CN110684832A - 叶酸相关基因多态性检测的试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及基因多态性检测领域，具体讲，涉及一种叶酸相关基因多态性检测的试剂盒及其使用方法。本申请的试剂盒包括核酸扩增试剂，核酸扩增试剂包括叶酸野生型反应液、叶酸突变型反应液和混合酶液；叶酸野生型反应液中含有用于检测野生型基因的引物和探针，叶酸突变型反应液中含有用于检测突变型基因的引物和探针。本申请的试剂盒具有灵敏度高、特异性强、稳定性好的技术优势。
Description
技术领域
本申请涉及基因多态性检测领域，具体讲，涉及一种叶酸相关基因多态性检测的试剂盒及其使用方法。
背景技术
叶酸是人体必不可少的营养物质，其主要生物学功能是作为甲基供体参与细胞内的甲基化反应和脱氧核糖核酸的合成，叶酸不能被人体直接利用，必需通过一系列活化才能发挥其生理功能，而从食物中摄取的叶酸只有在叶酸还原酶的作用下还原为四氢叶酸，才能参与人体许多重要的生化代谢反应。
叶酸缺乏是导致胚胎发育异常的环境因素之一，近年来，叶酸代谢与出生缺陷、不良妊娠的关系日益受到关注。有研究表明，人群中叶酸缺乏会导致胎儿先天性异常，特别是神经管畸形(Neural tube defects，NTDs)的发生，此外，叶酸缺乏还可以引起早产、流产等不良妊娠的发生。
孕妇受孕前后期适当增补叶酸可预防NTDs，使发病率降低50％～70％，且对降低神经管畸形的初发和再发均有效。但是对于由于叶酸代谢关键酶的编码基因突变造成叶酸代谢障碍的女性人群，在补充相同剂量叶酸的情况下，血清和红细胞叶酸的浓度较正常人低，仍然易发生NTDs。
目前认为，5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)，是叶酸代谢通路中的关键酶，在同型半胱氨酸向蛋氨酸的转化以及DNA的合成过程中发挥重要作用，而相关基因位点的多态性也被证实与编码酶的活性、叶酸浓度、血浆同型半胱氨酸(HCY)浓度密切相关。
MTHFR基因，能催化5,10-亚甲基四氢叶酸还原成体内最主要的甲基供体:5-甲基四氢叶酸，其多态性位点主要有rs1801133(677C＞T，导致缬氨酸被丙氨酸代替)和rs1801131(1298A＞G，导致谷氨酸被丙氨酸代替)，该两个位点的多态性可以引起酶活性降低，并可导致体内同型半胱氨酸浓度升高，从而引起DNA甲基化的降低，进一步导致NTDs的形成。
MTRR基因，主要功能是维持足够的活化形式的维生素B12，通过影响维生素B12的活性而改变血清中同型半胱氨酸的水平，其多态性位点主要是rs1801394(66A＞G，导致蛋氨酸被异亮氨酸替代)，该位点多态性使该酶活性降低，从而使血清中同型半胱氨酸的水平升高，进一步导致NTDs的形成。
因此，对MTHFR基因的rs1801133(C677T)、rs1801131(A1298C)，MTRR基因的rs1801394(A66G)位点多态性进行检测，有助于临床筛选携带风险基因型的妇女，通过增加叶酸的补充而维持正常的血清叶酸水平，从而降低血浆同型半胱氨酸浓度，降低NTDs患儿的出生概率。
目前，常用的基因突变的检测方法有以下几种：
核苷酸序列测定技术：核苷酸序列测定技术是基因多态性的经典检测方法，也是检测基因多态性的金标准，目前国内外报道的基因多态性的检测不少采用DNA测序法，该方法可靠直观，并可检测出多位点的变异。
聚合酶链反应(PCR)-限制性片段长度多态性分析(RFLP)技术：PCR-RFLP是在RFLP分析方法的基础上发展建立的一种更为简便的DNA分型技术。PCR-RFLP的基本原理是用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带。PCR结合RFLP分析技术能有效地鉴别野生株和变异株，实验简便、快速，无需特殊仪器，适合于一般实验室应用及大规模临床检验使用，但灵敏度不够，易污染，并且不可发现新的位点变异。
基因芯片技术：基因芯片(genechip)，又称基因微矩阵(microarray)，其原理是将大量特定的基因片段或寡核苷酸片段作为探针有序地和高密度地排列固定于玻璃或硅等载体上，然后与待测的有荧光标记的样品核酸按碱基配对的原则进行杂交，通过激光共聚焦系统检测杂交信号强度，经计算机分析处理数据资料，获取样品分子的数量和序列信息，从而可对核酸序列进行大规模、高通量的研究。基因芯片技术由于其具有大通量、快速、灵敏、平行检测基因的优势，已在生物学的各个领域中得到广泛的应用。但由于目前技术还不够成熟，所以有一定的假阳性和假阴性率，实验数据不容易解释，不可检测出新位点的变异。
变性高效液相色谱(DHPLC)技术：DHPLC技术是一种高通量、主动化的基因多态性检测技术。该技术已在医学、癌症、药物等研究领域开展，与SSCP和DNA直接测序等突变检测技巧相比，DHPLC具有敏锐性更高，特异性更强，便宜省时等优点。但缺点也很明显，如可判断有否突变，不能确定SNP的位置和类型，需用标准样品或结合测序验证，而且仪器价格昂贵，也制约了在临床的开展。
实时定量PCR技术(real-time quantitative PCR，RQ-PCR)，基于荧光能量传递技术(fluorescence resonance energy transfer，FRET)，通过检测PCR过程的荧光讯号而得知靶基因的初始浓度。实时定量PCR应用简化了检测过程，其反应速度快，灵敏度高，特异性强，可重复性好，闭管操作。鉴于此，本申请提出基于实时定量PCR技术的叶酸相关基因多态性检测试剂盒及其使用方法。
发明内容
本申请的发明目的在于提出一种叶酸相关基因多态性检测试剂盒及其使用方法。
