CN110982821B - 一种具有黄嘌呤氧化酶抑制活性的核酸适配体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种具有黄嘌呤氧化酶抑制活性的核酸适配体及其应用，涉及核酸适配体的筛选和应用技术领域。所述核酸适配体的核苷酸序列的DNA分子为：TGCCTTACGTGTGGTTGGCCTATGCGTGCTACCGTGAAAG或其互补序列，采用磁珠‑SELEX结合毛细管电泳‑SELEX技术进行筛选得到，且该黄嘌呤氧化酶抑制活性的核酸适配体能在制备黄嘌呤氧化酶抑制剂或降尿酸药物中应用。本发明克服了现有技术的不足，所述的核酸适配体具有显著的黄嘌呤氧化酶抑制活性及降尿酸活性，作为痛风、高尿酸血症、冠状动脉粥样硬化性心脏病、慢性心力衰竭、心肌梗死、高血压病等疾病的保健品和药物先导化合物，具有良好的应用前景。

Description

一种具有黄嘌呤氧化酶抑制活性的核酸适配体及其应用
技术领域
本发明涉及核酸适配体的筛选和应用技术领域，具体涉及一种具有黄嘌呤氧化酶抑制活性的核酸适配体及其应用。
背景技术
黄嘌呤氧化酶是催化次黄嘌呤氧化为黄嘌呤，并继续催化黄嘌呤氧化为尿酸的酶。黄嘌呤氧化酶与多种疾病的病理状态密切相关，如痛风、肝炎、缺血再灌注、炎症、癌症以及衰老等。黄嘌呤氧化酶抑制剂能够有效缓解和治疗上述疾病。目前，广泛使用的黄嘌呤氧化酶抑制剂主要是别嘌呤醇。它能够降低血中尿酸含量，对控制痛风疾病具有良好效果。但是，该药的特异性较差，对其他嘌呤和嘧啶代谢酶亦有抑制作用，从而引起不同程度的不良反应，甚至是致命的过敏综合征。面对选择有限的黄嘌呤氧化酶抑制剂和各种不良反应，医患人员通常十分为难。因此，研发新一代低毒副作用的高效黄嘌呤氧化酶抑制剂已成为当务之急。
核酸适配体(Aptamer)是通过体外分子进化(SELEX)技术，从寡核苷酸序列库中，筛选得到的能与靶分子特异性结合的一段寡核苷酸序列。核酸适体在医学诊断和疾病治疗中具有突出的应用优势，主要表现在：①对靶分子具有高度的结合能力，这种能力无论是在特异性方面还是在亲和力方面，都高于抗体对抗原的结合能力；②识别的靶分子范围广，从金属离子到蛋白酶再到细胞，核酸适体均能识别；③在体内没有免疫原性，不产生异源反应；④分子小，易合成，可修饰标记，稳定性好。基于以上核酸适体的优良特性，如果获得专一识别黄嘌呤氧化酶的核酸适体抑制剂，不仅能够避免由于交叉抑制其他代谢酶所引起的不良反应，而且不会产生免疫反应。同时，由于合成容易、分子稳定、可修饰标记，黄嘌呤氧化酶核酸适体抑制剂的生产成本和保存成本很低，并能够延伸应用于分子识别、影像定位、医学诊断以及药物筛选等多项领域。
目前，已公布的黄嘌呤氧化酶抑制剂多是化学合成物、天然提取物以及多肽类物质，本发明首次公布了一种对黄嘌呤氧化酶活性具有抑制作用的核酸适配体，基于本发明有望开发出成本低、毒副作用小的新一代黄嘌呤氧化酶抑制剂，在疾病防疗、医学诊断以及药物筛选方面，具有重要的科学理论意义和实际应用价值。
发明内容
针对现有技术不足，本发明提供一种具有黄嘌呤氧化酶抑制活性的核酸适配体及其应用，所述的核酸适配体具有显著的黄嘌呤氧化酶抑制活性及降尿酸活性，作为痛风、高尿酸血症、冠状动脉粥样硬化性心脏病、慢性心力衰竭、心肌梗死、高血压病等疾病的保健品和药物先导化合物具有良好的应用前景。
为实现以上目的，本发明的技术方案通过以下技术方案予以实现：
一种具有黄嘌呤氧化酶抑制活性的核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列的DNA分子为：TGCCTTACGTGTGGTTGGCCTATGCGTGCTACCGTGAAAG或其互补序列。
优选的，所述核酸适配体的筛选方式包括以下步骤：
(1)选取随机文库，采用磁珠-SELEX技术进行第一轮筛选；
(2)采用毛细管电泳-SELEX技术进行2-6轮筛选；
(3)将1～6轮筛选样品高通量测序，并采用ClustalX2.1软件对筛选所得核酸适配体序列进行同源性分析，采用DNAMAN9软件分析筛选所得核酸适配体序列的二级结构，经过序列聚类分析、二级结构分析以及高通量测序计算特定序列在次级核酸文库中的占比，选择出TGCCTTACGTGTGGTTGGCCTATGCGTGCTACCGTGAAAG的核苷酸序列。
所述的一种具有黄嘌呤氧化酶抑制活性的核酸适配体在制备黄嘌呤氧化酶抑制剂或降尿酸药物中应用。
优选的，采用核苷酸序列TGCCTTACGTGTGGTTGGCCTATGCGTGCTACCGTGAAAG为活性成份添加药物学上可接受的载体或辅料制备黄嘌呤氧化酶抑制剂或降尿酸药物。
