CN108841968A - 一种使用高通量dna杂交芯片的人类y染色体snp分型方法 - Google Patents

一种使用高通量dna杂交芯片的人类y染色体snp分型方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种使用高通量DNA杂交芯片的人类Y染色体SNP分型方法，基于Y染色体SNP检测需求，进行位点同源性比对，同时对比数据库中已验证位点；根据设计好的芯片进行生产；将从受试者处采集的唾液或口腔拭子样本进行gDNA的提取；根据Axiom芯片检测流程，自动化进行芯片制备；使用GeneTitan MC仪器对制备好的基因芯片进行扫描；使用软件对基因芯片扫描结果进行分析，计算各检测SNP位点的基因型；基于检测得到的SNP分型结果，根据ISOGG Y‑DNA树计算Y‑DNA单倍群。本发明杂交SNP芯片在Y染色体的应用具有核酸制备、检测成本低，SNP定制位点灵活，测出率高，降低了原有对家族、姓氏等研究中由于改姓、入赘等带来的结果的不确定性，实验检测所需的gDNA量较低，检测成本更低。

Description

一种使用高通量DNA杂交芯片的人类Y染色体SNP分型方法
技术领域
本发明涉及到生物工程技术领域，特别涉及一种使用高通量DNA杂交芯片的人类Y染色体SNP分型方法。
背景技术
目前，人类直系男性亲属（五服内家族）分子生物（基因）标记物研究还缺乏针对中国人群的可靠方法与基于家族信息的标记物数据库。而Y-DNA单倍群是家族男性成员基因标志物的常用方法，但是由于改姓、领养、入赘等历史问题，每个家族内Y-DNA单倍群可能并不单一，Y染色体成分较为复杂，也对男性家族成员的基因标志物选择带来了难度。
现有技术方案：
现有Y染色体的Hyplotyping实验、计算技术总结（可以包括商用可定制芯片）
Y全序/Big-Y：二代测序是对Y染色体进行测序的较好方式，但是由于Y染色体结构特殊，基因组组装难度较高，且Y染色体长度约为60M，也导致了实验成本较高。
STR：STR一般通过一代测序进行检测，对家族的区分较好。
基因芯片：市面现有采用SNP芯片进行检测，现有常见检测方式主要通过半定制的高密度illumina Infinium GSA芯片和ThermoFisher Axiom PMRA芯片，通过增加Y染色体的SNP位点进行，由于Y染色体与其他染色体同源性较高，部分位点无法通过进行检测，但由于基因芯片检测位点有针对性，性价比较高。
现有技术缺点：
二代测序对Y染色体进行检测的成本较高高，且对个DNA的总量和质量要求高。
STR由于检测的位点较少，获得的信息有限。
现有分析模型（如ISOGG Y-DNA树）主要针对全球人群，缺乏针对中国人家族marker的细分背景数据。
发明内容
发明的目的在于提供一种使用高通量DNA杂交芯片的人类Y染色体SNP分型方法，杂交SNP芯片在Y染色体的应用具有核酸制备、检测成本低，SNP定制位点灵活，测出率高等优势，降低了原有对家族、姓氏等研究中由于改姓、入赘等带来的结果的不确定性，实验检测所需的gDNA量较低，检测成本更低，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种使用高通量DNA杂交芯片的人类Y染色体SNP分型方法，包括如下步骤：
步骤一：位点筛选；
步骤二：芯片Y染色体SNP定制、实验、分析、单倍群计算，包括芯片定制设计：基于Y染色体SNP检测需求，进行位点同源性比对，同时对比数据库中已验证位点，优化芯片设计方案；芯片生产：根据设计好的芯片进行生产；
步骤三：基因芯片基因分型实验，包括DNA提取：将从受试者处采集的唾液或口腔拭子样本进行gDNA的提取；芯片制备：根据Axiom芯片检测流程，自动化进行芯片制备；芯片扫描：使用GeneTitan MC仪器对制备好的基因芯片进行扫描；
步骤四：生信分析、单倍群计算，包括生信分析：使用软件对基因芯片扫描结果进行分析，计算各检测SNP位点的基因型；单倍群计算：基于检测得到的SNP分型结果，根据ISOGGY-DNA树计算Y-DNA单倍群，出具报告。
优选的，步骤三还包括样本收集。
优选的，样本收集方法包括如下步骤：
步骤一：姓氏家族信息收集；
步骤二：筛选家族样本；
步骤三：家族样本采集。
优选的，步骤一包括
