CN102277424A - Cyp2c19基因扩增用引物对、含有其的cyp2c19基因扩增用试剂及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种引物对,其为用于利用基因扩增法扩增CYP2C19基因中的含有检测目标位点的目标区域的引物对,其能够特异地扩增上述区域。使用分别包含含有序列号12和序列号32的碱基序列的正向引物和含有序列号22和序列号48的碱基序列的反向引物的2对引物对。通过使用该引物对,可以在同一反应液中同时扩增CYP2C19基因的分别含有两种多态性(CYP2C19基因*2、CYP2C19*3)发生位点的2个区域。
Description
本申请是分案申请,其原申请的国际申请号是PCT/JP2007/073205,中国国家申请号是2007800301350,申请日为2007年11月30日,发明名称为“CYP2C19基因扩增用引物对、含有其的CYP2C19基因扩增用试剂及其用途”。
技术领域
本发明涉及用于扩增CYP2C19基因的引物对、含有其的CYP2C19基因扩增用试剂及其用途。
背景技术
细胞色素P450是被归类为超家族的酶类,存在多个亚家族(例如CYP1A、CYP1B、CYP2C、CYP2D、CYP2E、CYP3A等)。已知,其中,作为人类CYP2C亚家族的同工酶的CYP2C19为与药物代谢相关的酶。而且,已经通过对CYP2C19底物药物(抗癫痫剂)即(S)-美芬妥英(S-Mep)代谢极低的酶缺陷者(PMs)证明了编码CYP2C19的基因(CYP2C19基因)的突变。作为与该PMs有关的重要的基因多态性,已知有CYP2C19*2和CYP2C19*3。前者为外显子5的鸟嘌呤(681位)变为腺嘌呤的突变,成为剪接缺陷(splicing defect)的原因,遗传信息的翻译起始位点改变。后者为外显子4的鸟嘌呤(636位)成为腺嘌呤的突变,由于变成终止子,翻译在突变位点被中断。对包括日本人在内的亚洲人解析这两种多态性,几乎100%可以判断PMs,另外,即便是白种人中也存在约85%,因此认为是与人种无关的主要的多态性。
另外,对于这些CYP2C19基因多态性(CYP2C19*2和 CYP2C19*3),已知除了上述PMs之外,对例如催眠镇静剂安定代谢为N-脱甲基体(去甲安定),奥美拉唑(OPZ)、兰索拉唑、雷贝拉唑等质子泵阻碍剂(PPI)、抗癫痫剂苯妥英(PHT)、三环系抗抑郁剂丙咪嗪、催眠镇静剂海索比妥、疟疾治疗药氯胍、肌肉松弛剂卡立普多等的代谢也有影响。特别是有报告指出;对于作为PPI的一种的OPZ,这些CYP2C19基因多态性(CYP2C19*2和CYP2C19*3)作为药物应答通过并用OPZ、克拉霉素和阿莫西林三种药物,提高了幽门螺杆菌的除菌率。因此研究CYP2C19基因的两种多态性CYP2C19*2和CYP2C19*3,对于预测药物所产生的副作用、决定显示更优良效果的药物给药条件是极为重要的。
另外,作为在基因水平解析所有疾病的原因、个体间的疾病易感性(易患疾病)、个体间的药效的不同等的方法,广泛地进行点突变、所谓的单核苷酸多态性(SNP)的检测。点突变的通常检测方法可以举出;(1)利用PCR(聚合酶链反应)扩增试样的目标DNA的相当于检测对象序列的区域,再对其全基因序列进行解析的直接测序法;(2)利用PCR扩增试样的目标DNA的相当于检测对象序列的区域,通过随上述检测对象序列有无目标突变而切断作用不同的限制酶,将该扩增产物切断,进行电泳从而进行分型的RFLP解析;(3)使用目标突变位于3’末端区域的引物进行PCR,通过有无扩增来判断突变的ASP-PCR法等。
但是,这些方法例如必须进行由试样提取的DNA的精制、电泳、限制酶处理等,因此需要功夫和成本。另外,进行PCR后,有必要暂时开启反应容器,因此有上述扩增产物混入到之后的反应体系内、解析精度降低的顾虑。而且,由于自动化困难,因此无法解析大量的样品。另外,上述(3)的ASP-PCR 法,还存在特异性低的问题。
由该问题出发,近年来作为点突变的检测方法,正在实施对由目标核酸和探针形成的双链核酸的融解温度(Tm)进行解析的方法。这种方法由于通过Tm解析或上述双链的融解曲线的解析来进行,因此称作融解曲线解析。其为如下的方法。即,首先使用与含有检测目标的点突变的检测对象序列互补的探针,形成检测试样的目标单链DNA与上述探针的杂交体(双链DNA)。接着,对该杂交形成体实施加热处理,通过吸光度等的信号的变动来检测随着温度上升的杂交体的解离(融解)。然后,根据该检测结果决定Tm值,从而判断有无点突变。在杂交形成体的同源性越高时Tm值越高、同源性越低时Tm值越低。因此,对于含有点突变的检测对象序列和与其互补的探针形成的杂交形成体,预先求得Tm值(评价标准值),测定检测试样的目标单链DNA和上述探针的Tm值(测定值)。上述测定值与评价标准值相同时,则可以判断为匹配、即目标DNA存在点突变,测定值低于评价标准值时,则可以判断为错配、即目标DNA上不存在点突变。而且,通过该方法还可以实现自动化。
但是,对于利用这种Tm解析的检测方法,存在PCR中必需特异且高效地扩增含有检测目标位点的区域的问题。特别是,细胞色素P450如上所述是被归类为超家族的酶类,在属于同一亚家族(CYP2C亚家族)的分子种类中,存在同源性非常高的同工酶,编码它们的序列也极为类似。因此在PCR中,有CYP2C19以外的同工酶的编码基因也被扩增的顾虑。另外,其它同工酶的编码基因也被扩增的情况,也成为例如CYP2C19基因的特定多态性(CYP2C19*2或CYP2C19*3)解析(非专利文献1和非专利文献2)中解析结果可靠性降低的原因。而且,象这样,由于解析1个样品上也需要大量的劳力,因此还具有解析 大量样品并不实用的问题。
非专利文献1:PMID:8195181 J Biol Chem.1994 Jun 3;269(22):15419-22.
非专利文献2:PMID:7969038 Mol Pharmacol.1994 Oct;46(4):594-8.
