DE10219373A1

DE10219373A1 - Verfahren und Diagnosekit zur molekularen Diagnostik pharmakologisch relevanter Gene

Info

Publication number: DE10219373A1
Application number: DE2002119373
Authority: DE
Inventors: Stefanie Dr. Waschütza; Eckart Dr. Schnakenberg; Michael Lustig
Original assignee: Adnagen GmbH
Current assignee: Alere Diagnostics GmbH
Priority date: 2002-04-30
Filing date: 2002-04-30
Publication date: 2004-02-19

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und ein hierfür geeignetes Diagnose-Kit für die Bestimmung der Medikamenten-Verträglichkeit eines Menschen. Das Diagnose-Kit enthält mindestens zwei Paare Oligonukleotide (Reverseprimer, Forwardprimer), wobei die beiden Oligonukleotide jedes Paares als Primer zur Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion jeweils eines der beiden komplementären Stränge eines gesuchten DNS-Abschnittes geeignet sind, und wobei der jeweils einem Paar Oligonukleotide zugeordnete gesuchte DNS-Abschnitt Teil des Gens eines der menschlichen Enzyme der Phase I und/oder Phase II des Entgiftungsstoffwechsels und von dem dem anderen Paar Oligonukleotide zugeordneten gesuchten DNS-Abschnitt verschieden ist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein diagnostisches System sowie seine Verwendung zur Bestimmung der Medikamentenverträglichkeit eines Menschen. Dieses System ermöglicht die molekulare Diagnostik relevanter Gene, die im Stoffwechsel von Medikamenten von Bedeutung sind und ermöglicht u.a. die Risikoeinschätzung hinsichtlich des Auftretens medikamentenbedingter Nebenwirkungen.
Die Stoffwechselleistung im menschlichen Organismus ist geprägt durch die katalytische Eigenschaft involvierter Enzymsysteme. Dabei ist die medikamentöse Therapie direkt abhängig von der individuellen Stoffwechselleistung. Das der menschliche Metabolismus individuell verschieden ist, zeigt sich in den unterschiedlichen therapeutischen Erfolgen und den Neben wirkungen, die in Folge von Medikamenten auftreten können. Neben therapeutisch relevanten Substanzen werden auch toxische und kanzerogene Substanzen über diesen Stoffwechselweg umgesetzt. Der Metabolismus hat dabei nicht nur die Detoxifizierung zur Folge. Einige Substanzen werden durch den Stoffwechsel erst in die therapeutische oder kanzerogene Form überführt.
Der Stoffwechsel im menschlichen Organismus kann in zwei Phasen unterteilt werden. In der Phase I können Substanzen detoxifiziert und damit für den Körper unschädlich gemacht werden. Zusätzlich sind die Enzyme der Phase I in der Lage Substanzen in eine zelltoxisch- oder genotoxisch aktive Form zu überführen. Die Phase II ist in der Lage die aus der Phase I entstandenen reaktiven Zwischenprodukte zu binden und in eine für den Körper ausscheidbare Form umzuwandeln.
Die interindividuelle Variabilität im Stoffwechsel ist bedingt durch die Stoffwechselleistung der Enzyme, die genetisch polymorph sind. Durch die Vernetzung der Phase I und Phase II Enzymsysteme im Stoffwechsel vieler Xenobiotika ist eine umfassende Betrachtung der genetischen Determinierung beider Stuffwechselphasen von Bedeutung.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren sowie ein Diagnosekit zur Verfügung zu stellen, mit dem die pharmakologisch relevanten Gene auf relevante Polymorphismen untersucht und so eine Vorhersage bezüglich der Stoffwechselaktivität getroffen werden kann.
Diese Aufgabe wird durch das erfindungsgemäße Verfahren und das erfindungsgemäße Diagnosekit genützt. Vorteilhafte Weiterbildungen dieses erfindungsgemäßen Verfahrens sowie des erfindungsgemäßen Diagnosekits werden in den jeweiligen abhängigen Ansprüchen gegeben.
Erfindungsgemäß beschreibt die vorliegende Erfindung ein Diagnosekit mit dem eine minimal invasive, sichere und zuverlässige Bestimmung der Stoffwechselleistung der Phase 1- und Phase 2-Enzyme eines Menschen auf molekularbiologischer Ebene, beispielsweise aus einer Blutprobe, möglich ist. Erfindungsgemäß werden dabei die in Tabelle 1 dargestellten SNPs untersucht. Die Erfindung besteht nun darin, den relevanten Satz an SNPs erkannt und zusammengefaßt zu haben. Weiterhin werden aus diesem Satz nicht etwa einzelne SNPs untersucht sondern eine Kombination von mindestens zwei der Enzympolymorphismen. Durch diese erfindungsgemäße Auswahl der relevanten Polymorphismen sowie die Analyse mehrerer der in diesem Set enthaltenen Polymorphismen können insbesondere potentielle pharmakokinetische Interaktionen bei der Verstoffwechselung von Arzneimitteln bei der Beurteilung der Pharmakokinetik berücksichtigt werden.
So sind z.B. am Medikamentenstoffwechsel von Phenytoin die Cytochrome CYP2C9 und CYP2C19 beteiligt. Dabei haben CYP2C9 und CYP2C19 einen Anteil von 90% bzw. 10% am tatsächlichen Clearance. Eine Beurteilung des therapeutischen Erfolgs kann demzufolge nur durch die genetische Analyse beider Enzymsysteme gewährleistet werden.
Ziel derartiger labormedizinischer Diagnosen ist es, den Genotyp der im Folgenden benannten Gene insbesondere mittels des Verfahrens der Real-time PCR zu bestimmen, insbesondere um bei Gabe von Medikamenten die Zahl und Schwere der Nebenwirkungen (schwere Blutbildveränderungen bis hin zu Todesfällen) zu reduzieren bzw. zu vermeiden. Darüber hinaus ermöglicht es eine sichere Genotypisierung der benannten Gene.
Das in dieser Erfindung enthaltene Set von Enzymen bzw. SNPs erlaubt eine größtmögliche Information über genetisch bestimmte und bedingte Stoffwechseleigenschaften bezüglich möglicher Wirksubstanzen für beide Stoffwechselphasen (Phase 1 und Phase 2). Insbesondere ist neben der Vermeidung von Arzneimittel-Nebenwirkungen auch eine Dosis-Individualisierung in der Arzneimitteltherapie aufgrund der erfindungsgemäß getroffenen Vorhersagen möglich.
Tabelle 1 Übersicht der erfindungsgemäß analysierten SNP's
Das Diagnose-Kit enthält in einer vorteilhaften Ausführungsform bis zu 35 Oligonukleotidepaare, die als Reverse- und Forward-Primer bei der Amplifikation mittels PCR eingesetzt werden. Durch diese werden spezifische Sequenzbereiche amplifiziert, die insgesamt 42 zu analysierende Mutationen enthalten. Zum Nachweis der insgesamt 42 Mutationen werden vorteilhafterweise 42 SNP-spezifische Hybridisierungsproben verwendet die für die Signalgabe einer sich anschließenden Schmelzkurven-Analyse erforderlich sind.
Im Folgenden werden für jedes der genannten Enzyme und SNP's in Einzelbeispielen die Primersequenzen sowie die Sondersequenzen sowie die zur Diagnostik erforderlichen Vorgehensweisen sowie konkrete beispielhafte Meßergebnisse dargestellt.
NAT2
Die N-Acetyltransferase 2 (NAT2, E.C.2.3.1.5) besitzt große klinische Bedeutung in der Entgiftung von Xenobiotika. Die hier nachgewiesenen Mutationen führen zu jeweils einem Aminosäureaustausch, mit Ausnahme der Mutation C282T und C481T, der die katalytische Eigenschaften und damit die Acetylierungskapazität des Enzyms der N-Acetyltransferase 2 ändert. Personen, die Träger keiner oder einer der o.g. Mutationen im heterozygoten Zustand sind, zählen zu den so genannten Schnellacetylierern, vorausgesetzt sie weisen keine weitere Mutation auf dem zweiten Allel auf. Träger einer dieser Mutationen im homozygoten Zustand sind Langsamacetylierer. Personen, die zu den Langsamacetylierern zählen, verstoffwechseln NAT2-spezifischen Substrate langsamer, was zu einer Anreicherung toxischer Metaboliten im Körper führen kann.
Die Primer H230 und H231 werden für die Herstellung eines PCR-Produkts in unmarkierter Form eingesetzt. Dieses Primerpaar ist die Basis für alle nachstehenden Real time PCRs mit anschließender Schmelzkurvenanalyse.
Tabelle 2 Sequenz der Primen H230 und H231 zur Amplifizierung der NAT2
Zusätzlich zu den Primer H230 und H231 werden fluoreszenzmarkierte, mutationsspezifische Nukleotide (sog. Hybridization Probes) in die PCR eingesetzt, wobei einer der beiden Primer die zu detektierende Mutation abdeckt. Die nachfolgend aufgelisteten Hybprobes sind spezifisch für den jeweiligen SNP.
Tabelle 3 Nachweis der NAT2-Mutation G191A
Tabelle 4 Nachweis der NAT2-Mutation C282T
Tabelle 5 Nachweis der NAT2-Mutation T341C
Tabelle 6 Nachweis der NAT2-Mutation C481T
Tabelle 7 Nachweis der NAT2-Mutation G590A
Tabelle 8 Nachweis der NAT2-Mutation A803G
Tabelle 9 Nachweis der NAT2-Mutation G857A
Der Pipettieransatz ist für den Nachweis aller NAT2 SNPs gleich und ist in der Tabelle 10 aufgelistet.
Tabelle 10 Pipettierschema für alle Mutationsanalysen der NAT2 sieht wie folgt aus
Die Programmierung des LightCycler ist für den Nachweis jeder NAT2 Mutation gleich der Tabelle 11.
