CN111778321A - 用于检测叶酸代谢相关基因的引物和探针及试剂盒与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于检测叶酸代谢相关基因的引物和探针及试剂盒与应用。本发明公开的检测或辅助检测叶酸代谢相关基因的探针，包括(1)‑(3)组探针中的至少一组。本发明对叶酸代谢能力相关基因突变的检测方法具有特异性强、灵敏度高、受污染小、操作简单快速、安全性能高等优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，尤其适合直接以全血作为检测样本，直接进行相关基因突变检测。根据本发明可以精准地对叶酸代谢能力进行判断，提供个体化叶酸服用和增补剂量，具有重要价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及用于检测叶酸代谢相关基因的引物和探针及试剂盒与应用。
背景技术
我国是新生儿出生缺陷的高发国家之一，每年的出生缺陷儿数量约占全世界的20％。据中国疾病预防控制中心统计资料显示，我国每年约有80万-120万名出生缺陷儿，平均每30秒就有一名缺陷儿出生。科学研究已经表明，叶酸缺乏是导致新生儿出生缺陷的主要原因。
叶酸(folic acid)是维生素B复合体之一，相当于蝶酰谷氨酸(pteroylglutamicacid，PGA)，是米切尔(H.K.Mitchell，1941)从菠菜叶中提取纯化的，故而命名为叶酸。叶酸是机体所需的重要营养素，在绿叶蔬菜、水果及动物肝脏中含量丰富。叶酸在人体内以四氢叶酸的形式起作用，四氢叶酸是一碳单位的运载体，可运载甲基、甲烯基、甲醛基等一碳单位，参与体内氨基酸、嘌呤、嘧啶的合成。因而叶酸对细胞分裂增殖、组织修复和机体发育等都是不可缺少的营养素，更是胚胎发育过程中不可缺少的营养素。叶酸代谢通路中的关键基因突变会使得关键酶活性降低，导致叶酸代谢障碍，造成叶酸缺乏。孕妇对叶酸的需求量比正常人高4倍，孕妇缺乏叶酸会导致新生儿出生缺陷等严重后果。叶酸缺乏的临床功能除了导致胎儿神经管缺陷外，还能增加孕妇妊娠高血压、自发性流产和胎儿宫内发育迟缓、早产以及新生儿低出生体重等发病率。叶酸增补不应仅仅局限在女性，男性补充叶酸有着同等重要的意义。科学研究证明，男性机体叶酸水平偏低，主要会导致两方面的不良后果：一是精子密度低、活性下降、勃起功能减弱，二是精液中携带的染色体数量异常(过多或过少，即精子中出现“非整倍体”)，引起唐氏综合症或流产。叶酸过量会影响锌的吸收，导致新生儿发育异常，如体虚、神经衰弱和恶性贫血等，同时增加患结肠腺瘤、乳腺癌等肿瘤的风险。
参与叶酸代谢最重要的两个基因是亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶还原酶基因(MTRR)。研究发现，如果MTHFR基因677位点发生突变，将会导致酶活性和热稳定性下降。若以个体携带677CC基因型时其MTHFR活性为100％，携带CT基因型的活性则为CC的71％，基因型为TT型的只有34％。如果MTRR基因66位点发生突变，将会导致酶活性发生变化，造成体内叶酸缺乏或同型半胱氨酸水平升高，进而诱发多种疾病，如Down综合症-先天愚型、神经管疾病、心血管疾病等，因此MTRR突变被认为是这些疾病的高风险因素。对MTHFR基因、MTRR基因及其相关位点的检测，可以直接发现被检测者叶酸代谢方面的遗传缺陷(即叶酸的利用能力)，从而根据风险高低(相关代谢酶的活性程度)建议更准确的补充剂量。
目前检测叶酸代谢相关基因遗传多态性的最简单的方法是PCR-RFLP，其主要原理是通过应用特异性限制性内切酶消化PCR扩增产物，并根据消化位点是否消失来判断其变异存在与否。但该方法操作复杂，样本量多时易造成PCR产物的交叉污染且容易出现酶切不充分或酶切过度而出现假阴性或假阳性结果，可靠性低。多重PCR方法尽管特异性有所提高，但是这种方法的原理仍然是基于普通PCR的原理，引物特异性以及低保真Taq酶等这些因素均可造成对结果的影响。DNA测序法虽然是目前进行基因诊断的金标准，但步骤繁琐，过程复杂，试剂价格昂贵，容易出现样本间的交叉污染而导致测序失败；另外测序仪的装备也超出了一般临床检验实验室的承受范围。高分辨率熔解曲线法是一种快速，简便，经济，实用的分型方法，但基因分型依赖于仪器温度控制的精密性，假阳性高。Taqman探针的方法采用特异性的荧光标记的探针，特异性强，灵敏度高且操作方便、快速，该方法同样被认为是SNP分型的金标准，在临床应用的前景值得期待。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供用于检测叶酸代谢相关基因MTHFR和/或MTRR遗传变异的引物和探针及试剂盒。
为了解决以上技术问题，在本发明的一个方面，提供检测或辅助检测叶酸代谢相关基因的探针，包括如下第(1)-(3)组探针中的至少一组：
