CN109593846A

CN109593846A - 检测叶酸代谢能力相关基因的引物、探针及试剂盒

Info

Publication number: CN109593846A
Application number: CN201910113589.9A
Authority: CN
Inventors: 雷秀清
Original assignee: Ajian (fuzhou) Gene Medical Laboratory Co Ltd
Current assignee: Ajian (fuzhou) Gene Medical Laboratory Co Ltd
Priority date: 2019-02-14
Filing date: 2019-02-14
Publication date: 2019-04-09

Abstract

本发明公开了一种检测叶酸代谢能力相关基因的引物、探针，属于生物医学技术领，本发明还提供了一种包含上述引物及探针的试剂盒。本发明提供的检测叶酸代谢能力相关基因的引物和探针特异性好能够提高SNP位点检测特异性；使用该试剂盒进行MTHFR和MTRR基因多态性的检测，检测结果与测序结果准确率高达100％，可三管同时检测样本的三个位点的纯合野生型、纯合突变型和杂合型，检测效率高；同时相比使用ΔCt值法的判断结果更易判断，结果可以通过分型软件准确分型，还可以通过荧光定量PCR曲线进行确认复核，结果更为准确可靠。

Description

检测叶酸代谢能力相关基因的引物、探针及试剂盒

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种检测叶酸代谢能力相关基因的引物、探针及试剂盒。

背景技术

叶酸是一种水溶性B族维生素，人体自身不能合成，必须从外界摄入。孕妇对叶酸的需求量比正常人高4倍，适当补充叶酸能够有效地降低胎儿畸形发生的概率；中老年人补充叶酸能明显的预防和治疗多种疾病，研究发现，适量补充叶酸可以有效降低脑卒中发生的风险，可以预防和延缓老年认知障碍的发生。

叶酸代谢能力受遗传因素的影响，某些基因的突变会影响叶酸的利用，其中，5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)是叶酸利用代谢关键酶；MTHFR基因第1298位碱基A突变为C，产生三种基因型：野生型(A/A)，杂合突变型(A/C)和纯合突变型(C/C)，该三种基因型在中国人群中分布所占比例为67％、29％、4％。基因型(C/C)会引起MTHFR活性下降，同型半胱氨酸转化为蛋氨酸能力下降，导致血浆中半胱氨酸升高。MTHFR基因第677位碱基C突变为T，产生三种基因型：野生型(C/C),杂合突变型(C/T)和纯合突变型(T/T)，该三种基因型在中国人群中分布所占比例为33％、44％、23％。碱基突变导致MTHFR酶活性降低，同型半胱氨酸转化能力下降，导致血浆中半胱氨酸浓度升高。甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)也是叶酸代谢的关键酶之一，MTRR基因第66位碱基A突变为G，产生三种基因型：野生型(A/A)，杂合突变型(A/G)和纯合突变型(G/G)，该三种基因型在中国人群中分布所占比例为55％、38％、7％。碱基突变引起MTRR酶活性下降，导致高同型半胱氨酸血症和叶酸利用能力下降。

对MTHFR基因和MTRR基因及其相关位点的检测，通过检测结果可以直接知道被检测者叶酸代谢能力是否有遗传缺陷，不同的基因型对应的叶酸补充量不同，叶酸个体化的补充对预防疾病的发生具有重要意义。

公开号为CN107254520A和CN108004309A的中国专利，使用DNA直接测序法对MTHFR基因和MTRR基因进行PCR扩增后检测，但该方法需要对扩增后的样品进行纯化、再次扩增分析序列，检测步骤繁琐、复杂，对环境及操作人员要求较高、需要昂贵的仪器设备、成本高，在临床上具有一定的限制；公开号为CN104774944A和CN105986010A的中国专利公开了使用质谱法检测叶酸代谢相关基因型的方法和试剂盒，这种方法通过引物长度及碱基的相对分子质量进行区分，通量高，灵敏度高但需要结合质谱仪进行分型，使用的仪器设备昂贵，并且对操作人员技术要求高，实用性及普及性受限。同时现有针对全血样本核酸提取检测叶酸代谢能力的试剂盒存在操作时间长、试剂成本高等问题。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是：提供一种准确率高的、可快速完成核酸提取的用于检测叶酸代谢能力相关基因的试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：检测叶酸代谢能力相关基因的引物和探针，包括以下引物和探针：