发明内容
发明要解决的课题
因此,本发明的目的在于提供用于利用基因扩增法特异地扩增CYP2C19基因的目标区域的引物对。
用于解决课题的方法
为了达成上述目的,本发明的引物对,其特征在于,其为用于利用基因扩增法扩增CYP2C19基因的引物对,含有下述引物对(1)和(2)中的至少1个引物对。
引物对(1):
包含含有下述(F1)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R1)的寡核苷酸的反向引物的一个引物对
(F1):与序列号1的碱基序列中的、以第1341位的腺嘌呤碱基(A)作为第1碱基、朝向5’方向至第25~41个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸,该寡核苷酸以上述腺嘌呤碱基(A)为3’末端
(R1):与序列号1的碱基序列中的、以第1442位的鸟嘌呤碱基(G)作为第1碱基、朝向3’方向至第19~24个碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸,该寡核苷酸以与上述第1442位的鸟嘌呤碱基(G)互补的胞嘧啶碱基(C)作为3’末端
引物对(2):
包含含有下述(F2)的寡核苷酸的正向引物和含有下述 (R2)的寡核苷酸的反向引物的一个引物对
(F2):与序列号1的碱基序列中的、以第143位的腺嘌呤碱基(A)作为第1碱基、朝向5’方向至第23~37个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸,该寡核苷酸以上述腺嘌呤碱基(A)为3’末端
(R2):与序列号1的碱基序列中的、以第231位的胸腺嘧啶碱基(T)作为第1碱基、朝向3’方向至第18~30个碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸,该寡核苷酸以与上述第231位的胸腺嘧啶碱基(T)互补的腺嘌呤碱基(A)作为3’末端
另外,本发明的基因扩增用试剂,其特征在于,是用于利用基因扩增法扩增CYP2C19基因的试剂,含有上述本发明的CYP2C19基因扩增用引物对。
本发明的扩增产物的制造方法,其特征在于,其为利用基因扩增法制造CYP2C19基因的扩增产物的方法,包含下述(I)工序。
(I)以试样中的核酸作为模板,使用本发明的CYP2C19基因扩增用引物对,在反应液中扩增上述CYP2C19基因的工序
本发明的多态性解析方法,其特征在于,其为解析CYP2C19基因的检测对象位点的多态性的方法,包括下述(i)~(iv)工序。
(i)利用本发明的扩增产物的制造方法,在反应液中扩增CYP2C19基因中含有检测对象位点的区域的工序
(ii)准备反应液的工序,所述反应液含有上述(i)工序的扩增产物和能够与上述检测对象位点杂交的探针
(iii)改变上述反应液的温度,测定上述扩增产物与上述探针的杂交形成体显示融解状态的信号值的工序
(iv)由伴随温度变化的上述信号值的变动,决定上述检测对象位点的多态性的工序
发明效果
利用本发明的引物对,可以在反应液中特异且高效地扩增CYP2C19基因中含有检测目标的多态性(CYP2C19*2或CYP2C19*3)发生位点的目标区域。因此,与上述的现有方法不同,可以减少功夫和成本。另外,由于如此特异地扩增CYP2C19基因中含有发生特定的多态性的检测对象位点的区域,再通过例如使用与含有检测对象位点的检测对象序列互补的探针,可以使用上述反应液直接进行Tm解析、将上述多态性分型。另外,由于可以在一个反应液中进行上述目标区域的扩增、多态性的分型,因此还能够实现操作的自动化。而且,当使用本发明的引物对时,例如即便是含有杂质的试样(例如全血或口腔粘膜等),也可以省略预处理、更为迅速且简单地进行扩增反应。另外,当使用本发明的引物对时,可以以优于以往的扩增效率进行扩增反应,因此还能够缩短扩增反应。因而,利用本发明的引物对、含有其的试剂以及使用它们的扩增产物的制造方法,可以迅速且简单地解析CYP2C19基因的多态性,因此在医疗领域中极为有效。
附图说明
图1为表示本发明实施例1的Tm解析结果的图表。
图2为表示本发明实施例2的Tm解析结果的图表。
具体实施方式
<CYP2C19基因扩增用引物对>
本发明的CYP2C19基因扩增用引物对如上所述,其特征 在于,含有上述引物对(1)和(2)中的至少1个引物对。通过含有至少任1个引物对,例如可以特异地扩增CYP2C19基因中的特定目标区域。
本发明的CYP2C19基因扩增用引物对例如可以仅含有上述引物对(1)和(2)中的任一种,还可以含有引物对(1)和(2)两者。在后叙述,利用引物对(1)能够特异地扩增的目标区域为CYP2C19基因中含有多态性CYP2C19*2发生位点的区域,利用引物对(2)能够特异地扩增的目标区域为CYP2C19基因中含有多态性CYP2C19*3发生位点的区域。
如上所述,已知CYP2C19基因的这两种多态性全部为对药物代谢具有影响的多态性,因此重要的是不仅对任一种进行研究,还要对全部两种进行研究。但是,以往方法具有在一个反应体系内无法解析多个序列的问题。认为这是由于:如上所述,CYP2C存在多个同工酶,因此在PCR中,CYP2C19以外的同工酶的编码基因也被扩增。因而,为了研究CYP2C19基因的两种多态性(CYP2C19*2和CYP2C19*3)的全部两种,有必要在各自的反应体系中分别扩增含有各个多态性发生位点的区域,分别对所得扩增产物进行解析。如此,在以往的方法中,难以仅将CYP2C基因中的CYP2C19基因作为模板、且在CYP2C19基因中仅特异地扩增分别含有上述多态性发生位点的两种目标区域。而且,由于解析1个样品也需要大量劳力,因此具有解析大量样品并不实用的问题。与此相反,通过本发明的CYP2C19基因扩增用引物对,即便是含有上述引物对(1)和(2)全部两种时,也可以在同一反应液中同时且特异地扩增各个目标区域。因此,与上述以往方法不同,可以减少功夫和成本。另外,由于可以在同一反应液中特异地扩增2个目标区域,通过使用例如与各个目标区域的检测对象序列互补的探针,可以使用上述反 应液直接进行Tm解析,分别对上述两种多态性进行分型。如此,由于可以在同一反应液中解析CYP2C19基因的两种多态性,本发明的CYP2C19基因扩增用引物对例如在含有引物对(1)和(2)的任一种时当然优选,在含有两种时也优选。使用这种CYP2C19基因引物对,当然可以扩增1个目标区域,当同时扩增2个目标区域时,则可以较以往更为高效地进行CYP2C19基因的多态性解析。
予以说明,以下有时将正向引物称作F引物、将反向引物称作R引物。
上述引物对(1)如上所述,为包含含有下述(F1)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R1)的寡核苷酸的反向引物的一对引物对。
(F1):与序列号1的碱基序列中的、以第1341位的腺嘌呤碱基(A)作为第1碱基、朝向5’方向至第25~41个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸,该寡核苷酸以上述腺嘌呤碱基(A)为3’末端
(R1):与序列号1的碱基序列中的、以第1442位的鸟嘌呤碱基(G)作为第1碱基、朝向3’方向至第19~24个碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸,该寡核苷酸以与上述第1442位的鸟嘌呤碱基(G)互补的胞嘧啶碱基(C)作为3’末端
序列号1所示的碱基序列是含有人10号染色体的CYP2C19基因的外显子4和外显子5的基因组DNA序列,序列号1中,1~161的区域表示外显子4、1323~1449的区域表示外显子5,二者之间为内含子。
上述引物对(1)为用于扩增含有序列号1的第1342位~第1441位的区域的DNA链及其互补链的引物对。已知该区域内的第1361位的碱基(序列号1的第1361位碱基)存在对CYP2C19 的功能具有影响的点突变(1361G、1361A),该多态性为上述的CYP2C19*2。本发明中,该位点的多态性在为纯合子时用1361G/G、1361A/A表示,在为杂合子时用1361G/A表示。予以说明,序列号1的第1361位的碱基相当于CYP2C19基因的mRNA中外显子5的第681位碱基,因此CYP2C19*2多态性例如还可以表示为681G/G、681A/A、681G/A。以下,将该引物对(1)也称作“CYP2C19*2用引物对”。予以说明,在仅解析CYP2C19*2的多态性时,可以仅使用CYP2C19*2用引物对。
