CN107254520A - 一种叶酸代谢相关基因的检测方法 - Google Patents

一种叶酸代谢相关基因的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种叶酸代谢相关基因的检测方法，具体步骤如下：对检测者的口腔黏膜细胞提取DNA；分别用SEQ NO 1和SEQ NO 2扩增MTHFR基因C677T，用SEQ NO 3和SEQ NO 4扩增MTHFR基因A1298C，用SEQ NO 5和SEQ NO 6扩增MTRR基因A66G，以口腔黏膜细胞提取DNA为模板进行PCR反应，将上述3对引物进行普通PCR扩增产物1％的琼脂糖凝胶电泳；将1％的琼脂糖凝胶电泳条带用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带；PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳条带用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收；测序反应；测序反应产物纯化，变性，上3730测序仪测序；将测序结果用Chromas软件分析3个SNP基因型即可。本发明具有检测准确度高、使用比较方便等优点。

Description

一种叶酸代谢相关基因的检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体来说是一种叶酸代谢相关基因的检测方法。
背景技术
叶酸又称蝶酰谷氨酸，由喋啶核、对氨苯甲酸及谷氨酸3个部分组成。人和哺乳动物都只能通过肠道吸收外源的叶酸而不能自身合成叶酸。叶酸主要被小肠上段吸收，在十二指肠和空肠上皮黏膜细胞内含叶酸还原酶，在该酶的作用下叶酸甲基化生成二氢叶酸，再甲基化后生成四氢叶酸。甲基四氢叶酸为一碳单位的载体，参与组成DNA和RNA的嘌呤和嘧啶等重要物质的生物合成。叶酸代谢还具有很高的个体差异，而且受到生物体内多种因素的影响，尤其是受叶酸代谢过程中重要的酶如亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶多态性的影响。叶酸在细胞内需要代谢转化才能发挥其生物学作用，亚甲基四氢叶酸还原酶是叶酸代谢通路中的关键酶，MTHFR基因核苷酸多态(677C→T和1298A→C)使其编码的酶功能活性降低，从而影响叶酸的生物转化和功能。
叶酸是指具有相关生物活性的一类通效维生素，有蝶啶、对氨基苯甲酸和一个或多个谷氨酸结合而成，即由α-氨基-4-羟基蝶啶与对氨基苯甲酸相连接，在以-NH-CO-键与谷氨酸链接组成，其不同的辅酶形成可以作为一碳单位的供体或载体而发挥作用，主要参与以下几类反应：①蛋氨酸合成；②嘌呤和嘧啶的合成；③丝氨酸和甘氨酸的相互转化和组氨酸的降解。大量研究表明，叶酸摄入绝对或相对的缺乏，是引起高同型半胱氨酸血症的直接原因。高同型半胱氨酸血症可能导致新生儿神经管缺陷(NTDs)、唐氏综合征(DS)、先天性心脏病(CHD)、唇腭裂；孕妇妊娠高血压、早产、自发性流产。
目前了解到涉及叶酸代谢能力的关键基因包括亚甲基四氢叶酸还原酶和甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR),这两种酶的基因出现位点变异导致酶活性降低，会显著影响机体的叶酸代谢能力,目前，叶酸代谢相关基因的检测方法普遍存在检测精确度差、速度慢的缺陷，需要进行有效的改进。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中的检测精确度差、速度慢的缺陷，而提供一种叶酸代谢相关基因的检测方法。
本发明解决上述技术问题提供的技术方案是：本发明公开了一种叶酸代谢相关基因的检测方法，具体步骤如下：
(1)、对检测者的口腔黏膜细胞提取DNA；
(2)、分别用SEQ NO 1和SEQ NO 2扩增MTHFR基因C677T，用SEQ NO 3和SEQ NO 4扩增MTHFR基因A1298C，用SEQ NO 5和SEQ NO 6扩增MTRR基因A66G，以口腔黏膜细胞提取DNA为模板进行PCR反应，取25uL体系，其包括:
模板：2uL、SEQ NO 1:1uL、SEQ NO 2：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hot start taq：0.3ul、去离子水：16.2uL；
模板：2uL、SEQ NO 3:1uL、SEQ NO4：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hot start taq：0.3ul、去离子水：16.2uL；
