CN108034710A - 用于检测叶酸代谢相关基因snp的引物、荧光探针及应用 - Google Patents

用于检测叶酸代谢相关基因snp的引物、荧光探针及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测叶酸代谢相关基因SNP的引物、荧光探针及应用。所提供的引物为四组，每组引物有对应的荧光探针组，分别针对rs1801133、rs1801131和rs1801394进行快速基因分型，应用本发明获得的检测结果精确可靠，且成本较低，具有较好的实用性。

Description

用于检测叶酸代谢相关基因SNP的引物、荧光探针及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地指一种用于检测叶酸代谢相关基因SNP的引物、荧光探针及应用。
背景技术
叶酸(Folic acid)是维生素B复合体之一，相当于蝶酰谷氨酸(pteroylglutamicacid，PGA)，是米切尔(H.K.Mitchell，1941)从菠菜叶中提取纯化的，故而命名为叶酸。叶酸是机体所需的重要营养素，在绿叶蔬菜、水果及动物肝脏中含量丰富。叶酸在人体内以四氢叶酸的形式起作用，四氢叶酸是一碳单位的运载体，可运载甲基、甲烯基、甲醛基等一碳单位，参与体内氨基酸、嘌呤、嘧啶的合成。因而叶酸对细胞分裂增殖、组织修复和机体发育
等都是不可缺少的营养素。
叶酸对人体的重要营养作用早在1948年即已得到证实，人类(或其他动物)如缺乏叶酸可引起巨红细胞性贫血以及白细胞减少症。此外，研究还发现，叶酸对孕妇尤其重要，叶酸缺乏会导致两种结果：第一，使同型半胱氨酸向甲硫氨酸转化出现障碍，进而导致高同型半胱氨酸血症，后者可引起血管内皮损伤、促进血管平滑肌细胞增生，引起凝血和纤溶系统功能失调，使血液处于高凝状态，也是引起妊娠高血压综合征的重要因素；第二，引起S-腺苷甲硫氨酸/S-腺苷同型半胱氨酸比值降低，抑制DNA甲基转穆酶活性和DNA甲基化，造成染色体不分离现象，引起多种胎儿畸形。经研究，在出生缺陷前五名中，有四项与叶
酸缺乏有关，即先天性心脏病、唇腭裂、脊柱裂和无脑儿。
妊娠头4周是胎儿神经管分化和形成的重要时期，此期叶酸缺乏可增加胎儿神经管畸形及早产的风险；更有研究显示，妇女在服用叶酸4周后，体内叶酸缺乏的状态才能得到明显的改善。因此，育龄妇女至少应在孕前3个月开始，适当多吃富含叶酸的食物和补充叶酸，以确保胚胎早期有一个较好的叶酸营养状态，预防胎儿神经管及其他器官畸形的发生。
育龄妇女服用叶酸增补剂时由于个人的遗传体质不同，存在叶酸代谢能力的差异，不同人群所需叶酸剂量不能一概而论。如服用剂量不足实际需求，达不到补充叶酸的效果；而盲目过量服用高浓度叶酸，会干扰孕妇的营养元素代谢，同样会影响胎儿发育，超量服用叶酸也会引起药品不良反应，反而会对孕妇和胎儿造成严重不良后果。所以不同身体状况与素质的育龄妇女必须根据自身情况，有的放矢地准备与补充所需要的叶酸。
因此，选取与育龄妇女孕前/孕期以及胎儿发育所需的叶酸代谢密切相关且研究明确的一些重要基因位点，综合利用现代科学研究成果，开发一项基于分子遗传基础的叶酸增补剂服用定量指导产品，将能够针对不同遗传体质人群提出适合其自身需求的叶酸补充剂量指导，具有很强的社会意义和广阔的市场前景。
目前检测叶酸代谢相关基因遗传多态性的最简单的方法是PCR-RFLP，其主要原理是通过应用特异性限制性内切酶消化PCR扩增产物，并根据消化位点是否消失来判断其变异存在与否。但该方法操作复杂，样本量多时易造成PCR产物的交叉污染且容易出现酶切不充分或酶切过度而出现假阴性或假阳性结果，可靠性低。多重PCR方法尽管特异性有所提高，但是这种方法的原理仍然是基于普通PCR的原理，引物特异性以及低保真Taq酶等这些因素均可造成对结果的影响。DNA测序法虽然是目前进行基因诊断的金标准，但步骤繁琐，过程复杂，试剂价格昂贵，容易出现样本间的交叉污染而导致测序失败；另外测序仪的装备也超出了一般临床检验实验室的承受范围。高分辨率熔解曲线法是一种快速，简便，经济，实用的分型方法，但基因分型依赖于仪器温度控制的精密性，假阳性高。Taqman探针的方法采用特异性的荧光标记的探针，特异性强，灵敏度高且操作方便，快速。该方法同样被认为是SNP分型的金标准，在临床应用的前景值得期待。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测叶酸代谢相关基因SNP的引物、荧光探针及应用。