Tabelle 11 PCR-Schema zum Nachweis aller Mutation mittels LightCycler-PCR
Tabelle 12 Schema der Schmelzkurvenanalyse für den SNP-Nachweis aller NAT2-Mutationen
Die im Anschluss der PCR folgende Schmelzkurve ergibt in den verschiedenen Fluoreszenskanälen Schmelzpunkte, die eine Unterscheidung in homozygote Wildtypen und Mutationen, sowie den heterozygoten Genotyp zulassen. Daraus ergeben sich für die einzelnen Mutationen die in den 1 bis 7 dargestellten Schmelzkurven und Schmelzpunkte. Dabei bezeichnen hier wie in allen folgenden Figuren die senkrechten Linien die Position der Spitzen der Schmelzkurven für den Wildtyp bzw. die bezeichnete Mutation.
Die Lage der Schmelzpunkte ergibt sich wie folgt:
Die Bestimmung des Phänotyps erfolgt durch die Auswertung der einzelnen Mutationen. Dabei wird die aktuelle Nomenklatur herangezogen.
CYP2D6
Das Enzym CYP2D6 (EC 1.14.14.1) metabolisiert einen Anteil von etwa 25% aller in der klinischen Praxis relevanten Pharmaka, wie z.B. Antiarrhythmika (z.B. Spartein, Propafenon), Neuroleptika (z.B. Fluvoxamin, TrimipraminAmitriptylin) und Opioide (z.B. Codein, Dextromethorpan). Das Enzym CYP2D6 katalysiert substratspezifisch unterschiedliche oxidative Reaktionen. Die Genotypisierung von CYP2D6 ist für die klinische Pharmakologie von großer Bedeutung, da damit eine mögliche Vorhersage der individuellen metaboli schen Kapazität eines Patienten getroffen werden kann und damit ein wesentlicher Beitrag zur Dosisindividualisierung der Arzneimitteltherapie und zur Vermeidung von Arzneimittelnebenwirkungen geleistet werden kann.
Von den zahlreichen Mutationen (bisher 48 bekannt) führen einige zu einer Veränderung der Enzymaktivität. Aufgrund der unterschiedlichen Enzymaktivität gibt es eine Einteilung in PM's (es wird kein funktionelles CYP2D6-Enzym exprimiert (PM 5–10%), mittlere Metabolisierer (IM 5%) schnelle Metabolisier (EM) und als Untergruppe der EM's (80%) die ultraschnellen Metabolisierer (UM 5%).
Durch den Nachweis von 10 hier ausgewählten wichtigen Mutationsstellen kann nach der Genotypisierung eine 90%ige Aussage zum gesamt Phänotyp und über 98%ige Aussage über PM und IM gemacht werden.
Die Mutation C100T, G1661C, C2850T, G4180C, A2935C führt zu einem Aminosäureaustausch, die Mutation nt G1846A zu einem Spleißdefekt, die Deletionen 1707delT und del2549A zu einem Frameshift sowie de 2613_2615delAGA zu einem Verlust der Aminosäureaktivität und die Mutation G1758T zu einem Stop Coden.
Die hier untersuchten 10 Mutationsstellen führen zur Veränderung der Enzymaktivität des CYP2D6 Proteins. Die durch die Mutationen beschriebenen Allele defizienten Phänotypen (Allele *3, *4, *5, *6, *39) und zu intermediären Phänotypen (*2, *7, *8, *9, *10, *34,).
Alle Analysen werden im LightCycler durchgeführt. Nachfolgend sind die Primersequenzen, Sondensequenzen und die Pipettierschemas aufgelistet.
C100T
Mit den spezifischen Primern H121/H122 wird ein Teil des CYP2D6-Gens amplifiziert, der die Mutation an der Position C100T enthält.
Tabelle 13 Primersequenzen zur Amplifizierung der spezifischen CYP2D6 Sequenz
Zusätzlich werden Hybridisierungssonden eingesetzt, die zur Bestimmung des Nukleotids an der Position C100T dienen. Dieser Nachweis erfolgt im Anschluss an die PCR mittels Schmelzkurvenanalyse mit den Sonden H153/154.
Tabelle 14 Sondensequenz für den Nachweis der Mutation C100T
Das Pipettierschema für die Analyse im LightCycler ist nachfolgend aufgeführt. Der Ansatz bezieht sich auf einen 1 × Ansatz. Für die Messung kann ein Master-Mix in x-facher Menge angesetzt werden. Für jeden Mix muss eine Negativprobe (H₂O) und Positivprobe eingeplant werden.
Tabelle 15 Pipettierschema für den Nachweis der Mutation C100T
Nachfolgend ist die Programmierung des LightCycler zur Amplifikation und Schmelzkurvenanalyse aufgezeigt.
Tabelle 16 Amplifikationsschema für den LightCycler
Tabelle 17 Bedingung für die Schmelzkurvenanalyse
Der Genotyp ergibt sich aus dem detektierten Nukleotid. In 8 ist die Analyse für die Mutationen C100T graphisch dargestellt.
Die sich aus der Schmelzkurve ergebenen Schmelzpunkte erlauben die Einteilung in den homozygoten (Mutation /Wildtyp) und heterozygoten Genotypen. Der Genotyp ergibt sich aus den detektierten Mutationen und der in der Literatur beschriebenen Nomenklatur.
G1661C und 1707delTs
Mit den spezifischen Primern H236/H237 wird ein Teil des CYP2D6-Gens amplifiziert, der die Mutation an den Positionen G1661C und 1707delT enthält.
Tabelle 18 Primersequenzen zur Amplifizierung der spezifischen CYP2D6 Sequenz
Zusätzlich werden Hybridisierungssonden eingesetzt, die zur Bestimmung der Nukleotide an den Positionen G1661C und 1707delT dienen. Dieser Nachweis erfolgt im Anschluss an die PCR mittels Schmelzkurvenanalyse mit den Sonden H169.3/170.3 für G1661C und H212/213 für 1707delT.
Tabelle 19 Sondensequenzen für den Nachweis der Mutationen G1661C und 1707delT
Das Pipettierschema für die Multiplexanalyse im LightCycler ist nachfolgend aufgeführt. Der Ansatz bezieht sich auf einen 1 × Ansatz. Für die Messung kann ein Master-Mix in x-facher Menge angesetzt werden. Für jeden Mix muss eine Negativprobe (H₂O) und eine Positivprobe eingeplant werden.
Tabelle 20 Pipettierschema für den Nachweis der Mutationen G1661C und 1707delT
Nachfolgend ist die Programmierung des LightCycler zur Amplifikation und Schmelzkurvenanalyse tabellarisch dargestellt.
Tabelle 21 Amplifikationsschema für den LightCycler
Tabelle 22 Bedingung für die Schmelzkurvenanalyse
Der Genotyp ergibt sich aus dem detektierten Nukleotid. In den 9 und 10 sind die Analysen für die Mutationen G1661C und 1707delT graphisch dargestellt.
Die sich aus der Schmelzkurve ergebenen Schmelzpunkte erlauben die Einteilung in den homozygoten (Mutation /Wildtyp) und heterozygoten Genotypen. Der Genotyp ergibt sich aus den detektierten Mutationen und der in der Literatur beschriebenen Nomenklatur.
G1846A und G1758T
Mit den spezifischen Primern H119/H120 wird ein Teil des CYP2D6-Gens amplifiziert, der die Mutationen an den Positionen G1846R und G1758T enthält.
Tabelle 23 Primersequenz zur spezifischen Amplifizierung des CYP2D6 Sequenz
Zusätzlich werden Hybridisierungssonden eingesetzt, die zur Bestimmung der Nukleotide an den Positionen G1846A und G1758T dienen. Dieser Nachweis erfolgt im Anschluss an die PCR mittels Schmelzkurvenanalyse mit den Sonden H179/180 für G1846A und H234/235 für G1758T.
Tabelle 24 Sondensequenzen für den Nachweis der Mutationen G1846A und G1758T
Das Pipettierschema für die Multiplexanalyse im LightCycler ist nachfolgend aufgeführt. Der Ansatz bezieht sich auf einen 1 × Ansatz. Für die Messung kann ein Master-Mix in x-facher Menge angesetzt werden. Für jeden Mix muss eine Negativprobe (H₂O) und eine Positivprobe eingeplant werden.
Tabelle 25 Pipettierschema für den Nachweis der Mutationen G1846A und G1758T
Nachfolgend ist die Programmierung des LightCycler zur Amplifikation und Schmelzkurvenanalyse dargestellt.
Tabelle 26 Amplifikationsschema für den LightCycler
Tabelle 27 Bedingung für die Schmelzkurvenanalyse
Der Genotyp ergibt sich aus dem detektierten Nukleotid. In den 11 und 12 sind die Analysen für die Mutationen G1846A und G1758T graphisch dargestellt.
Die sich aus der Schmelzkurve ergebenen Schmelzpunkte erlauben die Einteilung in den homozygoten (Mutation /Wildtyp) und heterozygoten Genotypen. Der Genotyp ergibt sich aus den detektierten Mutationen und der in der Literatur beschriebenen Nomenklatur.
2613_2615delAGA und 2549delA
Mit den spezifischen Primern H214/H215 wird ein Teil des CYP2D6-Gens amplifiziert, der die Deletionen 2613_2615delAGA und 2549delA enthalten.
Tabelle 28 Primersequenzen zur Amplifizierung der spezifischen CYP2D6 Sequenzen
Zusätzlich werden Hybridisierungssonden eingesetzt, die zur Bestimmung der Deletion 2613_2615del und der Mutation nt 2549. Dieser Nachweis erfolgt im Anschluss an die PCR mittels Schmelzkurvenanalyse mit den Sonden H220/H221 für 2613_2615delAGA und H218/219 für 2549delA.
Tabelle 29 Sondensequenzen für den Nachweis der Mutationen 2613_2615delAGA und 2549delA
Das Pipettierschema für die Multiplexanalyse im LightCycler ist nachfolgend aufgeführt. Der Ansatz bezieht sich auf einen 1 × Ansatz. Für die Messung kann ein Master-Mix in x-facher Menge angesetzt werden. Für jeden Mix muss eine Negativprobe (H₂O) und eine Positivprobe eingeplant werden.
Tabelle 30 Pipettierschema für den Nachweis der Deletionen 2613_2615delAGA und 2549delA
Nachfolgend ist die Programmierung des LightCycler zur Amplifikation und Schmelzkurvenanalyse dargestellt.