本发明中,引物对(1)的F1引物和R1引物,只要决定DNA聚合酶的扩增起始点的3′末端碱基满足上述条件即可。如此,通过固定各引物的3’末端的碱基,可以充分地防止引物对(1)结合在例如类似的其它同工酶的基因(例如CYP2C8、CYP2C9、CYP2C17、CYP2C18基因等)上。
这样,F1引物和R1引物只要其3′末端的碱基被固定即可,因此各引物的长度本身并无特别限定,可以适当调整至普通的长度。作为引物长度的一例,例如为13~50mer的范围、优选为14~45mer、更优选为15~40mer。作为具体例,上述F1引物优选为如下的寡核苷酸:与序列号1的碱基序列中的、以第1341位的腺嘌呤碱基(A)作为第1碱基、朝向5’方向至第25~41个碱基(优选第27~38个碱基、更优选第29~34个碱基)的区域序列相同的至少一个寡核苷酸。另外,上述R1引物优选是如下的寡核苷酸:与序列号1的碱基序列中的、以第1442位的鸟嘌呤碱基(G)作为第1碱基、朝向3’方向至第19~24个碱基(优选第20~23个碱基、更优选第20~22个碱基)的区域互补的至少一个寡核苷酸。予以说明,由于F1引物和R1引物的3′末端被固定,因此由引物延伸的区域如上所述例如为序列号1的第1342~第1441区域,所得扩增产物的整个长度随所用引物的长度而改 变。
另外,R1引物可以是与序列号1所示的碱基序列并非完全互补的寡核苷酸、F1引物可以是与上述碱基序列的互补链并非完全互补的寡核苷酸。即,各引物中除3’末端的碱基以外的部分中,可以与完全互补的寡核苷酸有1个~5个碱基不同。
以下举出F1引物和R1引物的具体例子,本发明并非限于此。另外,对这些F1引物和R1引物的组合并无任何限定,这些中,特别优选包含含有序列号3或序列号12的寡核苷酸的F1’引物和含有序列号20或序列号22的寡核苷酸的R1’引物的引物对(1’)。予以说明,下表中的“Tm(℃)”是下表的序列和与其完全互补的序列杂交时的Tm(℃),通过MELTCALC软件(http://www.meltcalc.com),使参数为寡核苷酸浓度0.2μM、钠当量(Naeq.)50mM而计算的数值(以下相同)。上述Tm值例如通过目前已知的MELTCALC软件(http://www.meltcalc.com)等计算,另外,还可以通过邻接法(Nearest Neighbor Method)决定(以下相同)。
表1
接着,上述引物对(2)如上所述,为包含含有下述(F2)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R2)的寡核苷酸的反向引物的一对引物对。
(F2):与序列号1的碱基序列中的、以第143位的腺嘌呤碱基(A)作为第1碱基、朝向5’方向至第23~37个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸,该寡核苷酸以上述腺嘌呤碱基(A)为3’末端
(R2):与序列号1的碱基序列中的、以第231位的胸腺嘧啶碱基(T)作为第1碱基、朝向3’方向至第18~30个碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸,该寡核苷酸以与上述第231位的胸腺嘧啶碱基(T)互补的腺嘌呤碱基(A)作为3’末端
上述引物对(2)为用于扩增含有序列号1中的第144位~第230位的区域的DNA链及其互补链的引物对。已知该区域内的第155位碱基(序列号1中的第155位碱基)存在对CYP2C19的 功能具有影响的点突变(155G、155A),该多态性为上述的CYP2C19*3。本发明中,该位点的多态性在为纯合子时用155G/G、155A/A表示,在为杂合子时用155G/A表示。予以说明,序列号1的第155位碱基相当于CYP2C19基因的mRNA的外显子4的第636位碱基,因此CYP2C19*3多态性例如还可以表示为636G/G、636A/A、636G/A。以下,将该引物对(2)也称作“CYP2C19*3用引物对”。予以说明,在仅解析CYP2C19*3的多态性时,可以仅使用CYP2C19*3用引物对。
从与上述引物对(1)相同的理由出发,本发明中,引物对(2)的F2引物和R2引物,只要决定DNA聚合酶的扩增起始点的3’末端的碱基满足上述条件即可。因此,F2引物和R2引物的长度本身并无特别限定,可以举出与上述同样的长度。作为具体例,上述F2引物优选为如下的寡核苷酸:与序列号1的碱基序列中的、以第143位的腺嘌呤碱基(A)作为第1碱基、朝向5’方向至第23~37个碱基(优选第25~35个碱基、更优选第27~33个碱基)的区域序列相同的至少一个寡核苷酸。另外,上述R2优选为如下的寡核苷酸:与序列号1的碱基序列中的、以第231位的胸腺嘌呤碱基(T)作为第1碱基、朝向3’方向至第18~30个碱基(优选第19~27个碱基、更优选第20~25个碱基)的区域互补的至少一个寡核苷酸。
另外,R2引物可以是与序列号1所示的碱基序列并非完全互补的寡核苷酸、F2引物可以是与上述碱基序列的互补链并非完全互补的寡核苷酸。即,各引物中除3’末端的碱基以外的部分中,可以与完全互补的寡核苷酸有1个~5个碱基不同。
以下举出F2引物和R2引物的具体例子,本发明并非限于此。另外,这些F2引物和R2引物的组合并无任何限定,这些中,特别优选包含含有序列号27或序列号32的寡核苷酸的F2’引物 和含有序列号40或序列号48的寡核苷酸的R2’引物的引物对(2’)。
表2
另外,为了提高扩增反应的反应温度,上述引物对(1)和(2)的各引物,例如还可以在5’末端加上目前已知的任意序列。
含有这种引物对(1)和(2)的至少1个的本发明CYP2C19基因扩增用引物对,例如优选在扩增全血试样等生物试样的CYP2C19基因时使用。特别是,在同时使用后述的多态性检测用探针与本发明的CYP2C19基因扩增用引物对时,优选基因扩增用反应液中全血试样的添加比例为0.1~0.5体积%。对于该方面在后叙述。
<CYP2C19基因扩增用试剂>
本发明的CYP2C19基因扩增用试剂,如上所述,其特征在于,其为用于利用基因扩增法扩增CYP2C19基因的试剂,包含本发明的CYP2C19基因扩增用引物对。本发明的CYP2C19基因扩增用试剂的特征在于含有本发明的引物对,除此之外的组成等并无任何限定。
为了对使用本发明的引物对、利用基因扩增法所获得的扩增产物进行检测,本发明的CYP2C19基因扩增用试剂例如还可以含有能够与CYP2C19基因的检测对象位点杂交的探针。如上所述,利用本发明的引物对,例如可以根据其中所含的引物对(1)和(2)的种类,利用基因扩增法获得CYP2C19基因中1个或2个目标区域的扩增产物。因此,通过同时存在有与上述各目标区域的检测对象序列互补的探针,例如可以利用后述的方法检测有无扩增、检测对象位点的基因型(多态性)等。对于这种探针及其利用方法,将在之后的多态性解析方法中说明。另外,本发明的CYP2C19基因扩增用试剂优选在扩增全血等生物试样的CYP2C19基因时使用。特别是,将本发明的CYP2C19基因扩增用试剂与上述探针一起使用时,优选使基因扩增用反应液中全血试样的添加比例为0.1~0.5体积%。予以说明,本发明中“检测对象序列”是指含有多态性发生的位点(检测对象位点)的序列。
本发明的CYP2C19基因扩增用试剂的形态并无特别限定,例如可以是含有本发明的CYP2C19基因扩增用引物对的液体试剂,还可以是在使用前用溶剂混悬的干燥试剂。另外,CYP2C19基因扩增用引物对的含量也无特别限定。
<扩增产物的制造方法>
本发明的扩增产物的制造方法,如上所述,其特征在于,其为利用基因扩增法制造CYP2C19基因的扩增产物的方法, 包含下述(I)工序。
(I)以试样中的核酸作为模板,使用本发明的CYP2C19基因扩增用引物对,在反应液中扩增上述CYP2C19基因的工序