为实现上述目的，本发明提供的一组用于检测叶酸代谢相关基因SNP的第一引物：所述第一引物为如下引物对：
677-F:CTGACCTGAAGCACTTGAAGGAGAA；
677-R:GGGACGATGGGGCAAGTGA；
由正向引物677-F:CTGACCTGAAGCACTTGAAGGAGAA或反向引物677-R:
GGGACGATGGGGCAAGTGA的核苷酸序列经增加、缺失或替换单个核苷酸得到的引物；
上述第一引物所对应的目的基因均为亚甲基四氢叶酸还原酶基因，以该基因为模板扩增所得DNA片段包含rs1801133[MTHFR(C677T)]位点。
本发明还提供一组与第一引物配合使用的第一荧光探针，所述第一荧光探针包含如下两条：
W677:FAM-ATGAAATCGGCTCCCGC-MGB；
M677:VIC-ATGAAATCGACTCCCGC-MGB。
本发明还提供上述第一引物和/或第一荧光探针在制备检测亚甲基四氢叶酸还原酶基因rs1801133[MTHFR(C677T)]多态性的试剂盒中的应用。
为实现上述目的，本发明提供的用于检测叶酸代谢相关基因SNP的第二引物：所述第二引物为如下引物对：
1298-F:TGAAGAGCAAGTCCCCCAAGG；
1298-R:CCACTCCAGCATCACTCACTTTG；
由正向引物1298-F:TGAAGAGCAAGTCCCCCAAGG或反向引物1298-R:
CCACTCCAGCATCACTCACTTTG的核苷酸序列经增加、缺失或替换单个核苷酸得到的引物；
上述第二引物所对应的目的基因均为亚甲基四氢叶酸还原酶基因，以该基因为模板扩增所得DNA片段包含rs1801131[MTHFR(A1298C)]位点。
本发明还提供一组与第二引物配合使用的第二荧光探针，所述第二荧光探针包含如下两条：
W1298:FAM-CAAAGACACTTTCTTCAC-MGB；
M1298:VIC-CAAAGACACTTGCTTCAC-MGB。
本发明还提供上述第二引物和/或第二荧光探针在制备检测亚甲基四氢叶酸还原酶基因rs1801131[MTHFR(A1298C)]多态性的试剂盒中的应用。
为实现上述目的，本发明提供的用于检测叶酸代谢相关基因SNP的第三引物：所述第三引物为如下引物对：
66-F:TTGAAGTGATGAGGAGGTTTCTGTT；
66-R:GATCTGCAGAAAATCCATGTACCA；
由正向引物66-F:TTGAAGTGATGAGGAGGTTTCTGTT或反向引物66-R:
GATCTGCAGAAAATCCATGTACCA的核苷酸序列经增加、缺失或替换单个核苷酸得到的引物；
上述第三引物所对应的目的基因均为甲硫氨酸合成酶还原酶，以该基因为模板扩增所得DNA片段包含rs1801394[MTRR(A66G)]位点。
本发明还提供一组与第三引物配合使用的第三荧光探针，所述第三荧光探针包含如下两条：
W66:FAM-CTCACATATTTCTTC-MGB；
M66:VIC-CTCACACATTTCTT-MGB。
本发明还提供上述第三引物和/或第三荧光探针在制备检测甲硫氨酸合成酶还原酶rs1801394[MTRR(A66G)]多态性的试剂盒中的应用。
为实现上述目的，本发明提供的用于检测叶酸代谢相关基因SNP的引物组：所述引物组包括上述第一引物、第二引物及第三引物：
所述第一引物为如下引物对：
677-F:CTGACCTGAAGCACTTGAAGGAGAA；
677-R:GGGACGATGGGGCAAGTGA；
所述第二引物为如下引物对：
1298-F:TGAAGAGCAAGTCCCCCAAGG；
1298-R:CCACTCCAGCATCACTCACTTTG；
所述第三引物为如下引物对：
66-F:TTGAAGTGATGAGGAGGTTTCTGTT；