MTHFR基因C677T引物：MTHFR677F和MTHFR677R；

MTHFR基因A1298C引物：MTHFR1298F和MTHFR1298R；

MTRR基因A66G引物：MTRR66F和MTRR66R；

MTHFR基因C677T探针：MTHFR677C和MTHFR677T；

MTHFR基因A1298C探针：MTHFR1298A和MTHFR1298C；

MTRR基因A66G探针：MTRR66A和MTRR66G；

所述探针的3’端用MGB修饰。

检测叶酸代谢能力相关基因的试剂盒，包括3个反应体系：PCR反应体系1、PCR反应体系2和PCR反应体系3；

PCR反应体系1包括MTHFR677F、MTHFR677R、MTHFR677C和MTHFR677T；

PCR反应体系2包括MTHFR1298F、MTHFR1298R、MTHFR1298A和MTHFR1298C；

PCR反应体系3所述的MTRR66F、MTRR66R、MTRR66A和MTRR66G。

本发明的有益效果在于：本发明提供的引物及探针特异性好能够提高SNP位点检测特异性；本发明还提供了一种包含上述引物及探针的试剂盒，使用该试剂盒进行MTHFR和MTRR基因多态性的检测，检测结果与测序结果准确率高达100％，可三管同时检测样本的三个位点的纯合野生型、纯合突变型和杂合型，检测效率高；同时相比使用ΔCt值法的判断结果更易判断，结果可以通过分型软件准确分型，还可以通过荧光定量PCR曲线进行确认复核，结果更为准确可靠。

附图说明

图1所示为本发明具体实施方式的MTHFR A1298C野生纯合型扩增曲线；

图2所示为本发明具体实施方式的MTHFR A1298C杂合型扩增曲线；

图3所示为本发明具体实施方式的MTHFR A1298C突变纯合型扩增曲线；

图4所示为本发明具体实施方式的MTHFR C677T野生纯合型扩增曲线；

图5所示为本发明具体实施方式的MTHFR C677T杂合型扩增曲线；

图6所示为本发明具体实施方式的MTHFR C677T突变纯合型扩增曲线；

图7所示为本发明具体实施方式的MTRR A66G野生纯合型扩增曲线；

图8所示为本发明具体实施方式的MTRR A66G杂合型扩增曲线；

图9所示为本发明具体实施方式的MTRR A66G突变纯合型扩增曲线；

图10所示为本发明具体实施方式的MTHFR A1298C位点检测样本分型结果；

图11所示为本发明具体实施方式的MTHFR C677T位点检测样本分型结果；

图12所示为本发明具体实施方式的MTRR A66G位点检测样本分型结果；

图13所示为本发明具体实施方式的23例已知基因型的样本的MTHFR A1298C位点检测样本分型结果；

图14所示为本发明具体实施方式的23例已知基因型的样本的MTHFR C677T位点检测样本分型结果；

图15所示为本发明具体实施方式的23例已知基因型的样本的MTRR A66G位点检测样本分型结果。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。

本发明最关键的构思在于：设计SEQ ID NO.1-12所示的6条引物和6条探针及包含上述引物和探针的试剂盒，实现MTHFR基因2个位点6种基因型和MTRR基因1个位点3种基因型的同步检测。

本发明的检测叶酸代谢能力相关基因的引物和探针，包括以下引物和探针：

MTHFR基因C677T引物：MTHFR677F和MTHFR677R；

MTHFR基因A1298C引物：MTHFR1298F和MTHFR1298R；

MTRR基因A66G引物：MTRR66F和MTRR66R；

MTHFR基因C677T探针：MTHFR677C和MTHFR677T；

MTHFR基因A1298C探针：MTHFR1298A和MTHFR1298C；

MTRR基因A66G探针：MTRR66A和MTRR66G；

所述探针的3’端均用MGB修饰，所述探针的5’端的荧光修饰基团不限，如FAM、HEX、cy3、cy5。

上述引物和探针序列为如下，见表1和表2：

表1

名称(引物)	序列(5’-3’)	碱基数
			MTHFR677F(SEQ ID NO.1)	CACAAAGCGGAAGAATGTGTCAG	23
MTHFR677R(SEQ ID NO.2)	TGACCTGAAGCACTTGAAGGAGAA	24
			MTHFR1298F(SEQ ID NO.3)	CCGGTTTGGTTCTCCCGAG	19
MTHFR1298R(SEQ ID NO.4)	CCGGTTTGGTTCTCCCGAG	20
			MTRR66F(SEQ ID NO.5)	GGCTCTAACCTTATCGGATTCACTA	25
MTRR66R(SEQ ID NO.6)	GCTACACAGCAGGGACAGGC	20

