CN107630073A - 一种叶酸代谢基因多态性位点的基因型检测方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种叶酸代谢基因多态性位点的基因型检测试剂盒及方法，首先，通过一种适用于唾液、口腔拭子等样本类型的提取方法，10分钟得到模板DNA，其次，基于多重反应体系和独特的引物设计，分别用同一份待测样本对多个叶酸代谢多态性位点进行实时荧光定量PCR检测；野生型模板在突变型ARMS引物多重反应体系中，无扩增曲线；纯合突变型模板在野生型ARMS引物多重反应体系中，无扩增曲线；杂合型突变模板在野生型ARMS引物多重反应体系和突变型ARMS引物多重反应体系中，同时有扩增曲线，以此来判定多态性位点。本发明的方法操作简单，结果判定容易，从模板的制备到实验结果分析，只需1小时，准确性高，特异性好。

Description

一种叶酸代谢基因多态性位点的基因型检测方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及基因检测领域，特别涉及一种叶酸代谢基因多态性位点的基因型检测方法及试剂盒。

背景技术

叶酸代谢与人体内许多的生化过程密切相关。一方面作为体内生化反应中碳单位转移酶系的辅酶，起着碳单位传递体的作用，另一方面参与DNA和RNA的合成、蛋白质的甲基化，此外也直接影响氨基酸的代谢。参与到叶酸代谢途径的酶有多种，包括二甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)、甲硫氨酸还原酶(MTR)、甲硫氨酸合成还原酶(MTRR)和胱硫脒β合酶(CBS)等，这些酶的某些核苷酸多态可导致叶酸代谢异常引起疾病或出生缺陷。

二甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）第677位碱基C>T变异(rs1801133)，可导致MTHFR蛋白第222位的丙氨酸被缬氨酸取代，杂合变异型(677CT)和纯合变异型(677TT)，在中国人群中的百分比分别为44％和23％，TT基因型人群高同型半胱氨酸（Hcy）水平显著升高，大量流行病和临床研究都证实TT基因型和高Hcy是脑卒中发生的独立危险因素。MTHFR第1298位碱基A>C变异(rs1801131)，可使MTHFR蛋白第433位的谷氨酰胺被丙氨酸取代，杂合变异型(1298AC) 和纯合变异型(1298CC)，在中国人群中的百分比分别为29.3％和3.9％，杂合突变型和纯合突变型相比野生型，MTHFR酶活性酶活性有所下降，甚至只能达到野生型的酶活性的30%左右，导致血清叶酸和维生素B12水平下降，血浆中同型半胱氨酸水平升高。甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)能够通过还原型甲基化作用重新生成具有功能活性的甲硫氨酸合酶，是叶酸代谢的关键酶之一。主要变异型有十余种，其中A66G是最主要和研究最多的突变。MTRR基因第66位碱基A>G变异(rs1801394)，导致MTRR蛋白氨基酸链残基22位蛋氨酸被异亮氨酸替代，引起酶的活性降低，导致同型半胱氨酸血症，增加神经管畸形和先天性心脏病等出生缺陷性疾病的发病风险。其中杂合变异型(66AG)和纯合变异型(66GG)在中国人群中占36％和6％。

叶酸是细胞生长和组织修复所必需的物质，在胚胎发育过程中，对孕妇尤其重要。据我国婚前育龄女性血清抽样调查发现，我国城市和农村女性缺乏叶酸者分别有21％和38％。据卫生部及疾控中心相关报告，我国每年有90万新生儿缺陷性疾病诞生，患出生缺陷排在前5位的包括：先天性心脏病，神经管畸形，唇腭裂，唐氏综合征，多指(趾)，这些都与孕妇叶酸缺乏有一定关系。1997年卫生部开始推荐孕期女性统一补充叶酸，剂量为400微克/天，该措施在出生缺陷预防中起了重要作用。但由于孕妇对叶酸的代谢能力不足，出生缺陷的发生率仍存在很大的地域差异。对于叶酸代谢能力正常的孕妇来说，每天补充400微克叶酸是足够的，但是对叶酸代谢能力存在障碍的孕妇来说，应该增加补充剂量，对所有成年人包括孕妇和乳母，合成叶酸制剂的可耐受的最高摄入量(UL)设定为1000微克/天。因此800微克/天的叶酸制剂是安全的。对叶酸的增补剂量并非越多越好。大量研究发现，过量补充叶酸会导致以下不良后果：导致体内锌缺乏，孕母叶酸过量补充会导致胎儿生长缓慢，出生体重过低。近年来的研究表明，叶酸代谢能力在个体间的差异与部分基因位点的多态性有关，具体位点包括：亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因的c.677位点、c.1298位点；甲硫氨酸合成还原酶(MTRR)基因的c.66位点；因此，利用基因分型技术检测孕母叶酸代谢相关基因型，对受检者叶酸利用能力进行分级，进而针对性的调整叶酸补充剂量。