为了完成本申请的目的，采用的技术方案为：
本申请涉及一种叶酸相关基因多态性检测的试剂盒，所述试剂盒包括核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂包括叶酸野生型反应液、叶酸突变型反应液和混合酶液；
其中，所述叶酸野生型反应液中含有用于检测野生型基因的引物和探针，所述叶酸突变型反应液中含有用于检测突变型基因的引物和探针，所述混合酶液中含有Taq酶、UNG酶和内控质粒；
所述用于检测野生型基因的引物和探针包括：由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:5、SEQ ID NO:7所示的上游引物；由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQID NO:8所示的下游引物；由SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:12所示的探针，所述探针的两端标记有荧光基团；
所述用于突变型基因的引物和探针包括：由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:7所示的上游引物；由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:6、SEQID NO:8所示的下游引物；由SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:12所示的探针，所述探针的两端标记有荧光基团。
可选的，SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的5’端标记有cy5、3’端标记有BHQ3，SEQ IDNO:10所示核苷酸序列的5’端标记有VIC、3’端标记有BHQ1，SEQ ID NO:11所示核苷酸序列的5’端标记有fam、3’端标记有BHQ1，SEQ ID NO:12所示核苷酸序列的5’端标记有ROX、3’端标记有BHQ2；
优选的，所述内控质粒的DNA序列如SEQ ID NO:22所示。
可选的，所述核酸扩增试剂还包括叶酸MIX反应液，所述叶酸MIX反应液中含有dATP、dCTP、dGTP、dUTP和10×Buffer。
可选的，所述叶酸野生型反应液中含有SEQ ID NO:1所示的引物8.25nmol、SEQ IDNO:2所示的引物8.25nmol、SEQ ID NO:3所示的引物11nmol、SEQ ID NO:4所示的引物11nmol、SEQ ID NO:5所示的引物8.25nmol、SEQ ID NO:6所示的引物8.25nmol、SEQ ID NO:7所示的引物4.125nmol、SEQ ID NO:8所示的引物4.125nmol、SEQ ID NO:9所示的探针5.5nmol、SEQ ID NO:10所示的探针11nmol、SEQ ID NO:11所示的探针5.5nmol、SEQ ID NO:12所示的探针2.75nmol；
所述叶酸突变型反应液中含有SEQ ID NO:1所示的引物8.25nmol、SEQ ID NO:13所示的引物8.25nmol、SEQ ID NO:3所示的引物8.25nmol、SEQ ID NO:14所示的引物8.25nmol、SEQ ID NO:15所示的引物8.25nmol、SEQ ID NO:6所示的引物8.25nmol、SEQ IDNO:7所示的引物4.125nmol、SEQ ID NO:8所示的引物4.125nmol、SEQ ID NO:9所示的探针5.5nmol、SEQ ID NO:10所示的探针5.5nmol、SEQ ID NO:11所示的探针5.5nmol、SEQ IDNO:12所示的探针2.75nmol。
可选的，所述混合酶液中含有Taq DNA聚合酶0.5～1体积份，UNG酶0.25～0.5体积份，内控质粒50～100体积份。
可选的，所述试剂盒中还包括对照品，所述对照品包括阴性对照和阳性对照，所述阴性对照的成分为工艺用水，所述阳性对照中含有SEQ ID NO:16～SEQ ID NO:22所示的质粒DNA。
可选的，所述试剂盒所适用的样本选自血液标本或口腔拭子标本。
本申请还涉及一种检测叶酸相关基因多态性的引物和探针，所述用于检测野生型基因的引物和探针包括：由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7所示的上游引物；由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8所示的下游引物；由SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:12所示的探针，所述探针的两端标记有荧光基团；
所述用于突变型基因的引物和探针包括：由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:7所示的上游引物；由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:6、SEQID NO:8所示的下游引物；由SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:12所示的探针，所述探针的两端标记有荧光基团。
可选的，SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的5’端标记有cy5、3’端标记有BHQ3，SEQ IDNO:10所示核苷酸序列的5’端标记有VIC、3’端标记有BHQ1，SEQ ID NO:11所示核苷酸序列的5’端标记有fam、3’端标记有BHQ1，SEQ ID NO:12所示核苷酸序列的5’端标记有ROX、3’端标记有BHQ2。