66-R:GATCTGCAGAAAATCCATGTACCA。
本发明还提供一组与上述引物组配合使用的荧光探针组，所述荧光探针组包含如下探针：
W677:FAM-ATGAAATCGGCTCCCGC-MGB；
M677:VIC-ATGAAATCGACTCCCGC-MGB；
W1298:FAM-CAAAGACACTTTCTTCAC-MGB；
M1298:VIC-CAAAGACACTTGCTTCAC-MGB；
W66:FAM-CTCACATATTTCTTC-MGB；
M66:VIC-CTCACACATTTCTT-MGB。
本发明还提供了一种用于检测叶酸代谢相关基因SNP的荧光定量PCR试剂盒，包括2×Probe Master Mix(Taq酶、dNTPs、MgCl2、PCR buffer)、ROX参比荧光、超纯水及上述引物组、上述荧光探针组。需要说明的是，关于上述各个试剂、引物组、荧光探针组的用量，以及PCR的时间、温度参数设置均为常用技术手段，是本领域技术人员可以根据实际情况来调整的，不用以限制本发明。PCR试剂盒为市售产品。
此外，本发明虽然只提供了包括第一引物、第二引物、第三引物的引物组，及荧光探针组的组合，但是第一引物、第二引物、第三引物中任意两种的组合及应用，或与对应荧光探针的联用也应该视为本发明的保护范围。
本发明还提供了一种检测叶酸代谢相关基因SNP多态性的方法，该方法是利用上述引物组、上述荧光探针组，针对人基因组DNA进行荧光定量PCR反应，根据反应过程产生的荧光信号区分相应SNP位点的多态性。
本发明的原理：
经本发明的发明人研究发现，与叶酸代谢相关的基因包括如下三种：
1)MTHFR：编码亚甲基四氢叶酸还原酶，能够催化形成5-甲基四氢叶酸，后者参与同型半胱氨酸代谢，MTHFR基因突变会导致叶酸利用率低，同型半胱氨酸在体内积累，引起高同型半胱氨酸血症，会影响胚胎早期心血管发育。
2)MTRR：编码甲硫氨酸合成酶还原酶，能够通过还原型甲基化作用重新生成具有功能活性的甲硫氨酸合酶，MTRR突变是造成叶酸/甲基维生素缺乏症的主要病因，也是同型半胱氨酸、叶酸代谢异常的主要原因之一。
所以本发明使用了目前国际上普遍认同的TaqMan探针技术对MTHFR基因的
rs1801133位点、rs1801131位点和甲硫氨酸合成酶还原酶的
rs1801394[MTRR(A66G)]位点进行基因分型，其原理主要是，在TaqMan探针法的PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一对探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5’端标记有报告基因，3’端标记有荧光淬灭基团，当探针完整的时候，报告基因所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号，随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3’-5’外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。用两种不同荧光染料(如FAM，HEX、VIC)分别标记这一对探针，针对双等位SNP的不同基因型，就可以在一次PCR反应中完成对单个SNP位点的基因型判定。在该方法中引物长度，探针长度，引物特异性，探针特异性对检测结果的特异性和敏感性非常重要，所以需要合理的设计引物及多次科学验证才能得到较好的引物及探针。
本发明的有益效果：提供了一种快捷的叶酸代谢相关SNP的分型试剂及应用，应用本发明获得的检测结果精确可靠，且成本较低，具有较好的实用性。
附图说明
图1为本发明实施例中SNP分型结果rs1801133[MTHFR(C677T)]基因型的PCR荧光分析图。
图2为本发明实施例中SNP分型结果rs1801131[MTHFR(A1298C)]基因型的PCR荧光分析图；
图3为本发明实施例中SNP分型结果rs1801394[MTRR(A66G)]基因型的PCR荧光分析图。