Tabelle 31 Amplifikationsschema für den LightCycler
Tabelle 32 Bedingung für die Schmelzkurvenanalyse
Der Genotyp ergibt sich aus dem Nachweis der Deletion und des detektierten Nukleotids. In den 13 und 14 sind die Analysen der Deletionen 2613_2615delAGA und 2549delA graphisch dargestellt.
Die sich aus der Schmelzkurve ergebenen Schmelzpunkte erlauben die Einteilung in den homozygoten (Mutation /Wildtyp) und heterozygoten Genotypen. Der Genotyp ergibt sich aus den detektierten Mutationen und der in der Literatur beschriebenen Nomenklatur.
C2850T und A2935C
Mit den spezifischen Primern H238/H239 wird ein Teil des CYP2D6-Gens amplifiziert, der die Mutationen an den Positionen C2850T und A2935C enthält.
Tabelle 33 Primersequenzen zur Amplifizierung der spezifischen CYP2D6 Sequenz
Zusätzlich werden Hybridisierungssonden eingesetzt, die zur Bestimmung der Nukleotide an den Positionen C2850T und A2935C dienen. Dieser Nachweis erfolgt im Anschluss an die PCR mittels Schmelzkurvenanalyse mit den Sonden H143/H144 für C2850T und H232/233 für A2935C.
Tabelle 34 Sondensequenz für den Nachweis der Mutation C2850T und A2935C
Das Pipettierschema für die Multiplexanalyse im LightCycler ist nachfolgend aufgeführt. Der Ansatz bezieht sich auf einen 1 × Ansatz. Für die Messung kann ein Master-Mix in x-facher Menge angesetzt werden. Für jeden Mix muss eine Negativprobe (H₂O) und eine Positivprobe eingeplant werden.
Tabelle 35 Pipettierschema für den Nachweis der Mutationen C2850T und A2935C
Nachfolgend ist die Programmierung des LightCycler zur Amplifikation und Schmelzkurvenanalyse dargestellt.
Tabelle 36 Amplifikationsschema für den LightCycler
Tabelle 37 Bedingung für die Schmelzkurvenanalyse
Der Genotyp ergibt sich aus dem detektierten Nukleotid. In den 15 und 16 sind die Analysen für die Mutationen C2850T und A2935C graphisch dargestellt.
Die sich aus der Schmelzkurve ergebenen Schmelzpunkte erlauben die Einteilung in den homozygoten (Mutation /Wildtyp) und heterozygoten Genotypen. Der Genotyp ergibt sich aus den detektierten Mutationen und der in der Literatur beschriebenen Nomenklatur.
G4180C
Mit den spezifischen Primern H240/H241 wird ein Teil des CYP2D6-Gens amplifiziert, der die Mutation an der Position G4180C enthält.
Tabelle 38 Primersequenz zur spezifischen Amplifizierung des CYP2D6 Sequenz
Zusätzlich werden Hybridisierungssonden eingesetzt, die zur Bestimmung des Nukleotids an der Position G4180C dienen. Dieser Nachweis erfolgt im Anschluss an die PCR mittels Schmelzkurvenanalyse mit den Sonden H187/H188.
Tabelle 38 Sondensequenz
Das Pipettierschema für die Analyse im LightCycler ist nachfolgend aufgeführt. Der Ansatz bezieht sich auf einen 1 × Ansatz. Für die Messung kann ein Master-Mix in x-facher Menge angesetzt werden. Für jeden Mix muss eine Negativprobe (H₂O) und Positivprobe eingeplant werden.
Tabelle 40 Pipettierschema für den Nachweis der Mutation G4180C
Nachfolgend ist die Programmierung des LightCycler zur Amplifikation und Schmelzkurvenanalyse aufgezeigt.
Tabelle 41 Amplifikationsschema für den LightCycler
Tabelle 42 Bedingung für die Schmelzkurvenanalyse
Der Genotyp ergibt sich aus dem detektierten Nukleotid. In 17 ist die Analyse für die Mutationen G4180C graphisch dargestellt.
Die sich aus der Schmelzkurve ergebenen Schmelzpunkte erlauben die Einteilung in den homozygoten (Mutation /Wildtyp) und heterozygoten Genotypen. Der Genotyp ergibt sich aus den detektierten Mutationen und der in der Literatur beschriebenen Nomenklatur.
CYP1A2
Arylamine und heterozyklische Amine werden durch CYP1A2 (E.C.1.14.14.1) aktiviert. Aromatische Amine gehörten zu den ersten Verbindungen, für die eine Kanzerogenität festgestellt werden konnte. Mit den Mutationen an den Positionen nt-3858 und nt-164 werden auch pharmakologische relevante Mutationen nachgewiesen, die durch ihren Aminosäureaustausch eine Änderung der Proteinstruktur und damit der katalytischen Eigenschaft zur Folge hat. Dabei geht die Mutation nt-3858 mit einer verringerten Enzymaktivität einher, während die Mutation nt-146 eine erhöhte induzierte der Enzymreaktion zeigt.
Über das CYP1A2 werden etwa 15% der heute verwendeten Arzneimittel verstoffwechselt. Dazu gehören Phosphodiesterasehemmer (Theophyllin) und andere Xanthinderivate (Analeptika, Antihypoxämika), sowie mehrere Antidepressiva und Neuroleptika. CYP1A2 wird von Tabakteer-Komponenten induziert (Kohlenwasserstoffverbindungen), was zu einem erhöhten und rascheren Clearance der Substrate führt.
Der Nachweis beider Mutationen wird in verschiedenen Ansätzen durchgeführt. Das Programm für den LightCycler ist bei beiden gleich.
G-3858A
Mit den spezifischen Primern H103/H104 wird ein Teil des CYP1A2-Gens amplifiziert, der für die Enzymaktivität mitverantwortlich ist. In diesem Amplifikat ist die Position G-3858A enthalten, die sich bei Veränderung auf die Enzymaktivität auswirken kann.
Tabelle 43 Primersequenz zur spezifischen Amplifizierung des 5'-UTR Region des CYP1A2-Gens
Zusätzlich werden Hybridisierungssonden eingesetzt, die zur Bestimmung des Nukleotids an der Position G-3858A dienen. Dieser Nachweis erfolgt im Anschluss an die PCR mittels Schmelzkurvenanalyse mit den Sonden H97/H98.
Tabelle 44 Sondensequenz für den Nachweis der Mutation G-3858A
Das Pipettierschema für die Analyse im LightCycler ist nachfolgend aufgeführt. Der Ansatz bezieht sich auf einen 1 × Ansatz. Für die Messung kann ein Master-Mix in x-facher Menge angesetzt werden. Für jeden Mix muss eine Negativprobe (H₂O) und Positivprobe eingeplant werden.
Tabelle 45 Pipettierschema für den Nachweis der Mutation G-3858A
Nachfolgend ist die Programmierung des LightCycler zur Amplifikation und Schmelzkurvenanalyse aufgezeigt.
Tabelle 46 Amplifikationsschema für den LightCycler
Tabelle 47 Bedingung für die Schmelzkurvenanalyse
Der Genotyp ergibt sich aus dem detektierten Nukleotid. In 18 ist die Analyse für die Mutationen G-3858A graphisch dargestellt.
Die sich aus der Schmelzkurve ergebenen Schmelzpunkte erlauben die Einteilung in den homozygoten (Mutation /Wildtyp) und heterozygoten Genotypen. Der Genotyp ergibt sich aus den detektierten Mutationen und der in der Literatur beschriebenen Nomenklatur.
C-164A
Mit den spezifischen Primern H105/H106 wird ein Teil des CYP1A2-Gens amplifiziert, der für die Enzymaktivität mitverantwortlich ist. In diesem Amplifikat ist die Position C-164A enthalten, der sich bei Veränderung auf die Enzymaktivität auswirken kann.
Tabelle 48 Primersequenz zur spezifischen Amplifizierung des CYP1A2
Zusätzlich werden Hybridisierungssonden eingesetzt, die zur Bestimmung des Nukleotids an der Position C-164A dienen. Dieser Nachweis erfolgt im Anschluss an die PCR mittels Schmelzkurvenanalyse mit den Sonden H229/H228.
Tabelle 49 Sondensequenz für den Nachweis der Mutation C-164A
Das Pipettierschema für die Analyse im LightCycler ist nachfolgend aufgeführt. Der Ansatz bezieht sich auf einen 1 × Ansatz. Für die Messung kann ein Master-Mix in x-facher Menge angesetzt werden. Für jeden Mix muss eine Negativprobe (H₂O) und Positivprobe eingeplant werden.
Tabelle 50 Pipettierschema für den Nachweis der Mutation C-164A
Tabelle 51 Amplifikationsschema für den LightCycler
Tabelle 52 Bedingung für die Schmelzkurvenanalyse
Der Genotyp ergibt sich aus dem detektierten Nukleotid. In 19 ist die Analyse für die Mutationen C-164A graphisch dargestellt.
Die sich aus der Schmelzkurve ergebenen Schmelzpunkte erlauben die Einteilung in den homozygoten (Mutation /Wildtyp) und heterozygoten Genotypen. Der Genotyp ergibt sich aus den detektierten Mutationen und der in der Literatur beschriebenen Nomenklatur.
CYP3A4
Die CYP3A4 wird hauptsächlich in der Leber gebildet und verstoffwechselt über die Hälfte aller auf den Markt befindlichen therapeutischen Substrate. Sie sind häufig verantwortlich für eine präsystemische Biotransformation (first pass). Vorteilhafterweise geben die folgenden insgesamt 6 SNPs (A-392G, A352G, C653G, T664C, 831insA, T1334C) Aufschluss über die katalytische Stoffwechselleistung des Enzyms CYP3A4. Die Mutation A-392G hat eine Veränderung in der Promotorregion und damit in der Regulierung der Genexpression zur Folge und die Insertion 831insA verursacht einen Frameshift. Die übrigen Mutationen haben einen Aminosäureaustausch zur Folge und damit eine Veränderung der katalytischen Eigenschaft des Enzyms.
Die Mutation A352G bewirkt einen Aminosäureaustausch 1118V wodurch die Enzymaktivität verringert ist. Ebenfalls zu einem Aminosäureaustausch P218R führt die Mutation C653G die eine verminderte Enzymaktivität bewirkt. Durch die Mutation T664C kommt es zu einem Aminosäureaustausch S222P der zu einem erniedrigten tatsächlichen clearance zu CYP3A4 Substraten wie z.B. Nifedipin. Eine Veränderung in der Häm-Bindungs region resultiert aus der Mutation T1334C, die den Aminosäureaustausch (M445T) bewirkt.