本申请还涉及上述试剂盒的使用方法，至少包括以下步骤：
(1)扩增试剂配制：将叶酸野生型反应液与叶酸MIX反应液和混合酶液混合，将将叶酸突变型反应液与叶酸MIX反应液和混合酶液混合，得到相应的PCR预混液；
(2)加样：从样本、阴性对照、阳性对照分别取样，加入到相应的PCR预混液中；
(3)PCR扩增；
(4)检测。
本申请的技术方案至少具有以下有益的效果：
本申请的试剂盒的灵敏度高，FQ-PCR的敏感度通常达102copies，且线性范围很宽。可在102～1010copies的范围内进行定量。
本申请的试剂盒的特异性强，荧光探针和模板杂交的应用，并通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，故与传统的PCR技术相比，特异性大为提高。
本申请的试剂盒的稳定性好。FQ-PCR结果相当稳定。因为域值设置在指数扩增期，各反应组分浓度相对稳定，CT值与荧光信号的对数呈线性关系。与终点法相比，能更精确地反映起始模板的拷贝数。
本申请的试剂盒的污染小。一般PCR产物需通过琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色和紫外光进行观察，或通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染进行检测，不仅需要多种仪器，而且费时费力，且染色剂溴化乙锭对人体又有害，这些繁杂的实验过程给污染和假阳性提供了机会。而本公司设计的试剂盒，采用荧光定量PCR，操作简便、省时、减少污染，避免了常规PCR操作中的诸多弊端。
本申请试剂盒采用等位基因特异性扩增定量PCR技术，一次实验，可以检测样本中叶酸相关3个SNP位点的9种基因型。本申请试剂盒对MTHFR基因的rs1801133(C677T)、rs1801131(A1298C)、MTRR基因的rs1801394(A66G)位点多态性进行检测，有助于临床筛选携带风险基因型的妇女，通过增加叶酸的补充而维持正常的血清叶酸水平,从而降低血浆同型半胱氨酸浓度，降低NTDs患儿的出生概率。
下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。
具体实施方式
本申请实施例涉及一种叶酸相关基因多态性检测的试剂盒。本申请的试剂盒由MTHFR基因的rs1801133、rs1801131、MTRR基因的rs1801394位点特异性引物、荧光探针以及Taq酶等成份组成，采用PCR体外扩增的方法，利用实时荧光Taqman探针法，通过比较野生型引物和突变型引物扩增的Ct值的变化，判断标本中的基因型，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好的技术优势。
具体的，本申请实施例的叶酸相关基因多态性检测的试剂盒包括核酸扩增试剂，核酸扩增试剂包括叶酸野生型反应液、叶酸突变型反应液和混合酶液。其中，叶酸野生型反应液中含有用于检测叶酸野生型基因的引物和探针，叶酸突变型反应液中含有用于检测叶酸突变型基因的引物和探针，混合酶液中含有Taq酶、UNG酶和内控质粒。
具体的，用于检测野生型基因的引物和探针包括：由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7所示的上游引物；由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8所示的下游引物；由SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:12所示的探针，探针的两端标记有荧光基团；
用于突变型基因的引物和探针包括：由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:7所示的上游引物；由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8所示的下游引物；由SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:12所示的探针，探针的两端标记有荧光基团；
优选的，所述内控质粒的DNA序列如SEQ ID NO:22所示。
可选的，SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的5’端标记有cy5、3’端标记有BHQ3，SEQ IDNO:10所示核苷酸序列的5’端标记有VIC、3’端标记有BHQ1，SEQ ID NO:11所示核苷酸序列的5’端标记有fam、3’端标记有BHQ1，SEQ ID NO:12所示核苷酸序列的5’端标记有ROX、3’端标记有BHQ2。
上述引物和探针的具体序列如表1所示：
表1
可选的，核酸扩增试剂还包括叶酸MIX反应液，叶酸MIX反应液中含有dATP、dCTP、dGTP、dUTP和10×Buffer。
可选的，叶酸野生型反应液中含有SEQ ID NO:1所示的引物8.25nmol、SEQ ID NO:2所示的引物8.25nmol、SEQ ID NO:3 11所示的引物nmol、SEQ ID NO:4所示的引物11nmol、SEQ ID NO:5所示的引物8.25nmol、SEQ ID NO:6所示的引物8.25nmol、SEQ ID NO:7所示的引物4.125nmol、SEQ ID NO:8所示的引物4.125nmol、SEQ ID NO:9所示的探针5.5nmol、SEQID NO:10所示的探针11nmol、SEQ ID NO:11所示的探针5.5nmol、SEQ ID NO:12所示的探针2.75nmol，
