TWI781518B

TWI781518B - 用以診斷脊髓性肌肉萎縮症之套組及其用途

Info

Publication number: TWI781518B
Application number: TW110101769A
Authority: TW
Inventors: 郭亦亦; 邱一帆; 鍾麗霞; 李淑如
Original assignee: 起元生物科技股份有限公司
Priority date: 2020-03-03
Filing date: 2021-01-18
Publication date: 2022-10-21
Also published as: TW202134441A; CN111218506B; CN111218506A; US20210277473A1; US11655509B2

Abstract

本揭示內容關於一種可基於從人類個體分離出的DNA樣品之SMN1 基因外顯子7與8的拷貝數以及SMN2 基因外顯子7與8的拷貝數，診斷該人類個體之脊髓性肌肉萎縮症的套組。本揭示內容也揭示藉由使用前述套組診斷脊髓性肌肉萎縮症的方法以及基於該診斷結果治療脊髓性肌肉萎縮症的方法。

Description

用以診斷脊髓性肌肉萎縮症之套組及其用途

本揭示內容關於疾病診斷的領域，更具體是，本揭示內容關於包含帶有特定多核苷酸序列之八個引子的套組，以及所述套組在診斷脊髓性肌肉萎縮症之用途。

脊髓性肌肉萎縮症(Spinal muscular atrophy，SMA)是一種基因異常疾病，其特點是運動神經元缺失以及漸進性肌肉缺失。它是最盛行於一個影響年青孩童的遺傳疾病之一，也是嬰幼兒的主要死因。有四種脊髓性肌肉萎縮症，會自不同年紀開始發生，包含：(1)第一型脊髓性肌肉萎縮症，又稱作偉霍二氏病(Werdnig-Hoffmann disease)，大部分在少於六個月之嬰兒中發展為嚴重型態；罹病的嬰兒通常具有餵食困難，且在二歲之前死於呼吸衰竭或誤吸；(2) 第二型脊髓性肌肉萎縮症，其發生於6到18個月齡之嬰兒；罹病病患通常具有低張症(hypotonia)，動作成長延遲，以及雖然可在無支撐情況下坐起，但是不能站立與獨自行走；罹病病患的預期壽命取決於呼吸肌肉使用的程度，但通常大於四年；(3) 第三型脊髓性肌肉萎縮症，亦為熟知的庫韋二氏病 (Kugelberg-Welander disease)，通常在18個月齡後發展；罹病病患能夠獨自行走，但是會經常地跌倒以及步履蹣跚，足下垂(foot drop)以及爬樓梯困難；第三型脊髓性肌肉萎縮症病患的預期壽命是正常或接近正常，大部分病患需要移動支持物；以及(4) 第四型脊髓性肌肉萎縮症，其影響成年人並通常僅有輕微的問題，像是上臂以及腿的肌肉孱弱，伴隨微小的呼吸問題。脊髓性肌肉萎縮症的發生率約萬分之一，而帶因者頻率約每五十人就有一人。脊髓性肌肉萎縮症的典型症狀包含，疲軟或孱弱的手臂與腿，移動問題 (例如：在坐姿、爬行及/或是行走具有難度)，抽搐或肌肉震顫，骨頭以及關節問題，(例如，常有脊椎彎曲)，吞嚥困難，以及呼吸問題(例如：呼吸窘迫症候群)。

脊髓性肌肉萎縮症是肇因於運動神經元存活1 (Survival of motor neuron 1 ，以下簡稱SMN1 )基因突變，所述運動神經元存活基因1編譯運動神經元存活1蛋白質(SMN1)，此蛋白質是運動神經的生存以及功能所必須。在脊索中，運動神經元的缺失阻斷腦與骨骼肌肉之間的訊息傳導。運動神經元存活2基因(以下稱：SMN2 )，離SMN1 基因875 kb之鹼基處，是一個疾病修飾基因，可以以劑量依賴方式彌補SMN1 基因的缺失。該兩個基因的全長核苷酸序列是相同的，除了在外顯子7與外顯子8的位置分別有兩個核苷酸的置換。在SMN1 基因外顯子7的去氧胞苷(C)確保該外顯子7是包含在最終成熟的SMN1 基因mRNA內。相反地，若在SMN2 基因之外顯子7的胞苷轉變成胸苷(T)，造成實質上跳過外顯子7，導致功能性蛋白質的產量降低。除了外顯子7發生鹼基的改變，也可以從SMN2 基因外顯子8之鹼基由鳥苷(G)變成腺苷(A)的改變創造出Dde I切位，來將SMN2 基因與SMN1 基因區隔。在基因擴增以及酵素處理之後，該SMN1蛋白將會以未裁切型態(長度為約200個鹼基)存在，而該SMN2蛋白則會被酵素裁切至長度為122個鹼基以及78個鹼基的產物。正常個體同時具有SMN1 基因與SMN2 基因，該SMN 1基因貢獻90%的SMN蛋白質，而SMN2 基因只有貢獻10%的SMN蛋白質。若僅帶有SMN2 基因的個體通常無法產生足夠的SMN蛋白質量，因此會罹患脊髓性肌肉萎縮症。

分子基因檢測是診斷脊髓性肌肉萎縮症的標準工具。聚合酶連鎖反應暨限制性片段長度多型性(Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)是鑑定脊髓性肌肉萎縮症的傳統方法，但是其不完全裁切導致精準度受到影響。對偶基因聚合酶連鎖反應(Allele-specific，(AS)-PCR)，或是也稱為擴增阻礙突變系統(amplification refractory mutation system，ARMS)，可以藉由PCR分析區分單一鹼基的改變，因而可以解決PCR-RFLP不完全裁切所導致的問題；然而，大約5%的病患具有SMN1 基因的點突變而非嚴重缺失，而AS-PCR反應無法檢測該些點突變。多重連結探針擴增法(Multiplex ligation-dependent amplification，MLPA)以及定量及時聚合酶連鎖反應(real-time PCR，RT-PCR)是透過偵測該特定基因座的拷貝數(copy number)，提供診斷脊髓性肌肉萎縮症的替代性方法。然而，MLPA對於雜質是非常敏感的，且無法偵測染色體結構上的變形以及鑲嵌。至於RT-PCR，其準確度會受DNA的萃取方法以及模板定量而影響。高解析熔化分析 (High-resolution melting analysis，HRMA)是新的脊髓性肌肉萎縮症偵測技術，但是其準確度以及專一性需要被改良，且陽性結果需要再以定序來做診斷確認。變性高效液相層析術 (Denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)則是一個花費昂貴以及耗時的程序，需要將樣本與控制組同型合子野生型DNA混合，以鑑定同型盒子以及半合子突變。

有鑑於此，相關領域需要一種改良的方法，以更準確且更專一的方式來偵測一人類個體之SMN1 基因與SMN2 基因的突變，藉以決定該人類個體是否具有脊髓性肌肉萎縮症或是否為脊髓性肌肉萎縮症帶因者。

為了給讀者提供基本的理解，以下提供本揭示內容的簡要發明內容。此發明內容不是本揭示內容的廣泛概述，同時非用來識別本發明的關鍵/必需元件或勾勒本發明的範圍。其唯一目的是以簡化的概念形式呈現本揭示內容的一些概念，以作為呈現於後文中更詳細描述的序言。

如本文具體實施及廣泛描述地，本揭示內容的一態樣是關於一種用以診斷人類個體是否患有脊髓性肌肉萎縮症或為脊髓性肌肉萎縮症帶因者的套組。根據本揭示內容之某些實施方式，該套組包含八個引子及聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction，以下簡稱PCR)試劑，其中第一引子包含具有序列編號：1之第一多核苷酸序列，以及設置並連接至第一多核苷酸序列5’端之第一非人類序列；第二引子包含具有序列編號：2之第二多核苷酸序列，以及設置並連接至第二多核苷酸序列5’端之第二非人類序列；第三引子包含具有序列編號：3之第三多核苷酸序列，以及設置並連接至第三多核苷酸序列5’端之第二非人類序列；第四引子包含具有序列編號：4之第四多核苷酸序列，以及設置並連接至第四多核苷酸序列5’端之第一非人類序列；第五引子包含具有序列編號：5之第五多核苷酸序列，以及設置並連接至第五多核苷酸序列5’端之第二非人類序列；第六引子包含具有序列編號：6之第六多核苷酸序列，以及設置並連接至第六多核苷酸序列5’端之第二非人類序列；第七引子由第一非人類序列所組成；以及第八引子由第二非人類序列所組成。

非必要地，第二引子或第三引子更包含第三非人類序列。依據某些實施方式，第三非人類序列是存在於第二引子中；在實施例中，第三非人類序列是設置在第二非人類序列及第二多核苷酸序列之間。根據替代性之實施方式，第三非人類序列是存在於第三引子中；在這些實施方式中，第三非人類序列是設置在第二非人類序列及第三多核苷酸序列之間。

額外或替代性地，第五或第六引子更包含一第三非人類序列。在某些實施例當中，第三非人類序列是存在於第五引子內，並設置在第二非人類序列及第五多核苷酸序列之間。在某些實施例中，第三非人類序列是存在於第六引子中，並設置在第二非人類序列及第六多核苷酸序列之間。

根據本揭示內容某些具體實施例，第一非人類序列具有序列編號：7之多核苷酸序列；第二非人類序列具有序列編號：8之多核苷酸序列；及第三非人類序列包含多核苷酸序列「ACTTC」。