表2

其中，上述探针的3’端用MGB修饰，5’端的荧光修饰基团不限，可以为FAM、HEX、cy3、cy5。

从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本发明提供的引物及探针特异性好能够提高SNP位点检测特异性；本发明还提供了一种包含上述引物及探针的试剂盒，使用该试剂盒进行MTHFR和MTRR基因多态性的检测，检测结果与测序结果准确率高达100％，可三管同时检测样本的三个位点的纯合野生型、纯合突变型和杂合型，检测效率高；同时相比使用ΔCt值法的判断结果更易判断，结果可以通过分型软件准确分型，还可以通过荧光定量PCR曲线进行确认复核，结果更为准确可靠。

进一步的，检测叶酸代谢能力相关基因的试剂盒，包括3个反应体系：PCR反应体系1、PCR反应体系2和PCR反应体系3；

PCR反应体系1包括权利要去1所述的MTHFR677F、MTHFR677R、MTHFR677C和MTHFR677T；

PCR反应体系2包括权利要去1所述的MTHFR1298F、MTHFR1298R、MTHFR1298A和MTHFR1298C；

PCR反应体系3包括权利要去1所述的MTRR66F、MTRR66R、MTRR66A和MTRR66G。

从上述描述可知，通过上述PCR反应体系的设置，能够使用一个试剂盒对检测样本的MTHFR因和MTRR基因的三个位点的纯合野生型、纯合突变型和杂合型进行分型。

进一步的，所述PCR反应体系1、PCR反应体系2和PCR反应体系3还包括预混液2×qPCR Mix，所述预混液2×qPCR Mix包括PCR缓冲液、dNTP、Mg2+、Taq酶、UNG酶和无菌纯水，所述dNTP包括dATP、dUTP、dCTP和dGTP。

从上述描述可知，引入UNG酶防污染系统，能更加准确、稳定的对样品进行分型检测。

进一步的，所述试剂盒还包括DMSO，所述DMSO的添加量为反应体系总体积的1-10％。

进一步的，所述DMSO的添加量为反应体系总体积的3％。

从上述描述可知，通过适量添加DMSO在不破坏DNA的基础上，可增加反应体系中溶液的相容性，本发明提供的试剂盒中DMSO的最适添加量为反应体系总体积的3％。

进一步的，所述MTHFR677F、MTHFR677R、MTHFR677C、MTHFR677T、MTHFR1298F、MTHFR1298R、MTHFR1298A、MTHFR1298C、MTRR66F、MTRR66R、MTRR66A和MTRR66G的终浓度为10μM。

进一步的，所述PCR反应体系1包括以下成分：预混液2×qPCR Mix 10μL、MTHFR1298F 0.5μL、MTHFR 1298R 0.5μL、MTHFR 1298A 0.1μL和MTHFR 1298C 0.2μL；

所述PCR反应体系2包括以下成分：预混液2×qPCR Mix10μL、MTHFR677F0.5μL、MTHFR677R 0.5μL、MTHFR677C 0.1μL和MTHFR677T 0.2μL；

所述PCR反应体系3包括以下成分：预混液2×qPCR Mix 10μL、MTRR66F 0.5μL、MTRR66R 0.5μL、MTRR66A 0.1μL和MTRR66G 0.2μL。

进一步的，检测叶酸代谢能力相关基因的试剂盒还包括裂解液和20X稀释液。

从上述描述可知，通过添加裂解液和20X稀释液可快速提取全血基因组核酸，仅需两种试剂即可快速提取全血基因组核酸并且满足检测的要求，无需纯化即可用于扩增，提取全血步骤简单、耗时短、可应用于零散样本的提取、不受样本量和试剂用量及仪器限制，可广泛应用于临床样本的提取，利于快速进行后续的检测。

如图1-图15所示，本发明的实施例一为：

1检测叶酸代谢能力相关基因的试剂盒，包括以下成分，如表3所示：

表3

所述裂解液的制备方法为：取2mL 2mol/L NaOH溶液，加入14mL无菌水，混匀后2-8℃保存；

其中，所述PCR反应液1、PCR反应液2、PCR反应液3中还包括反应液总体积1％-10％的DMSO。

2.1口腔拭子样本DNA提取：

使用口腔拭子专用采样套装采取样本，取出所有样本离心，去除上清，加入100μL的裂解液，95℃煮沸10min，迅速冷却5min，离心取出上清至新的离心管中，标记，放2-8℃暂存；

