CN101333558A - 5氟尿嘧啶药物敏感基因芯片检测试剂盒 - Google Patents

5氟尿嘧啶药物敏感基因芯片检测试剂盒 Download PDF

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CN101333558A CNA2007100431746A CN200710043174A CN101333558A CN 101333558 A CN101333558 A CN 101333558A CN A2007100431746 A CNA2007100431746 A CN A2007100431746A CN 200710043174 A CN200710043174 A CN 200710043174A CN 101333558 A CN101333558 A CN 101333558A
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xrcc1
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gstpi
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穆海东
汪宁梅
杜喜玲
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Abstract

本发明提供一种5氟尿嘧啶药物敏感基因芯片检测试剂盒，可用于平行经济地检测与5氟尿嘧啶药物敏感的相关基因。该试剂盒包括抽提液、杂交缓冲液、洗液、扩增液、Taq酶、基因芯片，所述的扩增液含有扩增4个含突变位点基因的引物，分别是含IVS14 A/G突变位点的DPD基因，含Ile105Val突变位点的GSTPi基因，含C677T突变位点的MTHFR基因，含Arg399Glu突变位点的XRCC1基因。5氟尿嘧啶是一种一线抗肿瘤化疗药物，本发明可用于检测对5氟尿嘧啶药物敏感的上述4个基因突变情况。

Description

5氟尿嘧啶药物敏感基因芯片检测试剂盒
技术领域
本发明属于临床检测的基因芯片技术领域，具体地说涉及一种5氟尿嘧啶药物敏感基因芯片检测试剂盒。
背景技术
5氟尿嘧啶是一种一线抗肿瘤化疗药物。5氟尿嘧啶所涉及的药物敏感基因有DPD(二氢尿嘧啶脱氢酶基因)，GSTPi(谷胱苷肽转移酶i)，MTHFR(5，10亚甲基四氢叶酸还原酶)和XRCC1(X线修复交叉互补蛋白1)四个基因。
二氢嘧啶脱氢酶是一种主要参与嘧啶分解代谢的酶，是5氟尿嘧啶代谢的限速酶。该基因第14内含子的第一个碱基由G变为A将会引起mRNA剪切变化，造成第14外显子165个碱基的缺失，从而使该酶失活，进而影响5氟尿嘧啶这种药物的分解代谢，造成有毒药物在体内的积累而引起严重的毒副作用。AA基因型癌症患者接受5氟尿嘧啶治疗会产生强烈的毒副作用甚至致死，AG基因型患者接受5氟尿嘧啶治疗也会引发很强的毒副作用。
谷胱甘肽S转移酶Pi基因编码发生变化，编码基因发生改变后105位由异亮氨酸变为缬氨酸的谷胱甘肽S转移酶Pi酶活降低，而低酶活则降低了化疗药物的失活，从而提高化疗药物5氟尿嘧啶、草酸铂的疗效，增加GG基因型患者在化疗中的生存，而化疗药物对AG基因型患者也比AA基因型患者的疗效提高许多。
5氟尿嘧啶进入体内后经胸苷激酶催化后与5，10亚甲基四氢叶酸形成共价络合物干扰DNA的合成于修复从而产生抗癌作用。MTHFR主要催化5，10亚甲基四氢叶酸还原为5甲基四氢叶酸。因此5，10亚甲基四氢叶酸还原酶的活性将直接影响体内5，10亚甲基四氢叶酸的浓度。MTHFR基因的677位碱基由C变为T导致该酶222位上由丙氨酸变为缬氨酸，从而影响该酶活性，使该酶活性降低，体内5，10亚甲基四氢叶酸浓度相应提高，增强5氟尿嘧啶的抗癌作用。TT纯合子的患者对5氟尿嘧啶敏感。
