CN111349692B - 进行聚合酶链式反应的方法及其相关应用 - Google Patents
进行聚合酶链式反应的方法及其相关应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111349692B CN111349692B CN202010202121.XA CN202010202121A CN111349692B CN 111349692 B CN111349692 B CN 111349692B CN 202010202121 A CN202010202121 A CN 202010202121A CN 111349692 B CN111349692 B CN 111349692B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pcr
- kit
- concentration
- dntps
- melting
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
- C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N25/00—Investigating or analyzing materials by the use of thermal means
- G01N25/02—Investigating or analyzing materials by the use of thermal means by investigating changes of state or changes of phase; by investigating sintering
- G01N25/04—Investigating or analyzing materials by the use of thermal means by investigating changes of state or changes of phase; by investigating sintering of melting point; of freezing point; of softening point
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/124—Animal traits, i.e. production traits, including athletic performance or the like
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Oncology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了进行聚合酶链式反应(PCR)和熔解分析以确定拷贝数变异和/或基因表达的方法和试剂盒。本发明还公开了这些方法和分析的相关应用。
Description
本申请是申请号为201480036694.2、申请日为2014年06月25日、发明名称为“进行聚合酶链式反应的方法及其相关应用”的中国发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明通常地涉及聚合酶链式反应(PCR)。更具体地,本发明涉及限制PCR的方法和进行熔解分析,以及其这种方法和分析的应用。
背景技术
脱氧核糖核酸(DNA)拷贝数变异(CNV)与某些遗传性疾病、染色体重排和癌症相关。
临床实验室通常用于检测CNV的标准方法是荧光原位杂交(FISH)[13,14]。FISH的分辨率是约100千碱基对(kb),但是包含较短片段的CNVs很难用这种方法检测。在人类基因组序列完成后的近十年中[15],一些能够解决更短CNVs的分子检测技术已经显示了存在于正常个体中的结构变异的显著水平。
在上个十年中发展的最流行的技术有阵列比较基因组杂交(CGH)、阵列单核苷酸多态性(SNP)、实时定量PCR(qPCR)和多重连接探针扩增(MLPA)以及大规模平行测序。基于阵列的技术(阵列CGH和阵列SNP)足以用于人类全基因组变异的全球和高分辨率的扫描[16-19]。靶向于阵列的高密度分辨率已经接近了一些碱基对。在最近几年中,新一代测序技术已经用于CNV检测[20,21]。上述方法耗时多并且需要费用较高的设备和试剂。
实时qPCR可以根据跨越循环数目的阈值变化用于计算CNVs(ΔΔCq)[22,23]。这个方法迅速且不需要昂贵的设备。从人类基因组一般观察到的拷贝数变异比率可以是10:1或者更高,或者小至4:3。三体综合征(trisomy)(如:唐氏综合征)涉及的3:2的比率是特别常见的。理论上,qPCR可以用于检测2:1的CNV和甚至三体性,但是在实践中为了获得可信赖的结果需要极大的关注,并且通过qPCR识别较小的比率是非常困难的。qPCR一般用于基因表达,然而,对于拷贝数的确定,qPCR已经在临床上较少应用。
MLPA被广泛应用于在临床实验室中检测遗传性疾病相关CNVs,因为它能够检测基因的大量缺失(deletion)和重复(duplication)(特别是外显子的缺失和重复)[24,25]。然而,MLPA耗时长并且需要长的定制的寡核苷酸探针。除了实时PCR以外,所有这些方法需要至少一天完成。
存在确定CNV和确定基因表达的可选择的快速方法的需要。
发明概述
在此公开限制性PCR和进行熔解分析的方法。这些方法可以用于各种目的,如确定遗传拷贝数变异(CNVs)和确定基因的相对表达水平。
例如,在一些具体实施方式中,该方法包括在限制扩增中通过聚合酶链反应对遗传性样品(genetic sample)的感兴趣区域(或位点(locus))进行扩增。该方法可以进一步包括确定任何产生的扩增子的熔解曲线(melting curve),然后将熔解曲线与作为参考的参考曲线进行比较,其中两条曲线之间的不同显示了遗传性样品在感兴趣区域的拷贝数变异。