图4为本发明实施例中测序结果的类型图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。
实施例
1、准备如下引物和探针：
(1)针对亚甲基四氢叶酸还原酶基因rs1801133[MTHFR(C677T)]位点的引物及荧光探针：
677-F:CTGACCTGAAGCACTTGAAGGAGAA
677-R:GGGACGATGGGGCAAGTGA
W677:FAM-ATGAAATCGGCTCCCGC-MGB
M677:VIC-ATGAAATCGACTCCCGC-MGB
(2)针对亚甲基四氢叶酸还原酶基因rs1801131[MTHFR(A1298C)]位点的引物及荧光探针：
1298-F:TGAAGAGCAAGTCCCCCAAGG
1298-R:CCACTCCAGCATCACTCACTTTG
W1298:FAM-CAAAGACACTTTCTTCAC-MGB
M1298:VIC-CAAAGACACTTGCTTCAC-MGB
(3)针对甲硫氨酸合成酶还原酶rs1801394[MTRR(A66G)]位点的引物及荧光探针：
66-F:TTGAAGTGATGAGGAGGTTTCTGTT
66-R:GATCTGCAGAAAATCCATGTACCA
W66:FAM-CTCACATATTTCTTC-MGB
M66:VIC-CTCACACATTTCTT-MGB
将上述3组引物分别与对应的探针制备成混合液，混合液中引物浓度为4μmol/L，荧光探针浓度为1μmol/L。
2、准备PCR扩增体系：
预备90个受检查人的DNA样本，每组15例样本，分6次进行检测，并对每个DNA分别加入3组引物和探针的混合液做3个PCR反应，来分别对每个SNP进行分型，所需试剂包括AceQ U+Probe Master Mix 10μl、ddH2O 8μl、荧光探针和引物混合液1μl，其余为1-20ng/μl的受检查人DNA样本1μl，总体积20μl。
3、PCR扩增程序：
PCR反应第一步：60℃、30s(采集荧光信号)；PCR反应第二步：95℃、10min；PCR反应第三步：92℃、15s；PCR反应第四步：60℃、1min(采集荧光信号)；PCR反应第五步：循环第三步第四步50次，然后60℃、30s(采集荧光信号)。
采用ABI SteponePlus荧光定量PCR仪(Applied Biosystems，美国应用生物技术有限公司)。
4、实验结果：
PCR反应结束后，应用Stepone software V2.3(Applied Biosystems，美国应用生物技术有限公司)进行分析，将得到的90例结果进行分类，其结果类型如图1～3所示，依据本发明的探针共分辨出3个SNP位点的共9种基因型。
5、试剂盒的准确性分析
为验证试剂盒检测的准确性，对90例样本进行测序验证。试剂盒检测的准确性达到了100％。测序结果的类型如图4所示。

Claims (13)

1.一组用于检测叶酸代谢相关基因SNP的第一引物：其特征在于，所述第一引物为如下引物对：
677-F:CTGACCTGAAGCACTTGAAGGAGAA；
677-R:GGGACGATGGGGCAAGTGA；
由正向引物677-F:CTGACCTGAAGCACTTGAAGGAGAA或反向引物677-R:
GGGACGATGGGGCAAGTGA的核苷酸序列经增加、缺失或替换单个核苷酸得到的引物；
上述第一引物所对应的目的基因均为亚甲基四氢叶酸还原酶基因，以该基因为模板扩增所得DNA片段包含rs1801133[MTHFR(C677T)]位点。
2.一种与权利要求1所述的用于检测叶酸代谢相关基因SNP的第一引物配合使用的第一荧光探针，其特征在于，所述第一荧光探针包含如下两条：
W677:FAM-ATGAAATCGGCTCCCGC-MGB；
M677:VIC-ATGAAATCGACTCCCGC-MGB。
3.权利要求1所述的第一引物和/或权利要求2所述第一荧光探针在制备检测亚甲基四氢叶酸还原酶基因rs1801133[MTHFR(C677T)]多态性的试剂盒中的应用。
4.用于检测叶酸代谢相关基因SNP的第二引物：其特征在于，所述第二引物为如下引物对：