第(1)组探针：
具有SEQ ID NO:3所示序列的TaqMan探针A1和具有SEQ ID NO:4所示序列的TaqMan探针B1，所述TaqMan探针A1和所述TaqMan探针B1的荧光基团不同；
第(2)组探针：
具有SEQ ID NO:7所示序列的TaqMan探针A2和具有SEQ ID NO:8所示序列的TaqMan探针B2，所述TaqMan探针A2和所述TaqMan探针B2的荧光基团不同；
第(3)组探针：
具有SEQ ID NO:11所示序列的TaqMan探针A3和具有SEQ ID NO:12所示序列的TaqMan探针B3，所述TaqMan探针A3和所述TaqMan探针B3的荧光基团不同；
优选地，所述叶酸代谢相关基因为MTHFR基因和/或MTRR基因，所述第(1)组探针用于检测或辅助检测MTHFR基因的C677T(rs1801133)位点的基因型，所述第(2)组探针用于检测或辅助检测MTHFR基因的A1298C(rs1801131)位点的基因型，所述第(3)组探针用于检测或辅助检测MTRR基因的A66G(rs1801394)位点的基因型。
在一个优选的实施方案中，上述探针中，所述TaqMan探针的荧光基团为FAM或HEX，淬灭基团为BHQ2。
在一个优选的实施方案中，上述任一所述的探针中，所述TaqMan探针A1、所述TaqMan探针A2和所述TaqMan探针A3的荧光基团均为FAM；
所述TaqMan探针B1、所述TaqMan探针B2和所述TaqMan探针B3的荧光基团均为HEX。
为了解决以上技术问题，在本发明的另一个方面，提供一种检测或辅助检测叶酸代谢相关基因的试剂盒，该试剂盒包含上述任一所述的探针；
优选地，所述叶酸代谢相关基因为MTHFR基因和/或MTRR基因。
在一个优选的实施方案中，上述试剂盒中，所述试剂盒还包含如下第i-iii组引物对中的至少一组：
第i组引物对：
SEQ ID NO:1所示的DNA分子和SEQ ID NO:2所示的DNA分子；
第ii组引物对：
SEQ ID NO:5所示的DNA分子和SEQ ID NO:6所示的DNA分子；
第iii组引物对：
SEQ ID NO:9所示的DNA分子和SEQ ID NO:10所示的DNA分子；
优选地，所述第i组引物对和所述第(1)组探针用于检测或辅助检测MTHFR基因的C677T(rs1801133)位点的基因型，所述第ii组引物对和所述第(2)组探针用于检测或辅助检测MTHFR基因的A1298C(rs1801131)位点的基因型，所述第iii组引物对和所述第(3)组探针用于检测或辅助检测MTRR基因的A66G(rs1801394)位点的基因型。
为了解决以上技术问题，在本发明的另一个方面，提供一种检测或辅助检测叶酸代谢相关基因的方法，包括如下步骤：
(1)建立如下荧光定量PCR反应体系1-3中的至少一种：
荧光定量PCR反应体系1：以待测样本的基因组DNA为模板，以上述第i组引物对为引物并且以上述任一所述的第(1)组探针为探针；
荧光定量PCR反应体系2：以待测样本的基因组DNA为模板，以上述第ii组引物对为引物并且以上述任一所述的第(2)组探针为探针；
荧光定量PCR反应体系3：以待测样本的基因组DNA为模板，以上述第iii组引物对为引物并且以上述任一所述的第(3)组探针为探针；
优选地，所述荧光定量PCR反应体系1检测或辅助检测MTHFR基因的C677T(rs1801133)位点的基因型；所述荧光定量PCR反应体系2检测或辅助检测MTHFR基因的A1298C(rs1801131)位点的基因型；所述荧光定量PCR反应体系3检测或辅助检测MTRR基因的A66G(rs1801394)位点的基因型；
(2)将步骤(1)建立的荧光定量PCR反应体系进行荧光定量PCR，在延伸期采集荧光信号，具体可以采用Roche LightCycler480进行荧光定量PCR；
(3)根据荧光信号的强弱进行基因型判定。
在一个优选的实施方案中，上述方法中，步骤(1)中，荧光定量PCR反应体系1-3使用的探针中TaqMan探针A1、TaqMan探针A2和TaqMan探针A3的荧光基团均为FAM，TaqMan探针B1、TaqMan探针B2和TaqMan探针B3的荧光基团均为HEX；荧光定量PCR反应体系具有如下组成：20μl的Mix2、2μl的浓度为5μM的引物和1.25μM的探针、2μl的20μg/μl的模板和1μl的ddH2O；
所述Mix2按照如下体积份的试剂配制而成：0.2份的Taq DNA Polymerase、0.4份的10mM的dNTP Mix、1.5份的10*BUFFER((NH4)2SO4))、2.0份的25mM的MgCl2和11.9份的ddH2O；
所述Taq DNA Polymerase、10*BUFFER((NH4)2SO4))和25mM的MgCl2优选为Thermoscientific产品，产品目录号为EP0406，10mM的dNTP Mix优选为Thermo scientific产品，产品目录号为R0193。