在一些具体实施方式中的另外一个实施例中,该方法包括在限制扩增中扩增遗传性样品感兴趣区域并通过聚合酶链反应也扩增参考。该方法可以进一步包括确定感兴趣区域的熔解曲线和参考的参考曲线,然后将感兴趣区域的熔解峰与参考的熔解峰进行比较,其中两个峰之间的不同显示了相对拷贝数和表达水平的不同。
还公开了分析PCR熔解温度数据的方法。该方法包括对遗传性样品和参考样品进行PCR。该方法进一步包括获得未经加工的荧光相对于熔解温度的数据,例如使用光扫描仪获得。该方法可包括从未经加工的荧光相对于熔解温度的数据中去除背景噪声。该方法可以进一步包括标准化所有的熔解温度数据,随后标准化参考荧光峰高度以显示遗传性样品峰的不同。
还提供进行这样方法的试剂盒。
附图说明
图1A说明用不同浓度的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)的双倍扩增。
图1B说明图1A表示的双倍扩增的熔解曲线。
图2A说明在第21个循环停止的聚合酶链反应(PCR)扩增。
图2B说明在第24个循环停止的PCR扩增。
图2C说明在第27个循环停止的PCR扩增。
图2D说明在第30个循环停止的PCR扩增。
图2E说明在第33个循环停止的PCR扩增。
图3A说明在标准dNTP浓度下的PCR熔解曲线。
图3B说明在dNTP浓度为100μM下的PCR熔解曲线。
图3C说明在dNTP浓度为50μM下的PCR熔解曲线。
图3D说明在dNTP浓度为25μM下的PCR熔解曲线。
图3E说明在dNTP浓度为12.5μM下的PCR熔解曲线。
图3F说明在dNTP浓度为6.25μM下的PCR熔解曲线。
图3G说明在dNTP浓度为3.125μM下的PCR熔解曲线。
图3H说明在dNTP浓度为1.56μM下的PCR熔解曲线。
图4A说明在10倍不同浓度的初始样品的PCR扩增。
图4B说明使用本文公开方法的一种具体实施方式的图1A中扩增子的熔解曲线。
图5A说明在标准聚合酶浓度下的PCR熔解曲线。
图5B说明在聚合酶浓度为0.2U/μL下的PCR熔解曲线。
图5C说明在聚合酶浓度为0.1U/μL下的PCR熔解曲线。
图5D说明在聚合酶浓度为0..05U/μL下的PCR熔解曲线。
图6A说明使用本文公开方法的一种具体实施方式的13-三体综合征样品的盲测概况。
图6B说明使用本文公开方法的一种具体实施方式分析18-三体综合征样品的盲测概况。
图6C说明使用本文公开方法的一种具体实施方式分析21-三体综合征样品的盲测概况。
图7说明使用本文公开方法的一种具体实施方式分析性染色体的盲测摘概况。
图8说明使用本文公开方法的一种具体实施方式分析杂合缺失(heterozygousdeletions)。
图9说明使用本文公开方法的一种具体实施方式和不饱和染料分析拷贝数变异。
图10列出了本文大部分实施例使用的引物。碱基对的大小和Tm描述了产生的扩增子。
图11说明使用本文公开方法的一种具体实施方式分析癌症样品的拷贝数变异。
图12说明使用本文公开方法的一种具体实施方式的样品的定量结果。
图13说明通过在此公开方法和常规定量PCR两种具体实施方式确定相对基因表达的相关性。
图14说明通过本文公开方法的一种具体实施方式分析相对基因表达。
图15A说明用104拷贝数扩增具有不同浓度的dNTPs人类基因组DNA的稀释系列质粒DNA(1011 to 101)。
图15B与图15A类似,除了显示的是2×稀释系列(220 to 29)和用214拷贝数混合人类基因DNA。
图16A是相对峰高度对拷贝数比率做图,其中CXCL9扩增子以1011到101拷贝提供,并且用小鼠β-肌动蛋白cDNA作为参考基因(reference gene)的104拷贝扩增。25μM dNTPs用于每一反应中。
图16B说明通过qPCR方法和通过相对峰高度确定的拷贝数之间的相关性。在qPCR方法中,小鼠cDNAβ-肌动蛋白参考基因和目标基因CXCL9通过qPCR被分别扩增。β-肌动蛋白和CXCL9的Cq被用于计算CXCL9的拷贝数。根据图16A的公式来计算通过熔解峰确定的CXCL9。
图17A显示单个等位基因扩增以确定SMA1基因的拷贝数。图17B与图17A相似,但是表示的是单个等位基因扩增以确定SMA2基因的拷贝数。
发明详述
拷贝数变异(CNV)是常见的遗传变异类型。人类基因组大约13%的基因在拷贝数上具有变异[1]。CNVs与人类疾病和群体多样性有关。基因组的结构重排,诸如缺失或重复,可以引起CNVs。许多遗传性疾病是由脱氧核糖核酸(DNA)序列的大区段的遗失或获得导致的。例如,1-3%的囊性纤维化病例是由囊性纤维化跨膜转导调节因子(CTFR)基因的大量缺失导致的拷贝数降低而导致的[2,3]。同样地,乳腺癌病例的类似部分是由1型乳腺癌易感基因(BRCAI)和2型乳腺癌易感基因(BRCAII)的大量缺失导致的。在另外的实施例中,整个染色体发生CNV,诸如在13-三体综合征,18-三体综合征和21-三体综合征。人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的易感性与趋化因子(C-C模体(motif))配体3样蛋白1(CCL3L1)基因拷贝数的增加有关[7,8]。例如,表皮生长因子受体(EGFR)基因的高拷贝数与结肠癌和非小细胞肺癌相关[9-12]。
在此公开测定遗传性CNVs的方法。在一些具体的实施方式中,该方法包括采用聚合酶链式反应(PCR)对遗传性样品的感兴趣区域进行扩增,同时限制感兴趣区域的扩增。该方法进一步包括测定任何得到的扩增子的熔解曲线,然后将熔解曲线与参考的参考曲线比较,其中两曲线之间的不同显示了拷贝数变异的存在。