当前市场上检测基因多态性的方法很多，包括如基因芯片法，基因测序，限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphisms, RFLP）等，其中基因测序为突变检测的金标准，但因其所需时间长，费用高，对取材要求严格，限制了在临床中的使用。RFLP仅适用于突变位点附近存在适当的特定限制性内切酶识别序列的情况，应用局限性较大。因此，对于患者而言，快速拿到检测结果尤为重要，所以本专利发明了一种基于实时荧光PCR方法，检测成本很低，从样本提取到结果分析，整个过程可在1小时之内完成，有望在临床上开展普筛叶酸代谢相关基因检测成为可能。

发明内容

为了解决叶酸代谢多态性的检测，本发明提供一种叶酸代谢基因多态性位点的基因型检测方法及试剂盒。

本发明整合了ARMS-PCR技术和荧光定量PCR技术。应用本发明的提取口腔拭子DNA方法在10分钟内提取可用于实时荧光PCR体系的基因组DNA，在相同反应体系(例如，包括样本DNA、ROX、TaqMan探针、dNTP、dUTP、UDG、BSA、聚合酶及缓冲液等)中，分别使用本发明的针对野生型模板的特异型性ARMS引物和针对突变型模板的特异性ARMS引物以及与所述特异性ARMS引物对应的共用上游或下游引物，用两个反应管对同一份待测样本进行检测，通过Ct值判定样本基因型，通过优化反应程序和体系，可同时对3个SNP在同一管反应液体系中进行快速检测，节约时间和成本，简化了操作，使得从提取到出报告可在1小时内完成。

本发明依据传统ARMS-PCR技术的原理，进行了增加特异型ARMS引物3`端和中间区域的错配碱基数，使得针对野生型模板的特异性ARMS引物对突变型样本不扩增，并且针对突变型模板的特异性ARMS引物对野生型样本不扩增，这样大大降低背景信号，使得结果通过Ct值更易于判断。

在一种实施方式中，本发明提供一种检测叶酸代谢基因多态性位点的基因型的方法，它包括以下步骤：

步骤1：DNA提取；方法包括如下：

（1）口腔拭子在被测者口腔左右两腮分别各上下刮20次，保证采集到足量的口腔脱落细胞样本，采集完毕，样本置于样本保存管，做好标记。

（2）将步骤（1）中的样本保存管用涡旋振荡器涡旋混匀30s，使口腔拭子中脱落细胞充分混合至保存液中；

（3）将步骤（2）的保存液全部转移至新的1.5mL离心管，然后5000g离心2min弃上清，获得细胞沉淀，此时在管底留10ul保存液，无须完全弃掉；

（4）向步骤（3）获得细胞沉淀中加入50uL浓度为40mM 的NaOH溶液，涡旋振荡10s，水浴100℃煮沸裂解6min；

（5）将步骤（4）水浴锅中的离心管取出，冰上冷却30s，然后12000g离心1min，取上清液即为提取的口腔拭子基因组DNA；

步骤2：在相同的反应体系中，使用叶酸代谢多态性位点的基因野生型模板的特异性ARMS引物和突变型模板的特异性ARMS引物分别对同一份待测样本进行实时荧光定量PCR检测；

所述野生型模板的特异性ARMS引物的3`末端终止在待测位点处并且与野生型序列匹配，其中，在所述引物的3`末端第2-5位设置一个或多个错配碱基；

所述突变型模板的特异性ARMS引物的3`末端终止在待测位点处并且与突变型序列匹配，其中，在所述引物的3`末端第2-5位设置一个或多个错配碱基；

所述野生型模板的特异性ARMS引物和所述突变型模板的特异性ARMS引物共用上游或下游引物，所述共用上游或下游引物分别与所述野生型模板的特异性ARMS引物或所述突变型模板的特异性ARMS引物一起扩增一段包含待测基因突变位点的序列；