在一个优选的实施方案中，上述任一所述的方法中，步骤(2)中，荧光定量PCR的扩增条件如下：第一阶段：95℃，2min，1个循环；第二阶段：95℃15s，60℃30s，40个循环；第三阶段：72℃5分钟，1个循环；在第二阶段的60℃时收集FAM和HEX信号，分别得到465nm-510nm和535nm-580nm的荧光值。
在一个优选的实施方案中，上述任一所述的方法中，步骤(3)中，基因型按照如下方法判定：荧光定量PCR反应体系1中，如果待测样本的535nm-580nm的荧光值大于2.0并且465nm-510nm的荧光值小于2.0，则该待测样本的MTHFR基因的C677T(rs1801133)位点的基因型判定为TT；如果待测样本的535nm-580nm的荧光值大于2.0并且465nm-510nm的荧光值大于2.0，则该待测样本的MTHFR基因的C677T(rs1801133)位点的基因型判定为CT；如果待测样本的535nm-580nm的荧光值小于2.0并且465nm-510nm的荧光值大于2.0，则该待测样本的MTHFR基因的C677T(rs1801133)位点的基因型判定为CC；
荧光定量PCR反应体系2中，如果待测样本的535-580的荧光值大于2.0并且465-510的荧光值小于2.0，则该待测样本的MTHFR基因的A1298C(rs1801131)位点的基因型判定为CC；如果待测样本的535-580的荧光值大于2.0并且465-510的荧光值大于2.0，则该待测样本的MTHFR基因的A1298C(rs1801131)位点的基因型判定为AC；如果待测样本的535-580的荧光值小于2.0并且465-510的荧光值大于2.0，则该待测样本的MTHFR基因的A1298C(rs1801131)位点的基因型判定为AA；
荧光定量PCR反应体系3中，如果待测样本的535-580的荧光值大于2.0并且465-510的荧光值小于2.0，则该待测样本的MTRR基因A66G(rs1801394)位点的基因型判定为GG；如果待测样本的535-580的荧光值大于2.0并且465-510的荧光值大于2.0，则该待测样本的MTRR基因A66G(rs1801394)位点的基因型判定为AG；如果待测样本的535-580的荧光值小于2.0并且465-510的荧光值大于2.0，则该待测样本的MTRR基因A66G(rs1801394)位点的基因型判定为AA。
为了解决以上技术问题，在本发明的另一个方面，提供上述任一所述的探针或上述任一所述的试剂盒在检测或辅助检测叶酸代谢相关基因中的应用；
优选地，所述叶酸代谢相关基因为MTHFR基因和/或MTRR基因。
一方面，本发明通过采用该引物(寡核苷酸序列)组合与相应的TaqMan探针混合进行多重荧光PCR检测荧光信号的有无或强弱来判断MTHFR/MTRR是否有遗传变异突变点，具有较高的灵敏度和较强的特异性。
另一方面，本发明提供的引物是针对中国人特有序列设计，具有更高的特异性，避免了假阳性、假阴性的出现，能有效地检测MTHFR/MTRR遗传变异突变点。
采用本发明的引物、探针和试剂盒能够使临床医生获知孕妇、备孕夫妇或高血压患者叶酸代谢能力情况，有助于临床医生采取正确的叶酸服用剂量，降低出生缺陷和高血压患者中风风险。
总之，本发明对叶酸代谢能力相关基因突变的检测方法具有特异性强、灵敏度高、受污染小、操作简单快速、安全性能高等优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，尤其适合直接以全血作为检测样本，直接进行相关基因突变检测。本发明可以精准地对叶酸代谢能力进行判断，提供个体化叶酸服用和增补剂量，具有重要价值。
附图说明
图1为96个随机样本的MTHFR基因C677T多态性分布。
图2为96个随机样本的MTHFR基因A1298C多态性分布。
图3为96个随机样本的MTRR基因A66G多态性分布。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1
一、设计并合成引物和探针
根据NCBI数据库中MTHFR基因C677T(rs1801133)、A1298C(rs1801131)和MTRR基因A66G(rs1801394)中特异性位点设计并合成表1的引物和探针。
表1引物和探针
注：表1中，FAM为6-羧基荧光素标记的荧光基团；HEX为六氯-6-甲基荧光素标记的荧光基团；BHQ 2为黑洞猝灭剂2。
二、荧光定量PCR