在特定實施例中，第一引子具有序列編號：9之多核苷酸序列；第二引子具有序列編號：10之多核苷酸序列；第三引子具有序列編號：11之多核苷酸序列；第四引子具有序列編號：12之多核苷酸序列；第五引子具有序列編號：13之多核苷酸序列；第六引子具有序列編號：14之多核苷酸序列；第七引子具有序列編號：7之多核苷酸序列；及第八引子具有序列編號：8之多核苷酸序列。

非必要地，第八引子係與報導分子共軛。

非必要地，本發明套組更包含兩DNA模板作為內部控制組，其中第一DNA模板之多核苷酸序列中，具有兩個拷貝數的β肌動蛋白基因(beta-actin (β-actin))；以及在第二DNA模板之多核苷酸序列中，具有兩個拷貝數的血紅素β (haemoglobin beta (HBB))基因。

本發明套組的PCR試劑可非必要地包含DNA聚合酶、緩衝液、MgCl₂ 、去氧核醣核苷三磷酸(deoxynucleotide triphosphates，以下稱dNTPs)以及甜菜鹼(betaine)。

根據本揭示內容之任何實施方式或實施例，本揭示內容之第二態樣是關於一種利用套組診斷人類個體是否具有脊髓性肌肉萎縮症或是為脊髓性肌肉萎縮症帶因者之方法。所述方法包含： (a) 自人類個體抽取DNA樣品； (b) 於PCR試劑中混合DNA樣品及第一引子至第八引子； (c) 將步驟(b)之混合物接受PCR； (d) 確認來自步驟(c)產物之DNA樣品中SMN1 基因之外顯子7的第一拷貝數、SMN2 基因之外顯子7的第二拷貝數、SMN1 基因之外顯子8的第三拷貝數以及SMN2 基因之外顯子8的第四拷貝數；其中當第一拷貝數與第二拷貝數之總和不等於第三拷貝數與第四拷貝數之總和時，則重複步驟(b)與(c)直到第一拷貝數與第二拷貝數之總和等同於第三拷貝數與第四拷貝數之總和；以及 (e) 基於步驟(d)測定之第一拷貝數診斷脊髓性肌肉萎縮症，其中當第一拷貝數為0，即診斷人類個體具有脊髓性肌肉萎縮症；或是當第一拷貝數為1，即診斷人類個體為脊髓性肌肉萎縮症帶因者。

基於診斷結果，臨床從業人員或技術人員可及時給予脊髓性肌肉萎縮症病患一適當治療。據此，本文還揭示一種治療脊髓性肌肉萎縮症個體的方法。該方法包含， (a) 從人類個體中抽取DNA樣品； (b) 於PCR試劑中混合DNA樣品及第一引子至第八引子； (c) 將步驟(b)之混合物接受PCR； (d) 確認來自步驟(c)產物之DNA樣品中SMN1 基因之外顯子7的第一拷貝數、SMN2 基因之外顯子7的第二拷貝數、SMN1 基因之外顯子8的第三拷貝數以及SMN2 基因之外顯子8的第四拷貝數；其中當第一拷貝數與第二拷貝數之總和不等於第三拷貝數與第四拷貝數之總和時，然後重複步驟(b)與(c)直到第一拷貝數及第二拷貝數之總和等同於第三拷貝數與第四拷貝數之總和；以及 (e) 基於該步驟(d)測定之第一拷貝數診斷脊髓性肌肉萎縮症，其中當第一拷貝數為0，則投以人類個體一有效量的治療劑。

取決於以上想要的目的，脊髓性肌肉萎縮症治療可能以諾西那生鈉(nusinersen)、立帝安(risdiplam)、賽諾基貝帕佛(onasemnogene abeparvovec)、或其組合治療脊髓性肌肉萎縮症。

在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

I. 定義

為方便起見，在此統整說明說明書、實施例即附隨申請專利範圍所採用的特定術語。除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，除非另有需要，否則可理解本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。具體來說，如申請專利範圍使用的單數型，除非內文另有說明，「一」包含其他複數型。此外，如申請專利範圍所使用的，「至少一」與「一或更多」等表述方式的意義相同，兩者都代表包含了一、二、三或更多。

雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比（例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者）均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一端點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。

本文使用的「多核苷酸序列(polynucleotide sequence)」一詞可被理解成代表一雙股DNA或一單股DNA。本發明的多核苷酸序列可藉由分離方法加以分離、純化 (或部分純化)，前述分離包括，但不限於：離子交換層析法、分子粒徑篩層析法、或是藉由基因工程方法，像是擴增、削減雜交、基因選殖、次選殖或化學品合成或組合這些基因工程之方法。

本文使用的「拷貝數」一詞是指一個體(例如：人類)之基因體中，多核苷酸序列之數目(例如，SMN1 基因之外顯子7、SMN1 基因之外顯子8、SMN2 基因之外顯子7或SMN2 基因之外顯子8)。根據本揭示內容，SMN1 基因之外顯子7的拷貝數表示個體5號染色體之SMN1 基因外顯子7的拷貝數；SMN1 基因外顯子8的拷貝數表示個體5號染色體之SMN1 基因外顯子8的拷貝數；SMN2 基因之外顯子7的拷貝數表示個體5號染色體之SMN2 基因外顯子7的拷貝數；SMN2 基因之外顯子8的拷貝數表示個體5號染色體之SMN2 基因外顯子8的拷貝數。可以從自單一細胞或從一群細胞(例如：組織樣本)測定拷貝數。當比較一個體之基因體中的「拷貝數」時，無須測定該個體之精確拷貝數，而是僅須要獲得一近似值使其可決定一給定個體相較於另一個體是否含有更多或較少的多核苷酸序列。用以測定多核苷酸序列拷貝數的方法是本領域所熟知的，舉例來說，南方點墨法分析、定量PCR、即時PCR以及DNA定序。

本揭示內容使用的「診斷」一詞意指一種方法，透過該方法，本領域技術人員可以評估及/或決定是否病患正罹患一特定疾病或病症機率(「可能性」)。在本揭示內容的案例中，「診斷」包含利用由本發明套組之四個引子擴增的PCR產物，並選擇性地配合其他臨床特徵，取得個體的DNA樣品並分析之，來達到對該個體之脊髓性肌肉萎縮症之診斷(即，發生或未發生)。這樣的診斷是「決定」，不是意指暗示該診斷是100%準確。許多生物標記是多重病症的指標。有經驗之臨床從業人員不會在資訊真空下使用生物標記結果，而是配合其他臨床指標與測試結果一同採用，以達成診斷。因此，經量測的生物標記值在預定診斷閾值之一側則表示，相對於該預定診斷閾值之另一側的側量值，該個體具有發生該疾病之更大的可能性。

本揭示內容使用的「非人類」一詞意指任何有別於人類物種之動物，從該些動物獲得(即，不經任何修飾，直接從非人類動物選殖)或衍生(即，從非人類序列選殖並經一或多個修飾；像是，序列之一或多個核苷酸的取代或缺失)之序列(即，本揭示內容之第一、第二及第三非人類序列)。適合取得或是衍生出本揭示內容之非人類序列的非人類動物包含，但不限於，老鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、兔子、猴子、綿羊、山羊、馬、貓、狗、黑猩猩、猿、狼、鹿、驢、斑馬、熊、長頸鹿、獅及老虎。根據本發明內容之一些實施例，本揭示內容之套組的非人類序列是不經序列修飾，從噬菌體衍生之。

本揭示內容使用的「PCR試劑」一詞意指除了特定引子(即，本發明套組之第一至第八引子)之外，執行PCR程序所需的化學物質。該些化學物質通常包含四種類型的成分：(i) 一水溶液緩衝液(也稱作PCR緩衝液)，(ii) 一可溶於水之鎂鹽 (例如，MgCl₂ )，(iii)至少四個去氧核醣核苷三磷酸(deoxyribonucleotide triphosphates)，(即dNTPs，其包含去氧胸苷三磷酸(thymidine triphosphate (dTTP))、去氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphate (dATP))、去氧胞苷三磷酸(deoxycitidine triphosphate (dCTP))以及去氧鳥苷三磷酸(deoxyguanosine triphosphate (dGTP)))，以及 (iv)一多核苷酸聚合酶，優選為一DNA聚合酶，更優選為一熱穩定DNA聚合酶，即，可於總時間至少10分鐘耐受90°C與100°C之間的溫度且不會喪失超過一半活性的一DNA聚合酶。取決期望的目的，該些化學物質可包含一或更多額外成份來改善PCR程序的效能及/或專一性，這類成份像是甜菜鹼，乙二醇(ethylene glycol)，及/或甘油。

本揭示內容使用的「個體」一詞意指藉由本發明套組及/或方法來診斷的人類物種。除非另有說明，「個體」一詞是意指雄性及雌性兩者。

II.具體實施方式

本揭示內容旨在提供一種藉由使用第一引子到一第八引子執行PCR以測定生物樣品中SMN1 基因外顯子7之拷貝數、SMN1 基因外顯子8之拷貝數、SMN2 基因外顯子7之拷貝數或SMN2 基因外顯子8之拷貝數的方法。同時，本揭示內容也關於一種基於前述測定的拷貝數來診斷該個體是否患有脊髓性肌肉萎縮症或為脊髓性肌肉萎縮症帶因者的套組及方法，從而使臨床從業人員或本領域具有通常知識者可及時給予脊髓性肌肉萎縮症病患適當治療，並提供脊髓性肌肉萎縮症帶因者帶有風險評估的遺傳諮詢(genetic counseling)，藉此降低或防止母系傳遞。