1298-F:TGAAGAGCAAGTCCCCCAAGG；
1298-R:CCACTCCAGCATCACTCACTTTG；
由正向引物1298-F:TGAAGAGCAAGTCCCCCAAGG或反向引物1298-R:
CCACTCCAGCATCACTCACTTTG的核苷酸序列经增加、缺失或替换单个核苷酸得到的引物；
上述第二引物所对应的目的基因均为亚甲基四氢叶酸还原酶基因，以该基因为模板扩增所得DNA片段包含rs1801131[MTHFR(A1298C)]位点。
5.一种与权利要求4所述用于检测叶酸代谢相关基因SNP的第二引物配合使用的第二荧光探针，其特征在于，所述第二荧光探针包含如下两条：
W1298:FAM-CAAAGACACTTTCTTCAC-MGB；
M1298:VIC-CAAAGACACTTGCTTCAC-MGB。
6.权利要求4所述的第二引物和/或权利要求5所述第二荧光探针在制备检测亚甲基四氢叶酸还原酶基因rs1801131[MTHFR(A1298C)]多态性的试剂盒中的应用。
7.用于检测叶酸代谢相关基因SNP的第三引物：其特征在于，所述第三引物为如下引物对：
66-F:TTGAAGTGATGAGGAGGTTTCTGTT；
66-R:GATCTGCAGAAAATCCATGTACCA；
由正向引物66-F:TTGAAGTGATGAGGAGGTTTCTGTT或反向引物66-R:
GATCTGCAGAAAATCCATGTACCA的核苷酸序列经增加、缺失或替换单个核苷酸得到的引物；
上述第三引物所对应的目的基因均为甲硫氨酸合成酶还原酶，以该基因为模板扩增所得DNA片段包含rs1801394[MTRR(A66G)]位点。
8.一种与权利要求7所述用于检测叶酸代谢相关基因SNP的第三引物配合使用的第三荧光探针，其特征在于，所述第三荧光探针包含如下两条：
W66:FAM-CTCACATATTTCTTC-MGB；
M66:VIC-CTCACACATTTCTT-MGB。
9.权利要求7所述的第三引物和/或权利要求8所述第三荧光探针在本发明还提供上述第三引物和/或第三探针在制备检测甲硫氨酸合成酶还原酶rs1801394[MTRR(A66G)]多态性的试剂盒中的应用。
10.用于检测叶酸代谢相关基因SNP的引物组，其特征在于，所述引物组包括权利要求1所述的第一引物、权利要求4所述的第二引物及权利要求7所述的第三引物：
所述第一引物为如下引物对：
677-F:CTGACCTGAAGCACTTGAAGGAGAA；
677-R:GGGACGATGGGGCAAGTGA；
所述第二引物为如下引物对：
1298-F:TGAAGAGCAAGTCCCCCAAGG；
1298-R:CCACTCCAGCATCACTCACTTTG；
所述第三引物为如下引物对：
66-F:TTGAAGTGATGAGGAGGTTTCTGTT；
66-R:GATCTGCAGAAAATCCATGTACCA。
11.一组与权利要求10所述用于检测叶酸代谢相关基因SNP的引物组配合使用的荧光探针组，所述荧光探针组包含如下探针：
W677:FAM-ATGAAATCGGCTCCCGC-MGB；
M677:VIC-ATGAAATCGACTCCCGC-MGB；
W1298:FAM-CAAAGACACTTTCTTCAC-MGB；
M1298:VIC-CAAAGACACTTGCTTCAC-MGB；
W66:FAM-CTCACATATTTCTTC-MGB；
M66:VIC-CTCACACATTTCTT-MGB。
12.一种用于检测叶酸代谢相关基因SNP的荧光定量PCR试剂盒，包括2×Probe MasterMix(Taq酶、dNTPs、MgCl2、PCR buffer、ROX参比荧光)、超纯水及权利要求10所述的引物组、权利要求11所述的荧光探针组。
13.一种检测叶酸代谢相关基因SNP多态性的方法，该方法是利用权利要求10所述的引物组、权利要求11所述的荧光探针组，针对人基因组DNA进行荧光定量PCR反应，根据反应过程产生的荧光信号区分相应SNP位点的多态性。
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