叶酸突变型反应液中含有SEQ ID NO:1所示的引物8.25nmol、SEQ ID NO:13所示的引物8.25nmol、SEQ ID NO:3所示的引物8.25nmol、SEQ ID NO:14所示的引物8.25nmol、SEQ ID NO:15所示的引物8.25nmol、SEQ ID NO:6所示的引物8.25nmol、SEQ ID NO:7所示的引物4.125nmol、SEQ ID NO:8所示的引物4.125nmol、SEQ ID NO:9所示的探针5.5nmol、SEQ ID NO:10所示的探针5.5nmol、SEQ ID NO:11所示的探针5.5nmol、SEQ ID NO:12所示的探针2.75nmol。
由于本申请的试剂盒为多重PCR，1个反应管中存在不同大小的扩增产物，如果引物浓度不进行优化，引物对的扩增效率差异会造成检测结果的偏差。对此，本申请对引物的浓度进行了优化，从而显著提高了试剂盒的灵敏度。
可选的，混合酶液中含有Taq DNA聚合酶0.5～1体积份，UNG酶0.25～0.5体积份，内控质粒50～100体积份。优选的，混合酶液中含有Taq DNA聚合酶0.5体积份，UNG酶0.25体积份，内控质粒50体积份。UNG酶的作用原理是降解含有dU的双链或单链DNA，在42℃时激活，95℃时灭活。由于PCR试剂盒均以dUTP取代dTTP，所以PCR产物都是含有dU的DNA链，在定量PCR开始前增加42℃的保温步骤，UNG酶即可将已有的PCR产物降解破坏，防止可能造成的污染。
其中，Taq DNA聚合酶的活性单位为5U/μl、UNG酶的活性单位为1U/μl，内控质粒的浓度为0.5pg/ml。
可选的，试剂盒中还包括对照品，对照品包括阴性对照和阳性对照，阴性对照的成分为工艺用水，阳性对照中含有SEQ ID NO:16～SEQ ID NO:22所示的质粒DNA。
具体的，质粒DNA的核苷酸序列如表2所示：
表2
可选的，本申请实施例的试剂盒所适用的样本选自血液标本或口腔拭子标本。
具体的，本申请实施例的适用于枸橼酸钠(蓝帽)抗凝全血或EDTA(紫帽)抗凝全血，口腔拭子。可使用商业化的试剂盒来提取。
具体提取方法为：
取200μl全血样本加入4倍体积红细胞裂解液，充分混合均匀，3000rpm离心5分钟，弃上清；在上述沉淀中加入200μl 5％的Chelex-100溶液，震荡混匀后，100℃加热10分钟；冷却至室温，12000rpm离心1分钟；取上清用于后续实验。提取完的DNA建议立即进行检测，否则请于-20℃保存。
本申请试剂盒的使用方法为：
在每次检测中，必须对试剂盒中的阴性对照、阳性对照同时进行检测。
1.扩增试剂准备：从试剂盒中取出叶酸野生型反应液、叶酸突变型反应液，室温融化并振荡混匀后，2000rpm离心10秒。反应体系每个反应管按：叶酸野生型反应液或叶酸突变型反应液7μl+叶酸MIX反应液13μl+混合酶液2μl配制(注意各不同基因PCR管数应分别为样本数、阴性对照和阳性对照管数之和。)
2.加样：分别取阴性对照、待检样本DNA液或阳性对照各3μl，依次加至分别装有上述不同PCR反应混合液的离心管中，盖紧管盖，快速离心10秒，将其移至检测区。
3.PCR扩增：Stratagene Mx3000p荧光PCR检测仪扩增条件：42℃，5min；94℃，3min；(94℃，45sec；60℃，80sec)40个循环。反应体系为25μl。在PCR循环第二步60℃时收集荧光信号。
检测通道为：FAM、CY5、VIC和ROX，参比荧光设定为none。
4.检测：
(1)基线的确定：软件默认为3-15个循环的平均荧光信号为基线。在实验中，一般选择曲线波动较小，较稳定的那段作为基线，用户可根据实际情况自行酌情调整。终点要避免覆盖信号已经开始有明显增长的地方。且以起点与终点之间最好能间隔8个循环以上为原则。
(2)阈值的确定：在阴性对照无扩增的情况下,阈值设定在无典型扩增曲线样本的最高点，且阴性对照未检出为原则，确定起始阈值。
(3)注意：不同的反应液应分别单独确定各自的基线和阈值后，再进行各自分析。
计算机自动处理和分析数据。
【参考值(参考范围)】
本申请实施例的试剂盒对含10ng/μl浓度以上的人基因组DNA样本，能准确分型。
【检测结果的解释】
注：ΔCT值的计算方法：ΔCT值＝野生基因型CT值-突变基因型CT值。
1、有效性判定：
A.阴性对照有效性判定，具体如表3所示：
表3
| 项目 | 有效性判定 |
| 野生基因型、突变基因型 | C<sub>T</sub>值均应≥38或显示“Undet” |
B.阳性对照有效性判定，具体如表4所示：
表4
| 项目 | 有效性判定 |
| 野生基因型、突变基因型 | C<sub>T</sub>值均应<36 |
2、结果判定：
具体如表5所示：
表5
如以上三种情况均不属于，需重新检测，如再次检测结果仍然一样，建议将PCR产物送至测序服务公司进行测序。
如待测样品中任何一个反应液的三个通道的荧光信号均未升起，且该管的内控ROX信号也不升起，提示加入的DNA含有PCR抑制剂，需要重新提取DNA后再做。
实施例1
一种叶酸相关基因多态性检测的试剂盒，其组成如表6所示：
表6
试剂盒各组分的包装及含量如表7所示：
表7
实施例2：本申请试剂盒的准确性检测
采用实施例1的试剂盒对准确性参考品进行检测：
其中，准确性参考品的配制方法如表8所示：
表8
将制备得到的准确性参考品使用反应液进行检测，得到的实验结果如表9所示：