在具体的细胞、组织和/或器官中测定基因的表达水平由于许多原因是重要的。在此公开了确定基因的相对表达水平的方法。该方法包括采用聚合酶链式反应(PCR)扩增遗传性样品的感兴趣区域并扩增参考样品,同时限制扩增。该方法进一步包括确定感兴趣区域和参考的熔解曲线,然后将感兴趣区域的熔解峰与参考的熔解峰比较,其中两峰之间的不同显示了相对表达水平的不同。
感兴趣区域的限制性扩增可以包括如下一种或多种:(a)在感兴趣区域扩增的平台期之前限制PCR循环的总数目;(b)将PCR过程中存在的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)的量限定至足以降低感兴趣区域的扩增;或(c)将PCR过程中存在的聚合酶的量限定至足以降低感兴趣区域的扩增。
在选项(a)下,PCR循环可以被限制到大约一个循环,在所述一个循环中,扩增的感兴趣区域可区别于也是在扩增过程中产生的背景噪声,在此所述一个循环被称作“循环数定量(quantification cycle)”或者“Cq”。在一些具体实施方式中,PCR循环可以被限定在Cq的正负3个循环内。在一些具体实施方式中,PCR循环可以被限定在Cq的正负2个循环内。在一些具体实施方式中,PCR循环可以被限定在Cq的正负1个循环内。PCR循环是Cq的可以取决于最初的模板拷贝数。在这个方法中,确定CNV之前先确定样品的Cq是必要的。
在选项(b)下,开始PCR之前dNTPs的浓度可以被限制到约为标准PCR反应体系浓度的30%至约为标准PCR反应体系浓度的1%,包括约为标准PCR反应体系浓度的25%,约12.5%,约6.25%,约3.125%,和约1.56%。例如,对于PCR方法一般在开始PCR前可以使用浓度为200微摩尔(μM)的dNTPs,这是常用的标准PCR反应体系浓度,然后dNTPs的浓度可以被限定到约50μM至约3.1μM,包括约25μM,约12.5μM和约6.25μM。虽然本文中使用的实施例对四种dNTP都进行了限定,但是应理解的是,一种,两种或三种dNTPs可以被如此限定,示例性地取决于GC含量。在选项(c)下,开始PCR前的聚合酶的浓度可以被限定到约为标准PCR反应体系浓度的50%至约为标准PCR反应体系浓度的20%,包括约为标准PCR反应体系浓度的25%。例如,对于PCR方法一般使用聚合酶的浓度为约0.04U/μL,然后聚合酶的浓度为约0.02U/μL或约0.01U/μL。
确定遗传性CNV的方法可以进一步包括计算拷贝数的百分率差异和/或遗传性样品拷贝数对参考的比率。确定基因相对表达水平的方法可以进一步包括计算表达水平的百分率差异和/或比率。
对于确定遗传性CNVs的方法,遗传性样品可以包括核酸,诸如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。对于确定基因相对表达水平的方法,遗传性样品可以包括信使核糖核酸(m RNA)。当样品包括RNA,诸如mRNA时,那么该方法可以包括在扩增步骤前对遗传性样品进行反转录。
在该方法一些具体实施方式中,PCR包括终点PCR。例如,终点PCR可以被用于遗传性CNV的相对或绝对测定或基因的相对表达水平。
在该方法一些具体实施方式中,PCR包括实时PCR。
确定遗传性CNVs的方法可以进一步包括在与感兴趣区域的相同反应混合物中扩增参考。参考可以包括遗传性样品感兴趣区域的野生型等位基因。参考可能具有未知的扩增效率。参考的引物与感兴趣区域的引物可能是不同或者相同的。参考的引物浓度与感兴趣区域的引物浓度可能是相同或不同的。
对于确定表达水平的方法,参考可能包括感兴趣区域的基因的同一细胞或组织中表达的看家基因(housekeeping gene)。参考可能具有未知的扩增效率。参考的引物可能不同于感兴趣区域引物。参考的引物的浓度和感兴趣区域的引物浓度可能是相同的或不同的。
在该方法的一些具体实施方式中,遗传性样品的感兴趣区域和参考的扩增子可以从具有最小单核苷酸多态性(SNPs)和其他序列变体中选择。如果杂合突变或SNPs存在于感兴趣区域或参考的扩增子上,相应的熔解峰可能变低和变宽或者展示双峰,并且可能降低检测的准确性。由于同样的原因,感兴趣区域和参考片段可能被选择用于展示单熔解域,这将比标准化参考熔解峰容易。在参考峰上的两个熔解域不可能太困难而不能解释,但是如果感兴趣片段的区域具有两个或更多个熔解域,那么信号可能在峰间劈开,并且对相对表达水平或拷贝数变异的确定可能是更困难的。在一些具体实施方式中,可以对扩增子进行设计以便于感兴趣区域和参考片段各自具有一个熔解域。
在该方法的一些具体实施方式中,在多重PCR中,对于不同的引物,退火和扩增的效率可能是不同的。这可能影响在反应进展中感兴趣区域扩增子和参考扩增子之间的比率,并成为一种结果的不确定性的根源。增加退火时间可以用于补偿效率。退火时间可足以限制时间至避免非特异性产品的扩增。
在该方法的一些具体实施方式中,该方法可能包含收集杂交荧光对熔解温度的数据。
在一些具体实施方式中,荧光一般通过饱和dsDNA结合染料产生,诸如LCGreen,LCGreen+,Syto9,EvaGreen和ResoLight染料,以及其他饱和染料,正如本领域公知的,一些在美国专利号7,456,281中列出,在此合并用于参考。正如本领域公知的,通过不饱和dsDNA结合染料也可以产生荧光。最常用的不饱和dsDNA结合染料是SYBR Green I,而其他常用的不饱和dsDNA结合染料在美国专利号7,582,429的表1中列出,在此也进行合并用于参考。可以理解的是,在纯合基因型中,使用饱和dsDNA结合染料是可取的,以利用这类染料可以提供的精确度。在杂合基因型中,不饱和染料可能是优选的,在杂合基因型由于发生错配可能产生低温度峰和肩峰,并且不饱和染料的重新分布可能最小化这种低温度峰和肩峰。然而,染料的特异性选择可能取决于正在进行的精确分析。在一些具体实施方式中,可以通过标记探针产生荧光。,诸如分子信标、杂交探针、TaqMan探针、蝎子探针(Scorpion probes)、LNA(锁核酸(Locked Nucleic Acid))探针和环化探针。
