CN106520976A - 一种扩增人y染色体str基因座的多色荧光复合扩增试剂盒及其应用 - Google Patents
一种扩增人y染色体str基因座的多色荧光复合扩增试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种扩增人Y染色体STR基因座的多色荧光复合扩增试剂盒及其应用，在单个扩增体系中可以检测30个STR基因座。与现有技术相比：(1)本发明所述试剂盒中包含的基因座具有多态性高、突变率低的优点，且频率分布合理、个体识别力高，从而保证相同家系分型的同一性以及不同家系间分型的差异性；(2)本发明所述试剂盒具有很强的检材适应性，能够检测多种样本。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及分子遗传学，具体涉及一种扩增人Y染色体STR基因座的多色荧光复合扩增试剂盒及其在法医鉴定、亲权鉴定和家系排查中的应用。
背景技术
DNA-STR分型技术由于具有特异性好，灵敏度高，分型简便快速，易于标准化等优点，自20世纪90年代以来已成为法医物证检验的主要手段之一。当前法庭科学上常用的Y染色体上的短串联重复位点(Y-STR)主要都是选择非重组区，因此这些Y-STR完全连锁，整个Y-STR单倍型上的所有STR基因座可以作为一个整体的遗传标记。所以，利用Y-STR进行个体识别与父权鉴定相关机率计算不能参照常染色体的累计法，只能以单倍型概率计算，因此必须不断增加新的Y染色体遗传标记来提高个体识别力。目前，市面上主流试剂盒有Plus、Y23、AGCU Y24等荧光检测试剂盒，基因座数量分别为17个、27个(7个快速突变位点)、23个(2个快速突变位点)、24个。而且， Plus、Y23位点选择主要是基于欧洲，非洲和南亚人群，Y-STR的频率分布和个体识别力会因群体而有所差异。因此，选择适合中国人群的Y-STR位点，同时适当的提高位点数量，可以有针对性地提高中国人群的Y-STR单倍型的个体识别力。
法庭科学中的工具可以分为两种，一种是排查工具，一种是认定工具。相对于常染色体STR位点，Y-STR单倍型在个体识别方面的个体识别力较低，不能用于唯一性的个体认定，只能作为辅助公安刑侦调查的工具。Y-STR独特的优势在于同一父系所有男性样本分型一致(也就是父系遗传)的特点，可以作为家系排查的工具，从而有效缩小侦查范围。Y-STR试剂盒的分型结果首先应尽量保证相同家系分型的同一性，其次确保不同家系间分型的差异性。因此，Y-STR试剂盒应该选择多态性较高，而且突变率较低的基因座。
发明内容
解决的技术问题：为了克服现有技术的缺陷，获得一种基因多样性值高、突变率低，且频率分布合理、个体识别力高的试剂盒，本发明提供了一种扩增人Y染色体STR基因座的多色荧光复合扩增试剂盒及其应用。
技术方案：一种扩增人Y染色体STR基因座的多色荧光复合扩增试剂盒，所述试剂盒包含30对STR基因座的特异性扩增引物，其中STR基因座为：DYS557、DYS520、DYS549、DYS389I、DYS439、DYS389II、DYS392、DYS447、DYS19、DYS391、DYS635、DYS456、DYS522、DYS438、DYS527a、DYS527b、DYS622、DYS587、DYS481、DYS437、DYS390、DYS448、GATA_H4、DYS460、DYS393、DYS443、DYS385a、DYS385b、DYS444、DYS643。
优选的，所述30对STR基因座的特异性扩增引物的序列如下：DYS557、SEQ ID NO:1～2；DYS520、SEQ ID NO:3～4；DYS549、SEQ ID NO:5～6；DYS389I、SEQ ID NO:7～8；DYS439、SEQ ID NO:9～10；DYS389II、SEQ ID NO:11～12；DYS392、SEQ ID NO:13～14；DYS447、SEQ ID NO:15～16；DYS19、SEQ ID NO:17～18；DYS391、SEQ ID NO:19～20；DYS635、SEQ ID NO:21～22；DYS456、SEQ ID NO:23～24；DYS522、SEQ ID NO:25～26；DYS438、SEQ ID NO:27～28；DYS527a和DYS527b、SEQ ID NO:29～30；DYS622、SEQ ID NO:31～32；DYS587、SEQ ID NO:33～34；DYS481、SEQ ID NO:35～36；DYS437、SEQ ID NO:37～38；DYS390、SEQ ID NO:39～40；DYS448、SEQ ID NO:41～42；GATA_H4、SEQ ID NO:43～44；DYS460、SEQ ID NO:45～46；DYS393、SEQ ID NO:47～48；DYS443、SEQ ID NO:49～50；DYS385a和DYS385b、SEQ ID NO:51～52；DYS444、SEQ ID NO:53～54；DYS643、SEQ ID NO:55～56。