1）人类遗传学领域研究学者、专家给出各姓氏起源地、发祥地及家族宗祠所在地信息资料；
2）对各地图书馆的家谱资料查询核对，很多地区图书馆都有各姓氏家谱方案存放，根据图书馆中家谱档案，选择符合技术要求的家族资料；
3）联系各地家族姓氏宗亲会负责人、家谱修撰人，查阅族谱信息。
优选的，步骤二包括
1）图书馆资料、家族修撰保存的家谱资料及历史记载资料核对。图书馆中家谱资料、各姓氏家族传下来的家谱资料和历史资料三方核对，确保资料的准确性；
2）实地考察，选择具有详尽家谱记载且家谱中记录世代为30代以上的姓氏家族；
3）根据家谱世系关系记载，选择具有明确亲缘关系的男性成员，每个家族选择5组成员进行采样，每组2个成员，每组内成员具有五服内血统关系，而每组之间成员为五服外血统关系。
优选的，步骤三包括
1）现场采集样本，唾液样本采集器采集唾液样本2mL；
2）记录好各成员之间的血统关系。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提出的使用高通量DNA杂交芯片的人类Y染色体SNP分型方法，通过二代测序、高密度基因芯片等方式能达到此检测目的，基于SNP分型的家族单倍群分析多数基于成本较高的一代、二代测序技术。杂交SNP芯片在Y染色体的应用具有核酸制备、检测成本低，SNP定制位点灵活，测出率高，降低了原有对家族、姓氏等研究中由于改姓、入赘等带来的结果的不确定性，实验检测所需的gDNA量较低，检测成本更低。
附图说明
图1为本发明的Y染色体与姓氏宗族演变示意图；
图2为本发明的芯片芯片至数据分析全流程图；
图3为本发明的家族样本收集方法流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-2，一种使用高通量DNA杂交芯片的人类Y染色体SNP分型方法，包括如下步骤：
步骤一：位点筛选；
步骤二：芯片Y染色体SNP定制、实验、分析、单倍群计算；
（1）包括芯片定制设计：基于Y染色体SNP检测需求，进行位点同源性比对，同时对比数据库中已验证位点，优化芯片设计方案；
（2）芯片生产：根据设计好的芯片进行生产；
步骤三：基因芯片基因分型实验；
（1）样本收集；
（2）包括DNA提取：将从受试者处采集的唾液或口腔拭子样本进行gDNA的提取；
（3）芯片制备：根据Axiom芯片检测流程，自动化进行芯片制备；
（4）芯片扫描：使用GeneTitan MC仪器对制备好的基因芯片进行扫描；
步骤四：生信分析、单倍群计算；
（1）包括生信分析：使用软件对基因芯片扫描结果进行分析，计算各检测SNP位点的基因型；
（2）单倍群计算：基于检测得到的SNP分型结果，根据ISOGG Y-DNA树计算Y-DNA单倍群，出具报告。
家族定义
由于存在改姓、入赘、收养等历史原因，一个家族可能存在多个不同Y染色体的来源。本技术中对家族的定义为：以家谱记载信息为准，凡是记载在家谱中并能够明确表明其与其他家族成员的血统关系，既为该姓氏家族成员。
多于一人的直系亲属家族的基因标志物定义方法
由于一个家族可能存在多个不同Y染色体来源，对一个家族的定义无法使用单一的基因特征进行定义。一个家族的基因标志物，是包括这个家族中所有基因特征的并集，即我们认为在我们对家谱记载内的所有成员都是这个家族成员，出现的不同的基因特征，都属于这个家族的特征。通过检测，只要符合这个家族某一支系的基因特征，即基因标志物特征，我们均认为受检者符合这个家族的基因特征，认为可能是这个家族的成员之一。
请参阅图3，样本收集方法包括如下步骤：
步骤一：姓氏家族信息收集；
（1）人类遗传学领域研究学者、专家给出各姓氏起源地、发祥地及家族宗祠所在地信息资料；
（2）对各地图书馆的家谱资料查询核对，很多地区图书馆都有各姓氏家谱方案存放，根据图书馆中家谱档案，选择符合技术要求的家族资料；
（3）联系各地家族姓氏宗亲会负责人、家谱修撰人，查阅族谱信息。
步骤二：筛选家族样本；
（1）图书馆资料、家族修撰保存的家谱资料及历史记载资料核对。图书馆中家谱资料、各姓氏家族传下来的家谱资料和历史资料三方核对，确保资料的准确性；
（2）实地考察，选择具有详尽家谱记载且家谱中记录世代为30代以上的姓氏家族；
（3）根据家谱世系关系记载，选择具有明确亲缘关系的男性成员，每个家族选择5组成员进行采样，每组2个成员，每组内成员具有五服内血统关系，而每组之间成员为五服外血统关系。