Der verursachte Frameshift durch die Insertion 831insA bewirkt eine Verringerung der katalytischen Funktion der CYP3A4.
Alle hier aufgeführten Mutationsanalysen des CYP3A4-Gens werden mit dem gleichen Pipettierschema und dem gleichen Programm im LightCycler durchgeführt. Das Pipettierschema für alle Analysen im LightCycler ist nachfolgend aufgeführt. Der Ansatz bezieht sich auf einen 1 × Ansatz. Für die Messung kann ein Master-Mix in x-facher Menge angesetzt werden. Für jeden Mix muss eine Negativprobe (H₂O) und Positivprobe eingeplant werden.
Tabelle 53 Pipettierschema für den Nachweis sämtlicher Mutation im CYP3A4-Gen
Nachfolgend ist die Programmierung des LightCycler zur Amplifikation und Schmelzkurvenanalyse aufgezeigt.
Tabelle 54 Amplifikationsschema für den LightCycler
Tabelle 55 Bedingung für die Schmelzkurvenanalyse
A-392G
Mit den spezifischen Primern H197/H198 wird ein Teil des CYP3A4-Gens amplifiziert, der für die Enzymaktivität mitverantwortlich ist. In diesem Amplifikat. ist die Position A-392G enthalten, der sich bei Veränderung auf die Enzymaktivität auswirken kann.
Tabelle 56 Primersequenz zur spezifischen Amplifizierung des CYP3A4 Sequenz
Zusätzlich werden Hybridisierungssonden eingesetzt, die zur Bestimmung des Nukleotids an der Position A-392G dienen. Dieser Nachweis erfolgt im Anschluss an die PCR mittels Schmelzkurvenanalyse mit den Sonden H194/H193.
Tabelle 57 Sondensequenz für den Nachweis der Mutation A-392G
Der Genotyp ergibt sich aus dem detektierten Nukleotid. In 20 ist die Analyse für die Mutationen A-392G graphisch dargestellt.
Die sich aus der Schmelzkurve ergebenen Schmelzpunkte erlauben die Einteilung in den homozygoten (Mutation /Wildtyp) und heterozygoten Genotypen. Der Genotyp ergibt sich aus den detektierten Mutationen und der in der Literatur beschriebenen Nomenklatur.
A352G
Mit den spezifischen Primern H199/H200 wird ein Teil des CYP3A4-Gens amplifiziert, der für die Enzymaktivität mitverantwortlich ist. In diesem Amplifikat: ist die Position A352G enthalten, der sich bei Veränderung auf die Enzymaktivität auswirken kann.
Tabelle 58 Primersequenz zur spezifischen Amplifizierung des CYP3A4 Sequenz
Zusätzlich werden Hybridisierungssonden eingesetzt, die zur Bestimmung des Nukleotids an der Position A352G dienen. Dieser Nachweis erfolgt im Anschluss an die PCR mittels Schmelzkurvenanalyse mit den Sonden H150/H149.
Tabelle 59 Sondensequenz für den Nachweis der Mutation A352G
Der Genotyp ergibt sich aus dem detektierten Nukleotid. In 21 ist die Analyse für die Mutationen A352G graphisch dargestellt.
Die sich aus der Schmelzkurve ergebenen Schmelzpunkte erlauben die Einteilung in den homozygoten (Mutation /Wildtyp) und heterozygoten Genotypen. Der Genotyp ergibt sich aus den detektierten Mutationen und der in der Literatur beschriebenen Nomenklatur.
C653G und T664C
Mit den spezifischen Primern H195/H196 wird ein Teil des CYP3A4-Gens amplifiziert, der für die Enzymaktivität mitverantwortlich ist. In diesem Amplifikat sind die Positionen C653G und T664C enthalten, der sich bei Veränderung auf die Enzymaktivität auswirken kann.
Tabelle 60 Primersequenz zur spezifischen Amplifizierung des CYP3A4 Sequenz
Zusätzlich werden Hybridisierungssonden eingesetzt, die zur Bestimmung des Nukleotids an der Position C653G und T664C dienen. Dieser Nachweis erfolgt im Anschluss an die PCR mittels Schmelzkurvenanalyse mit den Senden H192/H191 für C653G und H130/H129 für T664C.
Tabelle 61 Sondensequenz für den Nachweis der Mutationen C653G und T664C
Der Genotyp ergibt sich aus dem detektierten Nukleotid. In 22 und 23 sind die Analysen für die Mutationen C653G und T664C graphisch dargestellt.
Die sich aus der Schmelzkurve ergebenen Schmelzpunkte erlauben die Einteilung in den homozygoten (Mutation /Wildtyp) und heterozygoten Genotypen. Der Genotyp ergibt sich aus den detektierten Mutationen und der in der Literatur beschriebenen Nomenklatur.
831insA
Mit den spezifischen Primern H201/H202 wird ein Teil des CYP3A4-Gens amplifiziert, der für die Enzymaktivität mitverantwortlich ist. In diesem Amplifikat ist die Position 831insA enthalten, der sich bei Veränderung auf die Enzymaktivität auswirken kann.
Tabelle 62 Primersequenz zur spezifischen Amplifizierung des CYP3A4 Sequenz
Zusätzlich werden Hybridisierungssonden eingesetzt, die zur Bestimmung des Nukleotids an der Position 831insA dienen. Dieser Nachweis erfolgt im Anschluss an die PCR mittels Schmelzkurvenanalyse mit den Sonden H190/H189.
Tabelle 63 Sondensequenz für den Nachweis der Mutation 831insA
Der Genotyp ergibt sich aus dem detektierten Nukleotid. In 24 ist die Analyse für die Mutationen 831insA graphisch dargestellt.
Die sich aus der Schmelzkurve ergebenen Schmelzpunkte erlauben die Einteilung in den homozygoten (Mutation /Wildtyp) und heterozygoten Genotypen. Der Genotyp ergibt sich aus den detektierten Mutationen und der in der Literatur beschriebenen Nomenklatur.
T1334C
Mit den spezifischen Primern H203/H204 wird ein Teil des CYP3A4-Gens amplifiziert, der für die Enzymaktivität mitverantwortlich ist. In diesem Amplifikat ist die Position T1334C enthalten, der sich bei Veränderung auf die Enzymaktivität auswirken kann.
Tabelle 64 Primersequenz zur spezifischen Amplifizierung des CYP3A4 Sequenz
Zusätzlich werden Hybridisierungssonden eingesetzt, die zur Bestimmung des Nukleotids an der Position T1334C dienen. Dieser Nachweis erfolgt im Anschluss an die PCR mittels Schmelzkurvenanalyse mit den Sonden H152/H151.
Tabelle 65 Sondensequenz für den Nachweis der Mutation T1334C
Der Genotyp ergibt sich aus dem detektierten Nukleotid. In 25 ist die Analyse für die Mutationen T1334C graphisch dargestellt.
Die sich aus der Schmelzkurve ergebenen Schmelzpunkte erlauben die Einteilung in den homozygoten (Mutation /Wildtyp) und heterozygoten Genotypen. Der Genotyp ergibt sich aus den detektierten Mutationen und der in der Literatur beschriebenen Nomenklatur.
mEH
Die mikrosomale Epoxid Hydrolase (mEH) spielt eine entscheidende Rolle bei der Detoxifikation von Umweltgiften und Medikamenten. Klinisch relevante Substanzen, wie z.B Carbamazepin, Phenytoin oder Phenobarbiturate, die über P-450 Enzyme aktiviert und somit zu Epoxide Metaboliten umgewandelt werden, erreichen über die mEH einen nicht toxischen Zustand.
Die Mutation im Exon 3 (T337C) hat einen Aminosäureaustausch (Y113H) zur Folge, der zu einer Verringerung der Enzymaktivität führt, die auf eine erniedrigte Expression beruht. Die Mutation im Exon 4 (A416G) hat ebenfalls einen Aminosäureaustausch (H139R) zur Folge. Diese bewirkt eine erhöhte Enzymaktivität durch eine höhere Stabilität des Proteins.
Die Durchführung der Untersuchung wird durch eine Multiplex-Analyse im LightCycler durchgeführt werden.
T337C und A416G
Spezifisch werden im Exon 3 mit den Primern H125/H126 und im Exon 4 mit den Primern H127/H128 im Exon 4 Abschnitte des mEH-Gens amplifiziert, die für die Enzymaktivität mitverantwortlich sind. In diesem Amplifikat sind die Nukleotidpositionen T337C und A416G enthalten, die sich bei Veränderung auf die Enzymaktivität auswirken.
Tabelle 66 Primersequenz zur spezifischen Amplifizierung des mEH-Gens
Zusätzlich werden Hybridisierungssonden eingesetzt, die zur Bestimmung der an den Positionen nt 337 und nt 416 dienen. Dieser Nachweis erfolgt im Anschluss an die PCR mittels Schmelzkurvenanalyse mit den Sonden H178/H177 für A416G und H176/H175 für T337C.
Tabelle 67 Sondensequenz für den Nachweis der Mutationen T337C und A416G
Das Pipettierschema für die Analysen im LightCycler ist nachfolgend aufgeführt. Der Ansatz bezieht sich auf einen 1 × Ansatz. Für die Messung kann ein Master-Mix in x-facher Menge angesetzt werden. Für jeden Mix muss eine Negativprobe (H₂O) und Positivprobe eingeplant werden.
Tabelle 68 Pipettierschema für den Nachweis beider Mutationen im mEH-Gen
Die Analyse wird in einem Multiplexansatz durchgeführt. Nachfolgend ist die Programmierung des Light-Cycler aufgelistet.
Tabelle 69 Amplifikationsschema für den LightCycler
Tabelle 70 Bedingung für die Schmelzkurvenanalyse
Der Genotyp ergibt sich aus dem detektierten Nukleotid. In den 26 und 27 sind die Analysen für die Mutationen T337C bzw. A416G graphisch dargestellt.