步骤3：根据样本用野生型模板的特异性ARMS引物进行荧光定量PCR检测的Ct野生型和突变型模板的特异性ARMS引物进行ARMS荧光定量PCR检测的Ct突变型，来判断多态性位点的型别从而确定叶酸代谢基因突变的基因型。

在一种实施方式中，根据以下情况进行判断：

1. 若多重体系中无扩增信号或Ct值≥38，说明提取样本失败，需重新提取DNA检测；

2. 若多重体系中有扩增曲线呈S型曲线且20≤Ct值≤32，根据以下情况进行判断：

a) 若突变型反应体系有扩增信号且Ct值≤32且野生型反应体系无扩增信号或Ct值≥38，则判定为纯合突变型；

b) 若野生型反应体系有扩增信号且Ct值≤32且突变型反应体系无扩增信号或Ct值≥38，则判定为野生型；

c) 若突变型反应体系和野生型反应体系都有扩增信号且Ct值≤32，且两者的Ct值的差值在±2以内，则判定为杂合型；

d) 该位点的的野生型或突变型反应体系扩增曲线呈S型曲线且Ct值＞32，说明样本DNA提取浓度过低，需要重新用提取样本DNA测试。

在一种实施方式中，野生型模板的特异性ARMS引物和突变型模板的特异性ARMS引物中，引入错配碱基的位置和类型相同；优选地，除了突变位点处的碱基以外，所述野生型模板的特异性ARMS引物和所述突变型模板的特异性ARMS引物完全相同。

在一种实施方式中，叶酸代谢多态性位点是MTHFR基因rs1801131（A>C）和rs1801133（C>T），MTRR基因rs1801394（A>G）。

在一种实施方式中，检测MTHFR基因 rs1801131（A>C）点突变的野生型特异性ARMS引物是GGAGGAGCTGACCAGTGACAA (SEQ ID NO: 1)、突变型特异性ARMS引物是GGAGGAGCTGACCAGTGACAC (SEQ ID NO: 2)，和共用下游引物为 CCACTCCAGCATCACTCACTT(SEQ ID NO: 3)；和检测其的探针为 TCTCGGGAGAACCAAACCGGAATG (SEQ ID NO: 4)；

检测MTHFR基因rs1801133（C>T）点突变的野生型特异性ARMS引物是GCGTGATGATGAAATCCG (SEQ ID NO: 5)、突变型特异性ARMS引物是GCGTGATGATGAAATCCA(SEQ ID NO: 6)，和共用下游引物为GCCAGCCTCTCCTGACTGTC (SEQ ID NO: 7)；和检测其的探针为 TCCCGCAGACACCTTCTCCTTCAAGTG (SEQ ID NO: 8)；

检测MTRR基因rs1801394（A>G）点突变的野生型特异性ARMS引物是AGGCCATCGCAGAAGAAAGA (SEQ ID NO:9)、突变型特异性ARMS引物是AGGCCATCGCAGAAGAAAGG(SEQ ID NO: 10)，和共用上游引物为CTTCAAAGCACAAAACGGTAA(SEQ ID NO: 11)；和检测其的探针为 ATCCGATAAGGTTAGAGCCGTTACAGTGG (SEQ ID NO:12)；

在一种实施方式中，本发明提供在上述方法中使用的试剂盒。

在一种实施方式中，试剂盒进一步包括：ROX校正液、dNTP、dUTP、BSA、UDG、Mg²⁺离子、聚合酶及缓冲液，以及叶酸代谢基因多态性位点的基因野生型模板的特异性ARMS引物、突变型模板的特异性ARMS引物和探针等。

本发明的优点在于：与现有基因多态性检测方法相比，本发明基于特异性ARMS荧光定量PCR快速检测叶酸代谢基因多态性的试剂盒及方法不仅特异性强，敏感性高，成本低，结果高度可靠，相比之前的△Ct值法的判定，结果更易于判断，而且在操作和使用上还具有独特优势，第一，以口腔拭子为模板，应用本发明的提取口腔拭子DNA方法在10分钟内提取可用于实时荧光PCR体系的基因组DNA；第二，荧光定量PCR检测快捷方便，全程闭管检测，同时，体系中引入UDG防污染试剂，降低污染，减少了不必要的费用和工作量；第三，多重实时荧光PCR体系中加入一定浓度的BSA，能够提高模板的特异性，相比单重检测，节约了试剂成本和简化了操作步骤，方便使用。此外，特别是荧光定量PCR可以用Ct值来表征扩增效率，因此这个方法可以检测叶酸代谢样本纯合野生型、纯合突变型和杂合子基因型情况，使得结果判断可以准确可靠。