或者使用商业试剂盒提取口腔拭子样本DNA。

2.2全血样本DNA提取：

(1)取2mL 20X稀释液溶液，加入38mL无菌水，混匀后，2-8℃保存，得1X稀释液，所述稀释液的主要成分为Tris-HCl，浓度为1.0-2.0mol/L；

(2)新的1.5mL离心管中依次加入200μL全血、600μL灭菌纯化水，震荡混匀，瞬时离心，加入裂解液室温裂解2min；然后在13000rpm离心2min，去除上清，留沉淀物；再加入600μL无菌纯化水，震荡混匀，在13000rpm离心2min，去除上清，留沉淀物；

(3)加入20μL 0.25mol/L NaOH，震荡混匀，瞬时离心；然后放入干浴器中：99℃8min，拿出冷却至室温；再加入180μL 1X稀释液，震荡混匀，在13000rpm离心3min，取50-150μL上清液转移到新的离心管中，于2-8℃保存备用；

或者使用商业化试剂盒对全血样本的DNA进行提取。

3PCR反应体系配制及加样：

设置测试组19组、阳性质控品3组、阴性质控品1组；

配置23份PCR反应体系；

其中，PCR反应体系为：2×qPCR预混液10μL、引物和探针1.3μL、DMSO 1μL，然后加无菌纯化水至18μL；所述预混液2×qPCR Mix包括PCR缓冲液、dNTP、Mg2+、Taq酶、UNG酶和无菌纯水，所述dNTP包括dATP、dUTP、dCTP和dGTP；

测试组每管荧光定量PCR管分装PCR反应体系18μL，样本DNA量添加2μL，充分混合后短暂离心；

阴性质控品每管荧光定量PCR管分装PCR反应体系18μL，阴性对照2μL，充分混合后短暂离心；

阳性质控品每管荧光定量PCR管分装PCR反应体系18μL和阳性对照2μL，充分混合后短暂离心；

其中，阳性控制品中的阳性对照为：MTHFR 1298AC、MTHFR 677CT、MTHFR66AG基因型组合的人基因组DNA，浓度为1-10ng/μL；

4PCR扩增检测：将上述PCR反应管放入荧光PCR仪中，程序设置如表4所示：

表4

荧光信号收集在阶段3的60℃45s(*标记)，收集的荧光信号可以为FAM、JOE。

5结果分析：

(1)荧光扩增曲线进行分型

实验中检测结果需满足以下条件：1、阳性质控品检测结果正常；2、阴性质控品检测结果正常。满足以上两个条件后，按照表5对检测样本进行基因型别分析，否则实验失败；

表5

MTHFR A1298C、MTHFR C677T和MTHFR A66G扩增曲线判读如图1-图9所示。

(2)测试结果分析

扩增反应完成后，通过收集得到的荧光信号进行检测结果分析：将X轴设定为FAM(基因型为野生型)，Y轴设定为HEX(JOE)(基因型为突变型)，在基因分型图上，靠近X轴的样本检测结果为野生型，靠近Y轴的样本检测结果为突变型，靠近对角线的样本为杂合型。

质控标准：1、阴性质控品检测结果点应靠近原点附近；2、3组阳性质控品杂合型的阳性对照检测结果点：野生纯合基因型点应在靠近Y轴处，突变纯合基因型检测结果点应在靠近X轴处，杂合基因型检测结果点应靠近对角线处。

MTHFR A1298C、MTHFR C677T和MTHFR A66G结果判读如图10-图12所示。

19例样本检测结果与对照组比较，一致性为100％，其中MTHFR 1298A>C(rs1801131)和MTRR 66A>G(rs1801394)结果与测序结果对比，一致性为100％，MTHFR 677C>T(rs1801133)与对照试剂检测结果对比，一致性为100％；表6所示为19个样本的检测结果；