以随机抽取的人外周血作为95个待测样本并且以水为空白样本，提取基因组DNA。以待测样本和空白样本的基因组DNA为模板，加入表1中针对MTHFR基因C677T的引物和探针组合(引物MTHFR-677-HRM-F和MTHFR-677-HRM-R以及探针MTHFR-C677C-FAM和MTHFR-T677T-HEX)或针对MTHFR基因A1298C的引物和探针组合(引物MTHFR-1298-HRM-F和MTHFR-1298-HRM-R以及探针MTHFR-A1298A-FAM和MTHFR-C1298C-HEX)或针对MTRR基因A66G的引物和探针组合(引物MTRR-66-HRM-F和MTRR-66-HRM-R以及探针MTRR-A66A-FAM和MTRR-G66G-HEX)，采用Roche LightCycler480进行荧光定量PCR。
荧光定量PCR扩增体系(25μl体系)如下：
Mix2的配方如表2所示：
表2
荧光定量PCR扩增条件：第一阶段：95℃，2min(1个循环)；第二阶段：95℃15s，60℃30s，(40个循环)；第三阶段：72℃5分钟，(1个循环)。在第二阶段的60℃时收集HEX和FAM信号，得到535nm-580nm的荧光值和465nm-510nm的荧光值，分别记作fluorescence(535-580)和fluorescence(465-510)。
利用LightCycler480_Software，进行Endpoint Genotyping分析，得到样本的MTHFR基因C677T多态性分布、MTHFR基因A1298C多态性分布和MTRR基因A66G多态性分布，分别如图1、2和3所示，图上的点与样本一一对应。
三、结果分析
1、MTHFR基因的C677T(rs1801133)位点的基因型的判定：
根据图1，如果样本的fluorescence(535-580)大于2.0并且fluorescence(465-510)小于2.0，则该样本的MTHFR基因的C677T(rs1801133)位点的基因型判定为TT；如果样本的fluorescence(535-580)大于2.0并且fluorescence(465-510)大于2.0，则该样本的MTHFR基因的C677T(rs1801133)位点的基因型判定为CT；如果样本的fluorescence(535-580)小于2.0并且fluorescence(465-510)大于2.0，则该样本的MTHFR基因的C677T(rs1801133)位点的基因型判定为CC。
根据该判定原则，样本的MTHFR基因的C677T(rs1801133)位点的基因型如表3所示。
表3
2、MTHFR基因的A1298C(rs1801131)位点的基因型的判定：
根据图2，如果样本的fluorescence(535-580)大于2.0并且fluorescence(465-510)小于2.0，则该样本的MTHFR基因的A1298C(rs1801131)位点的基因型判定为CC；如果样本的fluorescence(535-580)大于2.0并且fluorescence(465-510)大于2.0，则该样本的MTHFR基因的A1298C(rs1801131)位点的基因型判定为AC；如果样本的fluorescence(535-580)小于2.0并且fluorescence(465-510)大于2.0，则该样本的MTHFR基因的A1298C(rs1801131)位点的基因型判定为AA。
根据该判断原则，样本的MTHFR基因的A1298C(rs1801131)位点的基因型如表4所示。
表4
3、MTRR基因A66G(rs1801394)位点的基因型的判定：
根据图3，如果样本的fluorescence(535-580)大于2.0并且fluorescence(465-510)小于2.0，则该样本的MTRR基因A66G(rs1801394)位点的基因型判定为GG；如果样本的fluorescence(535-580)大于2.0并且fluorescence(465-510)大于2.0，则该样本的MTRR基因A66G(rs1801394)位点的基因型判定为AG；如果样本的fluorescence(535-580)小于2.0并且fluorescence(465-510)大于2.0，则该样本的MTRR基因A66G(rs1801394)位点的基因型判定为AA。
根据该判定原则，样本的MTRR基因A66G(rs1801394)位点的基因型如表5所示。
表5
将所有样本进行Sanger测序(碱基突变检测的金标准)，显示Sanger测序得到的MTHFR基因的C677T(rs1801133)位点的基因型、MTHFR基因的A1298C(rs1801131)位点的基因型和MTRR基因A66G(rs1801394)位点的基因型与根据本发明判定得到的表3、4和5的基因型完全一致。并且三次重复该实施例，结果均保持不变。
序列表
<110> 济南源创医学检验有限公司
<120> 用于检测叶酸代谢相关基因的引物和探针及试剂盒与应用
<130> DSP1F182060XN