Die sich aus der Schmelzkurve ergebenen Schmelzpunkte erlauben die Einteilung in den homozygoten (Mutation /Wildtyp) und heterozygoten Genotypen. Der Genotyp ergibt sich aus den detektierten Mutationen und der in der Literatur beschriebenen Nomenklatur.
Thiopurin-S-Methyltransferase (TPMT)
Die Chemotherapeutika 6-Mercaptopurin und 6-Thioguanin werden über Xanthinoxidase oxidiert oder durch Thiopurin-S-Methyltransferase methyliert, wobei die TPMT im hämatopoetischen System der einzige katalytische Weg darstellt. Die TPMT-Aktivität unterliegt einem genetischen Polymorphismus, der durch die Mutationen nt G238C, nt G460A, nt A719G beschrieben wird. In der weißen Bevölkerung wird eine um 75% reduzierte Enzymaktivität bei etwa 10% der Untersuchten beobachtet, während bei 1 von 300 Untersuchten keine Enzymaktivität mehr messbar ist. Durch die reduzierte Enzymaktivität kann es zu erheblichen Nebenwirkungen während der Therapie mit Thiopurinen kommen.
Eine auftretende der Mutation im Nukleotid nt G238C hat eine ca. 100 fache Verminderung der Enzymaktivität zur Folge während die Mutationen nt G460A und A719G zu einer 9 fachen Verminderung bzw. 1,4 fachen Verminderung der Enzymaktivität. Die Kombination der Mutation nt G460A und A719G führen zu einer Verminderung der Enzymaktivität um das ca. 200 fache.
G238C
Mit den spezifischen Primern H258/H259 wird ein Teil des TPMT-Gens amplifiziert, der die Position G238C enthalten.
Tabelle 71 Primersequenz zur spezifischen Amplifizierung des TPMT-Gens
Zusätzlich werden Hybridisierungssonden eingesetzt, die zur Bestimmung des Nukleotids an der Position G238C dienen. Dieser Nachweis erfolgt im Anschluss an die PCR mittels Schmelzkurvenanalyse mit den Sonden H137/H138.
Tabelle 72 Sondensequenz für den Nachweis der Mutation G238C
Das Pipettierschema für die Analysen im LightCycler ist nachfolgend aufgeführt. Der Ansatz bezieht sich auf einen 1 × Ansatz. Für die Messung kann ein Master-Mix in x-facher Menge angesetzt werden. Für jeden Mix muss eine Negativprobe (H₂O) und Positivprobe eingeplant werden.
Tabelle 73 Pipettierschema für den Nachweis beider Mutationen im TPMT-Gen
Nachfolgend ist die Programmierung des LightCycler aufgelistet.
Tabelle 74 Amplifikationsschema für den LightCycler
Tabelle 75 Bedingung für die Schmelzkurvenanalyse
Der Genotyp ergibt sich aus dem detektierten Nukleotid. In 28 ist die Analyse für die Mutation G238C graphisch dargestellt.
Die sich aus der Schmelzkurve ergebenen Schmelzpunkte erlauben die Einteilung in den homozygoten (Mutation /Wildtyp) und heterozygoten Genotypen. Der Genotyp ergibt sich aus den detektierten Mutationen und der in der Literatur beschriebenen Nomenklatur.
G460A und A719G
Mit den Primern H260/H261 und H167/168 werden spezifisch der die Positionen G460A und A719G enthaltenen TPMT-Genabschnitte amplifiziert.
Tabelle 76 Primersequenz zur spezifischen Amplifizierung des TPMT-Gens
Zusätzlich werden Hybridisierungssonden eingesetzt, die zur Bestimmung der Nukleotide an der Positionen G460A und A719G dienen. Dieser Nachweis erfolgt im Anschluss an die PCR mittels Schmelzkurvenanalyse mit den Sonden H139/H140 für G460A und H141/H142 für A719G.
Tabelle 77 Sondensequenz für den Nachweis der Mutationen G460A und A719G
Das Pipettierschema für die Analysen im LightCycler ist nachfolgend aufgeführt. Der Ansatz bezieht sich auf einen 1 × Ansatz. Für die Messung kann ein Master-Mix in x-facher Menge angesetzt werden. Für jeden Mix muss eine Negativprobe (H₂O) und Positivprobe eingeplant werden.
Tabelle 78 Pipettierschema für den Nachweis beider Mutationen im TPMT-Gen
Die Analyse wird in einem Multiplexansatz durchgeführt. Nachfolgend ist die Programmierung des Light-Cycler aufgelistet.
Tabelle 79 Amplifikationsschema für den LightCycler
Tabelle 80 Bedingung für die Schmelzkurvenanalyse
Der Genotyp ergibt sich aus dem detektierten Nukleotid. In den 29 und 30 sind die Analysen für die Mutationen G460A bzw. A719G graphisch dargestellt.
Die sich aus der Schmelzkurve ergebenen Schmelzpunkte erlauben die Einteilung in den homozygoten (Mutation /Wildtyp) und heterozygoten Genotypen. Der Genotyp ergibt sich aus den detektierten Mutationen und der in der Literatur beschriebenen Nomenklatur.
MTHFR
Der MTHFR Polymorphismus wird assoziiert mit einer Erniedrigung der Enzymaktivität. Bei einer homozygoten Mutation für die Mutation nt C667T besteht eine Restaktivität von ca. 30% und bei heterozygoten Trä ger von 65%.
Ebenso ist die Restaktivität bei einer Mutation nt A1298C für homozygote Genotypträger auf 65% reduziert und bei heterozygoten wird ebenfalls eine Verminderte Enzymaktivität beschrieben.
Kombinierte heterozygote Genotypen mit A1298C und C677T wird mit einer 50–60%igen Enzymaktivitätsminderung assoziiert gegenüber einem alleinigen Heterozygoten C677T Träger.
C677T und A1298C
Mit den Primern H111/H112 und H113/114 werden spezifisch der die Positionen C677T und A1298C enthaltenen MTHFR-Genabschnitte amplifiziert.
Tabelle 81 Primersequenz zur spezifischen Amplifizierung des MTHFR-Gens
Zusätzlich werden Hybridisierungssonden eingesetzt, die zur Bestimmung der Nukleotide an der Positionen C677T und A1298C dienen. Dieser Nachweis erfolgt im Anschluss an die PCR mittels Schmelzkurvenanalyse mit den Sonden H163/H164 für C677T und H165/H166 für A1298C.
Tabelle 82 Sondensequenz für den Nachweis der Mutationen C677T und A1298C
Das Pipettierschema für die Analysen im LightCycler ist nachfolgend aufgeführt. Der Ansatz bezieht sich auf einen 1 × Ansatz. Für die Messung kann ein Master-Mix in x-facher Menge angesetzt werden. Für jeden Mix muss eine Negativprobe (H₂O) und Positivprobe eingeplant werden.
Tabelle 83 Pipettierschema für den Nachweis beider Mutationen im MTHFR-Gen
Die Analyse wird in einem Multiplexansatz durchgeführt. Nachfolgend ist die Programmierung des Light-Cycler aufgelistet.
Tabelle 84 Amplifikationsschema für den LightCycler
Tabelle 85 Bedingung für die Schmelzkurvenanalyse
Der Genotyp ergibt sich aus dem detektierten Nukleotid. In den 31 und 32 sind die Analysen für die Mutationen C677T bzw. A1298C graphisch dargestellt.
Die sich aus der Schmelzkurve ergebenen Schmelzpunkte erlauben die Einteilung in den homozygoten (Mutation /Wildtyp) und heterozygoten Genotypen. Der Genotyp ergibt sich aus den detektierten Mutationen und der in der Literatur beschriebenen Nomenklatur.
Paraoxonase
Die Paraoxonase hydrolysiert Organophosphate (Insektenvertilgungsmittel und Nervengase). Diese Aryldialkylphosphatase kann mit der Anfälligkeit menschlicher Leberkarzinome möglicherweise in Verbindung stehen.
Für die Paraoxonase wurde starke Expressionsunterschiede beobachtet.
Die Mutation im Exon3 (Aminosäureaustausch L55M) hat eine erniedrigte Enzymaktivität bei reduziertem mRNA Level zur Folge.
Der Wildtyp im Exon6 (Aminosäureaustausch Q192R) geht einher mit einer Substrat abhängigen kinetischen Variation des Enzyms. Es zeigt einen erhöhten Vmax für Diazoxon- und Sarin-Hydrolyse gegenüber der Mutation im Gegensatz zum Substrat Paraoxon. Zudem hat die Mutation 192R (Arginin) eine höhere Aktivität der Paraoxonase gegenüber den 192Q (Glutamin).
L55M und Q192R
sMit den Primern H115/H116 und H117/118 werden spezifisch, der die Veränderung der Aminosäure L55M und Q192R enthaltenen Paraoxonase-Genabschnitte, amplifiziert.
Tabelle 86 Primersequenz zur spezifischen Amplifizierung des Paraoxonase-Gens
Zusätzlich werden Hybridisierungssonden eingesetzt, die zur Bestimmung der Nukleotide an der Positionen L55M (T > A) und Q192R (A > G) dienen. Dieser Nachweis erfolgt im Anschluss an die PCR mittels Schmelzkurvenanalyse mit den Sonden H171/H172 (L55M) und H173/H174 (Q192R).
Tabelle 87 Sondensequenz für den Nachweis der Aminosäureveränderungen L55M und Q192R
Das Pipettierschema für die Analysen im LightCycler ist nachfolgend aufgeführt. Der Ansatz bezieht sich auf einen 1 × Ansatz. Für die Messung kann ein Master-Mix in x-facher Menge angesetzt werden. Für jeden Mix muss eine Negativprobe (H₂O) und Positivprobe eingeplant werden.
Tabelle 88 Pipettierschema für den Nachweis beider Mutationen im Paraoxonase-Gen
Die Analyse wird in einem Multiplexansatz durchgeführt. Nachfolgend ist die Programmierung des LightCycler aufgelistet.
Tabelle 89 Amplifikationsschema für den LightCycler
Tabelle 90 Bedingung für die Schmelzkurvenanalyse
In den 33 und 34 sind die Analysen für die Mutationen L55M (T > A) bzw. Q192R (A > G) graphisch dargestellt.