如此,使用本发明的引物对进行扩增反应,由此可以如上所述扩增CYP2C19基因的目标区域。另外,本发明的CYP2C19基因扩增用引物对含有上述引物对(1)和(2)两者时,可以在同一反应液中同时扩增CYP2C19的分别含有2个检测对象位点的2个目标区域。通过本发明被扩增的目标区域如上所述,为分别含有发生各多态性(CYP2C19*2和CYP2C19*3)的检测对象位点的区域。予以说明,本发明的扩增产物制造方法的特征在于使用本发明的引物对,基因扩增法的种类、条件等并无任何限定。
上述基因扩增法如上所述并无特别限定,例如可以举出PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)法、NASBA(Nucleic acid sequence based amplification,基于核酸序列的扩增)法、TMA(Transcription mediated amplification,转录介导扩增)法、SDA(Strand Displacement Amplification,链置换扩增)法等,优选PCR法。予以说明,以下以PCR法为例说明本发明,但并非局限于此。
作为适用本发明的试样,例如只要含有成为模板的核酸即可,并无特别限定,例如优选应用于含有杂质的材料。作为上述含有杂质的试样例如可以举出全血、口腔内细胞(例如口腔粘膜)、指甲或毛发等体细胞、生殖细胞、吐出的痰液、羊水、石蜡包埋组织、尿、胃液(例如胃洗涤液)等、它们的混悬液等。根据使用本发明引物对的扩增产物的制造方法,例如即便是含有各种杂质的试样(特别是全血或口腔细胞等的生物试 样),也不易受杂质影响、可以特异地扩增CYP2C19基因的上述目标区域。因此,通过本发明,即便是通过以往方法较难测定的全血等杂质多的试样,也可以不进行例如精制等预处理而直接使用。因此,从试样的预处理的观点出发,可以说可以较以往方法更为迅速地制造扩增产物。
上述反应液中的试样添加比例并无特别限定。作为具体例,当上述试样为生物试样(例如全血试样)时,上述反应液中的添加比例的下限例如优选为0.01体积%以上、更优选为0.05体积%以上、进一步优选为0.1体积%以上。上述添加比例的上限并无特别限定,例如优选为2体积%以下、更优选为1体积%以下、进一步优选为0.5体积%以下。
另外,以如后所述的光学检测为目的时,特别是进行使用标记探针的光学检测时,全血试样这类生物试样的添加比例例如优选设定为0.1~0.5体积%。在PCR反应中,通常为了使DNA变性(解离成单链DNA)而实施加热处理,但由于该加热处理,试样所含的糖、蛋白质等变性,有产生不溶沉淀物、混浊等的顾虑。因此,在利用光学方法确认扩增产物的有无或检测对象位点的基因型(多态性)时,这种沉淀物或混浊的发生有可能对测定精度造成影响。但是,通过将反应液的全血试样的添加比例设定在上述范围内,虽然原理不明,但由于可以充分防止变性所产生的沉淀物等造成的影响,因此可以提高利用光学方法的测定精度。另外,由于还可充分地抑制全血试样中的杂质对PCR的干扰,因此可以进一步提高扩增效率。因而,在使用本发明的引物对的基础上,通过进一步将全血试样等试样的添加比例设定在上述范围内,可以进一步排除试样预处理的必要性。
另外,上述反应液中的全血试样的比例不仅可以用上述体 积比例(例如0.1~0.5体积%),还可以用血红蛋白(以下称作“Hb”)的重量比例表示。此时,上述反应液中的全血试样的比例换算为Hb量例如优选为0.565~113g/L的范围、更优选为2.825~56.5g/L的范围、进一步优选为5.65~28.25g/L的范围。予以说明,上述反应液中的全血试样的添加比例例如可以满足上述体积比例和Hb重量比例两者,也可以满足任一者。
作为全血,例如可以是溶血的全血、未溶血的全血、抗凝固全血、含有凝固部分的全血等的任一种。
本发明中,试样所含的目标核酸例如为DNA。上述DNA例如可以是生物试样等试样中原本含有的DNA,还可以是通过基因扩增法扩增的扩增产物DNA。为后者时,可以举出利用逆转录反应(例如RT-PCR,逆转录PCR)由上述试样原本含有的RNA(总RNA、mRNA等)产生的cDNA。
本发明的扩增产物的制造方法中,优选在基因扩增反应开始前,向上述反应液中添加白蛋白。通过这种白蛋白的添加,例如可以进一步降低上述沉淀物、悬浊的产生所带来的影响,且可以进一步提高扩增效率。具体地说,优选在上述(I)工序的扩增反应或解离为单链DNA的工序前添加白蛋白。
上述反应液中白蛋白的添加比例例如为0.01~2重量%的范围、优选为0.1~1重量%、更优选为0.2~0.8重量%。上述白蛋白并无特别限定,例如可以举出牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白、大鼠血清白蛋白、马血清白蛋白等,这些物质可以使用任一种,还可以并用两种以上。
接着,列举一个例子对本发明的扩增产物制造方法进行说明,即,对于全血试样,以DNA为目标核酸、使用含有上述引物对(1)和(2)两者的本发明CYP2C19基因扩增用引物对、利用PCR制造CYP2C19基因的2个区域的扩增产物。予以说明, 本发明的特征在于使用本发明的引物对,其他构成及条件并无任何限定。
首先,制备PCR反应液。本发明的引物对的添加比例并无特别限定,优选按照引物对(1)和(2)的F引物分别达到0.1~2μmol/L的方式进行添加、更优选为0.25~1.5μmol/L、特别优选为0.5~1μmol/L。另外,优选按照引物对(1)和(2)的R引物分别达到0.1~2μmol/L的方式进行添加、更优选为0.25~1.5μmol/L、特别优选为0.5~1μmol/L。各引物对的F引物和R引物的添加比例(F∶R摩尔比)并无特别限定,例如优选为1∶0.25~1∶4、更优选为1∶0.5~1∶2。
反应液中全血试样的比例并无特别限定,优选上述范围。全血试样可以直接添加在反应液中,还可以预先用水或缓冲液等溶剂稀释后添加至反应液中。预先稀释全血试样时,其稀释率并无特别限定,例如稀释率可以按照反应液中最终全血添加比例达到上述范围来进行设定,例如为100~2000倍、优选为200~1000倍。
上述反应液中的其它组成成分并无特别限定,可以举出目前已知的成分,其比例也无特别限定。上述组成成分例如可以举出DNA聚合酶、核苷酸(核苷三磷酸(dNTP))和溶剂。另外,如上所述,优选上述反应液中进一步含有白蛋白。予以说明,上述反应液中,各组成成分的添加顺序并无任何限定。
上述DNA聚合酶并无特别限定,例如可以使用目前已知的耐热性细菌来源的聚合酶。具体例子有可以商业地获得的来自水生栖热菌(Thermus aquaticus)的DNA聚合酶(美国专利第4,889,818号以及美国专利第5,079,352号)(商品名Taq聚合酶)、来自极端嗜热菌(Thermus thermophilus)的DNA聚合酶(WO 91/09950)(rTth DNA polymerase)、来自强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的DNA聚合酶(WO 92/9689)(Pfu DNA polymerase:Stratagenes公司产)、来自嗜热球菌(Thermococcus litoralis)的DNA聚合酶(EP-A 455 430)(商标Vent:New England Biolabs公司产)等,其中,优选来自水生栖热菌(Thermus aquaticus)的耐热性DNA聚合酶。
上述反应液中DNA聚合酶的添加比例并无特别限定,例如为5~50U/mL、优选为1~100U/mL、更优选为20~30U/mL。予以说明,DNA聚合酶的活性单位(U)一般是以活化鲑鱼精子DNA为模板DNA,在活性测定用反应液中、74℃下、30分钟内,将10nmol的总核苷酸吸收到酸不溶性沉淀物中的活性作为1U。上述活性测定用反应液的组成例如为25mM TAPS buffer(pH9.3、25℃)、50mM KCl、2mM MgCl2、1mM巯基乙醇、200μM dATP、200μM dGTP、200μM dTTP、100μM“α-32P”dCTP、0.25mg/mL活化鲑鱼精子DNA。
上述核苷三磷酸通常可以举出dNTP(dATP、dCTP、dTTP)。上述反应液中的dNTP的添加比例并无特别限定,例如为0.01~1mmol/L、优选为0.05~0.5mmol/L、更优选为0.1~0.3mmol/L。
上述溶剂例如可以举出Tris-HCl、Tricine、MES、MOPS、HEPES、CAPS等缓冲液,可以使用市售的PCR用缓冲液或市售的PCR试剂盒的缓冲液等。