表9
由表9结果可知，检测分别含不同基因型的准确性参考品样本，阳性符合率为100％。
实施例4：本申请试剂盒的精密度检测
采用实施例1的试剂盒对精密度参考品进行检测：其中，精密度参考品的配制方法如表10所示：
表10
将制备得到精密度参考品的每一批做10个孔，得到的实验结果如表11和表12所示：
表11
表12
由表11、12结果可知，对各精密度参考品，在相应的反应液中重复做10次，均能检出，且其实验数据CV值均小于10％。
实施例5：本申请试剂盒的最低检出量检测
采用实施例1的试剂盒对最低检出量参考品进行检测：
其中，最低检出量参考品的配制方法如表13所示：
表13
将制备得到的最低检出量参考品使用反应液进行检测，得到的实验结果如表14所示：
表14
本申请的试剂盒对最低检出量参考品进行检测，证实本申请试剂盒的最低检出量为10ng/μl。
本申请虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本申请构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本申请的保护范围应当以本申请权利要求所界定的范围为准。
序列表
<110> 苏州云泰生物医药科技有限公司
上海源奇生物医药科技有限公司
<120> 叶酸相关基因多态性检测的试剂盒及其使用方法
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<210> 2
<211> 21
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<400> 7
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<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcctcaagtt tatgcact 18
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
accccaaagg ccaccccgaa gca 23
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aggaggagct gctgaagatg tggggg 26
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tgagcaagct gtggtacatg gattttctgc a 31
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gagagaacgt gcgggcgatt tgc 23
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gctgcgtgat gatgaaattg a 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gaagacttca aagacacatg 20
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aaggccatcg cagaagaatt g 21
<210> 16
<211> 301
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cctgtggtct cttcatccct cgccttgaac aggtggaggc cagcctctcc tgactgtcat 60
ccctattggc aggttacccc aaaggccacc ccgaagcagg gagctttgag gctgacctga 120
agcacttgaa ggagaaggtg tctgcgggag ccgatttcat catcacgcag cttttctttg 180
aggctgacac attcttccgc tttgtgaagg catgcaccga catgggcatc acttgcccca 240
tcgtccccgg gatctttccc atccaggtga ggggcccagg agagcccata agctccctcc 300
a 301
<210> 17
<211> 301
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cctgtggtct cttcatccct cgccttgaac aggtggaggc cagcctctcc tgactgtcat 60
ccctattggc aggttacccc aaaggccacc ccgaagcagg gagctttgag gctgacctga 120
agcacttgaa ggagaaggtg tctgcgggag tcgatttcat catcacgcag cttttctttg 180
aggctgacac attcttccgc tttgtgaagg catgcaccga catgggcatc acttgcccca 240
tcgtccccgg gatctttccc atccaggtga ggggcccagg agagcccata agctccctcc 300
a 301
<210> 18
<211> 301
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gtgccctgac ctctgggcac ccctctgcca ggggcaattc ctcttcccct gcctttgggg 60