优选的，所述引物的浓度如下：DYS557、0.1μM；DYS520、0.12μM；DYS549、0.09μM；DYS389I、0.11μM；DYS439、0.2μM；DYS389II、0.12μM；DYS392、0.3μM；DYS447、0.44μM；DYS19、0.6μM；DYS391、0.1μM；DYS635、0.2μM；DYS456、0.12μM；DYS522、0.22μM；DYS438、0.24μM；DYS527a和DYS527b、0.31μM；DYS622、0.2μM；DYS587、0.26μM；DYS481、0.13μM；DYS437、0.21μM；DYS390、0.18μM；DYS448、0.15μM；GATA_H4、0.2μM；DYS460、0.13μM；DYS393、0.1μM；DYS443、0.2μM；DYS385a和DYS385b、0.21μM；DYS444、0.22μM；DYS643、0.35μM。
所述引物的序列及浓度如表1所示：
表1 引物序列及浓度
优选的，所述基因座的基因多样性值大于0.6，突变率小于5‰。所述各基因座的多态性及突变率数据如表2所示：
表2 基因座多态性及突变率
优选的，所述引物分为五组：第一组，DYS392、DYS389I、DYS447、DYS389II、DYS438、DYS527a、DYS527b、DYS522；第二组，DYS391、DYS456、DYS19、DYS622、DYS587、DYS385a、DYS385b；第三组，DYS481、DYS437、DYS390、DYS460、DYS643；第四组，DYS393、GATA_H4、DYS439、DYS635、DYS444、DYS448；第五组、DYS549、DYS443、DYS557、DYS520；每对引物中至少一条采用荧光染料标记其5’端。
上述五组引物分别置于不同的通道中，分子量内标为单独通道，荧光标记物为SIZ。
优选的，所述荧光染料为FAM、HEX、TAMRA、ROX、VIG中任意一种，且每组采用的荧光标记不同。
进一步的，各组引物5’端采用的荧光染料具体为：第一组、FAM，第二组、HEX，第三组、TAMRA，第四组、ROX，第五组、VIG。
优选的，试剂盒中的PCR反应缓冲液包含以下化学组分：Tris-HCl、20mM，KCl、30mM，TMAC、10mM，MgCl2、1.8mM，dNTP、2mM，甘油、3％，BSA、0.8mg/mL，NP-40、1％，C-Taq DNA聚合酶、2U。
所述的一种扩增人Y染色体STR基因座的多色荧光复合扩增试剂盒在法医鉴定、亲权鉴定和家系排查中的应用。
优选的，所述样品DNA包括利用碱裂解法、Chelex法、磁珠提取法或有机法中任意一种提取的人基因组DNA及滤纸、Whatman FTA卡、棉签、纱布中任意一种载体收集的人类血液、汗液、尿液、精斑、阴道分泌物或口腔细胞。
有益效果：(1)本发明所述试剂盒中包含的基因座具有多态性高、突变率低的优点，且频率分布合理、个体识别力高，从而保证相同家系分型的同一性以及不同家系间分型的差异性；(2)本发明所述试剂盒具有很强的检材适应性，能够检测多种样本。
附图说明
图1是本发明所述试剂盒的标准DNA9948分型图；
图2是本发明所述试剂盒对血卡的直扩分型图；
图3是本发明所述试剂盒Ladder分型图；
图4是基因座排布示意图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1 Y染色体STR基因座的筛选
收集中国汉族人群1008名无关男性个体、1124对父子共2165份男性血样，测试分析48个Y-STR基因座在中国汉族人群中的遗传多态性与突变情况。所有测试基因座如下：DYS459a/b、DYS643、DYS522、DYS389I/II、DYS447、DYS576、DYS19、DYS388、DYS391、DYS635、DYS456、DYS533、DYS520、DYS622、DYS481、DYS437、DYS390、DYS630、DYS448、GATA_H4、DYS458、DYS393、DYS552、DYS570、DYS385a/b、DYS593、DYS444、DYS438、DYS527a/b、DYS392、DYS460、DYS449、DYS549、DYS439、DYS587、DYS446、DYS518、DYS627、DYS557、DYF387S1a/b、DYS510、DYS443、GATA_A10、DYS531，最后从中筛选出30个多态性大于0.6，而且突变率小于5‰的Y染色体STR基因座。