DNA修复蛋白XRCC1：DNA修复蛋白XRCC1与多核苷酸激酶、DNA聚合酶β、DNA连接酶III作用，共同参与DNA修复系统中碱基切除修复。该基因发生突变后399位的精氨酸变为谷氨酰氨降低了XRCC1的DNA的修复能力从而造成5氟尿嘧啶和奥沙利铂化疗药物对GA杂合子和AA纯合子的患者疗效不佳，易在化疗过程中诱发治疗性急性白血病。
目前用于检测5氟尿嘧啶单位点突变的方法主要有：测序法，这是最直接，最准确的方法；荧光定量PCR法，和单碱基延伸法。这些方法所需要的设备仪器都价格昂贵，技术复杂，从经济上考虑不适于用作常规方法加以推广。
发明内容
为了对5氟尿嘧啶药物敏感的相关基因进行平行检测，对大量样本进行同时分析，并考虑经济推广的可行性，本发明提供一种5氟尿嘧啶药物敏感基因芯片检测试剂盒，包括抽提液、杂交缓冲液、洗液、扩增液、Taq酶、基因芯片；其特征在于，所含的扩增液含有扩增4个含突变位点基因的引物，分别是含IVS14 A/G突变位点的DPD基因，含Ile105Val突变位点的GSTPi基因，含C677T突变位点的MTHFR基因，含Arg399Glu突变位点的XRCC1基因。
所述的5氟尿嘧啶药物敏感基因芯片检测试剂盒，扩增液可以包含以下一组序列的引物：
DPD-1：CCTGGACAAAGCTCCTTT
DPD-2：AAGCAACTGGCAGATTC
GSTPi-1：TATGGGAAGGACCAGC
GSTPi-2：GGTGCAGATGCTCACA
MTHFR-1：CCTGAAGCACTTGAAGGA
MTHFR-2：TTCACAAAGCGGAAGA
XRCC1-1：AAGGAGTGGGTGCTGGA
XRCC1-2：TTGCCCAGCACAGGAT
所述的5氟尿嘧啶药物敏感基因芯片检测试剂盒，还可以包括扩增液B，扩增液B中包含如下序列的ASPE(Allele-Specific Primer Extension，即等位基因特特性引物延伸)引物：
DPD-G：5’-GCTGACTTTCCAGACAACG
DPD-A：5’-GCTGACTTTCCAGACAACA
GSTPi-A：5’-TGACCTCCGCTGCAAATACA
GSTPi-G：5’-TGACCTCCGCTGCAAATACG
MTHFR-C：5’-AGGTGTCTGCGGGAGC
MTHFR-T：5’-AGGTGTCTGCGGGAGT
XRCC1-A：5’-CGGCTGCCCTCCCA
XRCC1-G：5’-CGGCTGCCCTCCCG
所述的5氟尿嘧啶药物敏感基因芯片检测试剂盒，扩增液B中包含的ASPE引物还可以是含有5’-端检测定位序列的如下序列：
DPD-tag-G：5’-CTTTATCAATACATACTAGCTGACTTTCCAGACAACG
DPD-tag-A：5’-TACATTACCAATAATCTTGCTGACTTTCCAGACAACA
GSTPi-tag-A：5’-TCAACAATCTTTTACAATGACCTCCGCTGCAAATACA
GSTPi-tag-G：5’-AATCCTTTTACATTCATTGACCTCCGCTGCAAATACG
MTHFR-tag-C：5’-CTTTAATCCTTTATCACTTTAGGTGTCTGCGGGAGC
MTHFR-tag-T：5’-TCAATCAATTACTTACTCAAAGGTGTCTGCGGGAGT
XRCC1-tag-A：5’-TTACTCAAAATCTACACTTTTTCGGCTGCCCTCCCA
XRCC1-tag-G：5’-CTACAAACAAACAAACATTATCCGGCTGCCCTCCCG
所述的5氟尿嘧啶药物敏感基因芯片检测试剂盒，扩增液B含有生物素标记的dCTP。
所述的5氟尿嘧啶药物敏感基因芯片检测试剂盒，所含的基因芯片上的探针序列可以是以下序列：