另外,上述PCR反应液还可以含有肝素、甜菜碱、KCl、MgCl2、MgSO4、甘油等,它们的添加比例例如可以设定为不干扰PCR反应的范围。
反应液的总体积并无特别限定,例如可以根据所用机器(热循环仪)等适当地设定,通常为1~500μL、优选为10~100μL。
接着,进行PCR。PCR循环条件并无特别限定,例如(1)全血来源的双链DNA解离成单链DNA、(2)引物的退火、(3) 引物的延伸(聚合酶反应)分别如下所述。另外,循环数也无特别限定,以下述(1)~(3)的3步为1个循环,例如优选为30个循环。上限并无特别限定,例如共计100个循环以下、优选70个循环以下、更优选50个循环以下。各步的温度变化例如可以使用热循环仪等自动地控制。使用本发明的引物对时,如上所述由于扩增效率优异,因此与利用以往方法时50个循环需要3小时左右相比,利用本发明可以在约1小时左右(优选1小时以内)完成50个循环。
表3
如上所述,可以制造与CYP2C19基因的2个区域互补的扩增产物。予以说明,制造与2个目标区域中任1个互补的扩增产物时,例如可以使用含有引物对(1)和(2)中对应于目标区域的任一种引物对的本发明CYP2C19基因扩增用引物对。
本发明的扩增产物的制造方法还包含检测通过上述扩增反应获得的目标区域的扩增产物的工序。由此,可以检测扩增产物的有无、CYP2C19基因的上述目标区域的基因型(多态性CYP2C19*2或多态性CYP2C19*3)。扩增产物的有无可以利用目前已知的方法确认。具体地说,在上述(I)工序中,在上述反应液中预先添加能够与CYP2C19基因的检测对象位点杂交的探针(例如荧光标记探针),进而,可以通过(II)工序,即,对于上述反应液测定上述探针的荧光标记的荧光强度来确认。另外,当所扩增的目标区域为2个时,例如在上述(I)工序中 向上述反应液中预先添加两种能够与CYP2C19基因的各检测对象位点杂交的探针(例如荧光标记探针),进而,可以通过(II)工序,即,对上述反应液测定各探针的各荧光标记的荧光强度来确认。予以说明,以下将CYP2C19基因的多态性CYP2C19*2和CYP2C19*3的检测作为本发明的一方式,来进行说明。
<CYP2C19基因的多态性解析方法>
本发明的CYP2C19基因的多态性解析方法,其特征在于,其为解析CYP2C19基因的检测对象位点的多态性的方法,包含下述(i)~(iv)工序。
(i)利用本发明的扩增产物的制造方法,在反应液中扩增CYP2C19基因中含有检测对象位点的区域的工序
(ii)准备反应液的工序,所述反应液含有上述(i)工序的扩增产物和能够与上述检测对象位点杂交的探针
(iii)改变上述反应液的温度,测定上述扩增产物与上述探针的杂交形成体显示融解状态的信号值的工序
(iv)由伴随温度变化的上述信号值的变动,决定上述检测对象位点的多态性的工序
如此使用本发明的引物对制造扩增产物,由此可以如上所述地扩增CYP2C19基因的含有多态性(CYP2C19*2或CYP2C19*3)的检测对象位点的目标区域,解析上述目标区域的检测对象位点的多态性。
上述(ii)工序的探针并无特别限定,例如是与多态性CYP2C19*2发生位点杂交的探针(以下也称作“CYP2C19*2用探针”)、以及与多态性CYP2C19*3发生位点杂交的探针(以下也称作“CYP2C19*3用探针”)。这些探针优选为与含有上述检测对象位点的检测对象序列互补的探针。这些探针可以为任何一种,还可以是两种,例如可以根据用本发明的CYP2C19基因扩 增用引物对所扩增的目标区域的种类来决定。使用两种探针时,例如可以使用同一反应液解析2个检测对象位点的多态性。
上述用于检测多态性的探针并无特别限定,可以利用目前已知的方法设定。例如含有多态性检测对象位点的检测对象序列可以根据CYP2C19基因的正义链的序列来设计,还可以根据反义链的序列来设计。另外,多态性检测对象位点的碱基可根据各多态性的种类适当地决定。即,为CYP2C19*2时,由于已知序列号1的第1361位碱基存在“G”和“A”的多态性,因此例如可以举出与第1361位为G的检测对象序列和第1361位为A的检测对象序列任一个互补的探针(正义链的检测用探针)、与其反义链的序列互补的探针(反义链的检测用探针)。另外,为CYP2C19*3时,由于已知序列号1的第155位碱基存在“G”和“A”的多态性,因此例如可以举出与第155位为G的检测对象序列和第155位为A的检测对象序列任一个互补的探针(正义链的检测用探针)、与其反义链的序列互补的探针(反义链的检测用探针)。这样,不论在设计探针时将发生多态性的检测对象位点的碱基设定为上述任一种碱基,都可以利用后述的方法判断在CYP2C19基因的各检测对象位点处显示何种多态性。
上述各探针可以在上述(i)工序后、即对CYP2C19基因的目标区域进行扩增反应后,添加于扩增反应液中,但优选在上述(i)工序的扩增反应之前预先添加到反应液中,其原因在于这样能容易且迅速地进行解析。
上述反应液中探针的添加比例并无特别限定,例如优选按照各探针达到10~400nmol的范围的方式进行添加,更优选为20~200nmol。另外,使用荧光染料作为探针的标记时,例如为了调整所检测的荧光强度,可以同时使用与标记探针序列相同的未标记探针,该未标记探针可以在其3′末端添加有磷酸。 此时,标记探针与未标记探针的摩尔比例如优选为1∶10~10∶1。CYP2C19*2用探针和CYP2C19*3用探针中,组合添加未标记探针的探针并无特别限定,例如优选对CYP2C19*3用探针添加标记探针和未标记探针。上述探针的长度并无特别限定,例如为5~50mer、优选为10~30mer。
对于Tm值进行说明。当持续加热含有双链DNA的溶液时,260nm的吸光度上升。这是由于双链DNA双链间的氢键通过加热而打开,解离成单链DNA(DNA融解)。而且,当全部双链DNA解离、变为单链DNA时,其吸光度显示为加热开始时的吸光度(仅双链DNA的吸光度)的约1.5倍左右,由此可以判断融解结束。根据该现象,融解温度Tm一般定义为吸光度到达吸光度总上升量的50%时的温度。
在上述(iii)工序中,测定上述扩增产物与上述探针的杂交形成体显示融解状态的信号,既可以是上述260nm的吸光度的测定,还可以是标记物的信号的测定。具体地说,优选如下:使用被标记物标记的标记探针作为上述探针,测定上述标记物的信号。上述标记探针例如可以举出单独显示信号、由于杂交而不显示信号的标记探针;或者单独不显示信号、由于杂交而显示信号的标记探针。为前者的探针时,在与检测对象序列形成杂交体(双链DNA)时不显示信号,通过加热探针游离时,则显示信号。另外,为后者的探针时,在与检测对象序列形成杂交体(双链DNA)时显示信号,通过加热探针游离时,则信号减少(消失)。因此,通过利用信号特有的条件(吸收波长等)检测该标记所产生的信号,可以与上述260nm的吸光度测定同样,在融解进行的同时决定Tm值等。
本发明中,如上所述,还可以对于在同一反应液中扩增的2个区域的扩增产物确认多态性。因此,使用两种探针时,优选 用在不同的条件下被检测的不同标记进行标记。通过如此使用不同的标记,即便是同一反应液,也可以通过改变检测条件来分别解析各扩增产物。
上述标记探针的标记物的具体例子,例如可以举出荧光染料(荧光团)。上述标记探针的具体例子例如优选用荧光染料进行标记、单独显示荧光且由于杂交而荧光减少(例如猝灭)的探针。利用这种荧光猝灭现象(Quenching phenomenon)的探针一般被称作荧光猝灭探针。其中,上述探针优选寡核苷酸的3’末端或5’末端被荧光染料标记,被标记的上述末端的碱基优选为C。此时,优选如下设计上述标记探针的碱基序列:在上述标记探针所杂交的检测对象序列中,与上述标记探针的末端碱基C成对的碱基或者从上述成对的碱基起的1~3个碱基为G。这种探针一般被称作鸟嘌呤猝灭探针,已知有所谓的QProbe(注册商标)。这种鸟嘌呤猝灭探针与检测对象序列杂交时,用荧光染料标记的末端C接近上述检测对象DNA中的G,因此显示上述荧光染料的发光减弱(荧光强度减少)的现象。使用这种探针时,可以利用信号的变动容易地确认杂交和解离。