Die sich aus der Schmelzkurve ergebenen Schmelzpunkte erlauben die Einteilung in den homozygoten (Mutation /Wildtyp) und heterozygoten Genotypen. Der Genotyp ergibt sich aus den detektierten Mutationen und der in der Literatur beschriebenen Nomenklatur.
CYP2C9
Das CYP2C9 ist an der Biotranformation von zahlreichen therapeutischen Substraten, wie z.B. Satinen, beteiligt. Die Allele CYP2C9*2 und CYP2C9*3 die die Mutationen C430T bzw. A1075C tragen, sind ursachlich an der Veränderung der katalytischen Enzymaktivität beteiligt ("poor metabolizers-PM"). Die Mutation C430T führt zu einem Aminosäureaustausch R144C und damit zu einer verringerten Umsatzgeschwindigkeit. Die zweite wichtige Mutation A1075C führt zu dem Aminosäurewechsel I359L. Die Folge ist eine stereospezifische Konformationsänderung und damit zu einer verminderten Enzymaktivität. Die aus den beiden Mutationen resultierenden Genotypen kommen mit einer Häufigkeit von 6–8% vor.
C430T
Mit den spezifischen Primern H183.1/H184.1 wird ein Teil des CYP2C9-Gens amplifiziert, der für die Enzymaktivität mitverantwortlich ist. In diesem Amplifikat ist die Position C430T enthalten, der sich bei Veränderung auf die Enzymaktivität auswirken kann.
Tabelle 91 Primersequenz zur spezifischen Amplifizierung des CYP2C9-Gens
Zusätzlich werden Hybridisierungssonden eingesetzt, die zur Bestimmung des Nukleotids an der Position C430T dienen. Dieser Nachweis erfolgt im Anschluss an die PCR mittels Schmelzkurvenanalyse mit den Sonden H223/H222.
Tabelle 92 Sondensequenz für den Nachweis der Mutation C430T
Das Pipettierschema für die Analyse im LightCycler ist nachfolgend aufgeführt. Der Ansatz bezieht sich auf einen 1 × Ansatz. Für die Messung kann ein Master-Mix in x-facher Menge angesetzt werden. Für jeden Mix muss eine Negativprobe (H₂O) und Positivprobe eingeplant werden.
Tabelle 93 Pipettierschema für den Nachweis der Mutationen nt 430 im CYP2C9
Nachfolgend ist die Programmierung des LightCycler aufgelistet.
Tabelle 94
Tabelle 95
Der Genotyp ergibt sich aus dem detektierten Nukleotid. In 35 ist die Analyse für die Mutationen C430T graphisch dargestellt.
Die sich aus der Schmelzkurve ergebenen Schmelzpunkte erlauben die Einteilung in den homozygoten (Mutation /Wildtyp) und heterozygoten Genotypen. Der Genotyp ergibt sich aus den detektierten Mutationen und der in der Literatur beschriebenen Nomenklatur.
A1075C
Mit den spezifischen Primern H248/H249.2 wird ein Teil des CYP2C9-Gens amplifiziert, der für die Enzymaktivität mitverantwortlich ist. In diesem Amplifikat ist die Position A1075C enthalten, der sich bei Veränderung auf die Enzymaktivität auswirken kann.
Tabelle 96 Primersequenz zur spezifischen Amplifizierung des CYP2C9-Gens
Zusätzlich werden Hybridisierungssonden eingesetzt, die zur Bestimmung des Nukleotids an der Position A1075C dienen. Dieser Nachweis erfolgt im Anschluss an die PCR mittels Schmelzkurvenanalyse mit den Sonden H225/H226.
Tabelle 97 Sondensequenz für den Nachweis der Mutation A1075C
Das Pipettierschema für die Analyse im LightCycler ist nachfolgend aufgeführt. Der Ansatz bezieht sich auf einen 1 × Ansatz, Für die Messung kann ein Master-Mix in x-facher Menge angesetzt werden. Für jeden Mix muss eine Negativprobe (H₂O) und Positivprobe eingeplant werden.
Tabelle 98 Pipettierschema für den Nachweis der Mutation nt 1075 im CYP2C9-Gen
Nachfolgend ist die Programmierung des LightCycler aufgelistet.
Tabelle 99 Amplifikationsschema für den LightCycler
Tabelle 100 Bedingung für die Schmelzkurvenanalyse
Der Genotyp ergibt sich aus dem detektierten Nukleotid. In 36 ist die Analyse für die Mutationen A1075C graphisch dargestellt.
Die sich aus der Schmelzkurve ergebenen Schmelzpunkte erlauben die Einteilung in den homozygoten (Mutation /Wildtyp) und heterozygoten Genotypen. Der Genotyp ergibt sich aus den detektierten Mutationen und der in der Literatur beschriebenen Nomenklatur.
CYP2C19
Ein weiteres wichtiges Isoenzym des Arzneimittel-Stoffwechsels wird durch das CYP2C19-Gen codiert. Es ist im Stoffwechsel bekannter Antikonvulsiva wie S-Mephenytoin involviert. Dieses Enzym fungiert teil weise als alternativer Stoffwechselweg neben CYP2D6. Die Mutationen nt G636A und nt G681A führen zu einem PM-Phänotyp (langsame Metabolisierer). In der kaukasichen Bevölkerung haben ca. 5% einen PM-Phänotyp. Die Mutationen nt G636R hat einen vorzeitiges Stop Codon zur Folge, währen die Mutation nt G681A einen Splissedefekt im Exon5 nach sich zieht.
G636A
Mit den spezifischen Primern H181/H182 wird ein Teil des CYP2C19-Gens amplifiziert, der für die Enzymaktivität mitverantwortlich ist. In diesem Amplifikat ist die Position G636A enthalten, der sich bei Veränderung auf die Enzymaktivität auswirken kann.
Tabelle 101 Primersequenz zur spezifischen Amplifizierung des CYP2C19-Gens
Zusätzlich werden Hybridisierungssonden eingesetzt, die zur Bestimmung des Nukleotids an der Position 636A dienen. Dieser Nachweis erfolgt im Anschluss an die PCR mittels Schmelzkurvenanalyse mit den Sonden H227/H226.
Tabelle 102 Sondensequenz für den Nachweis der Mutation G636A
Das Pipettierschema für die Analyse im LightCycler ist nachfolgend aufgeführt. Der Ansatz bezieht sich auf einen 1 × Ansatz. Für die Messung kann ein Master-Mix in x-facher Menge angesetzt werden. Für jeden Mix muss eine Negativprobe (H₂O) und Positivprobe eingeplant werden.
Tabelle 103 Pipettierschema für den Nachweis der Mutation G636A im CY2C19-Gen
Nachfolgend ist die Programmierung des LightCycler aufgelistet.
Tabelle 104 Amplifikationsschema für den LightCycler
Tabelle 105 Bedingung für die Schmelzkurvenanalyse
Der Genotyp ergibt sich aus dem detektierten Nukleotid. In 37 ist die Analyse für die Mutationen G636A graphisch dargestellt.
Die sich aus der Schmelzkurve ergebenen Schmelzpunkte erlauben die Einteilung in den homozygoten (Mutation /Wildtyp) und heterozygoten Genotypen. Der Genotyp ergibt sich aus den detektierten Mutationen und der in der Literatur beschriebenen Nomenklatur.
G681A
Mit den spezifischen Primern H244.2/H245.2 wird ein Teil des CYP2C19-Gens amplifiziert, der für die Enzymaktivität mitverantwortlich ist. In diesem Amplifikat ist die Position G681A enthalten, der sich bei Veränderung auf die Enzymaktivität auswirken kann.
Tabelle 106 Primersequenz zur spezifischen Amplifizierung des CYP2C19-Gens
Zusätzlich werden Hybridisierungssonden eingesetzt, die zur Bestimmung des Nukleotids an der Position G681A dienen. Dieser Nachweis erfolgt im Anschluss an die PCR mittels Schmelzkurvenanalyse mit den Sonden H243/H242.
Tabelle 107 Sondensequenz für den Nachweis der Mutation nt 681
Das Pipettierschema für die Analyse im LightCycler ist nachfolgend aufgeführt. Der Ansatz bezieht sich auf einen 1 × Ansatz. Für die Messung kann ein Master-Mix in x-facher Menge angesetzt werden. Für jeden Mix muss eine Negativprobe (H₂O) und Positivprobe eingeplant werden.
Tabelle 108 Pipettierschema für den Nachweis der Mutation G681A im CYP2C19-Gen
Nachfolgend ist die Programmierung des LightCycler aufgelistet.
Tabelle 109 Amplifikationsschema für den LightCycler
Tabelle 110 Bedingung für die Schmelzkurvenanalyse
Der Genotyp ergibt sich aus dem detektierten Nukleotid. In 38 ist die Analyse für die Mutationen G681A graphisch dargestellt.
Die sich aus der Schmelzkurve ergebenen Schmelzpunkte erlauben die Einteilung in den homozygoten (Mutation /Wildtyp) und heterozygoten Genotypen. Der Genotyp ergibt sich aus den detektierten Mutationen und der in der Literatur beschriebenen Nomenklatur.
CYP2E1
Das CYP2E1 ist maßgeblich in dem Metabolismus bekannte Medikamente (z.B. Paracetamol und Enfluran) involviert. Zusätzlich ist es an der Biotransformation kleiner Moleküle (z.B, von Ethanol) beteiligt. Die Mutationen in der 5' flankierenden Region G-1293C und C-1053T führen zu einem veränderten Expressionslevel. Die Auswirkung der Mutation T7632A ist bislang nicht beschrieben worden allerdings mit dem Polymorphismus der G-1293C und C-1053 gekoppelt. Bei etwa 99% tritt in der europäischen Bevölkerung der Wildtyp im CYP2E1 Polymorphismus auf.
G-1293C
Mit den spezifischen Primern H256.1/H257.1 wird ein Teil des CYP2E1-Gens amplifiziert, der für die Enzymaktivität mitverantwortlich ist. In diesem Amplifikat ist die Position G-1293C enthalten, der sich bei Veränderung auf die Enzymaktivität auswirken kann.