模板：2uL、SEQ NO 5:1uL、SEQ NO 6：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hot start taq：0.3ul、去离子水：16.2uL；
(3)、将上述3对引物进行普通PCR扩增产物1％的琼脂糖凝胶电泳；
(4)、将1％的琼脂糖凝胶电泳条带用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带；
(5)、测序反应：
测序反应5ul体系：引物1uL，胶回收产物为模板和水共3ul，bigdye 1ul，测序反应条件如下：95℃预变性5min，接着进入循环，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸45s，共25个循环，之后，继续72℃延伸5min，4℃保存；
(6)、测序反应产物纯化，变性，上3730测序仪测序；
(7)、将测序结果用Chromas软件分析3个SNP基因型即可。
作为优选，所述的步骤(1)中，采用口腔拭子DNA提取试剂盒对检测者的口腔黏膜细胞提取DNA；
作为优选，所述的步骤(1)中，提取的DNA浓度不低于10ng/ul，260/280＝1.8；
作为优选，所述的步骤(2)中，所述的提供叶酸代谢能力基因检测的特异性扩增的引物SEQ NO 1、SEQ NO 2、SEQ NO 3、SEQ NO4、SEQ NO 5和SEQ NO 6，其碱基序列如下所示：
SEQ NO 1：CCTCTCCTGACTGTCATCCC
SEQ NO 2：GCCTTCACAAAGCGGAAGAA
SEQ NO 3：GTGGGACGAGTTCCCTAACG
SEQ NO 4：CACTCCAGCATCACTCACTTTG
SEQ NO 5：GCCTTGAAGTGATGAGGAGG
SEQ NO 6：CCACTGTAACGGCTCTAACC。
作为优选，所述的步骤(2)中，其反应条件如下：95℃预变性5min，接着进入循环，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，共40个循环，之后，继续72℃延伸5min，4℃保存。
与现有技术相比，本发明具有以下有益优点：
本发明提供一种检测叶酸代谢能力基因的方法，包括如下步骤：获取受检者核酸，所述核酸包含DNA片段，所述的DNA片段使用口腔拭子刮取口腔黏膜细胞，用天跟口空拭子提取试剂盒提取DNA；检测一下叶酸代谢能力基因的的SNP位点的基因型，MTHFR基因C677T、MTHFR基因A1298C和MTRR基因A66G，其中包括3对引物扩增包含所述SNP位点的DNA片段，确定所述SNP位点的碱基类型。受检者可以是人或者其他哺乳动物。亚甲基四氢叶酸还原酶的C667T位点和A1298C位点催化产生5-甲基四氢叶酸，参与甲基传递及核苷酸合成通路，MTHFR酶活性降低，同型半胱氨酸在体内积累。甲硫氨酸合成酶(MTRR)的A66G位点将失活的甲硫氨酸合成酶还原成活性状态，维持甲基传递通路继续进行，MTRR酶的活性降低，易致同型半胱氨酸血症、神经管缺陷等疾病。上述SNP位点根据HGVS命名法标注该位点在参考cDNA上的位置来表示的，是为简便指代某个特定SNP位点，一个SNP位点还可以有其它表示方式，如以下会出现的以“rs”开头的SNP位点表示方式，rs1801133与MTHFR基因C677T表示同一个位点，该方式是GenBank SNP数据库的命名方法，以“rs”加7位阿拉伯数字来表示一个SNP。根据数据库如SNP数据库中确定并获得特定SNP位点基因序列上的位置信息的同时，也能获得其前后序列、分布频率等。本发明利用3个SNP位点，确定了3个位点的3对引物，用PCR扩增Sanger测序获得3个位点的基因型。该方法是一种成本低，速度快、高准确度的叶酸代谢相关基因分型的方法。
经过反复的实验与推敲，本发明选出了3对特异性很好的引物，第一对用于检测MTHFR基因C677T基因型，第二对用于检测MTHFR基因A1298C基因型，第三对引物用于检测MTRR基因A66G基因型。并且建立了稳定的反应体系，摸索出理想的反应条件，应用敏感度较高的丙烯酰胺凝胶电泳技术作为结果检出手段，因此得出可靠地实验结果。
附图说明
图1为实施例1的对3对引物进行普通PCR扩增产物1％的琼脂糖凝胶电泳图。
附图标记为：M:Marker2000；1:MTHFR基因C677T；2:MTHFR基因A1298C；3:MTRR基因A66G。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步说明，但本发明并不仅限于这些实施例。
本发明公开了一种叶酸代谢相关基因的检测方法，具体步骤如下：
(1)、对检测者的口腔黏膜细胞提取DNA；