pos1：TGATTGTAGTATGTATTGATAAAG
pos2：GATTTGAAGATTATTGGTAATGTA
pos3：GATTTGATTGTAAAAGATTGTTGA
pos4：GTAAGTAATGAATGTAAAAGGATT
pos5：TGATAAAGTGATAAAGGATTAAAG
pos6：GTATTTGAGTAAGTAATTGATTGA
pos7：TGAAAAAGTGTAGATTTTGAGTAA
pos8：T T GATAAT GTTTGTTTGTTT GTAG
该试剂盒通过将5氟尿嘧啶所涉及的药物敏感基因DPD(二氢尿嘧啶脱氢酶基因)，GSTPi(谷胱苷肽转移酶i)，MTHFR(5，10亚甲基四氢叶酸还原酶)和XRCC1四个基因结合在一起，达到对相关基因进行平行检测的目的。另外通过将ASPE法与化学发光法相结合，检测单位点突变，优点在于：(1)结果准确，(2)通量大，(3)背景低，(4)操作简便，(5)无需大型仪器。
附图说明
图1为5氟尿嘧啶药物敏感基因芯片检测试剂盒应用流程图
图2为试剂盒中所含5氟尿嘧啶药物敏感基因检测芯片示意图
具体实施方式
下面结合附图和举例说明本发明目的的实施。
实施例子：
1.样本处理
用口腔粘膜脱落细胞作为样本来源，进行基因组DNA抽提。抽提使用博大泰克的细胞基因组抽提试剂盒。
2.芯片制备，将文献中已有标记定位探针在超平玻片上点样，探针序列如下：
pos1：TGATTGTAGTATGTATTGATAAAG
pos2：GATTTGAAGATTATTGGTAATGTA
pos3：GATTTGATTGTAAAAGATTGTTGA
pos4：GTAAGTAATGAATGTAAAAGGATT
pos5：TGATAAAGTGATAAAGGATTAAAG
pos6：GTATTTGAGTAAGTAATTGATTGA
pos7：TGAAAAAGTGTAGATTTTGAGTAA
pos8：TTGATAATGTTTGTTTGTTTGTAG
3.引物设计：
(1)设计以下引物序列组A，用以扩增含突变位点的与5氟尿嘧啶所涉及的药物敏感相关的基因片断，包括有DPD(二氢尿嘧啶脱氢酶基因)，GSTPi(谷胱苷肽转移酶i)，MTHFR(5，10亚甲基四氢叶酸还原酶)和XRCC1四个基因。
DPD-1：CCTGGACAAAGCTCCTTT
DPD-2：AAGCAACTGGCAGATTC
GSTPi-1：TATGGGAAGGACCAGC
GSTPi-2：GGTGCAGATGCTCACA
MTHFR-1：CCTGAAGCACTTGAAGGA
MTHFR-2：TTCACAAAGCGGAAGA
XRCC1-1：AAGGAGTGGGTGCTGGA
XRCC1-2：TTGCCCAGCACAGGAT
(2)设计以下ASPE引物序列组B，用以扩增含突变位点的序列，同时引进用于基因检测定位的标记序列，以便与芯片上相应的定位探针杂交，从而获得检测结果。
DPD-tag-G：5’-CTTTATCAATACATACTAGCTGACTTTCCAGACAACG
DPD-tag-A：5’-TACATTACCAATAATCTTGCTGACTTTCCAGACAACA
GSTPi-tag-A：5’-TCAACAATCTTTTACAATGACCTCCGCTGCAAATACA
GSTPi-tag-G：5’-AATCCTTTTACATTCATTGACCTCCGCTGCAAATACG
MTHFR-tag-C：5’-CTTTAATCCTTTATCACTTTAGGTGTCTGCGGGAGC
MTHFR-tag-T：5’-TCAATCAATTACTTACTCAAAGGTGTCTGCGGGAGT
XRCC1-tag-A：5’-TTACTCAAAATCTACACTTTTTCGGCTGCCCTCCCA