(II-1) 用以診斷脊髓性肌肉萎縮症之套組

本發明內容第一態樣涉及診斷脊髓性肌肉萎縮症之套組。依據本揭示內容之實施方式，該套組包含八個引子及PCR試劑。

參考第1圖，其繪示本揭示內容之引子設計。SMN1 基因(10)包含外顯子7(103)及外顯子8(105)，而SMN2 基因(20)包含外顯子7(203)及外顯子 8(205)。承前所述，除了個別位於外顯子7與外顯子8的兩個核苷酸置換之外，此兩個基因之核苷酸序列是相同的，所述置換是，在SMN1 基因(10)外顯子7(203)之核苷酸「C」變成SMN2 基因(20)外顯子7(203)之核苷酸「T」，以及SMN1 基因(10)外顯子8(105)之核苷酸「G」變成SMN2 基因 (20) 外顯子8(205)之核苷酸「A」。

根據第1圖，第一引子(111)包含第一多核苷酸序列(121)及一設置在第一多核苷酸序列(121)5’端的第一非人類序列(310)，其中第一多核苷酸序列(121)是與外顯子7(103、203)的上游序列互補。第二引子(113)包含第二多核苷酸序列(123)及設置在第二多核苷酸序列(123)5’端的第二非人類序列(320)，其中第二多核苷酸序列(123)是與外顯子 7(103)的序列互補。第三引子(213)包含第三多核苷酸序列(223)及設置在第三多核苷酸序列(223)5’端的第二非人類序列(320)，其中第三多核苷酸序列(223)是與外顯子 7(203)的序列互補。第四引子(117)包含第四多核苷酸序列(127)及設置在第四多核苷酸序列(127)5’端的第一非人類序列(310)，其中第四多核苷酸序列(127)是與外顯子 8(105、205)的序列互補。第五引子(115)包含第五多核苷酸序列(125)及設置在第五多核苷酸序列(125)5’端 (125)的第二非人類序列(320)，其中第五多核苷酸序列(125)是與外顯子 8(105)的序列互補。第六引子(215)包含第六多核苷酸序列(225)及設置在第六多核苷酸序列(225)5’端的第二非人類序列(320)，其中第六多核苷酸序列(225)是與外顯子8的序列互補(205)。第七引子則由第一非人類序列(310)組成。第八引子由第二非人類序列(320)組成。

根據本揭示內容某些實施方式，第一多核苷酸序列(121)具有「GCAGCCTAATAATTGTTTTCTTTGGG」之多核苷酸序列(序列編號：1)；第二多核苷酸序列(123)具有「CCTTCCTTCTTTTTGATTTTGTNNG」之多核苷酸序列(序列編號：2)；第三多核苷酸序列(223)具有「ACCTTCCTTCTTTTTGATTTTGTNNA」之多核苷酸序列 (序列編號：3)；第四多核苷酸序列 (127)具有「AGCCATGTCCACCAGTTAGATTC」之多核苷酸序列(序列編號：4)；第五多核苷酸序列(125)具有「AAACCATCTGTAAAAGACNNG」之多核苷酸序列(序列編號：5)；第六多核苷酸序列(225)具有「AAACCATCTGTAAAAGACNNA」之多核苷酸序列(序列編號：6)。

兩個「N」核苷酸存在於序列編號： 2、3、5及6。根據WIPO標準ST.25(1998)闡述的符號，N代表A、T、C或G核苷酸的任一種。本領域技術人員可依照期望的目的，調整序列編號：2及序列編號：3之多核苷酸序列中「N」核苷酸的類型(即，選取A、T、C或G作為該N核苷酸)，以區分擴增之SMN1 基因外顯子7 片段及擴增之SMN2 基因之外顯子7 片段，因而增進診斷專一性。類似地，可依照期望目的調整序列編號為：5及序列編號：6之多核苷酸序列的「N」核苷酸，以區分擴增之SMN1 基因之外顯子 8 片段及擴增之SMN2 基因之外顯子 8 片段，因而增進診斷之專一性。

根據一些更優選的實施方式，在序列編號：2第23與24個核苷酸(即：從5’端至3’端數，序列編號：2之第一及第二「N」核苷酸)分別是「C」及「G」；即，第二多核苷酸序列在其3’端具有核苷酸序列「GTCGG」；在序列編號：3第24及25個核苷酸(即：從5’端至3’端數，序列編號：3之第一及第二「N」核苷酸)分別是「A」及「T」；即，第三多核苷酸序列在其3’端具有核苷酸序列「GTATA」；在序列編號：5第19及20個核苷酸(即：從5’端至3’端數，序列編號：5之第一及第二「N」核苷酸)分別是「C」及「G」；即，第五多核苷酸序列在其3’端具有核苷酸序列「ACCGG」；在序列編號：6第19及20個核苷酸(即：從5’端至3’端數，序列編號：6之第一及第二「N」核苷酸)分別是「G」及「G」；即，第六多核苷酸序列在其3’端具有核苷酸序列「ACGGA」；

根據某些實施方式，第二、第三、第五及第六多核苷酸序列在其3’端分別具有多核苷酸序列「GTCGG」、「GTATA」、「ACCGG」及「ACTCA」。根據某些實施方式，第二、第三、第五及第六多核苷酸序列在其3’端分別具有多核苷酸序列「GTCGG」、「GTGTA」、「ACCGG」及「ACTCA」。根據某些實施方式，第二、第三、第五及第六多核苷酸序列在其3’端分別具有多核苷酸序列「GTCAG」、「GTGTA」、「ACAGG」及「ACTCA」。根據某些實施方式，第二、第三、第五及第六多核苷酸序列在其3’端分別具有多核苷酸序列「GTATG」、「GTATA」、「ACCGG」及「ACTCA」。根據某些實施方式，第二、第三、第五及第六多核苷酸序列在其3’端分別具有多核苷酸序列「GTATG」、「GTCCA」、「ACCGG」及「ACTCA」。根據某些實施方式，第二、第三、第五及第六多核苷酸序列在其3’端分別具有多核苷酸序列「GTATG」、「GTCGA」、「ACCGG」及「ACTCA」。根據某些實施方式，第二、第三、第五及第六多核苷酸序列在其3’端分別具有多核苷酸序列「GTTTG」、「GTCGA」、「ACCGG」及「ACTCA」。根據某些實施方式，第二、第三、第五及第六多核苷酸序列在其3’端分別具有多核苷酸序列「GTCGG」、「GTCCA」、「ACCGG」及「ACGGA」。根據某些實施方式，第二、第三、第五及第六多核苷酸序列在其3’端分別具有多核苷酸序列「GTCGG」，「GTGTA」，「ACGGG」及「ACTCA」。根據某些實施方式，第二、第三、第五及第六多核苷酸序列在其3’端分別具有多核苷酸序列「GTCCG」、「GTGTA」、「ACTAG」及「ACGGA」。根據某些實施方式，第二、第三、第五及第六多核苷酸序列在其3’端分別具有多核苷酸序列「GTATG」、「GTCCA」、「ACTCG」及「ACCGA」。

根據某些具體實施例，第一非人類序列(310)及第二非人類序列(320)分別具有序列編號：7與8之多核苷酸序列。

在實施例執行時，第一及第二引子(111、113)分別作為用於擴增SMN1 基因(10)之外顯子7(103)之序列的正向及反向引子，且第一及第三引子(111、213)分別作為用來擴增SMN2 基因(20)之外顯子7(203)之序列的正向及反向引子。如此獲得之外顯子7區段(即，分別由第一及第二引子(111、113)以及第一及第三引子(111、213)擴增之外顯子7(103、203) DNA區段)位於其5’端之第一非人類序列(310)，以及位於其3’端之第二非人類序列(320)。在這方法中，更可藉由第七及第八引子(310、320)擴增外顯子7區段。

第五及第四引子(115、117)分別作為用來擴增SMN1 基因(10)之外顯子8(105)序列之正向及反向引子，且第六及第四引子(215、117)分別作為用於擴增SMN2 基因(20)之外顯子8(205)序列之正向及反向引子。如此獲得之外顯子8區段(即，分別藉由第五及第四引子(115、117)以及第六及第四引子(215、117)擴增之外顯子8(105、205)的DNA區段)包含位在其5’端之第二非人類序列(320)，以及位在其3’端之第一非人類序列(310)。在這方法中，更可藉由第七及第八引子(310、320)擴增外顯子8區段。

一本領域具有通常知識者可能藉由將外顯子7與8區段接受一電泳分析(例如：毛細管電泳分析)來決定SMN1 基因之外顯子7與8以及SMN2 基因之外顯子7與8之拷貝數，並將該DNA片段的峰面積(peak area)與來自一健康個體之控制組樣品的DNA片段峰面積比較。基於分析結果，本領域技術人員可決定SMN1 及SMN2 基因之特定外顯子序列 (即：外顯子7與8)之拷貝數，因而做出脊髓性肌肉萎縮症的診斷或是脊髓性肌肉萎縮症之嚴重程度的診斷。根據本揭示內容中某些實施方式，當SMN1 基因外顯子7之拷貝數為0，則診斷該個體具有脊髓性肌肉萎縮症；抑或是，當SMN1 基因外顯子7之拷貝數為1，則該個體為脊髓性肌肉萎縮症帶因者。根據某些實施方式，是由SMN1 基因外顯子8以及SMN2 基因外顯子7與8之拷貝數來決定脊髓性肌肉萎縮症之嚴重程度，前述拷貝數是與脊髓性肌肉萎縮症之嚴重程度成反比。

非必要地，第二引子或第三引子更包含第三非人類序列據以分辨SMN1 與SMN2 基因之外顯子7區段。根據某些實施方式，第三非人類序列是存在於第二引子，且設置在第二非人類序列及第二多核苷酸序列之間。根據替選實施方式，第三非人類序列是存在於第三引子，且設置在第二非人類序列及第三多核苷酸序列之間。