(2)、分别用SEQ NO 1和SEQ NO 2扩增MTHFR基因C677T，用SEQ NO 3和SEQ NO 4扩增MTHFR基因A1298C，用SEQ NO 5和SEQ NO 6扩增MTRR基因A66G，以口腔黏膜细胞提取DNA为模板进行PCR反应，取25uL体系，其包括:
模板：2uL、SEQ NO 1:1uL、SEQ NO 2：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hot start taq：0.3ul、去离子水：16.2uL；
模板：2uL、SEQ NO 3:1uL、SEQ NO4：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hot start taq：0.3ul、去离子水：16.2uL；
模板：2uL、SEQ NO 5:1uL、SEQ NO 6：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hot start taq：0.3ul、去离子水：16.2uL；
(3)、将上述3对引物进行普通PCR扩增产物1％的琼脂糖凝胶电泳；
(4)、将1％的琼脂糖凝胶电泳条带用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带；
(5)、测序反应：
测序反应5ul体系：引物1uL，胶回收产物为模板和水共3ul，bigdye 1ul，测序反应条件如下：95℃预变性5min，接着进入循环，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸45s，共25个循环，之后，继续72℃延伸5min，4℃保存；
(6)、测序反应产物纯化，变性，上3730测序仪测序；
(7)、将测序结果用Chromas软件分析3个SNP基因型即可。
分析如下：表1
表2
作为优选，所述的步骤(1)中，采用口腔拭子DNA提取试剂盒对检测者的口腔黏膜细胞提取DNA；
作为优选，所述的步骤(1)中，提取的DNA浓度不低于10ng/ul，260/280＝1.8；
作为优选，所述的步骤(2)中，所述的提供叶酸代谢能力基因检测的特异性扩增的引物SEQ NO 1、SEQ NO 2、SEQ NO 3、SEQ NO4、SEQ NO 5和SEQ NO 6，其碱基序列如下所示：
SEQ NO 1：CCTCTCCTGACTGTCATCCC
SEQ NO 2：GCCTTCACAAAGCGGAAGAA
SEQ NO 3：GTGGGACGAGTTCCCTAACG
SEQ NO 4：CACTCCAGCATCACTCACTTTG
SEQ NO 5：GCCTTGAAGTGATGAGGAGG
SEQ NO 6：CCACTGTAACGGCTCTAACC。
作为优选，所述的步骤(2)中，其反应条件如下：95℃预变性5min，接着进入循环，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，共40个循环，之后，继续72℃延伸5min，4℃保存。
实施例1
将孕妇唐某进行叶酸代谢相关基因检测
(1)、用口腔拭子DNA提取试剂盒对唐某的口腔黏膜细胞提取DNA，确保DNA浓度25ng/ul，260/280＝1.91；
(2)、分别用SEQ NO 1和SEQ NO 2扩增MTHFR基因C677T；用SEQ NO 3和SEQ NO 4扩增MTHFR基因A1298C；用SEQ NO 5和SEQ NO 6扩增MTRR基因A66G。以口腔黏膜细胞提取DNA为模板进行PCR反应，取25uL体系，其包括:
模板：2uL、SEQ NO 1:1uL、SEQ NO 2：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hot start taq：0.3ul、去离子水：16.2uL；
模板：2uL、SEQ NO 3:1uL、SEQ NO4：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hot start taq：0.3ul、去离子水：16.2uL；
模板：2uL、SEQ NO 5:1uL、SEQ NO 6：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hot start taq：0.3ul、去离子水：16.2uL；
其反应条件如下：95℃预变性5min，接着进入循环，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，共40个循环，之后，继续72℃延伸5min，4℃保存；