表6

收集23例已知基因型的样本，使用本发明的全血提取试剂进行提取，然后进行叶酸代谢能力相关基因检测，结果一致性为100％，正确率为100％。

MTHFR A1298C、MTHFR C677T和MTHFR A66G结果判读如图13-图15所示。综上所述，本发明提供的检测叶酸代谢能力相关基因的引物和探针特异性好能够提高SNP位点检测特异性；本发明还提供了一种包含上述引物的试剂盒，使用该试剂盒进行MTHFR和MTRR基因多态性的检测，检测结果与测序结果准确率高达100％，可三管同时检测样本的三个位点的纯合野生型、纯合突变型和杂合型，检测效率高；同时相比使用ΔCt值法的判断结果更易判断，结果可以通过分型软件准确分型，还可以通过荧光定量PCR曲线进行确认复核，结果更为准确可靠；本发明的试剂盒引入UNG酶防污染系统，能更加准确、稳定的对样品进行分型检测。同时本发明提供的试剂盒利用碱裂解法的原理，仅需两种试剂即可快速提取全血基因组核酸并且满足检测的要求，无需纯化即可用于扩增，步骤简单、耗时短、可应用于零散样本的提取、不受样本量和试剂用量及仪器限制，样本成本低，可广泛应用于临床样本的提取，利于快速进行后续的检测。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 阿吉安（福州）基因医学检验实验室有限公司

<120> 检测叶酸代谢能力相关基因的引物、探针及试剂盒

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cacaaagcgg aagaatgtgt cag 23

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgacctgaag cacttgaagg agaa 24

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccggtttggt tctcccgag 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gaagagcaag tcccccaagg 20

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggctctaacc ttatcggatt cacta 25

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gctacacagc agggacaggc 20

<210> 7

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aaatcggctc ccgc 14

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atgaaatcga ctcccgca 18

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aaagacactt tcttcactg 19

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

caaagacact tgcttca 17

<210> 11

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cttgctcaca tattt 15

<210> 12

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cttgctcaca cattt 15

Claims

1.检测叶酸代谢能力相关基因的引物和探针，其特征在于，包括以下引物和探针：

MTHFR基因C677T引物：MTHFR677F和MTHFR677R；

MTHFR基因A1298C引物：MTHFR1298F和MTHFR1298R；

MTRR基因A66G引物：MTRR66F和MTRR66R；

MTHFR基因C677T探针：MTHFR677C和MTHFR677T；

MTHFR基因A1298C探针：MTHFR1298A和MTHFR1298C；

MTRR基因A66G探针：MTRR66A和MTRR66G；

所述探针的3’端用MGB修饰。

2.检测叶酸代谢能力相关基因的试剂盒，其特征在于，包括3个反应体系：PCR反应体系1、PCR反应体系2和PCR反应体系3；

所述PCR反应体系1包括权利要去1所述的MTHFR677F、MTHFR677R、MTHFR677C和MTHFR677T；

所述PCR反应体系2包括权利要去1所述的MTHFR1298F、MTHFR1298R、MTHFR1298A和MTHFR1298C；

所述PCR反应体系3包括权利要去1所述的MTRR66F、MTRR66R、MTRR66A和MTRR66G。

3.根据权利要求2所述的检测叶酸代谢能力相关基因的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应体系1、PCR反应体系2和PCR反应体系3还包括预混液2×qPCR Mix，所述预混液2×qPCRMix包括PCR缓冲液、dNTP、Mg²⁺、Taq酶、UNG酶和无菌纯水，所述dNTP包括dATP、dUTP、dCTP和dGTP。

4.根据权利要求2所述的检测叶酸代谢能力相关基因的试剂盒，其特征在于，还包括DMSO，所述DMSO的添加量为反应体系总体积的1-10％。

5.根据权利要求4所述的检测叶酸代谢能力相关基因的试剂盒，其特征在于，所述DMSO的添加量为反应体系总体积的3％。

6.根据权利要求2所述的检测叶酸代谢能力相关基因的试剂盒，其特征在于，所述MTHFR677F、MTHFR677R、MTHFR677C、MTHFR677T、MTHFR1298F、MTHFR1298R、MTHFR1298A、MTHFR1298C、MTRR66F、MTRR66R、MTRR66A和MTRR66G的终浓度为10μM。

7.根据权利要求6所述的检测叶酸代谢能力相关基因的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应体系1包括以下成分：预混液2×qPCR Mix 10μL、MTHFR 1298F 0.5μL、MTHFR 1298R0.5μL、MTHFR 1298A 0.1μL和MTHFR 1298C 0.2μL；

所述PCR反应体系2包括以下成分：预混液2×qPCR Mix 10μL、MTHFR677F 0.5μL、MTHFR677R 0.5μL、MTHFR677C 0.1μL和MTHFR677T 0.2μL；

所述PCR反应体系3包括以下成分：预混液2×qPCR Mix 10μL、MTRR66F 0.5μL、MTRR66R0.5μL、MTRR66A 0.1μL和MTRR66G 0.2μL。

8.根据权利要求2所述的检测叶酸代谢能力相关基因的试剂盒，其特征在于，还包括裂解液和20X稀释液。