在某些具体实施方式中,只扩增一个等位基因是可取的。在ARMS PCR(或特异性等位基因的PCR扩增(PASA)),通过位于引物3’末端的单个核苷酸残基的不同能够区分模板,通过这种方式设计引物中的一个。只有效地延长与引物3’末端配对的序列。因此,ARMS引物可以设计用于在保持对其他等位基因扩增阻滞时扩增多等位基因系统中特定的成员,其他等位基因可以提供低至从非互补等位基因的单个碱基。扩增单个等位基因的其他方法在此是已知的和预期的。
当PCR作为扩增方法应用在此实施例中时,可以理解的是,任何通过限制循环数目限制扩增平台期的扩增方法,聚合酶或其他适当酶的量,或dNTPs或NTPs的量,可以是合适的。这种合适的程序包括聚合酶链式反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、核酸基础序列扩增法(NASBA)、级联滚环扩增(CRCA)、环介导等温DNA扩增(LAMP)、等温和嵌合引物开始的核酸扩增(ICAN)、基于解旋酶靶的扩增(HDA)、转录介导的扩增(TMA)以及类似的。因此,当使用术语PCR时,可以理解为包含其他替代的扩增方法。
可以对收集的荧光对熔解温度的数据进行高分辨率的熔解分析。高分辨率熔解分析可以随意地包含标准化温度方面和荧光强度方面的数据。将感兴趣区域的熔解曲线与参考核酸的参考曲线进行比较可以包括标准化熔解峰和观察到感兴趣区域熔解曲线熔解峰高度或面积的不同。见美国专利号7,582,429,在此合并引用用于参开。然而,由于采用负导数确定峰高度,标准化可以不是必要的。
在确定CNVs方法的一些具体实施方式中,相对拷贝数是定量的。在其他一些具体实施方式中,绝对量是定量。对于绝对量的定量,遗传样品浓度可以被标准化。并且,对于绝对定量,参考可以不与遗传样品扩增,并且参考可以包含核准曲线。
在该方法的一些具体实施方式中,相同遗传样品的多个感兴趣区域可以在相同的PCR中扩增。在这样的具体实施方式中,每一感兴趣区域的引物之间可以是不同的,并且优选具有相同或相似的引物Tms。然而,扩增子Tms之间应当通过4-10℃被直观地分开。虽然产品熔解温度能够更接近4℃(例如1-2℃),峰可能开始重叠,并且对于每一产品分配准确的峰高度或面积可能是更困难的。多高斯曲线可能适合用于折叠峰以更好地估计高度和面积,但是避免如果可能分离熔解峰的问题是更容易的。特别的问题是当参考的拷贝数和靶的拷贝数是非常不同时,比如说10:1,那么Tms是接近的。虽然多高斯拟合可能揭示最小峰的存在,在衍生熔解图上甚至没有峰被识别。
确定遗传性CNVs的方法能够检测CNVs,其是使用通过简单限制PCR反应中dNTPs的浓度、DNA聚合酶、循环数目(或其组合)进行的DNA熔解分析。该方法可能实质上比目前现有的应用在定量拷贝数变异的方法更简单、更快速、并且更经济和/或准确。另外,调整模板或修饰或设计特定的寡核苷酸是不需要的。在此公开的方法可以使用任何具有完整熔解的PCR平台或与分离的熔解设备(如LightScanner)的PCR平台。对于一些具体的实施方式,实时PCR不是必须的,但是可以用。在PCR之后只需要5到10分钟来实现该方法。考虑到CNV相关的许多苛刻条件,在检测和定量CNV技术上的这种进步可能是十分有利的。在通过整个基因组方法假定检测之后(CNV阵列、SNP阵列或下一代测序),该方法也可以用于确认拷贝数变异的存在。
还公开了检测胎儿出生缺陷的方法。该方法包括使用上面公开的确定遗传性CNVs的方法之一,并且包括使用包括胎儿DNA的遗传性样品。在一些具体实施方式中,胎儿DNA可以从母体血清中获得。
还公开了检测遗传疾病的方法。该方法包括使用上面公开的确定遗传性CNVs的方法之一。
还公开了确定癌症类型的方法。该方法包括使用上面公开的确定遗传性CNVs的方法之一,并且包括使用来自疑有癌症的组织的遗传性样品。例如,结肠癌和/或肺癌可以被鉴定,其取决于特定CNVs的存在。
还公开确定病人的人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的易感性的方法。该方法包括使用上面公开的确定遗传性CNVs的方法之一,其中遗传样品感兴趣区域包括病人的趋化因子(C-C基序)配体3样蛋白1(CCL3L1)基因的部分。
还公开确定病毒感染水平的方法。该方法包括使用上面公开的确定遗传性CNVs的方法之一,并且包括使用来自病毒感染组织的遗传性样品。该方法可以进一步包括使用装甲病毒作为参考。
还公开分析聚合酶链式反应(PCR)熔解温度数据的方法。该方法进一步包括在至少一个基因位点和参考基因上进行PCR。该方法进一步包括获得荧光相对熔解温度的原始数据。该方法包括从荧光相对熔解温度的原始数据中去除背景噪声。该方法进一步包括标准化剩余熔解温度数据,然后标准化参考荧光峰,用于比较遗传位点峰的峰高度或面积。
去除背景噪声可以包括进行指数背景扣除,虽然其他的背景去除方法是预期的。
可选的剩余熔解温度数据的转换和重叠可以包括将每一结果曲线转化为在曲线之间最小化最小二乘分离。该转化可以包括确定经过特定区间的每一曲线的平均温度,并且通过每一单独的平均值与所有曲线平均值不同来转化每一曲线。特定的区间可以是荧光强度为峰强度的约5%到约15%相对应的温度数据。特定的区间可以是高温度和低杂交区域,其是从指数减少杂交转换的,诸如在荧光对温熔解温度数据的负导数图中最得力的“踝状”区域。
在其他具体实施方式中,参考峰不仅作为荧光密度标准化子,其使得遗传位点峰或面积用以比较,而且作为内部温度对照用以校准由于扩增盘位置或缓冲液的不同而产生样品间轻微的温度差异。然后,参考峰具有2个功能:荧光强度标准化子,和为了获得用于比较的更加准确曲线的温度调节子。