此外地或替代地，第五或第六引子更額外或替選地包含第三非人類序列，據以分辨SMN1 與SMN2 基因之外顯子8區段。根據某些實施方式，第三非人類序列是存在於第五引子，並設置在第二非人類序列及第五多核苷酸序列之間。根據替選實施方式，第三非人類序列是存在於第六引子內，並是設置於第二非人類序列及第六多核苷酸序列之間。

根據本發明內容某些具體實施例，第一非人類序列具有序列編號：7之多核苷酸序列；第二非人類序列具有序列編號：8之多核苷酸序列；以及第三非人類序列包含多核苷酸序列「ACTTC」。

在一特定的實施例中，第一引子具有序列編號：9之多核苷酸序列；第二引子具有序列編號：10之多核苷酸序列；第三引子具有序列編號：11之多核苷酸序列；第四引子具有序列編號：12之多核苷酸序列；第五引子具有序列編號：13之多核苷酸序列；第六引子具有序列編號：14之多核苷酸序列；第七引子具有該序列編號：7之多核苷酸序列；以及第八引子具有序列編號：8之多核苷酸序列。

非必要地，第八引子的3’端或5’端係與一報導分子共軛。適合與第八引子共軛之報導分子的非限制性實例包含，但不限於，螢光分子、發光分子、磷光分子、比色染料、顯影劑以及酵素。

揭示內容的非必要實施方式，該套組更包含兩個DNA模板作為內部控制組，其中在多核苷酸序列中，第一DNA模板具有兩個拷貝數的β肌動蛋白基因；以及其中在多核苷酸序列中，第二DNA模板具有兩個拷貝數的血紅素β基因。以本發明套組內之八個引子執行進行PCR程序並藉由偵測技術(例如：毛細管電泳分析)分析之後，可獲得分對應於SMN1 基因之外顯子7、SMN1 基因之外顯子8、SMN2 基因之外顯子7及SMN2 基因之外顯子8之PCR產物的四個峰面積；接著以內部控制組之峰面積標準化前述各個峰面積，進而測定期望的外顯子序列之拷貝數。

根據本揭示內容之實施方式，除上述八個引子外，本發明套組更包含在PCR分析中以擴增DNA區段之PCR試劑。在某些實施例中，PCR試劑包含DNA聚合酶、PCR緩衝液(例如：三羥甲基氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)aminomethane)緩衝液(Tris緩衝液)、Tris-HCl緩衝液或是任一種本領域技術人員所熟知可用於執行PCR程序的水性緩衝液)、MgCl₂ 、去氧核醣核苷三磷酸(dNTPs，包括dATP、dTTP、dGTP以及 dCTP)以及甜菜鹼。

(II-2) 診斷脊髓性肌肉萎縮症的方法

根據本揭示內容之任何實施方式或實施例，在此揭露藉由使用前述套組以診斷人類個體是否具有脊髓性肌肉萎縮症或是否為脊髓性肌肉萎縮症帶因者的方法。本發明方法包含如下之步驟， (a) 從人類個體抽取一DNA樣品； (b) 於PCR試劑中混合DNA樣品及第一引子至第八引子； (c) 將該步驟(b)之混合物接受PCR程序； (d) 確認來自步驟(c)之產物，DNA樣品中的SMN1 基因外顯子7之第一拷貝數、SMN2 基因外顯子7之第二拷貝數、SMN1 基因外顯子7之第三拷貝數及SMN2 基因外顯子8之第四拷貝數；其中當第一及第二拷貝數之總和不等於第三及第四拷貝數之總和時，重複步驟(b)及(c)數次，直到第一及第二拷貝數之總和與第三及第四拷貝數之總和相同；以及 (e) 基於該步驟(d)測定的第一拷貝數，做出脊髓性肌肉萎縮症之診斷。

在步驟(a)，DNA樣品是從人類個體之細胞或組織抽取之。該細胞或組織可以是任何一種可從人類個體取得之細胞或組織，只要該細胞或組織含有人類個體DNA。舉例來說，所述細胞可以是一上皮細胞、纖維母細胞、幹細胞、血液細胞、角質細胞或脂肪細胞。組織可以是一組織檢體，像是胃檢體、鼻咽檢體、大腸直腸檢體、腦檢體、肝檢體、脾臟檢體、皮膚檢體、羊水、絨毛膜絨毛、乾燥血漬或全血。根據本揭示內容之實施例，該DNA樣品是抽取自人類個體。可藉由市售套組或任何常規的DNA抽取技術從細胞或組織抽取DNA樣品；舉例來說，苯酚/氯仿測定法及清潔劑(即：十二烷基硫酸(sodiumdodecyl sulfate，SDS)、聚山梨醇酯20(TWEEN^® -20)、乙基苯基聚乙二醇(NP-40)及聚乙二醇辛基苯基醚(TRITON^® X-100))/醋酸測定法。

接著，將抽取DNA樣品與含有第一至第八引子的本發明PCR試劑混合，接著如步驟(b)及(c)各別說明的，進行PCR擴增。根據本揭示內容之某些實施方式，在PCR試劑中，第一引子至第三引子的最終濃度各為0.85 nM，第四到第六引子的最終濃度各是1.2 μM，且第七引子與第八引子的最終濃度各是3.0 μM。

在步驟(d)，測定步驟(c)之PCR產物中的外顯子序列 (即，SMN1 基因之外顯子7及8，以及SMN2 基因之外顯子7及8)之拷貝數。取決於期望目的，可藉由基因定序分析、電泳檢定(例如：洋菜膠電泳分析或毛細管電泳分析)或免疫分析來測定外顯子序列之拷貝數。根據本發明內容之某些實施方式，經PCR程序擴增之DNA區段之峰面積(例如：外顯子7及外顯子8片段)是先透過毛細管電泳分析接著經內部控制組之峰面積標準化。在一特定的實施方式中，首先藉由以下方程式：

從外顯子基因的峰面積計算標準化數值(也就是，峰面積之比值，R)，其中T代表來自一個體(即，疑似具有脊髓性肌肉萎縮症或者為脊髓性肌肉萎縮症帶因者之個體)的待測樣品，而RS代表源自一正常健康控制組(即，不具有脊髓性肌肉萎縮症也非脊髓性肌肉萎縮症帶因者之個體)的樣品。根據本揭示內容之具體實施例，是根據本揭示內容表4闡述之準則標準化數值取得在該測試樣品中各外顯子序列之拷貝數。也可以經由包含SMN1 基因之外顯子7、SMN1 基因之外顯子8、SMN2 基因之外顯子7及/或SMN2 基因之外顯子8之特定拷貝數(例如：0、1、2、3、4、5及6個拷貝數)之DNA模板，從標準化數值測定待測樣品中各外顯子序列之拷貝數。應當被理解的是，用來測定外顯子序列之拷貝數的方法應不限於此。

根據本揭示內容之一些實施方式，SMN1 基因之外顯子7的拷貝數與SMN2 基因之外顯子7的拷貝數之總和(即，在SMN1 基因中的外顯子7拷貝數+在SMN2 基因中外顯子7之拷貝數)應該等於SMN1 基因外顯子8之拷貝數與SMN2 基因外顯子8之拷貝數之總和(即，在SMN1 基因之外顯子8之拷貝數+在SMN2 基因之外顯子8之拷貝數)。SMN1 與SMN2 基因外顯子7之拷貝數之總和不等於SMN1 與SMN2 基因中外顯子8之拷貝數的總和，則表示應調整PCR條件及/或在PCR程序發生失誤。在此情況下，應確認PCR條件及/或應再次執行該PCR程序，以修補PCR失誤。根據一實施例，在SMN1 基因中，外顯子7與8之各拷貝數是0，而在SMN2 基因外顯子7與8之各拷貝數是2；在該實施例中，SMN1 基因與SMN2 基因外顯子7拷貝數之總和是2，且在SMN1 基因與SMN2 基因之外顯子8拷貝數之總和也為2。根據另一實施例，SMN1 基因之外顯子7與8之拷貝數是 0，而SMN2 基因之外顯子7與8之各拷貝數是3；在此實施例中，SMN1 基因與SMN2 基因外顯子7之拷貝數之總和是3，而SMN1 基因與SMN2 基因外顯子8之拷貝數之總和也是3。根據另一實施例，SMN1 基因之外顯子7與8之拷貝數分別是0及2，且SMN2 基因之外顯子7與8之拷貝數分別是3及1；在此實施例中，SMN1 基因與SMN2 基因之外顯子7的拷貝數之總和是3，且SMN1 基因與SMN2 基因之外顯子8的拷貝數總和也為3。根據又另一實施例，SMN1 基因之外顯子7及8之拷貝數分別是0及1，且SMN2 基因之外顯子7及8之拷貝數是分別是4及3；在此實施例中，SMN1 基因與SMN2 基因外顯子7之拷貝數之總和是4，而SMN1 基因與SMN2 基因外顯子8之拷貝數之總和也是4。根據又另一實施例，SMN1 基因之外顯子7與8之拷貝數分別是2與3，且SMN2 基因之外顯子7及8之拷貝數分別為2及1；在此實施例中，SMN1 基因與SMN2 基因外顯子7之拷貝數之總和是4，而SMN1 基因與SMN2 基因外顯子8之拷貝數之總和也是4。