48个Y-STR基因座多态性和突变率信息统计如表3所示：
表3 48个Y-STR基因座多态性和突变率信息统计
本发明所述试剂盒选取多态性大于0.6，而且突变率小于5‰的基因座，具体多态性和突变率信息如表2所示：
表2 基因座多态性及突变率
实施例2 Y染色体STR基因座排布
结合引物设计和每个基因座的等位基因范围，进行试剂盒基因座排布。设计过程中需要注意下几点：a、选择相互间重叠程度较小的荧光染料；b、效率高的荧光染料尽可能多的排布基因座，效率低的少放基因座；c、效率低的基因座需要考虑排在小片段位置或标记效率高的荧光染料。结果为：
如图4所示，所述引物分为五组：第一组，DYS392、DYS389I、DYS447、DYS389II、DYS438、DYS527a、DYS527b、DYS522，荧光染料标记物为FAM；第二组，DYS391、DYS456、DYS19、DYS622、DYS587、DYS385a、DYS385b，荧光染料标记物为HEX；第三组，DYS481、DYS437、DYS390、DYS460、DYS643，荧光染料标记物为TAMRA；第四组，DYS393、GATA_H4、DYS439、DYS635、DYS444、DYS448，荧光染料标记物为ROX；第五组、DYS549、DYS443、DYS557、DYS520，荧光染料标记物为VIG。
实施例3 特异性引物设计及不同引物浓度调试
(1)Y-STR基因座引物序列的确定
首先，通过基因座名称或者Y染色体位置，利用UCSC或NCBI网站进行基因座序列下载；其次，根据每个基因座重复单元两侧的序列进行引物设计。
引物设计时需要注意以下几点：a、避免引物间二聚体和发卡结构，以免影响引物的扩增效率；b、确保引物序列中不包含SNP位点，特别是保证引物3’端序列的稳定性；c、引物序列需要利用NCBI进行blast比对，保证序列的特异性；d、确保所有引物具有相近的退火温度，且在同一退火温度下，具有相近的扩增效率。
随着复合扩增系统中引物数量的增加，不同基因座引物之间的相互干扰也越来越严重，反应体系的动力学变得越来越复杂，因此需要设计大量的引物序列进行复杂的测试，最终保证试剂盒的扩增特异性及效率。
首先，进行引物的单扩实验，排除非特异性、扩增效率低的引物；其次，进行单色小复扩实验，即将每一组引物分别单独混合测试，和单扩一样，需要排除产生非特异及扩增效率低的引物；最后，进行大复扩实验，即四组引物全部混合测试，在初步确定了各基因座复合扩增引物后，进行引物的初步组配，利用标准DNA以及其他实际DNA样本为模板，考察每个基因座引物的浓度及检测效率，考察非特异扩增产物，若存在，即通过调整引物序列的方式，对引物序列加以改进。
(2)Y-STR基因座引物浓度的确定
复合扩增试剂盒中由于每个基因座的引物序列、扩增子大小和引物扩增效率不同，如果要使试剂盒的检测结果达到较高的均衡性要求，就需要对不同基因座的引物浓度进行摸索调整。引物序列及浓度调整结果如表1所示：
表1 引物序列及浓度
实施例4 PCR反应Buffer的确定
PCR反应buffer包括缓冲液、一价阳离子、二价阳离子、dNTP、Taq DNA聚合酶，以及根据PCR需要选择合适的添加剂。为了提高扩增特异性、效率以及抗抑制能力，需要对以上各种buffer组分进行优化。
PCR体系中，先进行Mg2+和dNTPs浓度的正交实验，Mg2+测试1.5mM、2.0mM、2.5mM、3.0mM，共4个梯度，dNTPs测试0.15mM、0.2mM、0.25mM、0.30mM，共4个梯度，最终Mg2+和dNTPs的最适浓度分别为2.0mM和0.2mM；
C-Taq DNA聚合酶含量分别测试1.0U、1.5U、2.0U、2.5U、3.0U共5梯度，最适浓度为2.0U；Tris-HCl分别测试10mM、20mM、30mM、40mM共4梯度，最适浓度为20mM；KCl分别测试10mM、20mM、30mM、40mM、50mM共5梯度，最适浓度为30mM；TMAC分别测试10mM、20mM、30mM，共3梯度，最适浓度为10mM；甘油分别测试2％、3％、4％、5％、6％，共5梯度，最适浓度为3％；NP-40分别测试0.5％、1％、1.5％、2％、共4梯度，最适浓度为1％；BSA分别测试0.4mg/mL、0.8mg/mL、1.2mg/mL、1.6mg/mL，共4梯度，最适浓度为0.8mg/mL。将以上各组分按照最适浓度混合，即组成该试剂盒的PCR反应buffer。