agctgaagga ctactacctc ttctacctga agagcaagtc ccccaaggag gagctgctga 120
agatgtgggg ggaggagctg accagtgaag aaagtgtctt tgaagtcttc gttctttacc 180
tctcgggaga accaaaccgg aatggtcaca aagtgagtga tgctggagtg gggaccctgg 240
ttcatcccct gcccctggcc tgaccccagc tgcaggccag gctgcggggc tgtgacttcc 300
c 301
<210> 19
<211> 301
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gtgccctgac ctctgggcac ccctctgcca ggggcaattc ctcttcccct gcctttgggg 60
agctgaagga ctactacctc ttctacctga agagcaagtc ccccaaggag gagctgctga 120
agatgtgggg ggaggagctg accagtgaag caagtgtctt tgaagtcttc gttctttacc 180
tctcgggaga accaaaccgg aatggtcaca aagtgagtga tgctggagtg gggaccctgg 240
ttcatcccct gcccctggcc tgaccccagc tgcaggccag gctgcggggc tgtgacttcc 300
c 301
<210> 20
<211> 301
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aatatcttta ggttgttact gcttcattaa aaagaggatc ttttttcccc catttttcag 60
tttcactgtt acatgccttg aagtgatgag gaggtttctg ttactatatg ctacacagca 120
gggacaggca aaggccatcg cagaagaaat atgtgagcaa gctgtggtac atggattttc 180
tgcagatctt cactgtatta gtgaatccga taaggttaga gccgttacag tggattttac 240
cgttttgtgc tttgaagaat tttggttggg aagtgatatt tatgaaacaa aaggacacta 300
a 301
<210> 21
<211> 301
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aatatcttta ggttgttact gcttcattaa aaagaggatc ttttttcccc catttttcag 60
tttcactgtt acatgccttg aagtgatgag gaggtttctg ttactatatg ctacacagca 120
gggacaggca aaggccatcg cagaagaaat gtgtgagcaa gctgtggtac atggattttc 180
tgcagatctt cactgtatta gtgaatccga taaggttaga gccgttacag tggattttac 240
cgttttgtgc tttgaagaat tttggttggg aagtgatatt tatgaaacaa aaggacacta 300
a 301
<210> 22
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ctaggcgttt gtactccgtc acagcggttg ctcgaagcac gtgcggggtt attttaaaag 60
ggattgcagc ttgtagtcct gcttgagaga acgtgcgggc gatttgcctt aaccccacca 120
tttttccgga gcgagttacg aagacaaaac ctcttcgttg accgatgtac tcttgtagaa 180
agtgcataaa cttctgagga 200
Claims (10)
1.一种叶酸相关基因多态性检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂包括叶酸野生型反应液、叶酸突变型反应液和混合酶液；
其中，所述叶酸野生型反应液中含有用于检测野生型基因的引物和探针，所述叶酸突变型反应液中含有用于检测突变型基因的引物和探针，所述混合酶液中含有Taq酶、UNG酶和内控质粒；
所述用于检测野生型基因的引物和探针包括：由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:7所示的上游引物；由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8所示的下游引物；由SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:12所示的探针，所述探针的两端标记有荧光基团；
所述用于突变型基因的引物和探针包括：由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:7所示的上游引物；由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8所示的下游引物；由SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:12所示的探针，所述探针的两端标记有荧光基团；