最後，在步驟(e)，一臨床從業人員或一本領域具有通常知識者可基於步驟(d)所測定之拷貝數來做出脊髓性肌肉萎縮症之診斷。根據本發明內容之某些實施方式，當SMN1 基因之外顯子7之拷貝數為0的情況下，該人類個體是被診斷為具有脊髓性肌肉萎縮症；抑或是，當SMN1 基因之外顯子7之拷貝數是1的情況下，該人類個體是可被診斷為脊髓性肌肉萎縮症帶因者。

再者，臨床從業人員或本領域具有通常知識者可從SMN1 基因之外顯子8之拷貝數，以及SMN2 基因之外顯子7與8之拷貝數來測定脊髓性肌肉萎縮症的嚴重程度。根據某些實施方式，SMN1 基因外顯子8及SMN2 基因之外顯子7及8的各拷貝數是與脊髓性肌肉萎縮症嚴重程度成反比。

本揭示內容之診斷套組及方法至少在以下五個方面中具有優勢： (1) 第一至第三引子適用於擴增SMN1 基因及SMN2 基因之外顯子7，而第四至第六引子適用於擴增SMN1 基因及SMN2 基因之外顯子8。經由偵測技術(例如，毛細管電泳分析)之分析，本領域技術人員可透過偵測外顯子7及外顯子8之片段所個別形成之峰面積來決定SMN1 基因及SMN2 基因之外顯子拷貝數，從而診斷一個體是否具有脊髓性肌肉萎縮症或是是否為脊髓性肌肉萎縮症帶因者。 (2)可藉由本發明之方法中兩個步驟來擴增SMN1 基因及SMN2 基因之外顯子7與8。具體地，在基因擴增的第一步驟，是藉由第一及第二引子(例如：序列編號：9及10，分別作為正向及反向引子)擴增SMN1 基因外顯子7序列，而藉由第一及第三引子(例如，序列編號：9及11，分別作為正向及反向引子)擴增SMN2 基因外顯子7序列。如此獲得之外顯子7片段在其5’端具有第一非人類序列(例如，序列編號：7)，並在其5’端具有第二非人類序列(例如，序列編號：8)。關於該SMN1 基因外顯子8及SMN2 基因外顯子8之序列，它們分別藉由第四及第五引子(例如，序列編號：12及13，分別作為SMN1 基因外顯子之正向及反向引子)以及第四及第六引子(例如，序列編號：12及14，分別作為SMN2 基因外顯子8序列之正向及反向引子)擴增，從而獲得外顯子8片段在其5’端具有第二非人類序列(例如，序列編號：8)，並在其5’端具有第一非人類序列(例如，序列編號：7)。接著，在基因擴增之第二步驟中，外顯子7及外顯子8片段更可透過與外顯子7與外顯子8片段之第一及第二非人類序列結合，並藉由第七及第八引子(例如，序列編號：7及8)擴增。在第一至第六引子中，第一及第二非人類序列的使用確保期望的多核苷酸序列(例如，SMN1 及SMN2 基因之外顯子7與8之序列)可被有效的擴增，從而使本領域技術人員可準確地定量期望多核苷酸序列之拷貝數。 (3) 一錯配之核苷酸可被引入至第二及/或第三引子的3’端(即，用來擴增SMN1 與SMN2 基因之外顯子7序列之反向引子)，藉此經擴增之SMN1 基因之外顯子7片段可從已被擴增之SMN2 基因之外顯子7之片段區別，因而改善診斷的專一性。根據一例示性的實施方式，第二引子在其3’端包含核苷酸序列「CGG」，其中第一核苷酸「G」是與相對應之SMN1 基因外顯子7之核苷酸「A」錯配；以及第三引子在其3’端包含核苷酸序列「ATA」，其中第一核苷酸「A」是與相對應之SMN2 基因之外顯子7核苷酸「G」錯配。相似地，錯配核苷酸被引入至第五及/或第六引子之3’端中(即，用來擴增SMN1 基因及SMN2 基因之外顯子8序列的正向引子)，其目的是用以增進診斷專一性。 (4) 如上文所述，SMN1 基因外顯子7及SMN2 基因外顯子7之拷貝數的總和應等於SMN1 基因外顯子8及SMN2 基因外顯子8之拷貝數的總和。外顯子7序列之拷貝數之總和不等於外顯子8序列之拷貝數之總和則表示應調整PCR條件及/或在PCR程序時有失誤發生，以及應確認PCR條件及/或應再次執行PCR程序修補PCR失誤。設計內建控制組確保該序列定量之準確度與精確度。 (5)與分析程序耗費許多時間並需要大量DNA樣品的常規方法學比較，透過本揭示內容之套組及方法，10-120 ng的DNA樣品即足以進行分析，且分析程序可以在3小時內完成。

(II-3) 治療脊髓性肌肉萎縮症之方法

基於該存在之揭示於章節(II-2)所描述之診斷結果，臨床從業人員或本領域技術人員可能及時投予脊髓性肌肉萎縮症病患適當的治療因而緩解相關脊髓性肌肉萎縮症之症狀。替代地，在該案例當該個體是被診斷為脊髓性肌肉萎縮症帶因者，接著提供基因學之建議及可用之管理選項。

據此，另一本揭示內容之態樣是關於一方法用以治療一人類個體具有脊髓性肌肉萎縮症。該方法包含， (a) 從人類個體抽取DNA樣品； (b) 於PCR試劑中混合DNA樣品及第一引子至第八引子； (c) 以PCR處理步驟(b)之混合物； (d) 從步驟(c)產物的DNA樣品中確認SMN1 基因外顯子7之第一拷貝數、SMN2 基因外顯子7之第二拷貝數、SMN1 基因外顯子7之第三拷貝數以及SMN2 基因外顯子8之第四拷貝數；其中當第一及第二拷貝數之總和不等於第三及第四拷貝數之總和時，接著重複步驟(b)及(c)，直到第一及第二拷貝數之總和等同於第三及第四拷貝數之總和；以及 (e) 基於步驟(d)測定之第一拷貝數治療脊髓性肌肉萎縮症，其中當第一拷貝數為0，則投予該人類個體一有效量治療劑。

本案治療方法的步驟(a)到(d)與前述的步驟相當類似，因此，為了簡潔，在此省略其詳細說明。

在步驟(e)中，投予一具有脊髓性肌肉萎縮症之人類個體治療劑以減輕或改善脊髓性肌肉萎縮症相關之症狀。治療劑的實例包含，但不限於，諾西那生鈉(商品名：Spinraza®)、立帝安(商品名：Evrysdi^TM )、賽諾基貝帕佛(商品名：Zolgensma®) 或其組合。除此之外或替代地，人類個體可接受脊髓性肌肉萎縮症基因療法或任一其他提供脊髓性肌肉萎縮症有益效果的治療，例如，一侵入療法。再者，臨床從業人員或本領域技術人員可能決定投予個體之劑型方案(例如，投予的頻率，投予之劑量，投予之時間間隔以及治療期間)依據SMN1 基因外顯子8之拷貝數以及SMN2 基因外顯子7與8之拷貝數如前所述反比於脊髓性肌肉萎縮症嚴重程度。

下文提出多個實施例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明。不應將這些實例視為對本發明範圍的限制。無須進一步說明，據信所屬技術領域中具有通常知識者可根據本文的描述，最大限度地利用本發明。本文引用的所有公開文獻均透過引用其整體併入本文。

實施例

材料與方法

PCR 引子

本研究合成八個PCR引子，用以偵測SMN1 基因與SMN2 基因之外顯子7與8的拷貝數。表1分別列出本發明引子之多核苷酸序列。

表1 PCR引子之多核苷酸序列

名稱	多核苷酸序列(自5’端到3’端)*	序列編號
P1	TCGACGCACGCTCCTGCTACA GCAGCCTAATAATTGTTTTCTTTGGG	9
P2	TGACCGTCTGCGCCTCGTTC CCTTCCTTCTTTTTGATTTTGTCGG	10
P3	TGACCGTCTGCGCCTCGTTC ACTTC ACCTTCCTTCTTTTTGATTTTGTATA	11
P4	TCGACGCACGCTCCTGCTACA AGCCATGTCCACCAGTTAGATTC	12
P5	TGACCGTCTGCGCCTCGTTC AAACCATCTGTAAAAGACCGG	13
P6	TGACCGTCTGCGCCTCGTTC ACTTC AAACCATCTGTAAAAGACGGA	14
P7	TCGACGCACGCTCCTGCTACA	7
P8	TGACCGTCTGCGCCTCGTTC	8

* 以底線標示第一非人類序列；以雙底線標示第二非人類序列；而第三非人類序列以粗體標示。

PCR 檢定

將包含表2引子的PCR溶液(1微升)與DNA聚合酶 (0.16 微升)及DNA樣品(2微升)混合，接著透過PCR程序擴增樣品內之DNA分子。 PCR條件總結於表3。

表2 PCR溶液特定成分之濃度

名稱	PCR溶液
最後濃度
10×PCR緩衝液	1×
25毫莫耳濃度MgCl₂	0.5毫莫耳濃度
dATP	0.25 毫莫耳濃度
dTTP	0.25 毫莫耳濃度
dGTP	0.25 毫莫耳濃度
dCTP	0.25 毫莫耳濃度
甜菜鹼	1.85 莫耳濃度
1×三羥甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸緩衝液	1×
PCR引子	P1： 0.85微莫耳濃度	P5： 1.2 微莫耳濃度	ACTB_F： 0.5微莫耳濃度
P2： 0.85微莫耳濃度	P6： 1.2 微莫耳濃度	ACTB_R： 0.5微莫耳濃度
P3： 0.85微莫耳濃度	P7：3.0微莫耳濃度	HBB_F： 0.45微莫耳濃度
P4：1.2 微莫耳濃度	P8：3.0微莫耳濃度	HBB_R： 0.45微莫耳濃度