在一些具体实施方式中,标准化剩余熔解温度数据可以应用除了曲线间的最小二乘分离以外的其他标准,诸如,举例来说,最大或平均绝对值、均方根、导数和/或L^p其中p=无限大、1和2。选择的标准也可能加权到荧光强度或温度范围中间、较低或较高附近。另外,每一标准可以被应用到离散数据而不是拟合数据。标准化可以被选择以便于最小化地分离感兴趣区域和参考峰(或包含在该反应中的其他峰)已知的保守特征,其中分离是通过满足标准或距离功能的性质的任何数学定量定义的。
在一些具体实施方式中,标准化剩余熔解温度数据可以包括与遗传性样品扩增一个或两个内部对照。实际峰温度和内部对照的期待峰温度间的不同可以是按比例为感兴趣区域的峰温度。
该方法进一步包括在标准化参考荧光强度峰以比较遗传样品峰之前计算温度标准化数据的负导数。
在其他具体实施方式中,该方法可以包括通过进行非线性最小二乘使用列文伯格-马夸尔特法(Levenberg-Marquart method.)拟合Ce^{rt}的指数去除背景噪声。得到的指数衰变因子“r”作为在拟合窗口点的(平均)温度函数可以用于代替熔解曲线的负导数。去除背景噪声的系统和方法提供在PCT公开号为WO2007/035806的专利文件中,其于2006年9月20日提交,题目为“用指数背景扣除分析熔解曲线”,以及PCT公开号为WO2010/132813的专利文件中,其于2014年5月14日提交,题目为“用于自动熔解曲线分析的系统和方法”。在此将上面的每一个的内容作为参考被整体合并如本文。
该方法可以进一步包括对标准化的荧光峰进行无偏差分层聚类。已知的进行无偏差分层聚类的方法可以被应用,诸如这些公开在本文引用的参考文献27[27]。
该方法也可以进一步包括通过定位标准化荧光峰的目标峰定量相对拷贝数,进行最小二乘拟合,以及计算峰的比率。另外或可选地,可以用曲线面积的比率。同样地,该方法也可以用于定量相对表达水平。
实施例
首先介绍限制性扩增的循环数目、dNTPs和聚合酶的变化对高分辨拷贝数比率定量的影响的研究测定结果,其是根据特定参数被改变进行的。接下来介绍盲测、用10倍样品体积变化的试验、较高的复合、杂合缺失检测和SYBRGreen试验,由于他们都是基于来自较早试验获得的参数和方法。最后介绍示例性说明将在此公开的方法应用在用于确定基因相对表达水平试验中。
具有1,2,3和4拷贝的染色体X的遗传样品提供用于CNV检测方法的研究的有用模板。1和2拷贝的百分率不同是50%,2和3拷贝是33%,以及3和4拷贝是25%。在以下的实施例中,人类细胞株遗传DNA样品从医学研究科里尔协会(Coriell Institute for MedicalResearch)购买得到。样品NA11472是具有标准1个拷贝的染色体X的男性DNA。样品NA18800是具有标准2个拷贝的染色体X的女性DNA。样品NA03623含有3个拷贝的染色体X。样品NA11226含有4个拷贝的染色体X。样品NA1866在CFTR外显子2和外显子3上具有杂合缺失。通过ARUP实验室提供50个遗传DNA样品,一些表现为13-三体综合征、18-三体综合征、21-三体综合征和野生型,并且其他50个样品表现为单倍体、三倍体综合征,以及野生型。使用5Prime DNA提取试剂(飞世尔科技,匹兹堡,PA)(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)直接从残余的干净的绒毛、胎儿身体组织或蜕膜中提取遗传DNA。通过Affymetrix SNP 6.0微阵列已经检测到所有DNA样品的拷贝数变体[26]。
在下面的实施例中,uMelt软件(https://dna.utah.edu/umelt/umelt.html)用于预测拷贝数变异和参考扩增子的熔解曲线和熔解温度(Tms)。Tm在感兴趣(靶)区域和参考扩增子之间的不同被设计为在2℃和10℃之间。研究人类基因组数据库(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov和http://genome.ucsc.edu)以确认靶序列和参考序列唯一地出现在人类基因组中,并且序列变异的可能性是最低的。
在下面的实施例中,参考和靶片段选择如下。
选择染色体7上的囊性纤维化跨膜传导调节自(CFTR)外显子7的片段作为染色体13,18,21,X和Y的CNV检测的参考。选择染色体7上的CFTR外显子6的片段单独作为染色体X的CNV的参考。细胞色素b-245β(CYBB)外显子10的片段也被用作染色体X的CNV的参考。性别决定区Y(SRY)的片段用于染色体Y的CNVs。MIM 104895(NCBI基因库登记号)的片段用于检测染色体13。微管蛋白聚谷氨酰酶复合物亚体-2(TPGS2)外显子4的片段用于染色体18的CNV分析。接近微卫星标记D21S11的片段用于染色体21。染色体21的胺甲基四氢叶酸环化脱氢酶(FTCD)外显子6的片段用作CFTR外显子2和外显子3缺失的参考。图10显示参考和靶的引物序列。
在下面的实施例中,用包含在高分辨熔解分析后的两个或三个扩增子的多重PCR检测CNV或相关基因表达。在下面实施例中,一个成分经常是参考,与一个或两个靶点一起。除非下面进行另外的陈述,PCR试剂包含带有64ng抗Taq抗体(eEnzyme公司)的0.04U/μLKlenTaq1TM(Ab Petides公司),2mM Mg++,50mmol/L mM Tris(pH 8.3),1xPlus(BioFire Diagnostics公司),每一引物0.5μm。用从5ng到200ng不同浓度的遗传DNA和不同浓度的dNTPs进行比较和优化定量分析。PCR以10μL的体积进行。
在PCR完成后,进行高分辨熔解以定量参考和靶的熔解峰比率。用多重PCR检测13,18和21三体综合征。用三重PCR通过比较它们相应CNV熔解峰与参考峰同时测定染色体X和Y的CNVs。用三重PCR检测CFTR外显子2和3的杂合缺失。