XRCC1-tag-G：5’-CTACAAACAAACAAACATTATCCGGCTGCCCTCCCG
4.PCR扩增待测片断并引入生物素标记。用引物序列组A扩增含待测突变位点的序列，用ASPE引物序列组B扩增含突变位点的序列，扩增时加入含生物素标记的dCTP，以此引入对样本产物检测所需的生物素标记。
5.杂交检测
按以下步骤对得到的相应样本产物进行杂交检测：
(1)将扩增得到的标记产物与杂交液(5×SSC，0.2％SDS)以1∶6的比例混合，加入反应区域，50ul。
(2)42℃保温保湿反应60分钟。
(3)用洗液(2×SSC，0.1％SDS)洗涤4-6次，每次2分钟，振动。
(4)加入HRP标记的亲和素反应液，50ul。
(5)在42℃反应15-20min。
(6)用洗液(2×SSC，0.1％SDS)洗涤4-6次，每次2分钟，晃动。
(7)加检测液20ul/孔，使检测液均匀分布于反应区域。
(8)CCD检测，视发光信号强度曝光30-60秒。
6.结果判定：
依据不同指标的CutOff值，参考标准品梯度曲线，判定样本的阴阳性。
与此同时，用常规方法对测试的样本进行常规检测。结果表明，用本发明的试剂盒得出的测试结果与常规方法相同。
序列表
DPD-1：CCTGGACAAAGCTCCTTT
DPD-2：AAGCAACTGGCAGATTC
GSTPi-1：TATGGGAAGGACCAGC
GSTPi-2：GGTGCAGATGCTCACA
MTHFR-1：CCTGAAGCACTTGAAGGA
MTHFR-2：TTCACAAAGCGGAAGA
XRCC1-1：AAGGAGTGGGTGCTGGA
XRCC1-2：TTGCCCAGCACAGGAT
DPD-G：5’-GCTGACTTTCCAGACAACG
DPD-A：5’-GCTGACTTTCCAGACAACA
GSTPi-A：5’-TGACCTCCGCTGCAAATACA
GSTPi-G：5’-TGACCTCCGCTGCAAATACG
MTHFR-C：5’-AGGTGTCTGCGGGAGC
MTHFR-T：5’-AGGTGTCTGCGGGAGT
XRCC1-A：5’-CGGCTGCCCTCCCA
XRCC1-G：5’-CGGCTGCCCTCCCG
DPD-tag-G：5’-CTTTATCAATACATACTAGCTGACTTTCCAGACAACG
DPD-tag-A：5’-TACATTACCAATAATCTTGCTGACTTTCCAGACAACA
GSTPi-tag-A：5’-TCAACAATCTTTTACAATGACCTCCGCTGCAAATACA
GSTPi-tag-G：5’-AATCCTTTTACATTCATTGACCTCCGCTGCAAATACG
MTHFR-tag-C：5’-CTTTAATCCTTTATCACTTTAGGTGTCTGCGGGAGC
MTHFR-tag-T：5’-TCAATCAATTACTTACTCAAAGGTGTCTGCGGGAGT
XRCC1-tag-A：5’-TTACTCAAAATCTACACTTTTTCGGCTGCCCTCCCA
XRCC1-tag-G：5’-CTACAAACAAACAAACATTATCCGGCTGCCCTCCCG
pos1：TGATTGTAGTATGTATTGATAAAG
pos2：GATTTGAAGATTATTGGTAATGTA
pos3：GATTTGATTGTAAAAGATTGTTGA
pos4：GTAAGTAATGAATGTAAAAGGATT
pos5：TGATAAAGTGATAAAGGATTAAAG
pos6：GTATTTGAGTAAGTAATTGATTGA
pos7：TGAAAAAGTGTAGATTTTGAGTAA
pos8：TTGATAATGTTTGTTTGTTTGTAG

Claims (6)