(1)各PCR溶液的最後體積：18微莫耳濃度。 (2) 總反應體積：20.16微升，包括18微升之PCR溶液、0.16微升之DNA聚合酶以及2微升之DNA樣品。 (3) ACTB_F：肌動蛋白β基因之正向引子，序列編號：15；ACTB_R：肌動蛋白β基因之反向引子，序列編號：16； HBB_F：血紅素蛋白β基因之正向引子，其序列編號：17；HBB_R：血紅素蛋白β基因之反向引子，序列編號：18。肌動蛋白β(ACTB)基因及血紅素蛋白β(HBB)基因在本揭示內容作為內部控制組。

表3 擴增DNA片段的PCR條件

PCR條件
	95°C / 5 分鐘
25次循環	95°C / 30秒
57°C / 30秒
72°C / 30秒
	72°C / 30分鐘
	4°C / 隔夜

PCR程序之後，將0.5微升的PCR產物與0.5微升之DNA片段尺寸分析試劑(LIZ^® size standard)及9微升之去離子甲醯胺混合，並藉由毛細管電泳分析。從該電泳可得到對應於SMN1 基因外顯子7、SMN1 基因外顯子8、SMN2 基因外顯子7及SMN2 基因外顯子8的PCR產物的四個峰面積，接著以持家基因(即，透過ACTB_F、ACTB_R、HBB_F 及 HBB_R擴增的PCR產物)以及內部控制組之峰面積進行標準化。SMN1 基因外顯子7及SMN2 基因外顯子7之拷貝數的總和應等於SMN1 基因外顯子8與SMN2 基因外顯子8的拷貝數的總和。當SMN1 外顯子7與SMN2 基因外顯子7之拷貝數的總和不等於SMN1 基因外顯子8與SMN2 基因外顯子8的拷貝數總和時，修正發生於PCR程序期間的錯誤。

具體而言，先使用以下方程式從每個外顯子基因的峰面積計算出標準化數值 (或者是，峰面積之比值，R)：

其中T代表來自一個體 (即，疑似患有脊髓性肌肉萎縮症或者為脊髓性肌肉萎縮症帶因者個體)，而RS則表示來自一正常健康控制組(即，不具脊髓性肌肉萎縮症也非脊髓性肌肉萎縮症帶因者)的待測樣品。

根據表4闡述的準則，從標準化數值獲得在待測驗品中，每個外顯子序列的拷貝數。

表4 評估外顯子序列拷貝數的準則

拷貝數	標準化數值(R)
0	R ≤ 0.37
1	0.37 ≤ R ＜ 1.41
2	1.41 ≤ R ＜ 2.45
3	2.45 ≤ R ＜ 3.5
≧4	R ≧3.50

個體是否具有脊髓性肌肉萎縮症或是否為脊髓性肌肉萎縮症帶因者，是基於SMN1 基因外顯子7的拷貝數所決定。舉例來說，當拷貝數是等於或大於2(例如：2、3、 4、5或6)，則決定該個體是一健康個體(即，不具有脊髓性肌肉萎縮症也不是脊髓性肌肉萎縮症帶因者的個體)。在拷貝數是1的情況下，決定該個體是一脊髓性肌肉萎縮症帶因者。或者是，當拷貝數是0，則決定該個體是脊髓性肌肉萎縮症患者。脊髓性肌肉萎縮症之嚴重程度更可由SMN1 基因外顯子8的拷貝數及SMN2 基因外顯子7與8之拷貝數所決定，該拷貝數與脊髓性肌肉萎縮症嚴重程度成反比。

製備正常控制組

將分別含有兩個複製的SMN1 基因外顯子7、兩個複製的SMN1 基因外顯子8、兩個複製的SMN2 基因外顯子7以及兩個複製的SMN2 基因外顯子8的載體，以 1：1：1：1之比例混合。最後的濃度是14,500 個複製/微升。

製備突變的樣本

本揭示內容包含四個突變樣品，包括PC01到PC04。突變樣品的成分總結於表5。以ddH₂ O稀釋該些樣品直到其操作濃度分別為5、25或60 ng/μl。

表5 突變樣品的成分

名稱	SMN1 基因外顯子7的拷貝數	SMN2 基因外顯子7的拷貝數	SMN1 基因外顯子8的拷貝數	SMN2 基因外顯子8的拷貝數
PC01	0	1	0	1
PC02	0	2	0	2
PC03	0	3	0	3
PC04	0	4	0	4

製備帶因者樣品

本實驗包含五個帶因者樣品，包括PC05到PC09。帶因者樣品的成分總結於表6。以ddH₂ O稀釋該些樣品至其操作濃度分別為5、25或60 ng/μl。

表6 帶因者樣品的成分

名稱	SMN1 基因外顯子7的拷貝數	SMN2 基因外顯子7的拷貝數	SMN1 基因外顯子8的拷貝數	SMN2 基因外顯子8的拷貝數
PC05	1	0	1	0
PC06	1	1	1	1
PC07	1	2	1	2
PC08	1	3	1	3
PC09	1	4	1	4

製備正常的樣品

本揭示內容包含12個正常樣品，包括 NC01到NC12。正常樣品的成分總結於表7。以ddH₂ O稀釋樣品至其操作濃度分別為5、25或60 ng/μl。

表7 正常樣品的成分

名稱	SMN1 基因外顯子7的拷貝數	SMN2 基因外顯子7的拷貝數	SMN1 基因外顯子8的拷貝數	SMN2 基因外顯子8的拷貝數
NC01	2	0	2	0
NC02	2	1	2	1
NC03	2	2	2	2
NC04	2	3	2	3
NC05	2	4	2	4
NC06	3	0	3	0
NC07	3	1	3	1
NC08	3	2	3	2
NC09	3	3	3	3
NC10	4	0	4	0
NC11	4	1	4	1
NC12	4	2	4	2

製備重複的樣品

本實驗包含三個重複的樣品，包括LPC01、LPC02及LNC01。該重複樣品的成分被總結於表8。以ddH₂ O稀釋該樣品直至其操作濃度分別為5或25 ng/μl。

表 8 重複樣品的成分

名稱	SMN1 基因外顯子7的拷貝數	SMN2 基因外顯子7的拷貝數	SMN1 基因外顯子8的拷貝數	SMN2 基因外顯子8的拷貝數
LPC01	1	0	1	0
LPC02	0	1	0	1
LNC01	2	2	2	2

製備最小 樣品

本實驗包含21個最小樣品包括LOD01至LOD21。最小樣品的成分總結於表9。以ddH₂ O稀釋該樣品直至其操作濃度分別為5、10或15 ng/μl。

表9 重複樣品的成分

名稱	SMN1 基因外顯子7的拷貝數	SMN2 基因外顯子7的拷貝數	SMN1 基因外顯子8的拷貝數	SMN2 基因外顯子8的拷貝數
LOD01	0	1	0	1
LOD02	0	2	0	2
LOD03	0	3	0	3
LOD04	0	4	0	4
LOD05	1	0	1	0
LOD06	1	1	1	1
LOD07	1	2	1	2
LOD08	1	3	1	3
LOD09	1	4	1	4
LOD10	2	0	2	0
LOD11	2	1	2	1
LOD12	2	2	2	2
LOD13	2	3	2	3
LOD14	2	4	2	4
LOD15	3	0	3	0
LOD19	3	1	3	1
LOD17	3	2	3	2
LOD18	3	3	3	3
LOD19	4	0	4	0
LOD20	4	1	4	1
LOD21	4	2	4	2

實施例 1 評估本發明套組的診斷準確度

為了評估本發明套組的準確度，將正常控制組(即：外顯子序列之特定拷貝數的四個載體)、突變樣品(即：PC01至PC04)、帶因者樣品(即：PC05至PC09)及正常樣品(即：NC01至NC12)分別與本發明套組混合，接著進行毛細管電泳分析。每實驗重複三次。根據分析結果，本發明套組能夠鑑別含有SMN1 基因外顯子7、SMN1 基因外顯子8、SMN2 基因外顯子7及SMN2 基因外顯子8(第2圖)，且本發明套組對於在測定拷貝數的準確度，是100% (數據未顯示)。

再者，本發明套組可與重複樣品(即：LPC01、LPC02與LNC01)及最小樣品(即LOD01至LOD21)混合，接著以毛細管電泳分析之。此實驗分別重複十次及二十次。結果顯示本發明套組能夠精確的測定SMN1 基因外顯子7、SMN1 基因外顯子8、SMN2 基因外顯子7及SMN2 基因外顯子8的拷貝數(數據未顯示)。

實施例 2 在人類個體中測定外顯子拷貝數

自143人類個體(包括15位脊髓性肌肉萎縮症患者、20位脊髓性肌肉萎縮症帶因者及108位正常個體)中分離全血樣品。從其抽取的DNA樣品與本發明引子混合，接著根據本揭示內容提及之材料與方法進行處裡。數據總結於表10。