PCR在LightCycler 480(Roche公司)上进行。在初始的95℃变性2分钟后,每一循环包括在95℃变性10s,在65℃退火30s,以及在72℃延伸10s,到达平台期。如上描述的每一个高分辨熔解获得物,以0.04℃/s的升温速率从65℃到95℃,其中,15个获得物/℃。所用的退火温度比引物Tms高1-2℃。高的退火温度降低了非特异性扩增的可能。长的退火时间增加了引物高效退火的相似性,以使结果更加准确,并且更短的扩增子不被优先扩增。然而,这种扩增方法仅仅是示例性的,并且可以理解的是可以应用其他扩增方法。
在下面实施例中,几个转化被应用到原始高分辨熔解数据以准确地鉴定和定量拷贝数比率和相对基因表达。在第一步骤,杂交对温度曲线使用指数背景去除提取[27]。在第二步骤中,应用温度域的个别转化到每一结果曲线以最小化曲线间的最小二乘分离。在低的杂交区间[pL,pH]=[.05,.15],这显示观察到的特征依赖于样品。通过找到在这个区间的每一曲线的平均温度获得转换,在之后每一曲线通过各自平均值和所有曲线中数的平均值不同进行转换。曲线的平均温度通过曲线的提取点(tj,pj)找到,其在[.05,.15]区间杂化并且然后翻转他们独立和从属的因变量以使温度成为独立的因变量(pj,,tj)。使用以下方法拟合这些点,最小二乘多项式水平n=2也被称作Savitzky-Golay或简单SG2拟合的式子T(p)=ap2+bp+c[28]。在转换中使用的平均温度是区间[pL,pH]:[a(pH 3-pL 3)/3+b(pH 2-pL 2)/2+c(pH-pL)]/(pH-pL)中T(p)的积分均值。在第三步骤中,通过进行SG2拟合在滑动窗口[T,T+W]内的转化曲线的式子p(T)=aT2+bT+c而计算转换曲线的负导数。通过在每一窗口点的<T>均值上拟合计算负导数而获得负导数曲线上的点(<T>,-p’(<T>)=-(2a<T>+b))。在第四步骤中,提取在它们最大值阈值部分之上每一曲线的参考峰的部分,并且再计算用式子p(T)=aT2+bT+c的SG2拟合。在根据参考峰振幅与所有峰的平均振幅的比率来做每一曲线之后计算顶点的振幅p(-b/(2a))。
可选地,代替上面描述的第二步骤中曲线重叠或温度转换,每一曲线的温度矫正在最后进行,其通过将如上描述的p(T)=aT2+bT+c的一阶导数设定为0(2aT+b=0;T=-b/2a)来确定参考峰的最大温度。然后每一曲线被水平转化到所有曲线的主最大值T。
示例性地,当矫正温标以便与相应参考峰位置相同,这样做加法以保持信号峰的相对分离。因此,温度的自然选择是用加法或算数平均数矫正。这个被限定作为单个数字,其可以加和到本身中代替一些不同的数字以获得相同的总数。例如,2,5和11的加和平均数是6,因为2+5+11=18=6+6+6。这个经常作为平均数提到。因此,n个数的加和平均数表示为a_1,a_2,…,a_n is1/n(a_1+a_2+…+a_n)。
当矫正染料信号比率(示例性地,在背景去除后)时为了相应参考峰高度一致,需要进行多次这样操作,以便保持信号峰的相对高度。因此,信号(负导数)峰高度的自然选择是用乘法的或几何均数矫正。这个被限定作为单个数字,其可以乘以到本身中代替一些不同的数字以获得相同产物。例如,3,8和9的乘法均值是6,因为3*8*9=216=6*6*6.因此,n个数的乘法平均数表示为a_1,a_2,…,a_n is(a_1*a_2*…*a_n)^(1/n),其中1/n次幂表示括号中结果的n次根。
注意的是,保持零信号峰的重要性是令人期望的,其与来自于杂交DNA结合的恒定染料的相应的绝对信号常数相对应。这需要乘法矫正而不是加法矫正。人们可能询问温度的相同需求是否是要求保持绝对的零温度。然而,在试验的温度比率中,针对温度误差的合适模型是同类转换,由于在盘中不同位置获得试验温度不同,或者由于单个样品从一个运行到下一个的设备的细节变化。
因此,正如在此使用的,熔解曲线可以表示原始荧光对温度,或者通过背景扣除矫正,或者衍生峰,进行或没有进行转换或矫正,或任意组合。可以理解的是,熔解数据的这个过程依赖于应用。
通过对重新标定靶峰进行无偏差分层聚类将样品分类为拷贝数变体。通过定位重新标定靶峰定量相对拷贝数,进行再次SG2拟合式子p(T)=aT2+bT+c,并计算顶点振幅的比率。相关基因表达进行类似计算。
实施例1-拷贝数变化研究
进行标准PCR以建立比较的基准点。使用标准PCR浓度的KlenTaq1(0.04U/μL)和dNTP(每200μM),PCR在35个循环后达到平台期,其Cq平均仅是在第24(23.8)个循环之前。在Cq之前和之后不同的循环PCR停止,并且进行熔解和峰比较。当PCR停止在第18个循环时,熔解峰扩增子是不可见的(数据没有显示)。当PCR停止在第21个循环时(在Cq之前),染色体X的4个不同拷贝是可区分,但是PCR的CNV熔解峰和参考是非常低的(图2A)。当PCR停止在第24个循环时(在Cq上),染色体X的四个不同拷贝数也是区分的并且熔解峰信号很强,CNVs与参考的比率与遗传模板的相同(图2B)。当PCR停止在第27个循环(在Cq之后)之后时,消耗更多的引物并且染色体X的3拷贝和4拷贝几乎不能区分彼此(图2C)。因此,CNV检测的灵敏度降低到33%(3:2的情况)。当PCR停止在第30或第33个循环时(基本在平台期前或后),更多的引物再被消耗,并且染色体X的所有4个不同拷贝数是可区分的(图2D和2E)。在第30或第33循环,参考和CNV扩增子的比率可以反映引物的比率而不是最初遗传模板比率。
当限制拷贝数时,Cq循环在通过熔解用于限制PCR以检测CNV上表现最好。通过这个方法区分CNV的能力的灵敏度至少是25%(4:3的情况)。
如果模板浓度不同,Cq可以是不同的,导致从Cq相对可能的Cq的CNV比率检测是不准确的。使用这个方法,反应应当允许进展到它们自己的Cq,而不是设定的循环数,或初始浓度变异可能发生在反应Cq循环的之前或之后,并且可能降低从峰上确定CNV比率的准确性。