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcacttcaac gtgaaggtgt c 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggcttcac attgcggaag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgccgcagcc gatatcttca 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgcgcgactc gaatacatca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tacctgaaca gcacgtcttc 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
actcgagcat cattcactct g 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agcagtgaag atagagtcat t 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acgagtgaag caagtctctt t 21
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tacactgcag gtacatgc 18
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
catctgtaac gactctagcc 20
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
catgctcact tatatctact gc 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctagctcact cattacatct gc 22
Claims (10)
1.检测或辅助检测叶酸代谢相关基因的探针，包括如下第(1)-(3)组探针中的至少一组：
第(1)组探针：
具有SEQ ID NO:3所示序列的TaqMan探针A1和具有SEQ ID NO:4所示序列的TaqMan探针B1，所述TaqMan探针A1和所述TaqMan探针B1的荧光基团不同；
第(2)组探针：
具有SEQ ID NO:7所示序列的TaqMan探针A2和具有SEQ ID NO:8所示序列的TaqMan探针B2，所述TaqMan探针A2和所述TaqMan探针B2的荧光基团不同；
第(3)组探针：
具有SEQ ID NO:11所示序列的TaqMan探针A3和具有SEQ ID NO:12所示序列的TaqMan探针B3，所述TaqMan探针A3和所述TaqMan探针B3的荧光基团不同；
优选地，所述叶酸代谢相关基因为MTHFR基因和/或MTRR基因，所述第(1)组探针用于检测或辅助检测MTHFR基因的C677T(rs1801133)位点的基因型，所述第(2)组探针用于检测或辅助检测MTHFR基因的A1298C(rs1801131)位点的基因型，所述第(3)组探针用于检测或辅助检测MTRR基因的A66G(rs1801394)位点的基因型。
2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于：所述TaqMan探针的荧光基团为FAM或HEX，淬灭基团为BHQ2。
3.根据权利要求1或2所述的探针，其特征在于：所述TaqMan探针A1、所述TaqMan探针A2和所述TaqMan探针A3的荧光基团均为FAM；
所述TaqMan探针B1、所述TaqMan探针B2和所述TaqMan探针B3的荧光基团均为HEX。
4.一种检测或辅助检测叶酸代谢相关基因的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1-3任一项所述的探针；
优选地，所述叶酸代谢相关基因为MTHFR基因和/或MTRR基因。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含如下第i-iii组引物对中的至少一组：
第i组引物对：
SEQ ID NO:1所示的DNA分子和SEQ ID NO:2所示的DNA分子；
第ii组引物对：
SEQ ID NO:5所示的DNA分子和SEQ ID NO:6所示的DNA分子；
第iii组引物对：
SEQ ID NO:9所示的DNA分子和SEQ ID NO:10所示的DNA分子；
优选地，所述第i组引物对和所述第(1)组探针用于检测或辅助检测MTHFR基因的C677T(rs1801133)位点的基因型，所述第ii组引物对和所述第(2)组探针用于检测或辅助检测MTHFR基因的A1298C(rs1801131)位点的基因型，所述第iii组引物对和所述第(3)组探针用于检测或辅助检测MTRR基因的A66G(rs1801394)位点的基因型。