(3)、将上述3对引物进行普通PCR扩增产物1％的琼脂糖凝胶电泳；
(4)、将1％的琼脂糖凝胶电泳条带用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收MTHFR基因C677T目的条带168bp、MTHFR基因A1298C目的条带226bp和MTRR基因A66G目的条带159bp；
(5)、测序反应
测序反应5ul体系：引物1uL，胶回收产物为模板和水共3ul，bigdye 1ul。
测序反应条件如下：95℃预变性5min，接着进入循环，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸45s，共25个循环，之后，继续72℃延伸5min，4℃保存。
(6)、测序反应产物纯化，变性，上3730测序仪测序。
(7)、将测序结果用Chromas软件分析3个SNP基因型。
检测结果如表3
结果分析
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (5)

1.一种叶酸代谢相关基因的检测方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)、对检测者的口腔黏膜细胞提取DNA；
(2)、分别用SEQ NO 1和SEQ NO 2扩增MTHFR基因C677T，用SEQ NO 3和SEQ NO 4扩增MTHFR基因A1298C，用SEQ NO 5和SEQ NO 6扩增MTRR基因A66G，以口腔黏膜细胞提取DNA为模板进行PCR反应，取25uL体系，其包括:
模板：2uL、SEQ NO 1:1uL、SEQ NO 2：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hotstart taq：0.3ul、去离子水：16.2uL；
模板：2uL、SEQ NO 3:1uL、SEQ NO4：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hotstart taq：0.3ul、去离子水：16.2uL；
模板：2uL、SEQ NO 5:1uL、SEQ NO 6：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hotstart taq：0.3ul、去离子水：16.2uL；
(3)、将上述3对引物进行普通PCR扩增产物1％的琼脂糖凝胶电泳；
(4)、将1％的琼脂糖凝胶电泳条带用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带；
(5)、测序反应：
测序反应5ul体系：引物1uL，胶回收产物为模板和水共3ul，bigdye 1ul，测序反应条件如下：95℃预变性5min，接着进入循环，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸45s，共25个循环，之后，继续72℃延伸5min，4℃保存；
(6)、测序反应产物纯化，变性，上3730测序仪测序；
(7)、将测序结果用Chromas软件分析3个SNP基因型即可。
2.根据权利要求1所述的一种叶酸代谢相关基因的检测方法，其特征在于：所述的步骤(1)中，采用口腔拭子DNA提取试剂盒对检测者的口腔黏膜细胞提取DNA。
3.根据权利要求1或2所述的一种叶酸代谢相关基因的检测方法，其特征在于：所述的步骤(1)中，提取的DNA浓度不低于10ng/ul，260/280＝1.8。
4.根据权利要求1所述的一种叶酸代谢相关基因的检测方法，其特征在于：所述的步骤(2)中，所述的提供叶酸代谢能力基因检测的特异性扩增的引物SEQ NO 1、SEQ NO 2、SEQNO 3、SEQ NO4、SEQ NO 5和SEQ NO 6，其碱基序列如下所示：
SEQ NO 1：CCTCTCCTGACTGTCATCCC
SEQ NO 2：GCCTTCACAAAGCGGAAGAA
SEQ NO 3：GTGGGACGAGTTCCCTAACG
SEQ NO 4：CACTCCAGCATCACTCACTTTG
SEQ NO 5：GCCTTGAAGTGATGAGGAGG
SEQ NO 6：CCACTGTAACGGCTCTAACC。
5.根据权利要求1或4所述的一种叶酸代谢相关基因的检测方法，其特征在于：所述的步骤(2)中，其反应条件如下：95℃预变性5min，接着进入循环，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，共40个循环，之后，继续72℃延伸5min，4℃保存。
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