表10 藉由本發明套組測定人類個體外顯子拷貝數

樣本	個體	SMN1 基因外顯子7的拷貝數：SMN2 基因外顯子7的拷貝數/SMN2 基因外顯子8的拷貝數：SMN2 基因外顯子8的拷貝數
MLPA*	本發明套組
1	脊髓性肌肉萎縮症病患	0:2 / 0:2	0:2 / 0:2
2	脊髓性肌肉萎縮症病患	0:2 / 0:2	0:2 / 0:2
3	脊髓性肌肉萎縮症病患	0:2 / 0:2	0:2 / 0:2
4	脊髓性肌肉萎縮症病患	0:3 / 0:3	0:3 / 0:3
5	脊髓性肌肉萎縮症病患	0:3 / 0:3	0:3 / 0:3
6	脊髓性肌肉萎縮症病患	0:3 / 0:3	0:3 / 0:3
7	脊髓性肌肉萎縮症病患	0:3 / 0:3	0:3 / 0:3
8	脊髓性肌肉萎縮症病患	0:4 / 0:4	0:≧4 / 0:≧4
9	脊髓性肌肉萎縮症病患	0:3 / 0:3	0:3 / 0:3
10	脊髓性肌肉萎縮症病患	0:3 / 0:3	0:3 / 0:3
11	脊髓性肌肉萎縮症病患	0:3 / 0:3	0:3 / 0:3
12	脊髓性肌肉萎縮症病患	0:3 / 2:1	0:3 / 2:1
13	脊髓性肌肉萎縮症病患	0:3 / 1:2	0:3 / 1:2
14	脊髓性肌肉萎縮症病患	0:4 / 1:3	0:≧4 / 1:3
15	脊髓性肌肉萎縮症病患	0:2 / 1:1	0:2 / 1:1
16	脊髓性肌肉萎縮症帶因者	1:0 / 1:0	1:0 / 1:0
17	脊髓性肌肉萎縮症帶因者	1:1 / 1:1	1:1 / 1:1
18	脊髓性肌肉萎縮症帶因者	1:1 / 1:1	1:1 / 1:1
19	脊髓性肌肉萎縮症帶因者	1:1 / 1:1	1:1 / 1:1
20	脊髓性肌肉萎縮症帶因者	1:1 / 1:1	1:1 / 1:1
21	脊髓性肌肉萎縮症帶因者	1:2 / 1:2	1:2 / 1:2
22	脊髓性肌肉萎縮症帶因者	1:2 / 1:2	1:2 / 1:2
23	脊髓性肌肉萎縮症帶因者	1:2 / 1:2	1:2 / 1:2
24	脊髓性肌肉萎縮症帶因者	1:2 / 1:2	1:2 / 1:2
25	脊髓性肌肉萎縮症帶因者	1:2 / 1:2	1:2 / 1:2
26	脊髓性肌肉萎縮症帶因者	1:2 / 1:2	1:2 / 1:2
27	脊髓性肌肉萎縮症帶因者	1:2 / 1:2	1:2 / 1:2
28	脊髓性肌肉萎縮症帶因者	1:2 / 1:2	1:2 / 1:2
29	脊髓性肌肉萎縮症帶因者	1:3 / 1:3	1:3 / 1:3
30	脊髓性肌肉萎縮症帶因者	1:3 / 1:3	1:3 / 1:3
31	脊髓性肌肉萎縮症帶因者	1:4 / 1:4	1:≧4 / 1:≧4
32	脊髓性肌肉萎縮症帶因者	1:4 / 1:4	1:≧4 / 1:≧4
33	脊髓性肌肉萎縮症帶因者	1:1 / 2:0	1:1 / 2:0
34	脊髓性肌肉萎縮症帶因者	1:3 / 0:4	1:3 / 0:≧4
35	脊髓性肌肉萎縮症帶因者	1:1 /0:2	1:1 / 0:2
36	正常個體	2:0 / 2:0	2:0 / 2:0
37	正常個體	2:0 / 2:0	2:0 / 2:0
38	正常個體	2:0 / 2:0	2:0 / 2:0
39	正常個體	2:0 / 2:0	2:0 / 2:0
40	正常個體	2:0 / 2:0	2:0 / 2:0
41	正常個體	2:0 / 2:0	2:0 / 2:0
42	正常個體	2:0 / 2:0	2:0 / 2:0
43	正常個體	2:1 / 2:1	2:1 / 2:1
44	正常個體	2:1 / 2:1	2:1 / 2:1
45	正常個體	2:1 / 2:1	2:1 / 2:1
46	正常個體	2:1 / 2:1	2:1 / 2:1
47	正常個體	2:1 / 2:1	2:1 / 2:1
48	正常個體	2:2 / 2:2	2:2 / 2:2
49	正常個體	2:2 / 2:2	2:2 / 2:2
50	正常個體	2:2 / 2:2	2:2 / 2:2
51	正常個體	2:2 / 2:2	2:2 / 2:2
52	正常個體	2:2 / 2:2	2:2 / 2:2
53	正常個體	2:2 / 2:2	2:2 / 2:2
54	正常個體	2:2 / 2:2	2:2 / 2:2
55	正常個體	2:2 / 2:2	2:2 / 2:2
56	正常個體	2:2 / 2:2	2:2 / 2:2
57	正常個體	2:2 / 2:2	2:2 / 2:2
58	正常個體	2:2 / 2:2	2:2 / 2:2
59	正常個體	2:2 / 2:2	2:2 / 2:2
60	正常個體	2:3 / 2:3	2:3 / 2:3
61	正常個體	2:3 / 2:3	2:3 / 2:3
62	正常個體	2:3 / 2:3	2:3 / 2:3
63	正常個體	2:3 / 2:3	2:3 / 2:3
64	正常個體	2:3 / 2:3	2:3 / 2:3
65	正常個體	2:3 / 2:3	2:3 / 2:3
66	正常個體	2:4 / 2:4	2:≧4 / 2:≧4
67	正常個體	2:4 / 2:4	2:≧4 / 2:≧4
68	正常個體	2:4 / 2:4	2:≧4 / 2:≧4
69	正常個體	2:4 / 2:4	2:≧4 / 2:≧4
70	正常個體	2:5 / 2:5	2:≧4 / 2:≧4
71	正常個體	3:0 / 3:0	3:0 / 3:0
72	正常個體	3:0 / 3:0	3:0 / 3:0
73	正常個體	3:0 / 3:0	3:0 / 3:0
74	正常個體	3:0 / 3:0	3:0 / 3:0
75	正常個體	3:0 / 3:0	3:0 / 3:0
76	正常個體	3:0 / 3:0	3:0 / 3:0
77	正常個體	3:1 / 3:1	3:1 / 3:1
78	正常個體	3:1 / 3:1	3:1 / 3:1
79	正常個體	3:1 / 3:1	3:1 / 3:1
80	正常個體	3:1 / 3:1	3:1 / 3:1
81	正常個體	3:1 / 3:1	3:1 / 3:1
82	正常個體	3:1 / 3:1	3:1 / 3:1
83	正常個體	3:1 / 3:1	3:1 / 3:1
84	正常個體	3:2 / 3:2	3:2 / 3:2
85	正常個體	3:2 / 3:2	3:2 / 3:2
86	正常個體	3:2 / 3:2	3:2 / 3:2
87	正常個體	3:2 / 3:2	3:2 / 3:2
88	正常個體	3:2 / 3:2	3:2 / 3:2
89	正常個體	3:2 / 3:2	3:2 / 3:2
90	正常個體	3:2 / 3:2	3:2 / 3:2
91	正常個體	3:3 / 3:3	3:3 / 3:3
92	正常個體	3:3 / 3:3	3:3 / 3:3
93	正常個體	3:3 / 3:3	3:3 / 3:3
94	正常個體	3:3 / 3:3	3:3 / 3:3
95	正常個體	3:4 / 3:4	3:≧4 / 3:≧4
96	正常個體	3:5 / 3:5	3:≧4 / 3:≧4
97	正常個體	4:0 / 4:0	≧4:0 / ≧4:0
98	正常個體	4:0 / 4:0	≧4:0 / ≧4:0
99	正常個體	4:1 / 4:1	≧4:1 / ≧4:1
100	正常個體	4:1 / 4:1	≧4:1 / ≧4:1
101	正常個體	4:1 / 4:1	≧4:1 / ≧4:1
102	正常個體	4:2 / 4:2	≧4:2 / ≧4:2
103	正常個體	4:2 / 4:2	≧4:2 / ≧4:2
104	正常個體	4:2 / 4:2	≧4:2 / ≧4:2
105	正常個體	4:2 / 4:2	≧4:2 / ≧4:2
106	正常個體	4:2 / 4:2	≧4:2 / ≧4:2
107	正常個體	4:2 / 4:2	≧4:2 / ≧4:2
108	正常個體	4:3 / 4:3	≧4:3 / ≧4:3
109	正常個體	4:4 / 4:4	≧4:≧4 / ≧4:≧4
110	正常個體	4:4 / 4:4	≧4:≧4 / ≧4:≧4
111	正常個體	4:4 / 4:4	≧4:≧4 / ≧4:≧4
112	正常個體	4:4 / 4:4	≧4:≧4 / ≧4:≧4
113	正常個體	5:1 / 5:1	≧4:1 / ≧4:1
114	正常個體	5:1 / 5:1	≧4:1 / ≧4:1
115	正常個體	5:1 / 5:1	≧4:1 / ≧4:1
116	正常個體	5:1 / 5:1	≧4:1 / ≧4:1
117	正常個體	5:2 / 5:2	≧4:2 / ≧4:2
118	正常個體	5:2 / 5:2	≧4:2 / ≧4:2
119	正常個體	5:3 / 5:3	≧4:3 / ≧4:3
120	正常個體	5:3 / 5:3	≧4:3 / ≧4:3
121	正常個體	6:1 / 6:1	≧4:1 / ≧4:1
122	正常個體	2:3 / 3:2	2:3 / 3:2
123	正常個體	2:3 / 3:2	2:3 / 3:2
124	正常個體	2:3 / 3:2	2:3 / 3:2
125	正常個體	1:3 / 3:1	1:3 / 3:1
126	正常個體	2:2 / 1:3	2:2 / 1:3
127	正常個體	2:2 / 1:3	2:2 / 1:3
128	正常個體	2:2 / 1:3	2:2 / 1:3
129	正常個體	2:3 / 1:4	2:3 / 1:≧4
130	正常個體	3:2 / 2:3	3:2 / 2:3
131	正常個體	3:1 / 2:2	3:1 / 2:2
132	正常個體	3:2 / 4:1	3:2 / ≧4:1
134	正常個體	3:3 / 4:2	3:3 / ≧4:2
135	正常個體	2:1 / 1:2	2:1 / 1:2
136	正常個體	2:2 / 4:0	2:2 / ≧4:0
137	正常個體	2:1 / 3:0	2:1 / 3:0
138	正常個體	2:1 / 1:2	2:1 / 1:2
139	正常個體	2:2 / 3:1	2:2 / 3:1
140	正常個體	2:3 / 4:1	2:3 / ≧4:1
141	正常個體	4:1 / 3:2	≧4:1 / 3:2
143	正常個體	5:5 / 4:6	≧4:≧4 / ≧4:≧4