步骤三：家族样本采集；
1）现场采集样本，唾液样本采集器采集唾液样本2mL；
2）记录好各成员之间的血统关系。
芯片设计技术参数
基因芯片所需gDNA的标准总量为100ng，在实际检测中，无降解无污染、总量达到15ng以上的gDNA均能较稳定地检出；
在设计选择的低同源性的Y染色体上的12304个位点中，能够稳定检出的位点为9249个，占比75.17%。
家族样本数据示例
在某X姓家族的检测中，结果显示此10名此家族成员可基于单倍群分为两个分支，分别为O2a2b2a1a（O-F4110）和C2e2（C-F845）。从单倍群分析结果可看出，分支1、2、3来源于同一Y-DNA单倍群，分支4来源于另一Y-DNA单倍群祖先。此姓氏家族至少包括两个不同的Y-DNA单倍群来源，这两个基因标志物均为此姓氏家族的基因标志物。
表1：某X姓家族成员Y-DNA单倍群检测结果
以下对本发明中相关术语进行解释
家族：以血统关系为基础而结成的社会单位，包括同一血统的几辈人。
五服：指代五辈人，很多地方有“五服之内为亲”的说法，就是往上推五代，从高祖开始，高祖、曾祖、祖父、父和自己，凡是血统关系在这五代内的都是亲戚，即同出一个高祖的人都是亲戚，从高祖到自己是五代，称为五服。
家族基因：所有存在于同一家族中的男性成员的Y染色体单倍型，但是由于改姓、领养、入赘等历史问题，每个家族内Y-DNA单倍群可能并不单一，多种单倍型构成该家族的Y-DNA单倍群称为家族基因。
Y染色体：Y染色体是决定生物性别的性染色体的一种，直接决定人类性别，女性的性染色体组成是XX，男性是XY。父亲体内的Y染色体会传给儿子。人类Y染色体的95%为非重组区域(non-recombinating portion of Y chromosome，NRY)，不与任何染色体发生重组。因此,Y染色体的该特性保证了子代能完整地继承父代的NRY，保证了其严格的父系遗传。在代代父子相承的传递过程中，Y染色体也在不断地积累着变化。遗传突变的积累,使得人类父系遗传体系中Y染色体存在一定的差异。
Y染色体单倍型：Y染色体上稳定的SNP突变可以永远在父系后代中流传，可以构建可靠地父系 基因谱系，祖先的Y染色体上出现的SNP突变特征在后代中肯定能够找到，而后代只能在祖先Y染色体突变谱的基础上增加新的突变，由多个SNP突变构成的一种突变谱称为一种Y染色体单倍型。
DNA芯片：SNP基因芯片主要针对已知SNP进行检测，由于Y染色体部分区域与X染色体和常染色体同源性较高，较多的SNP无法通过基因芯片进行检测，同时基因芯片也无法对STR进行检测。
遗传标记：具有相对差异的单位性状（可检测的、由遗传决定的、并能按预期的方式从一代遗传给下一代的形态学、生理学或分子生物学特征等）作为标志来识别携带它的个体、细胞、染色体，或用以研究个体、家系和群体的遗传方式时称为遗传标记，它具有可遗传性和可识别性两个基本特征。
本发明采用的技术原理为：人体中每个体细胞都有23对染色体，包括22对常染色体和一对性染色体，女性的性染色体组成是XX，男性是XY。父亲体内的Y染色体会传给儿子，但是无法传给女儿。如果父生子，子生孙，孙生重孙，这样以男性传承下去，Y染色体的传承也会一直伴随下去。人类家族现有家族主要以父系进行构建，由于人类Y染色体严格遵循父传子的父系遗传规律，且Y染色体较为保守，不产生重组且突变频率较低。每个男性家族成员都与自己的直系祖先的Y染色体会非常接近；Y染色体上稳定的SNP突变可以永远在父系后代中流传，可以构建可靠地父系基因谱系，因此，Y染色体可以用于检测姓氏家谱的标记物。祖先的Y染色体上出现的SNP突变特征能够在后代中找到，而后代只能在祖先Y染色体突变谱的基础上增加新的突变。由多个SNP突变构成的一种突变谱称为一种单倍型。一个家族的多个Y染色体理论上都属于一个单倍群，因为其男性都应该来自于同一个祖先。
本发明的实验方法：
二代测序：通过全基因组测序或者捕获测序的方式，对Y染色体和全序列或者部分序列进行基因测序，能够检测大部分的SNP和部分的STR，也能够较好地发现人群中新的突变。