Tabelle 111 Primersequenz zur spezifischen Amplifizierung des CYP2E1-Gens
Zusätzlich werden Hybridisierungssonden eingesetzt, die zur Bestimmung des Nukleotids an der Position G-1293C dienen. Dieser Nachweis erfolgt im Anschluss an die PCR mittels Schmelzkurvenanalyse mit den Sonden H208/H209.
Tabelle 112 Sondensequenz für den Nachweis der Mutation G-1293C
Die sich aus der Schmelzkurve ergebenen Schmelzpunkte erlauben die Einteilung in den homozygoten (Mutation /Wildtyp) und heterozygoten Genotypen.
Das Pipettierschema für die Analyse im LightCycler ist nachfolgend aufgeführt. Der Ansatz bezieht sich auf einen 1 × Ansatz. Für die Messung kann ein Master-Mix in x-facher Menge angesetzt werden. Für jeden Mix muss eine Negativprobe (H₂O) und Positivprobe eingeplant werden.
Tabelle 113 Pipettierschema für den Nachweis der Mutationen nt-1293 im CYP2E1-Gen
Nachfolgend ist die Programmierung des LightCycler aufgelistet.
Tabelle 114 Amplifikationsschema für den LightCycler
Tabelle 115 Bedingung für die Schmelzkurvenanalyse
Der Genotyp ergibt sich aus dem detektierten Nukleotid. In 39 ist die Analyse für die Mutationen G-1293C graphisch dargestellt.
Die sich aus der Schmelzkurve ergebenen Schmelzpunkte erlauben die Einteilung in den homozygoten (Mutation /Wildtyp) und heterozygoten Genotypen. Der Genotyp ergibt sich aus den detektierten Mutationen und der in der Literatur beschriebenen Nomenklatur.
C-1053T
Mit den spezifischen Primern H244/H245 wird ein Teil des CYP2E1-Gens amplifiziert, der für die Enzymaktivität mitverantwortlich ist. In diesem Amplifikat ist die Position C-1053T enthalten, der sich bei Veränderung auf die Enzymaktivität auswirken kann.
Tabelle 116 Primersequenz zur spezifischen Amplifizierung des CYP2E1-Gens
Zusätzlich werden Hybridisierungssonden eingesetzt, die zur Bestimmung des Nukleotids an der Position C-1053T dienen. Dieser Nachweis erfolgt im Anschluss an die PCR mittels Schmelzkurvenanalyse mit den Sonden H206/H207.
Tabelle 117 Sondensequenz für den Nachweis der Mutation C-1053T
Das Pipettierschema für die Analyse im LightCycler ist nachfolgend aufgeführt. Der Ansatz bezieht sich auf einen 1 × Ansatz. Für die Messung kann ein Master-Mix in x-facher Menge angesetzt werden. Für jeden Mix muss eine Negativprobe (H₂O) und Positivprobe eingeplant werden.
Tabelle 118 Pipettierschema für den Nachweis der Mutation C-1053T im CYP2E1-Gen
Nachfolgend ist die Programmierung des LightCycler aufgelistet.
Tabelle 119 Amplifikationsschema für den LightCycler
Tabelle 120 Bedingung für die Schmelzkurvenanalyse
Der Genotyp ergibt sich aus dem detektierten Nukleotid. In 40 ist die Analyse für die Mutationen C- 1053T graphisch dargestellt.
Die sich aus der Schmelzkurve ergebenen Schmelzpunkte erlauben die Einteilung in den homozygoten (Mutation /Wildtyp) und heterozygoten Genotypen. Der Genotyp ergibt sich aus den detektierten Mutationen und der in der Literatur beschriebenen Nomenklatur.
T7632A
Mit den spezifischen Primern H204/H205 wird ein Teil des CYP2E1-Gens amplifiziert, der für die Enzymaktivität mitverantwortlich ist. In diesem Amplifikat ist die Position T7632A enthalten, der sich bei Veränderung auf die Enzymaktivität auswirken kann.
Tabelle 121 Primersequenz zur spezifischen Amplifizierung des CYP2E1-Gens
Zusätzlich werden Hybridisierungssonden eingesetzt, die zur Bestimmung des Nukleotids an der Position T7632A dienen. Dieser Nachweis erfolgt im Anschluss an die PCR mittels Schmelzkurvenanalyse mit den Sonden H208/H209.
Tabelle 122 Sondensequenz für den Nachweis der Mutation T7632A
Die sich aus der Schmelzkurve ergebenen Schmelzpunkte erlauben die Einteilung in den homozygoten (Mutation /Wildtyp) und heterozygoten Genotypen.
Das Pipettierschema für die Analyse im LightCycler ist nachfolgend aufgeführt. Der Ansatz bezieht sich auf einen 1 × Ansatz. Für die Messung kann ein Master-Mix in x-facher Menge angesetzt werden. Für jeden Mix muss eine Negativprobe (H₂O) und Positivprobe eingeplant werden.
Tabelle 123 Pipettierschema für den Nachweis der Mutation T7632A im CYP2E1-Gen
Nachfolgend ist die Programmierung des LightCycler aufgelistet.
Tabelle 124 Amplifikationsschema für den LightCycler
Tabelle 125 Bedingung für die Schmelzkurvenanalyse
Der Genotyp ergibt sich aus dem detektierten Nukleotid. In 41 ist die Analyse für die Mutationen T7632A graphisch dargestellt.
Die sich aus der Schmelzkurve ergebenen Schmelzpunkte erlauben die Einteilung in den homozygoten (Mutation /Wildtyp) und heterozygoten Genotypen. Der Genotyp ergibt sich aus den detektierten Mutationen und der in der Literatur beschriebenen Nomenklatur.
DPD
Das Enzym katalysiert den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt beim Katabolismus der Pyrimidinbasen Uracil und Thymin. Ebenso katalysiert es den physiologischen Abbau des strukturell dem Pyrimidin ähnlichen Antimetabolit 5-Fluoruracil (5-FU). Im Normalfall (extensive metabolizer) werden mehr als 80% des verabreichten 5-FU innerhalb kurzer Zeit abgebaut. Hinsichtlich der leukozytären DPD-Aktivität kann die Verstoffwechselung des 5-FU jedoch patientenabhängig um einen Faktor 10 variieren. Bei ca. 3–5% aller mit 5-FU therapierten Patienten werden toxisch bedingte Störungen (Mukositis, Kardiotoxizität, neurologische Störungen) beobachtet. Auch Todesfälle infolge eines Multiorganversagens nach 5-FU Therapie sind bereits aufgetreten. Ursache ist eine erniedrigte Aktivität der Dihydropyrimidin-Dehydrogenase, die bei ca. der Hälfte aller Patienten auf eine fehlerhafte Reifung der mRNA zurückzuführen ist . Eine solche mRNA enthält nicht mehr das kodierende Exon 14. Hierbei ist eine Konsensussequenz für korrektes Spleissen der RNA am Übergang Exon14/Intron 14 im Gen der DPD mutiert. Es entsteht eine um 165 bp verkürzte mRNA und in der Folge ein um 55 Aminosäuren verkürztes und inaktives Enzym. In Untersuchungen zeigten Patienten starke 5-FU Toxizitäten, von denen ca. 20% heterozygot und ca. 4% homozygot für die Exon 14-Skipping Mutation waren (gesamt ca. 20–25%).
G1A Intron
Mit den spezifischen Primern H264/H265 wird ein Teil des DPD-Gens amplifiziert, der für die Enzymaktivität mitverantwortlich ist. In diesem Amplifikat ist die Position G1A im Intron1 enthalten, der sich bei Veränderung auf die Enzymaktivität auswirken kann.
Tabelle 126 Primersequenz zur spezifischen Amplifizierung des DPD-Gens
Zusätzlich werden Hybridisierungssonden eingesetzt, die zur Bestimmung des Nukleotids an der Position G1A im Intron1 dienen. Dieser Nachweis erfolgt im Anschluss an die PCR mittels Schmelzkurvenanalyse mit den Sonden H266/H267.
Tabelle 127 Sondensequenz für den Nachweis der Mutation nt G1A1
Das Pipettierschema für die Analyse im LightCycler ist nachfolgend aufgeführt. Der Ansatz bezieht sich auf einen 1 × Ansatz. Für die Messung kann ein Master-Mix in x-facher Menge angesetzt werden. Für jeden Mix muss eine Negativprobe (H₂O) und Positivprobe eingeplant werden.
Tabelle 128 Pipettierschema für den Nachweis der Mutation nt G1A im Intron1 des DPD-Gens
Nachfolgend ist die Programmierung des LightCycler aufgelistet.
Tabelle 129 Amplifikationsschema für den LightCycler
Tabelle 130 Bedingung für die Schmelzkurvenanalyse
Der Genotyp ergibt sich aus dem detektierten Nukleotid. In 42 ist die Analyse für die Mutationen nt G1A im Intron14 graphisch dargestellt.
Die sich aus der Schmelzkurve ergebenen Schmelzpunkte erlauben die Einteilung in den homozygoten (Mutation /Wildtyp) und heterozygoten Genotypen. Der Genotyp ergibt sich aus den detektierten Mutationen und der in der Literatur beschriebenen Nomenklatur.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Diagnose-Kit für die Bestimmung der Medikamentenverträglichkeit eines Menschen mit mindestens zwei Paaren Oligonukleotiden (Reverseprimer, Forwardprimer), wobei die beiden Oligonukleotide jedes Paares als Primer zur Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion jeweils eines der beiden komplementären Stränge eines gesuchten DNS-Abschnittes geeignet sind, und wobei der jeweils einem Paar Oligonukleotide zugeordnete gesuchte DNS-Abschnitt Teil des Gens eines der menschlichen Enzyme der Phase I und/oder Phase II des Entgiftungsstoffwechsels und vom dem dem anderen Paar Oligonukleotide zugeordneten gesuchten DNS-Abschnitt verschieden ist.
Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß der jeweils einem Paar Oligonukleotide zugeordnete gesuchte DNS-Abschnitt Teil des Gens eines der menschlichen Enzyme NAT2, CYP2D6, CYP1A2, CYP3A4, mEH, TPMT, MTHFR, Paraoxonase, CYP2C9, CYP2C19, CYP2E1 und/oder DPD ist und mindestens zwei der folgenden Polymorphismen G191A, C282T, T341C, C481T, G590A, A803G, G857A des Gens der NAT2, C100T, G1661C, 1707delT, G1758T, G1846A, 2549delA, 2613_2615delAGA, C2850T, A2935C, G4180C des Gens der CYP2D6, G-3858A, C-164A des Gens der CYP1A2, A-392G, A352G, C653G, T664C, 831insA, T1334C des Gens der CYP3A4, T337C, A416G des Gens der MEH, G238C, G460A, A719G des Gens der TPMT, C677T, A1298C des Gens der MTHFR, L55M (Aminosäureaustausch), Q192R (Aminosäureaustausch) des Gens der Paraoxonase, C430T, A1075C des Gens der CYP2C9, G636A, G681A des Gens der CYP2C19, G-1293C, C-1053T, T7632A des Gens der CYP2E1 und/oder G1A im Intron 14 des Gens der DPD enthält.
Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens ein Primerpaar enthaltend oder bestehend aus den folgenden Sequenzen (in 5'- 3'-Richtung):
Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch mindestens zwei weitere Paare Oligonukleotide (), wobei die beiden Oligonukleotide je eines Paares als Hybridisierungssonden zum Nachweis einer Nukleotidsequenz je einer der gesuchten DNS-Abschnitte geeignet sind.
Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Hybridisierungssonden Sequenzen aufweisen, die aneinander anschließend und komplementär zu einem Einzelstrang eines Allels des Gens eines der menschlichen Enzyme NAT2, CYP2D6, CYP1A2, CYP3A4, mEH, TPMT, MTHFR, Paraoxonase, CYP2C9, CYP2C19, CYP2E1 und/oder DPD ist und mindestens eines der Oligonukleotide in hybridisiertem Zustand sich über den Locus eines der folgenden Polymorphismen G191A, C282T, T341C, C481T, G590A, A803G, G857A des Gens der NAT2, C100T, G1661C, 1707delT, G1758T, G1846A, 2549delA, 2613_2615delAGA, C2850T, A2935C, G4180C des Gens der CYP2D6, G-3858A, C-164A des Gens der CYP1R2, A-392G, A352G, C653G, T664C, 831insA, T1334C des Gens der CYP3A4, T337C, A416G des Gens der mEH, G238C, G460A, A719G des Gens der TPMT, C677T, A1298C des Gens der MTHFR, L55M (Aminosäureaustausch), Q192R (Aminosäureaustausch) des Gens der Paraoxonase, C430T, A1075C des Gens der CYP2C9, G636A, G681A des Gens der CYP2C19, G-1293C, C-1053T, T7632A des Gens der CYP2E1 und/oder G1A im Intron 14 des Gens der DPD erstreckt.
Diagnose-Kit nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens zwei Paare Oligonukleotide als Hybridisierungssonden bestehend oder enthaltenden folgende Sequenzpaare (in 5'- 3'-Richtung):
Diagnose-Kit nach einem der drei vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotide der Hybridisierungsproben mit verschiedenen Fluorophoren markiert sind, die ein anderes Signal abgeben, wenn sie aneinander anschließend mit einem DNS-Einzelstrang hybridisiert sind als im nicht hybridisierten Zustand.
Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der Hybrisisierungssonden mindestens eines der Oligonukleotidpaare mit dem Fluorophor 5'-LC-Red640, 5'-LC-Red705 oder 3'-Fluorescein markiert ist.
Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es zumindest teilweise die zur Durchführung einer Polymerasekettenreaktion erforderlichen Substanzen enthält.
Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß es als zur Durchführung einer Polymerasekettenreaktion erforderliche Substanzen eine Pufferlösung, Magnesiumchlorid, Desoxynukleotid-Triphosphate- und/oder eine hitzestabile Polymerase enthält.
Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß es als hitzestabile Polymerase eine Polymerase aus Thermus aquaticus (Taq-Polymerase) enthält.
Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es als Positivkontrolle eine DNS-Probe mit mindestens einem der gesuchten DNS-Abschnitte enthält.
Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin für eine Kontrollbestimmung einen Abschnitt einer für ein Albumin kodierenden DNS sowie zwei Oligonukleotide, die jeweils als Primer zur Amplifikation zumindest eines Abschnitts jeweils eines der beiden komplementären Stränge der für das Albumin kodierenden DNS geeignet sind, enthält.
Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Anleitung zur Durchführung der Polymerasekettenreaktion und/oder eine Anleitung zur Durchführung einer Fragmentanalyse enthält.
Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Schema zur Auswertung der erhaltenen Meßergebnisse enthält.
Verfahren zur Bestimmung die Bestimmung der Medikamentenverträglichkeit eines Menschen, dadurch gekennzeichnet, daß die allelische Variabilität mindestens zweier Polymorphismen der Gene der menschlichen Enzyme der Phase I und/oder Phase II des Entgiftungsstoffwechsels in einer Blut-, Gewebe- oder sonstigen Probe des Menschen erfaßt und aus dem Vorhandensein oder Fehlen der Allele der erfaßten Polymorphismen die Medikamentenverträglichkeit des Menschen bestimmt wird.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß Polymophismen der Gene eines der menschlichen Enzyme NAT2, CYP2D6, CYP1A2, CYP3A4, mEH, TPMT, MTHFR, Paraoxonase, CYP2C9, CYP2C19, CYP2E1 und/oder DPD erfaßt werden, und wobei mindestens zwei der folgenden Polymorphismen G191A, C282T, T341C, C481T, G590A, A803G, G857A des Gens der NAT2, C100T, G1661C, 1707delT, G1758T, G1846A, 2549delA, 2613_2615delAGA, C2850T, A2935C, G4180C des Gens der CYP2D6, G-3858A, C-164A des Gens der CYP1R2, A-392G, A352G, C653G, T664C, 831insA, T1334C des Gens der CYP3A4, T337C, A416G des Gens der mEH, G238C, G460A, A719G des Gens der TPMT, C677T, A1298C des Gens der MTHFR, L55M (Aminosäureaustausch), Q192R (Aminosäureaustausch) des Gens der Paraoxonase, C430T, A1075C des Gens der CYP2C9, G636A, G681A des Gens der CYP2C19, G-1293C, C-1053T, T7632A des Gens der CYP2E1 und/oder G1A im Intron 14 des Gens der DPD erfaßt werden.
Verfahren nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß aus der Probe die DNS isoliert wird und anschließend die DNS-Fraktion untersucht wird.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die DNS-haltigen Be standteile der Gewebe- oder Blutprobe zuerst aufkonzentriert werden und anschließend diese Fraktion untersucht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die DNS der Probe durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) vervielfältigt wird.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß zur Vervielfältigung der DNS eines oder mehrere Oligonukleotid-Paare (Forwardprimer und Reverseprimer) verwendet werden, die die folgenden Sequenzen (in 5'- 3'-Richtung) enthalten oder daraus bestehen:
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß der allelische Status der Polymorphismen mittels eines Paares Oligonukleotide als Hybridisierungssonden erfaßt wird.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß Hybridisierungssonden verwendet werden, die paarweise Sequenzen aufweisen, die sich aneinander anschließend und komplementär zu einem Einzelstrang eines Allels des Gens eines der menschlichen Enzyme NAT2, CYP2D6, CYP1A2, CYP3A4, mEH, TPMT, MTHFR, Paraoxonase, CYP2C9, CYP2C19, CYP2E1 und/oder DPD ist und mindestens eines der Oligonukleotide in hybridisiertem Zustand sich über den Locus eines der folgenden Polymorphismen G191A, C282T, T341C, C481T, G590A, A803G, G857A des Gens der NAT2, C100T, G1661C, 1707delT, G1758T, G1846A, 2549delA, 2613_2615delAGA, C2850T, A2935C, G4180C des Gens der CYP2D6, G-3858A, C-164A des Gens der CYP1R2, A-392G, A352G, C653G, T664C, 831insA, T1334C des Gens der CYP3R4, T337C, A416G des Gens der mEH, G238C, G460A, A719G des Gens der TPMT, C677T, A1298C des Gens der MTHFR, L55M (Aminosäureaustausch), Q192R (Aminosäureaustausch) des Gens der Paraoxonase, C430T, A1075C des Gens der CYP2C9, G636A, G681R des Gens der CYP2C19, G-1293C, C-1053T, T7632A des Gens der CYP2E1 und/oder G1A im Intron 14 des Gens der DPD erstrecken und anschließend die Bindungsstärke des sich über den Locus erstreckenden Oligonukleotids erfaßt wird.
Verfahren nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß nach Hybridisierung der Hybridisierungsproben an die DNS die Temperaturabhängigkeit der Ablösung der Hybridisierungsproben von der DNS (Schmelzkurve) ermittelt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei der folgenden Paare Oligonukleotide als Hybridisierungssonden (in 5'- 3'-Richtung) verwendet werden, die die folgenden Sequenzen enthalten oder daraus bestehen:
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß als Hybridisierungssonden Paare von Oligonukleotiden verwendet werden, die derart mit verschiedenen Fluorophoren markiert sind, daß sie ein anderes Signal abgeben, wenn die Oligonukleotide eines Paares aneinander anschließend mit einem DNS-Einzelstrang hybridisiert sind als im nicht hybridisierten Zustand.
Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der Hybrisisierungssonden mindestens eines der Oligonukleotidpaare mit dem Fluorophor 5'-LC-Red640, 5'-LC-Red705 oder 3'-Fluorescein markiert ist.
Verfahren nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis der amplifizierten DNS die von der amplifizierten und mit den Hybridisierungssonden hybridisierten DNS abgegebenen Fluoreszenzstrahlung erfaßt wird.
Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die vervielfältigte DNS durch geeignete Restriktionsenzyme verdaut und anhand der erzeugten DNS-Bruchstücke die allelische Variabilität bestimmt wird.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis der erzeugten DNS-Bruchstücke mittels Gelelektrophorese und/oder Kapillarelektrophorese erfolgt.
Verwendung eines Verfahrens und/oder eines Diagnose-Kits nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Bestimmung der individuellen Medikamentenverträglichkeit, zur Bestimmung der individuell erforderlichen wirksamen Dosis eines Medikamentes und/oder zur Bestimmung der Prädisposition für Nebenwirkungen bei Applikation eines Medikamentes.