附图说明

图1为rs1801131（A>C）野生型样本分别在野生型反应液（A）和突变型反应液（B）中的荧光扩增曲线图。

图2为实施例1使用Sanger测序法对叶酸代谢样本的MTHFR 基因rs1801131（A>C）野生型测序的原始峰图。

图3为rs1801131（A>C）杂合型样本分别在野生型反应液（A）和突变型反应液（B）中的荧光扩增曲线图。

图4为实施例1使用Sanger测序法对叶酸代谢样本的MTHFR 基因rs1801131（A>C）杂合型测序的原始峰图。

图5为rs1801131（A>C）纯合突变型样本分别在野生型反应液（A）和突变型反应液（B）中的荧光扩增曲线图。

图6为实施例1使用Sanger测序法对叶酸代谢样本的MTHFR 基因rs1801131（A>C）纯合突变型测序的原始峰图。

图7 rs1801133（C>T）野生型样本分别在野生型反应液（A）和突变型反应液（B）中的荧光扩增曲线。

图8为实施例2使用Sanger测序法对叶酸代谢样本的MTHFR基因rs1801133（C>T）野生型测序的原始峰图。

图9 rs1801133（C>T）纯合突变样本分别在野生型反应液（A）和突变型反应液（B）中的荧光扩增曲线。

图10为实施例2使用Sanger测序法对叶酸代谢样本的MTHFR基因rs1801133（C>T）纯合突变型测序的原始峰图。

图11为rs1801394（A>G）野生型样本分别在野生型反应液（A）和突变型反应液（B）的荧光扩增曲线。

图12为实施例3使用Sanger测序法对叶酸代谢样本的MTRR 基因rs1801394（A>G）野生型测序的原始峰图。

图13为rs1801394（A>G）纯合突变型样本分别在野生型反应液（A）和突变型反应液（B）的荧光扩增曲线。

图14为实施例3使用Sanger测序法对叶酸代谢样本的MTRR 基因rs1801394（A>G）纯合突变型测序的原始峰图。

具体实施方式

为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合下面结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。

下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常规方法。以下实施例中，PCR缓冲液、dUTP、UDG、dNTP均随DNA聚合酶，ROX校正液购于宝生物工程（大连）有限公司，BSA、所用引物及探针均由上海生物工程技术服务有限公司合成，口腔拭子DNA提取试剂来自本公司实验室自行配置。在下列实施例中均使用口腔拭子基因组DNA提取试剂制备样本DNA。

实施例1 叶酸代谢相关的MTHFR基因rs1801131（A>C）点突变基因型的检测

本发明采用特异性ARMS引物，在实时荧光定量PCR中降低野生型特异性ARMS引物对突变型样本的扩增效率和突变型特异性ARMS引物对野生型样本的扩增效率，使得结果更易于判断。

1)特异性ARMS引物设计

实验设计了野生型特异性ARMS引物(SEQ ID NO: 1)、突变型特异性ARMS引物(SEQ IDNO: 2)，共用下游引物为rs1801131（A>C）-R(SEQ ID NO: 3)，相关参数为：Tm值55.0℃-60.0℃，GC值40.0％-60.0％，引物大小20±3bp。特异性ARMS引物序列如下：

特异性上游特异性ARMS引物：

rs1801131（A>C）WF GGAGGAGCTGACCAGTGACAA (SEQ ID NO: 1)

rs1801131（A>C）MF GGAGGAGCTGACCAGTGACAC (SEQ ID NO:2)

共用下游引物rs1801131（A>C）R ：CCACTCCAGCATCACTCACTT (SEQ ID NO: 3)；

2)探针设计

在特异性ARMS引物扩增片段内设计探针，相关参数为：Tm值68.0℃-70.0℃，GC值40.0％-70.0％，对探针进行5’端VIC标记，3’端BHQ1标记，其序列如下：

rs1801131（A>C）P探针：TCTCGGGAGAACCAAACCGGAATG (SEQ ID NO: 4)；

3)ARMS荧光定量PCR扩增反应(总体积是30ul)