优选的，所述核酸适配体在制备预防和/或治疗痛风、高尿酸血症、冠状动脉粥样硬化性心脏病、慢性心力衰竭、心肌梗死、高血压病中的一种或二种以上疾病药物和/或保健品中的应用。
本发明提供一种具有黄嘌呤氧化酶抑制活性的核酸适配体及其应用，与现有技术相比优点在于：
(1)本发明通过磁珠-SELEX结合毛细管电泳-SELEX技术，首次筛选获得了对黄嘌呤氧化酶具有抑制活性的核酸适配体，该适配体属于核酸类的黄嘌呤氧化酶抑制剂；
(2)本发明所述的核酸适配体，相对分子质量为12429.02Da，易溶于水，对黄嘌呤氧化酶活性具有很强的抑制作用，IC50为1.131μmol/L；
(3)本发明所提供的核酸适配体可由商业公司合成获得，可以进行人工合成、修饰及标记，成本较低。
附图说明
图1为本发明所述核酸适配体在每轮筛选中占次级核酸文库的比例；
图2为本发明所述核酸适配体的二级结构；
图3为本发明所述核酸适配体抑制黄嘌呤氧化酶活性的曲线。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
采用磁珠-SELEX结合毛细管电泳-SELEX技术，筛选黄嘌呤氧化酶的核酸适配体：
1、检测中使用的引物序列如下：
批量扩增primerI：FAM-5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3’
批量扩增primerII：5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAA-spacer 18-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3’
定量扩增Q-PCR primerI：5’-GCAGCACAGAGGTCAGATG-3’
定量扩增Q-PCR primerII：5’-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3’
高通量测序引物见表1：
表1高通量测序引物
Figure BDA0002341136230000041
2、黄嘌呤氧化酶包被磁珠的制备：
①取100μL磁珠，用100μL硼酸-硼砂缓冲液洗涤3次，加入50μL EDC+50μL NHS，振荡混匀30min，移去上清液，用100μL硼酸-硼砂缓冲液洗涤磁珠2次；
②将上述物质立即加入终浓度为50μg/mL黄嘌呤氧化酶，混匀磁珠和蛋白，室温反应1h；
③将上述物质转移上清液，迅速向磁珠中加入100μmol/L乙醇胺反应15min，移除上清液，硼酸-硼砂缓冲液洗涤磁珠3次，然后重悬于100μL硼酸-硼砂缓冲液中，得到黄嘌呤氧化酶包被磁珠。
3、第1轮筛选：
①选取1.3nmol/L的随机核酸文库(其中随机核酸文库序列为：AGCAGCACAGAGGTCAGATG-(N40)-CCTATGCGTGCTACCGTGAA，其中N40代表40个随机核苷酸)沸水加热10min，后在-80℃下冰水猝冷5min，再加入50μL黄嘌呤氧化酶包被磁珠，室温震颤混匀1h，后上清液留存，硼酸-硼砂缓冲液清洗磁珠4次；
②将上述物质加入100μL硼酸-硼砂缓冲液，沸水加热10min，14000r/min离心1min，并将上清液作为模板进行PCR批量扩增；PCR反应体系为：模板20μL，批量扩增primerI(100μmol/L)50μL，批量扩增primerII(100μmol/L)50μL，dNTP 200μL，10×PCR扩增缓冲溶液1mL，pfu酶30μL，加超纯水至8650μL，PCR扩增条件为：95℃预变性1min，95℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃，5min；
③PCR扩增完毕后，将PCR产物全部收集并加入正丁醇，充分混合，9000r/min离心10min，收集沉淀，采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳切胶回收法制备单链DNA，得到次级核酸文库备用；
4、第2～6轮筛选轮筛选：
①将上述次级核酸文库加入硼酸-硼砂缓冲液配置成浓度为500nmol/L的溶液后，取40μL在95℃加热10min，后于冰乙醇冷却，再平均分装到2个PCR管中，第2轮筛选时一管加4.76μmol/L黄嘌呤氧化酶溶液，3～6轮筛选时浓度依次减半，室温振荡1h，并将另一份留作对照；