6.一种检测或辅助检测叶酸代谢相关基因的方法，包括如下步骤：
(1)建立如下荧光定量PCR反应体系1-3中的至少一种：
荧光定量PCR反应体系1：以待测样本的基因组DNA为模板，以权利要求5中所述的第i组引物对为引物并且以权利要求1-3任一项中所述的第(1)组探针为探针；
荧光定量PCR反应体系2：以待测样本的基因组DNA为模板，以权利要求5中所述的第ii组引物对为引物并且以权利要求1-3任一项中所述的第(2)组探针为探针；
荧光定量PCR反应体系3：以待测样本的基因组DNA为模板，以权利要求5中所述的第iii组引物对为引物并且以权利要求1-3任一项中所述的第(3)组探针为探针；
优选地，所述荧光定量PCR反应体系1检测或辅助检测MTHFR基因的C677T(rs1801133)位点的基因型，所述荧光定量PCR反应体系2检测或辅助检测MTHFR基因的A1298C(rs1801131)位点的基因型，所述荧光定量PCR反应体系3检测或辅助检测MTRR基因的A66G(rs1801394)位点的基因型；
(2)将步骤(1)建立的荧光定量PCR反应体系进行荧光定量PCR，在延伸期采集荧光信号；
(3)根据荧光信号的强弱进行基因型判定。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，荧光定量PCR反应体系1-3使用的探针为权利要求3所述的探针，荧光定量PCR反应体系具有如下组成：20μl的Mix2、2μl的浓度为5μM的引物和1.25μM的探针、2μl的20μg/μl的模板和1μl的ddH2O；
所述Mix2按照如下体积份的试剂配制而成：0.2份的Taq DNA Polymerase、0.4份的10mM的dNTP Mix、1.5份的10*BUFFER((NH4)2SO4))、2.0份的25mM的MgCl2和11.9份的ddH2O。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，荧光定量PCR的扩增条件如下：第一阶段：95℃，2min，1个循环；第二阶段：95℃15s，60℃30s，40个循环；第三阶段：72℃5分钟，1个循环；在第二阶段的60℃时收集FAM和HEX信号，分别得到465nm-510nm和535nm-580nm的荧光值。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，基因型按照如下方法判定：荧光定量PCR反应体系1中，如果待测样本的535nm-580nm的荧光值大于2.0并且465nm-510nm的荧光值小于2.0，则该待测样本的MTHFR基因的C677T(rs1801133)位点的基因型判定为TT；如果待测样本的535nm-580nm的荧光值大于2.0并且465nm-510nm的荧光值大于2.0，则该待测样本的MTHFR基因的C677T(rs1801133)位点的基因型判定为CT；如果待测样本的535nm-580nm的荧光值小于2.0并且465nm-510nm的荧光值大于2.0，则该待测样本的MTHFR基因的C677T(rs1801133)位点的基因型判定为CC；
荧光定量PCR反应体系2中，如果待测样本的535-580的荧光值大于2.0并且465-510的荧光值小于2.0，则该待测样本的MTHFR基因的A1298C(rs1801131)位点的基因型判定为CC；如果待测样本的535-580的荧光值大于2.0并且465-510的荧光值大于2.0，则该待测样本的MTHFR基因的A1298C(rs1801131)位点的基因型判定为AC；如果待测样本的535-580的荧光值小于2.0并且465-510的荧光值大于2.0，则该待测样本的MTHFR基因的A1298C(rs1801131)位点的基因型判定为AA；
荧光定量PCR反应体系3中，如果待测样本的535-580的荧光值大于2.0并且465-510的荧光值小于2.0，则该待测样本的MTRR基因A66G(rs1801394)位点的基因型判定为GG；如果待测样本的535-580的荧光值大于2.0并且465-510的荧光值大于2.0，则该待测样本的MTRR基因A66G(rs1801394)位点的基因型判定为AG；如果待测样本的535-580的荧光值小于2.0并且465-510的荧光值大于2.0，则该待测样本的MTRR基因A66G(rs1801394)位点的基因型判定为AA。
10.权利要求1-3任一项所述的探针或权利要求4或5所述的试剂盒在检测或辅助检测叶酸代谢相关基因中的应用；
优选地，所述叶酸代谢相关基因为MTHFR基因和/或MTRR基因。
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