实施例5 直扩检材的测试及Ladder组配
根据以上实施例组配的引物及Buffer，测试本试剂盒不同检材的适应性。其中标准DNA9948和血卡直扩结果如图1和图2所示。
等位基因分型标准物是STR基因座在人群中常见的等位基因混合物，它为每一个等位基因提供DNA片段大小的参照物。通过调整不同等位基因的浓度比例，最终组配Ladder的分型结果如图3所示。
实施例6 在男性嫌疑人家系排查过程中的应用
(1)收集犯罪现场嫌疑人样本：样本由某公安局提供。
(2)收集Y-STR数据库中比中家系的男性个体样本：样本由某公安局提供。
(3)PCR扩增及毛细管电泳跑样分析。
(4)利用AGCU Y24、Y-filer Plus试剂盒对以上两种样本进行分型检测，然后将分型结果与本试剂盒进行对比，结果如下表：
表4 男性嫌疑人家系排查统计
犯罪现场采集的男性嫌疑人样本，首先需要利用Y-STR试剂盒进行分型检测，然后再将分型结果进行Y-STR数据库比对，锁定犯罪嫌疑人所属家系，最后利用常染色体STR试剂盒进行嫌疑人身份确认。以上结果显示，嫌疑人和该家系中男性成员利用Yfiler Plus和AGCU Y24试剂盒检测时，高突变率基因座DYS449存在了一步突变，从而不能确认嫌疑人和该家系间的亲缘关系，容易导致侦查方向出现错误。本试剂盒在开发过程中利用无关男性个体和父子对对Y-STR基因座进行了大量的遗传信息统计，从中筛选了30个多态性大于0.6，突变率小于5‰的Y染色体STR基因座，非常适合法医中Y-STR数据库建设及男性个体的家系排查。
SEQUENCE LISTING
<110> 无锡中德美联生物技术有限公司
浙江省公安物证鉴定中心
<120> 一种扩增人Y染色体STR基因座的多色荧光复合扩增试剂盒及其应用
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<211> 20
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<213> 人工序列
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aggaatgtgg ctaacgctgt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
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<212> DNA
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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gaggcaagga tccaaataaa g 21
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<213> 人工序列
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gaatttcctc atatttctgg c 21
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Claims (10)
1.一种扩增人Y染色体STR基因座的多色荧光复合扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含30对STR基因座的特异性扩增引物，其中STR基因座为：DYS557、DYS520、DYS549、DYS389I、DYS439、DYS389II、DYS392、DYS447、DYS19、DYS391、DYS635、DYS456、DYS522、DYS438、DYS527a、DYS527b、DYS622、DYS587、DYS481、DYS437、DYS390、DYS448、GATA_H4、DYS460、DYS393、DYS443、DYS385a、DYS385b、DYS444、DYS643。