②设定毛细管电泳过程各参数，具体参数见表2，运行毛细管电泳程序，并根据毛细管电泳结果，收集15min～25min处的DNA作为模板进行PCR批量扩增；PCR反应体系为：模板20μL，批量扩增primer I(100μmol/L)50μL，批量扩增primerII(100μmol/L)50μL，dNTP200μL，10×PCR扩增缓冲溶液1mL，pfu酶30μL，加超纯水至8650μL；PCR扩增条件为：95℃预变性1min，95℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃，5min；
③PCR扩增完毕后，将PCR产物全部收集并加入正丁醇，充分混合，9000r/min离心10min，收集沉淀。采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳切胶回收法制备单链DNA，即为下一轮筛选的次级核酸文库，重复上述操作直至6轮筛选结束；
表2毛细管电泳参数
Figure BDA0002341136230000061
5、1～6轮筛选样品高通量测序：
①选取10μmol/L的高通量测序引物2μL，加到400μL PCR Mix中，分别加入1～6轮筛选的次级核酸文库10μL，进行PCR扩增；PCR扩增条件为：95℃预变性1min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，23个循环；最后75℃，5min；
②PCR扩增完毕后，将PCR产物全部收集并加入正丁醇，充分混合，9000r/min离心10min，收集沉淀后进行高通量测序；
6、核酸适配体序列及结构分析：采用Clustal X 2.1软件对筛选所得核酸适配体序列进行同源性分析，采用DNAMAN 9软件分析筛选所得核酸适配体序列的二级结构，经过序列聚类分析、二级结构分析以及高通量测序计算特定序列在次级核酸文库中的占比，最后选择出TGCCTTACGTGTGGTTGGCCTATGCGTGCTACCGTGAAAG的核苷酸序列(每轮筛选在次级核酸文库中占比的结果见图1，二级结构见图2)。
实施例2：
检测上述实施例1中核苷酸适配体TGCCTTACGTGTGGTTGGCCTATGCGTGCTACCGTGAAAG对黄嘌呤氧化酶活性的抑制性：
1、原料选择：选取上述实施例1中的核苷酸序列TGCCTTACGTGTGGTTGGCCTATGCGTGCTACCGTGAAAG，以及等长度对照核酸序列(A40，40个腺苷酸)，采用来源于牛乳的黄嘌呤氧化酶进行活性检测；
2、检测：在96孔酶标板上，按照表3建立黄嘌呤氧化酶活性分析体系，每组设置5个平行复孔。采用酶标仪在295nm处每隔15s记录一次吸收度A，共计时300s。抑制率(％)采用下列公式计算：抑制率(％)＝[(dA/dt)空白－(dA/dt)实验]/(dA/dt)空白×100。其中(dA/dt)空白为空白组的反应速率，(dA/dt)实验为实验组反应速率。dA/dt时间选择在15s～195s。抑制曲线见图3，建立非线性回归方程计算得黄嘌呤氧化酶的IC50为1.131μmol/L，其中方程式如下所示：
Figure BDA0002341136230000071
表3核酸适配体对黄嘌呤氧化酶活性抑制
Figure BDA0002341136230000072
Figure BDA0002341136230000081
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (2)

1.一种核酸适配体在制备用于抑制黄嘌呤氧化酶活性试剂中的应用，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列的DNA分子为：TGCCTTACGTGTGGTTGGCCTATGCGTGCTACCGTGAAAG。
2.根据权利要求1所述的一种核酸适配体在制备用于抑制黄嘌呤氧化酶活性试剂中的应用，其特征在于，所述核酸适配体的筛选方式包括以下步骤：
（1）选取随机文库，采用磁珠-SELEX技术进行第一轮筛选；
（2）采用毛细管电泳-SELEX技术进行2-6轮筛选；
（3）将1~6轮筛选样品高通量测序，并采用Clustal X 2.1软件对筛选所得核酸适配体序列进行同源性分析，采用DNAMAN 9软件分析筛选所得核酸适配体序列的二级结构，经过序列聚类分析、二级结构分析以及高通量测序计算特定序列在次级核酸文库中的占比，选择出TGCCTTACGTGTGGTTGGCCTATGCGTGCTACCGTGAAAG的核苷酸序列。
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CN105452466A (zh) * 2012-10-23 2016-03-30 卡里斯生命科学瑞士控股有限责任公司 适体及其用途

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