* MLPA：多重連結探針擴增法，其作為本揭示內容之正控制組。

依據表10及第3圖到第5圖之結果，本發明套組可以精確測定人類個體外顯子的拷貝數，進而鑑定脊髓性肌肉萎縮症病患、脊髓性肌肉萎縮症帶因者及正常個體。

應當理解的是，前述對實施方式的描述僅是以實施例的方式給出，且本領域所屬技術領域中具有通常知識者可進行各種修改。以上說明書、實施例及實驗結果提供本發明之例示性實施方式之結構與用途的完整描述。雖然上文實施方式中揭露了本發明的各種具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。

10SMN1 :基因 103SMN1 :基因外顯子7 105SMN1 :基因外顯子8 111:第一引子 113:第二引子 115:第五引子 117:第四引子 121:第一多核苷酸序列 123:第二多核苷酸序列 125:第五多核苷酸序列 127:第四多核苷酸序列 20SMN2 :基因 203SMN2 :基因外顯子7 205SMN2 :基因外顯子8 213:第三引子 215:第六引子 223:第三多核苷酸序列 225:第六多核苷酸序列 310:第一非人類序列 320:第二非人類序列

為使本發明內容更易理解，以下將配合圖示說明：

第1圖繪示本發明引子設計之示意圖。

第2圖是一電泳圖，其根據本揭示內容實施例1繪示正常控制組的分析結果，其中正常控制組含有四個載體，分別帶有SMN1 基因之外顯子7之兩個拷貝數、SMN1 基因之外顯子8之兩個拷貝數、SMN2 基因之外顯子7之兩個拷貝數及SMN2 基因之外顯子8之兩個拷貝數。分析結果指出在正常控制組，SMN1 基因之拷貝數與SMN2 基因之拷貝數之比例是2:2。

第3圖是一電泳圖，其根據本揭示內容實施例2繪示從脊髓性肌肉萎縮症病患分離之DNA樣品的分析結果。該分析結果呈現脊髓性肌肉萎縮症病患DNA樣品中，SMN1 基因之拷貝數與SMN2 基因之拷貝數之比例是0:2。

第4圖是一電泳圖，其根據本揭示內容之實施例2繪示，從脊髓性肌肉萎縮症帶因者分離之DNA樣品之分析結果。該分析結果呈現脊髓性肌肉萎縮症帶因者之DNA樣品中，SMN1 基因之拷貝數與SMN2 基因之拷貝數之比例是1:3。

第5圖是一電泳圖，其根據本揭示內容之實施例2繪示，從正常個體分離之DNA樣品的分析結果。該分析結果呈現在正常個體的DNA樣品中，SMN1 基因之拷貝數與SMN2 基因之拷貝數之比例是3:2。

根據慣例，各種描述的特徵/元件未按比例繪製，而是繪製成可最佳闡述與本發明相關的特定特徵/元件。此外，在各附圖圖式中，相同的元件符號和標記用於指示相同的元件/部件。

10:SMN1基因

103:SMN1基因外顯子7

105:SMN1基因外顯子8

111:第一引子

113:第二引子

115:第五引子

117:第四引子

121:第一多核苷酸序列

123:第二多核苷酸序列

125:第五多核苷酸序列

127:第四多核苷酸序列

20:SMN2基因

203:SMN2基因外顯子7

205:SMN2基因外顯子8

213:第三引子

215:第六引子

223:第三多核苷酸序列

225:第六多核苷酸序列

310:第一非人類序列

320:第二非人類序列

Claims

一種用以診斷一人類個體是否具有脊髓性肌肉萎縮症(spinal muscular atrophy，SMA)或是否為一脊髓性肌肉萎縮症帶因者之套組，包含：一第一引子，其包含一具有序列編號：1之一第一多核苷酸序列，以及一設置並連接至該第一多核苷酸序列5’端之第一非人類序列，其中該第一非人類序列具有序列編號：7之多核苷酸序列；一第二引子，其包含一具有序列編號：2之一第二多核苷酸序列，以及一設置並連接至該第二多核苷酸序列5’端之第二非人類序列，其中該第二非人類序列具有序列編號：8之多核苷酸序列；一第三引子，其包含一具有序列編號：3之一第三多核苷酸序列，以及該設置並連接至該第三多核苷酸序列5’端之第二非人類序列；一第四引子，其包含一具有序列編號：4之一第四多核苷酸序列，以及該設置並連接至該第四多核苷酸序列5’端之第一非人類序列；一第五引子，其包含一具有序列編號：5之一第五多核苷酸序列，以及該設置並連接至該第五多核苷酸序列5’端之第二非人類序列；一第六引子，其包含一具有序列編號：6之一第六多核苷酸序列，以及該設置並連接至該第六多核苷酸序列5’端之第二非人類序列；一第七引子，由該第一非人類序列所組成；一第八引子，由該第二非人類序列所組成；以及聚合酶連鎖反應(PCR)試劑。
如請求項1所述之套組，其中該第二引子或該第三引子更包含一第三非人類序列，其中該第三非人類序列具有ACTTC之多核苷酸序列，其中當該第三非人類序列存在於該第二引子內，該第三非人類序列是設置在該第二非人類序列以及該第二多核苷酸序列之間；或當該第三非人類序列存在於該第三引子內，該第三非人類序列是設置在該第二非人類序列以及該第三多核苷酸序列之間。
如請求項1所述之套組，其中該第五引子或該第六引子更包含一第三非人類序列，其中該第三非人類序列具有ACTTC之多核苷酸序列，其中當該第三非人類序列存在於該第五引子內，該第三非人類序列是設置在該第二非人類序列以及該第五多核苷酸序列之間；或當該第三非人類序列存在於該第六引子內，該第三非人類序列是設置在該第二非人類序列以及該第六多核苷酸序列之間。
如請求項2或3所述之套組，其中該第一引子具有序列編號：9之多核苷酸序列；該第二引子具有序列編號：10之多核苷酸序列；該第三引子具有序列編號：11之多核苷酸序列；該第四引子具有序列編號：12之多核苷酸序列；該第五引子具有序列編號：13之多核苷酸序列；該第六引子具有序列編號：14之多核苷酸序列；該第七引子具有該序列編號：7之多核苷酸序列；以及該第八引子具有該序列編號：8之多核苷酸序列。
如請求項1所述之套組，其中該第八引子係與一報導分子共軛。
如請求項1所述之套組，更包含兩DNA模板，其中在該第一DNA模板之多核苷酸序列中，其具有兩個拷貝數的β肌動蛋白基因；以及在該第二DNA模板之多核苷酸序列中，其具有兩個拷貝數的血紅素β基因。
一種利用如請求項1所述之套組，從一人類個體之一DNA樣品做出該人類個體是否帶有脊髓性肌肉萎縮症或是該人類個體是否為一脊髓性肌肉萎縮症帶因者之診斷方法，包含，(a)於該PCR試劑中混合該DNA樣品及該第一引子至該第八引子；(b)將該步驟(a)之混合物接受聚合酶連鎖反應；(c)確認來自於該步驟(b)產物之該DNA樣品中，運動神經元存活基因1(survival of motor neuron 1，SMN1)之外顯子7的一第一拷貝數、運動神經元存活基因2(survival of motor neuron 2，SMN2)之外顯子7的一第二拷貝數、該SMN1之外顯子8的一第三拷貝數以及該SMN2之外顯子8的一第四拷貝數；其中當該第一及該第二拷貝數之總和不等於該第三及該第四拷貝數之總和時，然後重複步驟(a)與(b)直到該第一及該第二拷貝數之總和等同於該第三與該第四拷貝數之總和；以及(d)基於該步驟(c)測定之該第一拷貝數診斷脊髓性肌肉萎縮症，其中當該第一拷貝數為0，即診斷該人類個體具有該脊髓性肌肉萎縮症；或是當該第一拷貝數為1，即診斷該人類個體為該脊髓性肌肉萎縮症帶因者。
如請求項7所述之方法，其中該第一引子具有序列編號：9之多核苷酸序列；該第二引子具有序列編號：10之多核苷酸序列；該第三引子具有序列編號：11之多核苷酸序列；該第四引子具有序列編號：12之多核苷酸序列；該第五引子具有序列編號：13之多核苷酸序列；該第六引子具有序列編號：14之多核苷酸序列；該第七引子具有序列編號：7之多核苷酸序列；以及該第八引子為具有序列編號：8之多核苷酸序列。