上述荧光染料并无特别限定,例如可以举出荧光素、磷光体、罗丹明、聚甲炔染料衍生物等,作为市售的荧光染料例如可以举出BODIPY FL(商标、モレキユラ一·プロ一ブ公司制)、FluorePrime(商品名、アマシヤムフアルマシア公司制)、Fluoredite(商品名、Milipore公司制)、FAM(ABI公司制)、Cy3和Cy5(アマシヤムフアルマシア公司制)、TAMRA(モレキユラ一·プロ一ブ公司制)等。两种探针中使用的荧光染料的组合例如只要能够在不同条件下检测出即可,并无特别限定,例如可以举出Pacific Blue(检测波长450~480nm)和BODIPY FL(检测波长515~555nm)的组合等。
以下举出用于检测多态性CYP2C19*2和CYP2C19*3的探针序列的具体例子,但本发明并非局限于此。下述探针(1)为CYP2C19*2用探针的一例,为用于检测正义链的探针。下述探针(2)为CYP2C19*3用探针的一例,为用于检测反义链的探针。
探针(1)
与序列号1中的、以第1373位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基、朝向5’方向至第16~28个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸,该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基作为3’末端
探针(2)
与序列号1中的、以第146位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基、朝向3’方向至第18~25个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸,该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基作为5’末端
和
与序列号1中的、以第150位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基、朝向3’方向至第14~19个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸,该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基作为5’末端
中的至少一种寡核苷酸
上述探针(1)中,处于序列号1的第1361位的碱基为A或G,上述探针(2)中,处于序列号1的第155位的碱基为A或G。
然后将上述探针(1)和探针(2)的具体例子示于下表中。予以说明,下表中“Tm(℃)”是下表的序列和与其完全互补的序列杂交时的Tm(℃),利用MELTCALC软件(http://www.meltcalc.com)、将参数设为寡核苷酸浓度0.2μM、钠当量(Na eq.)50mM计算的值。
表4
上述表中,探针(1)含有与序列号1的第1361位为A的区域相同的序列,大写的碱基表示与序列号1的第1361位的碱基互补的碱基。予以说明,上述探针(1)中,上述大写碱基可以置换成r、上述r可以为A和G的任一种。上述表中,探针(2)含有与序列号1的第155位为A的区域相同的序列,大写的碱基表示序列号1的第155位碱基。予以说明,上述探针(2)中,上述大写碱基可以置换成r、上述r可以为G和A的任一种。本发明的探针的具体例子如上所述,可以是上述表中所示的寡核苷酸的互补链。
上述探针为一个例子,本发明并非局限于此。这些探针中,CYP2C19*2用探针优选为(P1’)含有序列号61或序列号64的碱基序列的寡核苷酸,作为CYP2C19*3用探针优选为(P2’)含有 序列号69或序列号76的碱基序列的寡核苷酸。
这些探针在使用两种时,如上所述,优选用分别不同的荧光染料(通过不同波长检测的荧光染料)进行标记。例如,当上述表所示的探针为鸟嘌呤猝灭探针时,优选如下:CYP2C19*2用探针(P1探针)用上述荧光染料(例如Pacific Blue、TAMRA等)标记3’末端的胞嘧啶,CYP2C19*3用探针(P2探针)用上述荧光染料(例如BODIPY FL)标记5’末端的胞嘧啶。另外5’末端标记有荧光染料的探针例如为了防止探针本身延伸,可以在其3’末端添加磷酸基。
接着,举出一个例子说明本发明的检测方法,即,使用下述探针检测CYP2C19基因的2个多态性CYP2C19*2和CYP2C19*3。予以说明,本发明并非局限于此。
(探针)
CYP2C19*2用探针
5’-atttcccAggaacccataac-(Pacific Blue)-3’(序列号61)或
5’-tcccaggaacccataac-(BODIPY FL)-3’(序列号64)
CYP2C19*3用探针
5’-(BODIPY FL)-caccccctgAatccaggtaagg-P-3’(序列号69)或
5’-(BODIPY FL)-ccctgAatccaggtaag-P-3’(序列号76)
首先使用添加有上述两种标记探针的反应液,如上所述地进行PCR,在同一反应液中同时扩增CYP2C19基因的2个区域。上述反应液例如含有本发明的CYP2C19基因扩增用引物对、DNA聚合酶、dNTP、含有成为模板的核酸的试样以及上述两种探针。除此之外,还可以含有可以用于核酸扩增的各种添加剂。
接着,进行所得的扩增产物的解离以及通过解离获得的单链DNA与上述标记探针的杂交。这可以通过改变例如上述反应 液的温度来进行。
上述解离工序的加热温度只要是上述扩增产物能够解离的温度则无特别限定,例如为85~95℃。加热时间也无特别限定,通常为1秒~10分钟、优选1秒~5分钟。
解离的单链DNA和上述标记探针的杂交例如可以在上述解离工序后,通过降低上述解离工序的加热温度来进行。温度条件例如为40~50℃。
然后,改变上述反应液的温度,测定上述扩增产物与上述标记探针的杂交形成体显示融解状态的信号值。具体地说,例如加热上述反应液(上述单链DNA与上述标记探针的杂交形成体),测定随温度上升的信号值的变动。如上所述,当使用末端的C碱基被标记的探针(鸟嘌呤猝灭探针)时,在与单链DNA杂交的状态下,荧光减少(或者猝灭),在解离的状态下发出荧光。因此,例如可以慢慢加热荧光减少(或者猝灭)了的杂交形成体,测定随温度上升的荧光强度的增加。
测定荧光强度变动时的温度范围并无特别限定,例如起始温度为室温~85℃、优选为25~70℃,终止温度例如为40~105℃。另外,温度的上升速度并无特别限定,例如为0.1~20℃/秒、优选为0.3~5℃/秒。
接着,解析上述信号的变动决定Tm值。具体地说,可以从所得荧光强度求得各温度下每单位时间的荧光强度变化量(-d荧光强度增加量/dt),将显示最低值的温度作为Tm值。另外,可以将每单位时间的荧光强度增加量(d荧光强度增加量/dt)的最高点作为Tm值。予以说明,不使用猝灭探针,而是使用单独不显示信号且由于杂交而显示信号的探针作为标记探针时,相反地可以测定荧光强度的减少量。
本发明中,为了检测2个多态性CYP2C19*2、CYP2C19*3, 在与两种探针的各标记相应的条件下决定各个Tm值。CYP2C19*2用探针的Pacific Blue例如可以在检测波长450~480nm下检测,CYP2C19*3用探针的BODIPY FL例如可以在检测波长515~555nm下检测。另外,标记为TAMRA时,例如可以在检测波长585~700nm下检测。
然后,由这些Tm值决定各检测对象位点的基因型。Tm解析中,可以获得如下的结果:与有一个碱基不同的杂交体(错配)相比,完全互补的杂交体(匹配)其显示解离的Tm值增高。因此,通过对上述探针预先决定完全互补的杂交体的Tm值和有一个碱基不同的杂交体的Tm值,可以决定各检测对象位点的基因型。例如,在将检测对象位点的碱基假设为突变型(例如假定序列号1的第1361位碱基为A)、使用与含有其的检测对象序列互补的探针时,所形成的杂交体的Tm值若与完全互补的杂交体的Tm值相同,则可判定上述扩增产物的多态性为突变型。另外,所形成的杂交体的Tm值若与有一个碱基不同的杂交体的Tm值相同(低于完全互补的杂交体的Tm值),则可判定上述扩增产物的多态性为野生型(例如序列号1的第1361位的碱基为G)。而且,当检测到两种Tm值时,可以判断为杂合子。如此,由与各标记探针相应的2个Tm值,可以判断多态性CYP2C19*2和CYP2C19*3的有无。
