小和引物扩增效率不同，如果要使试剂盒的检测结果达到较高的均衡性要求，就需要对不同基因座的引物浓度进行摸索调整。例如，本申请的每个Y染色体基因座的扩增子大小均小于200bp，15个不同基因座的引物浓度可以依次为0.072～0.088μM、0.09～0.11μM、0.081～0.099μM、0.117～0.143μM、0.09～0.11μM、0.144～0.176μM、0.081～0.099μM、0.099～0.121μM、0.135～0.165μM、0.18～0.22μM、0.117～0.143μM、0.09～0.11μM、0.108～0.132μM、0.099～0.121μM、0.144～0.176μM。又例如，本申请的每个Y染色体基因座的扩增子大小均小于200bp，不同基因座的引物浓度也可以依次如表3所示。
表3 15个Y-Indel基因座引物浓度
实施例3、PCR反应Buffer缓冲液的确定
PCR反应buffer缓冲液包含Tris-HCl缓冲液、一价阳离子、二价阳离子、dNTP，以及根据PCR需要选择合适的添加剂。添加剂可以包括但不限于甘油、BSA、或TC中的一种或多种。为了能够使PCR扩增提高扩增特异性、效率以及抗抑制能力，本申请提供一个实施例，对以上各种buffer缓冲液组分进行优化。
具体的，PCR体系中，Tris-HCl分别测试5mM、10mM、20mM、40mM共4梯度，最适浓度为10mM；KCl分别测试20mM、30mM、40mM、50mM、60mM共5梯度，最适浓度为50mM；Mg2+和dNTPs浓度测试，Mg2+测试2.0mM、2.5mM、3.0mM、3.5mM，共4个梯度，dNTPs测试0.2mM、0.25mM、0.30mM、0.35mM，共4个梯度，最终Mg2+和dNTPs的最适浓度分别为3.0mM和0.3mM；甘油分别测试4％、5％、6％、8％、10％，共5梯度，最适浓度为8％；BSA分别测试0.4mg/mL、0.8mg/mL、1mg/mL、1.2mg/mL，共4梯度，最适浓度为1mg/mL；TC分别测试10mM、20mM、30mM、40mM，共4梯度，最适浓度为20mM。
进一步的，在一些实施例中，根据以上各组分的最适浓度，将各组分的最适浓度混合，即组成本申请中试剂盒的PCR反应buffer缓冲液。
其中，PCR反应buffer中每种化学组分的浓度如表4所示：
表4 PCR反应buffer的各组分
| Buffer组分 | PCR反应浓度 |
| Tris-HCl | 10mM |
| KCl | 50mM |
| MgCl<sub>2</sub> | 3.0mM |
| dNTP | 0.3mM |
| 甘油 | 8％ |
| BSA | 1mg/mL |
| TC | 20mM |
实施例4一种同时分析人类Y染色体15个Indel基因座的荧光标记复合扩增试剂盒组成及其应用。
1)其中，上述荧光标记符合扩增试剂盒可以包括PCR扩增体系，PCR扩增体系可以如表5所示：
表5 PCR扩增体系
2)PCR扩增程序如表6
表6 PCR扩增程序：
3)PCR产物毛细管电泳检测：
扩增产物3000rpm离心5分钟，取1μL产物或Y-Indel Ladder与0.5μL AGCU MarkerSIZ-500和12μL去离子甲酰胺混合，95℃变性3分钟后冰浴，毛细管电泳检测。其中，扩增产物的检测方法还可以包括但不限于琼脂糖、或聚丙烯酰胺。
根据本申请的基因座，对其排布如下：Y-Indel01、Y-Indel02、Y-Indel03、Y-Indel04、Y-Indel05、Y-Indel06、Y-Indel07、Y-Indel08、Y-Indel09、Y-Indel10、Y-Indel11、Y-Indel12、Y-Indel13、Y-Indel14、Y-Indel15为第一通道，荧光染料标记物为FAM；分子量内标为第六通道，荧光染料标记物为SIZ。荧光染料标记在引物对上游引物上。其中，上述荧光染料标记物还可以选用6-FAM和/或Alexa Fluor 488。
实施例5、本申请在降解检材检测中的应用
A.收集高度降解生物检材；
B.分别利用Data Y30、本申请中Y-Indel试剂盒进行PCR扩增；
C.扩增结果利用毛细管电泳法分析，Data Y30、本申请中Y-Indel试剂盒分型结果分别如图1和图2，Ladder分型结果如图3。
犯罪现场的各种法医DNA检材，由于所处环境的温度、湿度、化学及生物等因素的作用，DNA分子被损坏，发生断裂，分子变小，大片段丢失。
如图1所示，Data Y30作为STR复合扩增试剂盒，检测上述DNA高度降解样本时，会出现扩增效率随片段长度增大而逐渐降低现象，甚至大部分长片段STR基因座不能被检出，出现等位基因丢失现象。
如图2所示得知，本申请的试剂盒检测所需的扩增片段短，适合与高度降解DNA模板的检测，尤其是在STR分型结果失败或仅获得部分STR基因座分型的情况下使用。
实施例6、本申请的试剂盒在种族鉴定中的应用
1)东亚人及欧洲人样本采集：东亚人样本是本申请人自有、欧洲人样本是controlDNA 9948；
2)分别利用本申请Y-Indel试剂盒进行PCR扩增；
3)扩增结果利用毛细管电泳法分析，统计Y-Indel试剂盒分型结果，如表5。
上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 浙江省公安物证鉴定中心 浙江安宁生物科技有限公司