从这个实施例1的实验看,当PCR停止在Cq时,熔解峰信号足够强用于检测CNV,并且CNV和参考比率的熔解峰在基因组内是相同的,并且所用的引物与初始模板成比例。如果使PCR达到平台期,这个方法似乎不能工作。在示例性PCR反应中,除了引物和模板,试剂可以包含Mg++,Tris,BSA,Taq聚合酶和dNTPs。限制性的dNTPs和Taq聚合酶浓度(分别地在实施例2和4)限制扩增至当使PCR达到其平台期CNV比率是可区分的水平。
实施例2-dNTPs变化研究
从图3A可以看出在标准200μM dNTP的浓度,当使PCR到达平台期,染色体X的4个不同拷贝样品的熔解峰是不可区分的。
当dNTP的浓度降低至100μM时,1和2拷贝样品峰是可以轻微区分的。50%的CNV比率在这个浓度上勉强能区分,但是33%和25%的CNV是不能的。在100μM dNTP的浓度(图3B),人们认为在35个循环引物延伸开始被限制。
当dNTP的浓度进一步降低至50μM和25μM(分别在图3C和图3D),1,2和3拷贝样品的峰是可以区分彼此的,相当于通过停止标准PCR在Cq之后的一些循环(第27个循环,图2C)的分辨率,因此33%比率的不同CNV是可区分的。
当dNTP的浓度降低至12.5μM,6.25μM和3.125μM时,具有染色体X的1、2、3和4拷贝的样品相对应的熔解峰是清楚地区分的,相当于通过在Cq停止标准PCR(第24个循环,图2C),因此25%比率的不同CNV(4:3)也是可区分的。对于浓度3.125μM的dNTP(图3G),熔解峰信号没有当dNTP的浓度为12.5μM(图3E)或6.25μM(图3F)的强,但是染色体X的1、2、3和4个不同拷贝样品的熔解峰是很好地分离的。当dNTP浓度从12.5μM降至3.12μM(图3G),越低浓度的dNTP,CNV熔解峰越更好地分离。6.25μM的dNTP似乎是染色体中检测CNVs最好的浓度。
当dNTP的浓度进一步降低至1.56μM时(图3H),仅有较短的参考扩增子峰出现,但是染色体X的CNV片段是不存在的。
在标准dNTP浓度(200μM)PCR时,在PCR的较早循环中,较高的Tm(或者较长的扩增子)熔解峰具有较高的振幅熔解峰,并且较低的Tm(或者较短的扩增子)熔解峰具有较低的振幅熔解峰。两种熔解峰首先出现在相同的循环内。这表明两个片段的扩增效率是相同的。当dNTP浓度降低,较高Tm峰的相对振幅降低,并且其的较低Tm峰增加。当dNTP的浓度达到1.56μM时,较低的Tm片段扩增,但是较高的Tm片段根本不扩增(图3H)。这表明随着dNTP浓度降低,较长扩增子的扩增效率降低更快。
图1A说明用不同dNTP浓度多重扩增染色体7的CFTR外显子6的片段和CYBB外显子10的片段。图1B说明图1A中说明的多重扩增的熔解曲线。
随着dNTP浓度从200μM降低到0.78μM,PCR的Cq发生在3个循环后(图1A)。随着dNTP浓度降低,较长扩增子熔解峰的相对振幅降低,而较短扩增子熔解峰增加(图1B)。
通过控制dNTP的浓度进行CNV检测提供了比通过对照PCR循环数而获得的那些具有更好的结果。不受理论的束缚,这可能由于通过降低dNTP浓度的CNV检测保持靶和参考产品的比率在相同的水平,甚至使PCR达到平台期。因为dNTPs是限制性的,CNV和参考的比率被保存,不管初始模板浓度,甚至当PCR到达平台期。如果限制引物浓度,这种比率可能没有必要保持,因为每一引物仅仅影响它的扩增子。
实施例3-模板浓度变化
接下来,10倍不同浓度(5ng和50ng)的使用6.25uM Mg++基因组的DNA模板进行比较。图4A显示5ng和50ng DNA模板的Cq是不同的。但是一旦所有的样品达到PCR平台期,CNV与参考熔解峰的比率不受初始10倍模板浓度不同的影响(图4B)。通过控制dNTP的浓度进行的CNV检测不需要调整模板浓度与结果一致。
实施例4-聚合酶变化
在PCR中保持CNV比率常数,甚至使用标准dNTP浓度(200μM)时,Taq聚合酶也能用于限制PCR。在标准KlenTaq1聚合酶浓度(0.04U/μL)下,染色体X的4个不同拷贝数相应的熔解峰一般是不能区分的(图5A)。在0.02U/μL KlenTaq1下,具有染色体X的2和3个拷贝的样品相应的熔解峰是分离的,但是分离小(图5B)。在0.01U/μL KlenTaq1下,1和2个拷贝的样品相应的熔解峰是很好地分离的(图5C)。在0.005U/μL KlenTaq1聚合酶下,只有较短的扩增子扩增(图5D)。KlenTaq1聚合酶在0.005U/μL下,没有片段扩增可以检测到。
实施例5-盲法研究1:13、18和21三体综合征
13、18和21三体综合征在人类中最常见。野生型CNV和参考的比率是1(2:2);三体综合征的CNV和参考的比率是1.5(3:2),或者在最高峰(三体综合征)和最小参考峰之间33%不同。用6.25μM dNTP的多重PCR进行13、18和21三体综合征的盲测。扩增包含有13、18和21三体综合征和野生型样品的预先确定类型的50个样品,具有初始浓度从10ng/μL到200ng/μL。所有三体综合征和野生型样品保持它们的拷贝数比率直到PCR平台期。三体综合征和野生型是容易区分的,其实通过检查CNV熔解峰的振幅,也可通过无偏差分层聚类系统地和自动地获得。样品中的9个被鉴定为13三体综合征(图6A),8个为18三体综合征(图6B),13个为21三体综合征(图6C)以及30个野生型。野生型的2:2拷贝比率和三体综合征样品熔解峰3:2的拷贝比率是清楚地区分的。确定CNV与之前建立的基因型是完全相关的。根据自动分类法盲测的灵敏度和特异性均是100%。
使用通过不调整模板浓度计算实时PCR的ΔΔCq进行CNV检测的标准方法分析相同的样品[22]。使用这个方法不能将三体综合征与野生型区分。对于2:2的基因组拷贝数比率,ΔΔCq等于0。野生型和三体综合征表现为3:2的比率,其ΔΔCq小于1,这是很难被可靠地检测到。