另外,本发明中,如上所述,还可以测定杂交体形成时的信号变动来代替升高含有上述探针的反应液的温度(加热杂交形成体)、测定伴随温度上升的信号变动的方法。即,也可以在降低含有上述探针的反应液的温度以形成杂交形成体时,测定伴随上述温度降低的信号变动。
作为具体例,当使用单独显示信号、且由于杂交而不显示信号的标记探针(例如鸟嘌呤猝灭探针)时,在单链DNA和探 针解离的状态下发出荧光,但由于温度降低而形成杂交体时,上述荧光减少(或者猝灭)。因此,例如可以慢慢降低上述反应液的温度,测定伴随温度降低的荧光强度的减少。另外,使用单独不显示信号、且由于杂交而显示信号的标记探针时,在单链DNA和探针解离的状态下不发出荧光,但由于温度降低而形成杂交体时,则发出荧光。因此,例如可以慢慢降低上述反应液的温度,测定伴随温度降低的荧光强度的增加。
予以说明,当对CYP2C19基因的两种多态性(多态性CYP2C19*2或CYP2C19*3)中任1个多态性进行解析时,例如使用含有引物对(1)和(2)中与目标区域相应的任一种引物对即本发明CYP2C19基因扩增用引物对,进而使用与目标检测对象位点杂交的任一种探针即可。
接着,说明本发明的实施例。本发明并不受下述实施例的限定。
实施例1
使用肝素锂采血管对4位受试者进行采血(样品1~4)。将所得血液10μL与蒸馏水90μL混合,进而将该混合液10μL与蒸馏水90μL混合。将该混合液10μL添加至下述组成的PCR反应液40μL中,使用热循环仪进行PCR。PCR的条件为:95℃下处理60秒钟后,以95℃下1秒钟和54℃下10秒钟为1个循环,重复进行50个循环,进而在95℃下处理1秒钟,在40℃下处理60秒钟。接着,使温度的上升速度为1℃/3秒钟,将上述PCR反应液从40℃加热至95℃,测定荧光强度随时间的变化。测定波长为450~480nm(荧光染料Pacific Blue的检测)、515~555nm(荧光染料BODIPY FL的检测)。予以说明,50个循环的PCR所需要的时间约为1个小时。
表5
*商品名Gene Taq FP:ニツポンジ一ン公司制
(探针)
CYP2C19*2用探针
5’-atttcccaggaacccataac-(Pacific Blue)-3’(序列号61)
CYP2C19*3用探针1
5’-(BODIPY FL)-caccccctgaatccaggtaagg-P-3’(序列号69)
CYP2C19*3用探针2
5’-caccccctgaatccaggtaagg-P-3’(序列号69)
(引物对)
CYP2C19*2F1引物
5’-gttttctcttagatatgcaataattttccca-3’(序列号12)
CYP2C19*2R1引物
5’-cgagggttgttgatgtccatc-3’(序列号22)
CYP2C19*3F2引物
5’-gaaaaattgaatgaaaacatcaggattgta-3’(序列号32)
CYP2C19*3R2引物
5’-gtacttcagggcttggtcaata-3’(序列号48)
与CYP2C19*2用探针匹配的杂交体的Tm值为60.5℃、错配的杂交体的Tm值为53.0℃,与CYP2C19*3用探针匹配的杂交体的Tm值为66.5℃、错配的杂交体的Tm值为60.0℃。
将样品1~4的结果示于图1。该图为表示伴随温度上升的荧光强度变化的Tm解析的图表,纵轴的微分值表示“-d荧光强度增加量/dt”、横轴表示温度(以下同样)。如该图所示,由信号的峰决定各样品的CYP2C19*2和CYP2C19*3的基因型。为了支持这些实施例的结果,利用RFLP法和测序法对4位受试者确认CYP2C19*2和CYP2C19*3的基因型,获得与实施例相同的结果。如此,通过使用本发明的引物对,可以使用不实施预处理的全血试样,在同一反应液中同时扩增CYP2C19基因的2个区域,且使用上述同一反应液解析两种多态性。
实施例2
使用EDTA采血管对2位受试者进行采血(样品1~2)。将所得血液10μL与下述稀释液A 70μL混合,进而将该混合液10μL与下述稀释液B 70μL混合。在95℃下加热处理10μL该混合液5分钟后,添加至下述组成的PCR反应液46μL中,使用热循环仪进行PCR。PCR的条件为:在95℃下处理60秒钟后,以95℃下1秒钟和64℃下15秒钟为1个循环,重复进行50个循环,进而在95℃下处理1秒钟,在40℃下处理60秒钟。接着,使温度的上升速度为1℃/3秒钟,将上述PCR反应液从40℃加热至75℃,测定荧光强度随时间的变化。测定波长为515~555nm(荧光染料BODIPY FL的检测)和585~700nm(荧光染料TAMRA的检测)。
(稀释液A)
10mM Tris-HCl(pH8)、0.1mM EDTA、0.05%NaN3、0.3%SDS
(稀释液B)
10mM Tris-HCl(pH8)、0.1mM EDTA、0.05%NaN3
表6
*商品名Gene Taq FP:ニツポンジ一ン公司制
(探针)
CYP2C19*2用探针
5’-tcccaggaacccataac-(BODIPY FL)-3’(序列号64)
CYP2C19*3用探针
5’-(TAMRA)-ccctgaatccaggtaag-P-3’(序列号76)
(引物对)
CYP2C19*2F1引物
5’-taaattattgttttctcttagatatgcaataattttccca-3’(序列号3)
CYP2C19*2R1引物
5’-cccgagggttgttgatgtccatc-3’(序列号20)
CYP2C19*3F2引物
5’-tgatggaaaaattgaatgaaaacatcaggattgta-3’(序列号27)
CYP2C19*3R2引物
5’-tcaaaaatgtacttcagggcttggtcaata-3’(序列号40)
与CYP2C19*2用探针匹配的杂交体的Tm值为59℃、错配的杂交体的Tm值为51℃,与CYP2C19*3用探针匹配的杂交体的Tm值为58℃、错配的杂交体的Tm值为50℃。
将样品1~2的结果示于图2。该图为表示伴随温度上升的荧光强度变化的Tm解析的图表,纵轴的微分值表示“-d荧光强度增加量/dt”、横轴表示温度。如该图所示,由信号峰决定各样品的CYP2C19*2和CYP2C19*3的基因型。为了支持这些实施例的结果,利用RFLP法和测序法对2位受试者确认CYP2C19*2和CYP2C19*3的基因型,获得与实施例相同的结果。如此,通过使用本发明的引物对,可以使用不实施预处理的全血试样,在同一反应液中同时扩增CYP2C19基因的2个区域,且使用上述同一反应液解析两种多态性。
产业实用性
如上所述,利用本发明的引物对时,可以特异且高效地扩增CYP2C19基因的含有特定多态性(CYP2C19*2或CYP2C19*3)发生位点的区域。因此,与上述以往方法不同,可以减少功夫和成本。另外,由于如此特异地扩增含有多态性的检测对象位点的区域,因此例如通过使用与含有上述检测对象位点的检测对象序列互补的探针,可以使用上述反应液直接进行Tm解析、对上述多态性进行分型。另外,由于可以在1个反应液中扩增、分型,因此操作的自动化也成为可能。而且,当使用本发明的引物对时,例如即便是含有杂质的试样(例如全血或口腔粘膜等),由于可以省略预处理,因此可以更为迅速且简单地进行扩增反应。另外,使用本发明的引物对时,由于可以以较以往更为优异的扩增效率进行扩增反应,因此还能够缩短扩增反应。因而,通过本发明的引物对、含有其的试剂以及使用它们的扩增产物的制造方法,可以迅速且简单地解析 CYP2C19基因的多态性,因而在医疗领域中极为有效。
Claims (19)
1.一种用于检测CYP2C19基因的多态性的探针,其特征在于,
其是含有下述寡核苷酸(1)的探针和含有下述寡核苷酸(2)的探针的组合,
寡核苷酸(1):与序列号1中的、以第1373位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基、朝向5’方向至第16~28个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸,该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基作为3’末端;