PCR反应程序为：50℃ 2分钟、95℃ 2分30秒；40个循环：95℃ 15秒，55℃ 30秒（收集荧光）。所用仪器为ABI7500。

4)实验结果

平行扩增的荧光定量PCR反应中，阴性对照无扩增，说明反应体系正常，无污染。

图1中叶酸代谢待检样本rs1801131（A>C）在野生型反应液中的荧光扩增曲线为a，其Ct值为25.0；在突变型反应液中的荧光扩增曲线为b，其Ct值为40，根据判定标准，该样本为野生型样本。

图2中使用Sanger测序法对图1中叶酸代谢样本测序，原始峰图的结果显示为碱基A，说明荧光检测结果与测序结果完全一致，均为rs1801131（A>C）野生型。

图3中叶酸代谢待检样本rs1801131（A>C）在野生型反应液中的荧光扩增曲线为a，其Ct值为28.73；在突变型反应液中的荧光扩增曲线为b，其Ct值为28.35，根据判定标准，该样本为杂合型样本。

图4中使用Sanger测序法对图3中叶酸代谢样本测序，原始峰图的结果显示为碱基AC，说明荧光检测结果与测序结果完全一致，均为rs1801131（A>C）杂合型。

图5中叶酸代谢待检样本rs1801131（A>C）在野生型反应液中的荧光扩增曲线为a，其Ct值为39.2；在突变型反应液中的荧光扩增曲线为b，其Ct值为28.8，根据判定标准，该样本为纯合突变型样本。

图6中使用Sanger测序法对图5中叶酸代谢样本测序，原始峰图的结果显示为碱基C，说明荧光检测结果与测序结果完全一致，均为rs1801131（A>C）纯合突变型。

实施例2叶酸代谢相关的MTHFR基因rs1801133（C>T）点突变的基因型的检测

本发明采用特异性ARMS引物，在实时荧光定量PCR中降低野生型特异性ARMS引物对突变型样本的扩增效率和突变型特异性ARMS引物对野生型样本的扩增效率，使得结果更易于判断。

1）特异性ARMS引物设计

实验设计了野生型特异性ARMS引物、突变型特异性ARMS引物，共用上游引物为rs1801133（C>T）-F，相关参数为：Tm值55.0℃-60.0℃，GC值40.0％-60.0％，引物大小20±3bp。特异性ARMS引物序列如下：

下游特异性ARMS引物：

rs1801133（C>T）-WF GCGTGATGATGAAATCCG (SEQ ID NO: 5)；

rs1801133（C>T）-MF GCGTGATGATGAAATCCA (SEQ ID NO: 6)；

共用上游引物rs1801133（C>T）-R ：GCCAGCCTCTCCTGACTGTC (SEQ ID NO: 7)；

4）探针设计

在特异性ARMS引物扩增片段内设计探针，相关参数为：Tm值68.0℃-70.0℃，GC值40.0％-70.0％，对探针进行5’端FAM标记，3’端BHQ1标记，其序列如下：

rs1801133（C>T）-P探针：TCCCGCAGACACCTTCTCCTTCAAGTG (SEQ ID NO: 8)；

5）ARMS荧光定量PCR扩增反应(总体积是30ul)

PCR反应程序为：50℃ 2分钟、95℃ 2分30秒；40个循环：95℃ 15秒，60℃30秒（收集荧光）。所用仪器为ABI7500。

6) 实验结果

平行扩增的荧光定量PCR反应中，阴性对照无扩增，说明反应体系正常，无污染。

图7中叶酸代谢待检样本rs1801133（C>T）在野生型反应液中的荧光扩增曲线为a，其Ct值为27.0；在突变型反应液中的荧光扩增曲线为b，其Ct值为40，根据判定标准，该样本为野生型样本。

图8中使用Sanger测序法对图7中叶酸代谢样本测序，原始峰图结果显示为碱基C，说明荧光检测结果与测序结果完全一致，均为rs1801133（C>T）野生型。

图9中叶酸代谢待检样本rs1801133（C>T）在野生型反应液中的荧光扩增曲线为a，其Ct值为38.7；在突变型反应液中的荧光扩增曲线为b，其Ct值为25.0，根据判定标准，该样本为纯合突变型样本。