一代测序：每个STR（Short tandem repeats，短小串联重复）的核心序列结构相同，重复单位数目约为10～60次，其长度一般不超过300bp，多位于基因非编码区、内含子或非翻译区。STR的突变比SNP的突变频率更高，对家族的区分更细。由于重复单位及重复次数不同，使微卫星DNA在不同种族，不同人群之间的分布具有很大差异性，构成了STR遗传多态性。但由于序列较长，部分STR无法通过二代测序进行检测，对STR的检测常通过一代测序进行。
基因芯片：SNP基因芯片主要针对已知SNP进行，由于Y染色体部分区域与X染色体和常染色体同源性较高，较多的SNP无法通过基因芯片进行检测，同时基因芯片也无法对STR进行检测。
分析方法：
ISOGG（International Society of Genetic Genealogy，国际基因家谱学学会）是一个非商业非营利组织，定期维护Y-DNA单倍群树，并根据最新的科研进展不断更新突变位点和单倍群谱系命名。
现有的针对Y染色体DNA的分析工具较多，主要分为Y-STR单倍型工具、Y-STR单倍群工具、Y-SNP单倍群工具和针对二代测序结果的工具，主要用来计算：基因距离、最近共祖时间、单倍群预测等。
综上所述，本发明提出的使用高通量DNA杂交芯片的人类Y染色体SNP分型方法，通过二代测序、高密度基因芯片等方式能达到此检测目的，基于SNP分型的家族单倍群分析多数基于成本较高的一代、二代测序技术。杂交SNP芯片在Y染色体的应用具有核酸制备、检测成本低，SNP定制位点灵活，测出率高，降低了原有对家族、姓氏等研究中由于改姓、入赘等带来的结果的不确定性，实验检测所需的gDNA量较低，检测成本更低。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种使用高通量DNA杂交芯片的人类Y染色体SNP分型方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一：位点筛选；
步骤二：芯片Y染色体SNP定制、实验、分析、单倍群计算，包括芯片定制设计：基于Y染色体SNP检测需求，进行位点同源性比对，同时对比数据库中已验证位点，优化芯片设计方案；芯片生产：根据设计好的芯片进行生产；
步骤三：基因芯片基因分型实验，包括DNA提取：将从受试者处采集的唾液或口腔拭子样本进行gDNA的提取；芯片制备：根据Axiom芯片检测流程，自动化进行芯片制备；芯片扫描：使用GeneTitan MC仪器对制备好的基因芯片进行扫描；
步骤四：生信分析、单倍群计算，包括生信分析：使用软件对基因芯片扫描结果进行分析，计算各检测SNP位点的基因型；单倍群计算：基于检测得到的SNP分型结果，根据ISOGGY-DNA树计算Y-DNA单倍群，出具报告。
2.根据权利要求1所述的一种使用高通量DNA杂交芯片的人类Y染色体SNP分型方法，其特征在于：步骤三还包括样本收集。
3.根据权利要求2所述的一种使用高通量DNA杂交芯片的人类Y染色体SNP分型方法，其特征在于：样本收集方法包括如下步骤：
步骤一：姓氏家族信息收集；
步骤二：筛选家族样本；
步骤三：家族样本采集。
4.根据权利要求3所述的一种使用高通量DNA杂交芯片的人类Y染色体SNP分型方法，其特征在于：步骤一包括
人类遗传学领域研究学者、专家给出各姓氏起源地、发祥地及家族宗祠所在地信息资料；
对各地图书馆的家谱资料查询核对，很多地区图书馆都有各姓氏家谱方案存放，根据图书馆中家谱档案，选择符合技术要求的家族资料；
联系各地家族姓氏宗亲会负责人、家谱修撰人，查阅族谱信息。
5.根据权利要求3所述的一种使用高通量DNA杂交芯片的人类Y染色体SNP分型方法，其特征在于：步骤二包括
图书馆资料、家族修撰保存的家谱资料及历史记载资料核对。
6.图书馆中家谱资料、各姓氏家族传下来的家谱资料和历史资料三方核对，确保资料的准确性；
实地考察，选择具有详尽家谱记载且家谱中记录世代为30代以上的姓氏家族；
根据家谱世系关系记载，选择具有明确亲缘关系的男性成员，每个家族选择5组成员进行采样，每组2个成员，每组内成员具有五服内血统关系，而每组之间成员为五服外血统关系。
7.根据权利要求3所述的一种使用高通量DNA杂交芯片的人类Y染色体SNP分型方法，其特征在于：步骤三包括
现场采集样本，唾液样本采集器采集唾液样本2mL；
记录好各成员之间的血统关系。
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