寡核苷酸(2):与序列号1中的、以第146位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基、朝向3’方向至第18~25个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸,该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基作为5’末端,
和
与序列号1中的、以第150位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基、朝向3’方向至第14~19个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸,该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基作为5’末端中的至少一种寡核苷酸。
2.根据权利要求1所述的探针,其中,所述寡核苷酸(1)为序列号53~65的任一寡核苷酸。
3.根据权利要求2所述的探针,其中,所述寡核苷酸(1)为序列号61和64的任一寡核苷酸。
4.根据权利要求1所述的探针,其中,所述寡核苷酸(2)为序列号66~79的任一寡核苷酸。
5.根据权利要求4所述的探针,其中,所述寡核苷酸(2)为序列号69和76的任一寡核苷酸。
6.根据权利要求1所述的探针,其中,所述寡核苷酸(1)为序列号61的寡核苷酸,所述寡核苷酸(2)为序列号69的寡核苷酸。
7.根据权利要求1所述的探针,其中,所述寡核苷酸(1)为序列号64的寡核苷酸,所述寡核苷酸(2)为序列号76的寡核苷酸。
8.根据权利要求1所述的探针,其中,所述探针为荧光标记探针。
9.根据权利要求8所述的探针,其中,所述探针为末端的胞嘧啶残基被标记的荧光标记探针。
10.一种用于检测CYP2C19基因的多态性的试剂,其特征在于,
其包含权利要求1所述的含有所述寡核苷酸(1)的探针和含有所述寡核苷酸(2)的探针。
11.根据权利要求10所述的试剂,其进一步含有用于扩增CYP2C19基因的引物对(1)和(2),
引物对(1):
包含含有下述(F1)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R1)的寡核苷酸的反向引物的一个引物对
(F1):与序列号1的碱基序列中的、以第1341位的腺嘌呤碱基(A)作为第1碱基、朝向5’方向至第25~41个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸,该寡核苷酸以上述腺嘌呤碱基(A)为3’末端
(R1):与序列号1的碱基序列中的、以第1442位的鸟嘌呤碱基(G)作为第1碱基、朝向3’方向至第19~24个碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸,该寡核苷酸以与上述第1442位的鸟嘌呤碱基(G)互补的胞嘧啶碱基(C)作为3’末端
引物对(2):
包含含有下述(F2)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R2)的寡核苷酸的反向引物的一个引物对
(F2):与序列号1的碱基序列中的、以第143位的腺嘌呤碱基(A)作为第1碱基、朝向5’方向至第23~37个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸,该寡核苷酸以上述腺嘌呤碱基(A)为3’末端
(R2):与序列号1的碱基序列中的、以第231位的胸腺嘧啶碱基(T)作为第1碱基、朝向3’方向至第18~30个碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸,该寡核苷酸以与上述第231位的胸腺嘧啶碱基(T)互补的腺嘌呤碱基(A)作为3’末端。
12.根据权利要求11所述的试剂,其中,所述引物对(1)和(2)分别为下述引物对(1’)和(2’),
引物对(1’):
包含含有下述(F1’)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R1’)的寡核苷酸的反向引物的一个引物对
(F1’):含有序列号3的碱基序列的寡核苷酸和含有序列号12的碱基序列的寡核苷酸中的至少一种寡核苷酸
(R1’):含有序列号20的碱基序列的寡核苷酸和含有序列号22的碱基序列的寡核苷酸中的至少一种寡核苷酸
引物对(2’):
包含含有下述(F2’)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R2’)的寡核苷酸的反向引物的一个引物对
(F2’):含有序列号27的碱基序列的寡核苷酸和含有序列号32的碱基序列的寡核苷酸中的至少一种寡核苷酸
(R2’):含有序列号40的碱基序列的寡核苷酸和含有序列号48的碱基序列的寡核苷酸中的至少一种寡核苷酸。
13.根据权利要求12所述的试剂,其中,所述引物对(1)包含:含有序列号12和3的至少一个寡核苷酸的正向引物;和,含有序列号22和20的至少一个寡核苷酸的反向引物,
所述引物对(2)包含:含有序列号32和27的至少一个寡核苷酸的正向引物;和,含有序列号48和40的至少一个寡核苷酸的反向引物。
14.一种多态性解析方法,其特征在于,其为解析CYP2C19基因中的检测对象位点的多态性的方法,包括下述(i)~(iv)工序,
(i)以试样中的核酸作为模板,在反应液中扩增CYP2C19基因中含有检测对象位点的区域的工序,
(ii)准备反应液的工序,其中所述反应液含有上述(i)工序的扩增产物和、权利要求1所述的含有所述寡核苷酸(1)的探针和含有所述寡核苷酸(2)的探针,
(iii)改变所述反应液的温度,测定所述扩增产物与所述各探针的杂交形成体显示融解状态的信号值的工序,
(iv)由伴随温度变化的所述信号值的变动,决定所述检测对象位点的多态性的工序。
15.根据权利要求14所述的多态性解析方法,其中,在所述(i)工序中,在扩增反应之前,向所述反应液中添加权利要求1所述的含有所述寡核苷酸(1)的探针和含有所述寡核苷酸(2)的探针。
16.根据权利要求14所述的多态性解析方法,其中,在所述(i)工序中,使用下述引物对(1)和(2)在反应液中进行所述CYP2C19基因的扩增,
引物对(1):
包含含有下述(F1)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R1)的寡核苷酸的反向引物的一个引物对
(F1):与序列号1的碱基序列中的、以第1341位的腺嘌呤碱基(A)作为第1碱基、朝向5’方向至第25~41个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸,该寡核苷酸以上述腺嘌呤碱基(A)为3’末端
(R1):与序列号1的碱基序列中的、以第1442位的鸟嘌呤碱基(G)作为第1碱基、朝向3’方向至第19~24个碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸,该寡核苷酸以与上述第1442位的鸟嘌呤碱基(G)互补的胞嘧啶碱基(C)作为3’末端
引物对(2):
包含含有下述(F2)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R2)的寡核苷酸的反向引物的一个引物对
(F2):与序列号1的碱基序列中的、以第143位的腺嘌呤碱基(A)作为第1碱基、朝向5’方向至第23~37个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸,该寡核苷酸以上述腺嘌呤碱基(A)为3’末端
(R2):与序列号1的碱基序列中的、以第231位的胸腺嘧啶碱基(T)作为第1碱基、朝向3’方向至第18~30个碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸,该寡核苷酸以与上述第231位的胸腺嘧啶碱基(T)互补的腺嘌呤碱基(A)作为3’末端。
17.根据权利要求14所述的多态性解析方法,其中,所述试样为生物试样。
18.根据权利要求17所述的多态性解析方法,其中,所述生物试样为全血。
19.根据权利要求18所述的多态性解析方法,其中,所述反应液中全血试样的添加比例为0.1~0.5体积%。
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