图10中使用Sanger测序法对图9中叶酸代谢样本测序，原始峰图结果显示为碱基T，说明荧光检测结果与测序结果完全一致，均为rs1801133（C>T）纯合突变型。

实施例3叶酸代谢相关的MTRR基因rs1801394（A>G）点突变基因型的检测

本发明采用特异性ARMS引物，在实时荧光定量PCR中降低野生型特异性ARMS引物对突变型样本的扩增效率和突变型特异性ARMS引物对野生型样本的扩增效率，使得结果更易于判断。

1）特异性ARMS引物设计

实验设计了野生型特异性ARMS引物、突变型特异性ARMS引物，共用上游引物为rs1801394（A>G）-F，相关参数为：Tm值55.0℃-60.0℃，GC值40.0％-60.0％，引物大小20±3bp。特异性ARMS引物序列如下：

下游特异性ARMS引物：

rs1801394（A>G）-WF AGGCCATCGCAGAAGAAAGA (SEQ ID NO:9)；

rs1801394（A>G）-MF AGGCCATCGCAGAAGAAAGG (SEQ ID NO: 10)；

共用上游引物rs1801394（A>G）-R ：CTTCAAAGCACAAAACGGTAA (SEQ ID NO: 11)；

4）探针设计

在特异性ARMS引物扩增片段内设计探针，相关参数为：Tm值68.0℃-70.0℃，GC值40.0％-70.0％，对探针进行5’端Cy5标记，3’端BHQ2标记，其序列如下：

rs1801394（A>G）-P探针：ATCCGATAAGGTTAGAGCCGTTACAGTGG (SEQ ID NO:12)；

5）ARMS荧光定量PCR扩增反应(总体积是30ul)

PCR反应程序为：50℃ 2分钟、95℃ 2分30秒；40个循环：95℃ 15秒，60℃45秒（收集荧光）。所用仪器为ABI7500。

6) 实验结果

平行扩增的荧光定量PCR反应中，阴性对照无扩增，说明反应体系正常，无污染。

图11中叶酸代谢待检样本rs1801394（A>G）在野生型反应液中的荧光扩增曲线为a，其Ct值为29.3；在突变型反应液中的荧光扩增曲线为b，其Ct值为40，根据判定标准，该样本为野生型样本。

图12中使用Sanger测序法对图11中叶酸代谢样本测序，原始峰图结果显示为碱基A，说明荧光检测结果与测序结果完全一致，均为rs1801394（A>G）野生型。

图13中叶酸代谢待检样本rs1801394（A>G）在野生型反应液中的荧光扩增曲线为a，其Ct值为40；在突变型反应液中的荧光扩增曲线为b，其Ct值为29.8，根据判定标准，该样本为纯合突变型样本。

图14中使用Sanger测序法对图13中叶酸代谢样本测序，原始峰图结果显示为碱基G，说明荧光检测结果与测序结果完全一致，均为rs1801394（A>G）纯合突变型。

应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。

本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。

SEQUENCE LISTING

<110> 厦门基源医疗科技有限公司

<120> 一种叶酸代谢基因多态性位点的基因型检测方法及试剂盒

<130> 12

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

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ggaggagctg accagtgaca a 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggaggagctg accagtgaca c 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccactccagc atcactcact t 21

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tctcgggaga accaaaccgg aatg 24

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcgtgatgat gaaatccg 18

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcgtgatgat gaaatcca 18

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<400> 9

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aggccatcgc agaagaaagg 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cttcaaagca caaaacggta a 21

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

atccgataag gttagagccg ttacagtgg 29

Claims (8)

1.一种叶酸代谢基因多态性位点的基因型检测方法，其特征在于：其包括以下步骤：

（1）：DNA提取；

（2）：在相同的反应体系中，使用叶酸代谢基因多态性位点的基因野生型模板的特异性ARMS引物和突变型模板的特异性ARMS引物分别对同一份待测样本进行实时荧光定量PCR检测；