1.一种5氟尿嘧啶药物敏感基因检测试剂盒，包括抽提液、杂交缓冲液、洗液、扩增液、Taq酶、基因芯片；其特征在于，所含的扩增液含有扩增4个含突变位点的基因，分别是含IVS14 A/G突变位点的DPD基因，含Ile105Val突变位点的GSTPi基因，含C677T突变位点的MTHFR基因，含Arg399Glu突变位点的XRCC1基因。
2.根据权利要求1所述的5氟尿嘧啶药物敏感基因检测试剂盒，其特征在于，所述的扩增液可以包含以下一组序列的引物：
DPD-1：CCTGGACAAAGCTCCTTT
DPD-2：AAGCAACTGGCAGATTC
GSTPi-1：TATGGGAAGGACCAGC
GSTPi-2：GGTGCAGATGCTCACA
MTHFR-1：CCTGAAGCACTTGAAGGA
MTHFR-2：TTCACAAAGCGGAAGA
XRCC1-1：AAGGAGTGGGTGCTGGA
XRCC1-2：TTGCCCAGCACAGGAT。
3.根据权利要求1或2所述的5氟尿嘧啶药物敏感基因检测试剂盒，其特征在于，还可以包括扩增液B，扩增液B中包含如下序列的ASPE(Allele-Specific Primer Extension，即等位基因特特性引物延伸)引物：
DPD-G：5’-GCTGACTTTCCAGACAACG
DPD-A：5’-GCTGACTTTCCAGACAACA
GSTPi-A：5’-TGACCTCCGCTGCAAATACA
GSTPi-G：5’-TGACCTCCGCTGCAAATACG
MTHFR-C：5’-AGGTGTCTGCGGGAGC
MTHFR-T：5’-AGGTGTCTGCGGGAGT
XRCC1-A：5’-CGGCTGCCCTCCCA
XRCC1-G：5’-CGGCTGCCCTCCCG
4.根据权利要求3所述的5氟尿嘧啶药物敏感基因检测试剂盒，其特征在于，所述的扩增液B中包含的ASPE引物还可以是含有5’-端检测定位序列的如下序列：
DPD-tag-G：5’-CTTTATCAATACATACTAGCTGACTTTCCAGACAACG
DPD-tag-A：5’-TACATTACCAATAATCTTGCTGACTTTCCAGACAACA
GSTPi-tag-A：5’-TCAACAATCTTTTACAATGACCTCCGCTGCAAATACA
GSTPi-tag-G：5’-AATCCTTTTACATTCATTGACCTCCGCTGCAAATACG
MTHFR-tag-C：5’-CTTTAATCCTTTATCACTTTAGGTGTCTGCGGGAGC
MTHFR-tag-T：5’-TCAATCAATTACTTACTCAAAGGTGTCTGCGGGAGT
XRCC1-tag-A：5’-TTACTCAAAATCTACACTTTTTCGGCTGCCCTCCCA
XRCC1-tag-G：5’-CTACAAACAAACAAACATTATCCGGCTGCCCTCCCG。
5.根据权利要求3或4所述的5氟尿嘧啶药物敏感基因检测试剂盒，其特征在于，所述的扩增液B含有生物素标记的dCTP。
6.根据权利要求4所述的5氟尿嘧啶药物敏感基因检测试剂盒，其特征在于，所含的基因芯片上的探针序列可以是以下一组序列：
pos1：TGATTGTAGTATGTATTGATAAAG
pos2：GATTTGAAGATTATTGGTAATGTA
pos3：GATTTGATTGTAAAAGATTGTTGA
pos4：GTAAGTAATGAATGTAAAAGGATT
pos5：TGATAAAGTGATAAAGGATTAAAG
pos6：GTATTTGAGTAAGTAATTGATTGA
pos7：TGAAAAAGTGTAGATTTTGAGTAA
pos8：TTGATAATGTTTGTTTGTTTGTAG。
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