2.根据权利要求1所述的一种扩增人Y染色体STR基因座的多色荧光复合扩增试剂盒，其特征在于，所述30对STR基因座的特异性扩增引物的序列如下：DYS557、SEQ ID NO:1～2；DYS520、SEQ ID NO:3～4；DYS549、SEQ ID NO:5～6；DYS389I、SEQ ID NO:7～8；DYS439、SEQID NO:9～10；DYS389II、SEQ ID NO:11～12；DYS392、SEQ ID NO:13～14；DYS447、SEQ IDNO:15～16；DYS19、SEQ ID NO:17～18；DYS391、SEQ ID NO:19～20；DYS635、SEQ ID NO:21～22；DYS456、SEQ ID NO:23～24；DYS522、SEQ ID NO:25～26；DYS438、SEQ ID NO:27～28；DYS527a和DYS527b、SEQ ID NO:29～30；DYS622、SEQ ID NO:31～32；DYS587、SEQ ID NO:33～34；DYS481、SEQ ID NO:35～36；DYS437、SEQ ID NO:37～38；DYS390、SEQ ID NO:39～40；DYS448、SEQ ID NO:41～42；GATA_H4、SEQ ID NO:43～44；DYS460、SEQ ID NO:45～46；DYS393、SEQ ID NO:47～48；DYS443、SEQ ID NO:49～50；DYS385a和DYS385b、SEQ ID NO:51～52；DYS444、SEQ ID NO:53～54；DYS643、SEQ ID NO:55～56。
3.根据权利要求1或2所述的一种扩增人Y染色体STR基因座的多色荧光复合扩增试剂盒，其特征在于，所述引物的浓度如下：DYS557、0.1μM；DYS520、0.12μM；DYS549、0.09μM；DYS389I、0.11μM；DYS439、0.2μM；DYS389II、0.12μM；DYS392、0.3μM；DYS447、0.44μM；DYS19、0.6μM；DYS391、0.1μM；DYS635、0.2μM；DYS456、0.12μM；DYS522、0.22μM；DYS438、0.24μM；DYS527a和DYS527b、0.31μM；DYS622、0.2μM；DYS587、0.26μM；DYS481、0.13μM；DYS437、0.21μM；DYS390、0.18μM；DYS448、0.15μM；GATA_H4、0.2μM；DYS460、0.13μM；DYS393、0.1μM；DYS443、0.2μM；DYS385a和DYS385b、0.21μM；DYS444、0.22μM；DYS643、0.35μM。
4.根据权利要求1所述的一种扩增人Y染色体STR基因座的多色荧光复合扩增试剂盒，其特征在于，所述基因座的基因多样性值大于0.6，突变率小于5‰。
5.根据权利要求1所述的一种扩增人Y染色体STR基因座的多色荧光复合扩增试剂盒，其特征在于，所述引物分为五组：第一组，DYS392、DYS389I、DYS447、DYS389II、DYS438、DYS527a、DYS527b、DYS522；第二组，DYS391、DYS456、DYS19、DYS622、DYS587、DYS385a、DYS385b；第三组，DYS481、DYS437、DYS390、DYS460、DYS643；第四组，DYS393、GATA_H4、DYS439、DYS635、DYS444、DYS448；第五组、DYS549、DYS443、DYS557、DYS520；每对引物中至少一条采用荧光染料标记其5’端。
6.根据权利要求5所述的一种扩增人Y染色体STR基因座的多色荧光复合扩增试剂盒，其特征在于，所述荧光染料为FAM、HEX、TAMRA、ROX、VIG中任意一种，且每组采用的荧光标记不同。
7.根据权利要求5所述的一种扩增人Y染色体STR基因座的多色荧光复合扩增试剂盒，其特征在于，各组引物5’端采用的荧光染料具体为：第一组、FAM，第二组、HEX，第三组、TAMRA，第四组、ROX，第五组、VIG。
8.根据权利要求1所述的一种扩增人Y染色体STR基因座的多色荧光复合扩增试剂盒，其特征在于，试剂盒中的PCR反应缓冲液包含以下化学组分：Tris-HCl、20mM，KCl、30mM，TMAC、10mM，MgCl2、1.8mM，dNTP、2mM，甘油、3％，BSA、0.8mg/mL，NP-40、1％，C-Taq DNA聚合酶、2U。
9.权利要求1所述的一种扩增人Y染色体STR基因座的多色荧光复合扩增试剂盒在法医鉴定、亲权鉴定和家系排查中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述样品DNA包括利用碱裂解法、Chelex法、磁珠提取法或有机法中任意一种提取的人基因组DNA及滤纸、Whatman FTA卡、棉签、纱布中任意一种载体收集的人类血液、汗液、尿液、精斑、阴道分泌物或口腔细胞。
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