所述野生型模板的特异性ARMS引物的3`末端终止在待测位点处并且与野生型序列匹配，其中，在所述引物的3`末端第2-5位设置一个或多个错配碱基；

所述突变型模板的特异性ARMS引物的3`末端终止在待测位点处并且与突变型序列匹配，其中，在所述引物的3`末端第2-5位设置一个或多个错配碱基；

所述野生型模板的特异性ARMS引物和所述突变型模板的特异性ARMS引物共用上游或下游引物，所述共用上游或下游引物分别与所述野生型模板的特异性ARMS引物或所述突变型模板的特异性ARMS引物一起扩增一段包含待测基因突变位点的序列；

（3）：根据样本用野生型模板的特异性ARMS引物进行荧光定量PCR检测的Ct野生型和突变型模板的特异性ARMS引物进行ARMS荧光定量PCR检测的Ct突变型，来判断多态性位点的型别从而确定叶酸代谢基因突变的基因型。

2.根据权利要求1所述的一种叶酸代谢基因多态性位点的基因型检测方法，其特征在于：DNA提取方法包括如下：

（1）口腔拭子在受检者口腔左右两腮分别各上下刮20次，保证采集到足量的口腔脱落细胞样本，采集完毕，样本置于样本保存管，做好标记；

（2）将步骤（1）中的样本保存管用涡旋振荡器涡旋混匀30s，使口腔拭子中脱落细胞充分混合至保存液中；

（3）将步骤（2）的保存液全部转移至新的1.5mL离心管，然后6000g离心2min弃上清，获得细胞沉淀，此时在管底留10ul保存液，无须完全弃掉；

（4）向步骤（3）获得细胞沉淀中加入100uL浓度为400mM 的NaOH溶液，涡旋振荡10s，水浴100℃煮沸裂解6min；

（5）将步骤（4）水浴锅中的离心管取出，冰上冷却30s，然后12000g离心1min，取上清液即为提取的口腔拭子基因组DNA。

3. 根据权利要求1所述的一种叶酸代谢基因多态性位点的基因型检测方法，其特征在于：使用叶酸代谢多态性位点的基因野生型模板的特异性ARMS引物和突变型模板的特异性ARMS引物分别对同一份待测样本进行实时荧光定量PCR检测时，为了防止基因组的污染，在反应体系中引入了热启动防污染型试剂，包括2U/ul UDG酶和抗体修饰的热启动酶。

4.根据权利要求1所述的一种叶酸代谢基因多态性位点的基因型检测方法，其特征在于：野生型模板的特异性ARMS引物和突变型模板的特异性ARMS引物中，引入错配碱基的位置和类型相同；除了突变位点处的碱基以外，所述野生型模板的特异性ARMS引物和所述突变型模板的特异性ARMS引物完全相同。

5.根据权利要求1所述的一种叶酸代谢基因多态性位点的基因型检测方法，其特征在于：所述叶酸代谢多态性位点是MTHFR基因rs1801131：A>C和rs1801133：C>T，MTRR基因rs1801394：A>G。

6. 根据权利要求5所述的一种叶酸代谢基因多态性位点的基因型检测方法，其特征在于：检测MTHFR基因 rs1801131：A>C点突变的野生型特异性ARMS引物是GGAGGAGCTGACCAGTGACAA、突变型特异性ARMS引物是 GGAGGAGCTGACCAGTGACAC，和共用下游引物为CCACTCCAGCATCACTCACTT；和检测其的探针为TCTCGGGAGAACCAAACCGGAATG；

检测MTHFR基因 rs1801133：C>T点突变的野生型特异性ARMS引物是GCGTGATGATGAAATCCG、突变型特异性ARMS引物是GCGTGATGATGAAATCCA，和共用下游引物为GCCAGCCTCTCCTGACTGTC；和检测其的探针为 TCCCGCAGACACCTTCTCCTTCAAGTG；

检测MTRR基因rs1801394：A>G点突变的野生型特异性ARMS引物是AGGCCATCGCAGAAGAAAGA、突变型特异性ARMS引物是AGGCCATCGCAGAAGAAAGG，和共用上游引物为CTTCAAAGCACAAAACGGTAA；和检测其的探针为 ATCCGATAAGGTTAGAGCCGTTACAGTGG。

7.在权利要求1-6中任一种方法中使用的试剂盒。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：ROX校正液、dNTP、dUTP、UDG酶、BSA、聚合酶及缓冲液，以及叶酸代谢基因多态性位点的基因野生型模板的特异性ARMS引物、突变型模板的特异性ARMS引物和探针。