优选的，所述内控质粒的DNA序列如SEQ ID NO:22所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的5’端标记有cy5、3’端标记有BHQ3，SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的5’端标记有VIC、3’端标记有BHQ1，SEQ ID NO:11所示核苷酸序列的5’端标记有fam、3’端标记有BHQ1，SEQ ID NO:12所示核苷酸序列的5’端标记有ROX、3’端标记有BHQ2。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增试剂还包括叶酸MIX反应液，所述叶酸MIX反应液中含有dATP、dCTP、dGTP、dUTP和10×Buffer。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，
所述叶酸野生型反应液中含有SEQ ID NO:1所示的引物8.25nmol、SEQ ID NO:2所示的引物8.25nmol、SEQ ID NO:3所示的引物11nmol、SEQ ID NO:4所示的引物11nmol、SEQ IDNO:5所示的引物8.25nmol、SEQ ID NO:6所示的引物8.25nmol、SEQ ID NO:7所示的引物4.125nmol、SEQ ID NO:8所示的引物4.125nmol、SEQ ID NO:9所示的探针5.5nmol、SEQ IDNO:10所示的探针11nmol、SEQ ID NO:11所示的探针5.5nmol、SEQ ID NO:12所示的探针2.75nmol，
所述叶酸突变型反应液中含有SEQ ID NO:1所示的引物8.25nmol、SEQ ID NO:13所示的引物8.25nmol、SEQ ID NO:3所示的引物8.25nmol、SEQ ID NO:14所示的引物8.25nmol、SEQ ID NO:15所示的引物8.25nmol、SEQ ID NO:6所示的引物8.25nmol、SEQ ID NO:7所示的引物4.125nmol、SEQ ID NO:8所示的引物4.125nmol、SEQ ID NO:9所示的探针5.5nmol、SEQ ID NO:10所示的探针5.5nmol、SEQ ID NO:11所示的探针5.5nmol、SEQ ID NO:12所示的探针2.75nmol。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述混合酶液中含有Taq DNA聚合酶0.5～1体积份，UNG酶0.25～0.5体积份，内控质粒50～100体积份。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括对照品，所述对照品包括阴性对照和阳性对照，所述阴性对照的成分为工艺用水，所述阳性对照中含有SEQID NO:16～SEQ ID NO:22所示的质粒DNA。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒所适用的样本选自血液标本或口腔拭子标本。
8.一种检测叶酸相关基因多态性的引物和探针，所述用于检测野生型基因的引物和探针包括：由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7所示的上游引物；由SEQID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8所示的下游引物；由SEQ ID NO:9～SEQID NO:12所示的探针，所述探针的两端标记有荧光基团；
所述用于突变型基因的引物和探针包括：由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:7所示的上游引物；由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8所示的下游引物；由SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:12所示的探针，所述探针的两端标记有荧光基团。
9.根据权利要求8所述的引物和探针，其特征在于，SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的5’端标记有cy5、3’端标记有BHQ3，SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的5’端标记有VIC、3’端标记有BHQ1，SEQ ID NO:11所示核苷酸序列的5’端标记有fam、3’端标记有BHQ1，SEQ ID NO:12所示核苷酸序列的5’端标记有ROX、3’端标记有BHQ2。
10.一种如权利要求1～7任一项所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，至少包括以下步骤：
(1)扩增试剂配制：将叶酸野生型反应液与叶酸MIX反应液和混合酶液混合，将将叶酸突变型反应液与叶酸MIX反应液和混合酶液混合，得到相应的PCR预混液；
(2)加样：从样本、阴性对照、阳性对照分别取样，加入到相应的PCR预混液中；
(3)PCR扩增；
(4)检测。
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