<120> 一种人类Y染色体15个Indel基因座的荧光标记复合扩增试剂盒
<141> 2018-10-31
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<400> 25
cccgtctcta ctaaaaatac 20
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
acaggcatga gccaccgtg 19
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gaaaacatag acaccataaa gg 22
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
agtaaagaat attaatgata cctt 24
<210> 29
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ctaaataaca atcatcatgt tactac 26
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cgctgcatgg tgtcttctca gag 23
Claims (13)
1.一种人类Y染色体15个Indel基因座的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于，包括如下Y染色体15个Indel基因座：rs762582194、rs745561109、rs111833592、rs761724116、rs779415702、rs3054886、rs3841328、rs5901134、rs10580089、rs10669694、rs113742007、rs34332882、rs34168743、rs199815934和rs370867958。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述Y染色体15个Indel基因座对应的15组引物对依次分别为：SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4、SEQ ID NO.5-6、SEQ ID NO.7-8、SEQ ID NO.9-10、SEQ ID NO.11-12、SEQ ID NO.13-14、SEQ ID NO.15-16、SEQ ID NO.17-18、SEQ ID NO.19-20、SEQ ID NO.21-22、SEQ ID NO.23-24、SEQ ID NO.25-26、SEQ IDNO.27-28、SEQ ID NO.29-30。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述15组引物对的浓度为0.072～0.22μM。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述15组引物对的浓度依次分别为0.072～0.088μM、0.09～0.11μM、0.081～0.099μM、0.117～0.143μM、0.09～0.11μM、0.144～0.176μM、0.081～0.099μM、0.099～0.121μM、0.135～0.165μM、0.18～0.22μM、0.117～0.143μM、0.09～0.11μM、0.108～0.132μM、0.099～0.121μM、0.144～0.176μM。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述每个Indel基因座中的至少一条引物的5’端标记有荧光染料。
6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对标记的荧光染料包括6-FAM和/或Alexa Fluor 488。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括分子量内标。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述Y染色体15个基因座的扩增方法包括PCR扩增，其扩增产物的检测采用毛细管电泳检测。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括缓冲液，所述缓冲液包括Tris-HCl、一价阳离子、二价阳离子、或dNTP中的一种或其任意组合。
10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述每个Y染色体基因座的扩增长度小于200bp。
11.一种根据权利要求1-10任一项所述的试剂盒的应用，其特征在于，所述试剂盒用于亲权鉴定、个体识别。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于降解检材的检测、或种族鉴定。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述种族鉴定时，所述每个基因座在不同人群中的等位基因频率的差异大于0.3。
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