实施例6-盲法研究2:染色体X和Y的拷贝数
正常男性的染色体7和染色体X和染色体Y的拷贝数比率是2:1:1,正常女性是2:2:0,在染色体细胞株NA03623中,其是2:3:0。标准化一个染色体7拷贝,正常男性的染色体7和染色体X和染色体Y的拷贝数比率是1:0.5:0.5;正常女性是1:1:0,在三拷贝染色体细胞株(cell line)NA03623中,其是1:1.5:0(图7中的表2)。表1提供了图7表示的样品的染色体拷贝数。
将具有三倍体性染色体异常和野生型的预先确定类型的50个样品用于性染色体CNV盲测,该盲测使用去除6.25μM dNTP的标准PCR混合物进行三重PCR。野生型男性和女性样品通过染色体X和Y的拷贝数比率容易区分(图7)。22个样品显示与正常女性具有相同的比率。这些可能是野生型或染色体X的3拷贝的三倍体。6个样品显示为染色体7的2拷贝和染色体X的1拷贝而没有染色体Y。8个显示与正常男性具有相同的比率;11个显示染色体X的2拷贝和染色体Y的1拷贝(图7)。除了阵列分析显示染色体X的1拷贝和染色体Y的没有拷贝的两个样品外,所有样品的CNV比率被正确地分类型。使用微阵列重新分析这两个样品并发现在位点分析上是野生型的。
实施例7-杂合缺失的检测
约1-3%的遗传性疾病与杂合大量缺失有关。这些缺失可以包括一个或多个外显子或甚至整个基因。在这项研究中,将在细胞株NA18668中CFTR外显子2和外显子3杂合缺失作为例子。用三重PCR同时检测CFTR外显子2和外显子3的缺失。选择用于CNV检测的CFTR外显子2和外显子3的短扩增子,以将产生不期待变体可能性降到最低,例如能够影响实验中扩增的SNPs。在这些研究中,CFTR外显子2(Tm 73℃)和外显子3(Tm 77℃)的靶扩增子的Tms低于染色体21(Tm 83℃)的参考扩增子的Tm。从拷贝数比率与野生型比较看出,细胞株NA18668清楚地在CFTR外显子2和外显子3具有杂合缺失(图8)。这项研究也确认了在设计参考和靶扩增子用于确定拷贝数变异的,Tms的相对顺序可以是随机的并且不会影响分析的效率。
实施例8-SYBR Green研究
应用SYBR Green代替LCGreen Plus用于CNV检测。从他们在dNTP浓度为12.5μM(未显示)和6.25μM(图9)的熔解峰可以区分1,2和3拷贝数的样品。
实施例9-EGFR研究
EGFR拷贝数变化可以是肺癌致病机理和靶向治疗的重要标记物。ARUP实验室提供的来自八个没有鉴定的病人的用于福尔马林填充的和石蜡嵌入的肺肿瘤提取的DNA。每一样品中DNA的量是没有测定的。CFTR外显子7用作DNA靶的参考以估计EGFRDNA的水平(来自外显子20的扩增子)。多重PCR反应(10μL)包含0.5μM的正向和反向引物,6.25μM dNTP,0.4UKlenTaq1TM(抗体肽(Ab Peptides)),64ng抗Taq抗体(eEnzyme),2mM Mg,50mM Tris(pH8.3),500μg/ml牛血清白蛋白,1xPlus(BioFire Diagnostics)和1μL肿瘤DNA或25ng野生型DNA。在LightCycler 480(Roche)上进行PCR,在95℃变性两分钟,接着进行40个循环在95℃下10s,65℃下30s,并且72℃下10s。进行高分辨熔解获得物是以0.04℃/s的温速率从65℃到95℃,15个获得物/℃。采用实施例1-8相同的方法分析数据。图11显示使用8个非小细胞肺癌(NSCLC)样品的CFTR外显子7和EGFR,以及1个野生型参考的多重PCR扩增。NSCLC样品(#02)之一EGFR具有与野生型相同的拷贝数(2拷贝)。其他显示在EGFR拷贝上的增加,EGFR拷贝数比野生型高(或者大于2拷贝/细胞)。
实施例10-定量
在PCR中限制dNTP浓度的方法可以用于定量。CFTR基因,外显子27,被用作参考。引物序列在图10中显示。用不同的稀释质粒作为定量的靶。制备了连续的2倍质粒稀释从10^6拷贝到7.8x10^3拷贝(128倍)。如在图12的示例性说明,所有的模板浓度是可以区分的。
实施例11-使用两步PCR的相对基因表达
图13示例性说明了通过下述步骤确定的相对基因表达的相关性:1)用限制dNTPs进行多重PCR(面积或峰高度)和分析在此公开的熔解数据的方法;并且2)常规定量PCR(ΔCq)。用多个不同的伯氏疏螺旋体(Borelia Burgdorferi)和Poly I/C(聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸)组合处理小鼠细胞株来测定小鼠Oasl2基因的表达。β-肌动蛋白和Oasl2的引物序列和PCR扩增子的大小在图10中显示。将研究用的小鼠细胞株B6,CBCb1,C3H,C3H/HeN,IFNARO/BL6和IFNARO/C3H进行三倍体化。使用小鼠RiboPureTM-血液RNA分离试剂盒提取mRNA(Mouse RiboPureTM-Blood RNA Isolation Kit)并且使用II(LifeTechnologies)对RNAs进行反转录。相对Oasl2基因表达通过2个方法测量。首先,进行qPCR,并且在用20ng-50ng的cDNA扩增后确定β-肌动蛋白和Oasl2之间的ΔCq。第二,熔解后,在限制的dNTP多重PCR中(使用β-肌动蛋白作为参考)使用相同的cDNA。PCR试剂和方法与实施例9相同。测量Oasl2的熔解峰高度和面积并标准化到β-肌动蛋白对照的这些。
qPCR得到的ΔCq和用限制性dNTPs的多重PCR之间的相关,使用的熔解峰高度或峰面积是高的(R2=0.9788和R2=0.9678)。在与ΔCq相比较少使用限制性dNTPs的三倍体化和与2个反应比较仅仅需要一个PCR反应之间做标准差。
实施例12-使用一步逆转录PCR的相对基因表达
图14示例性说明用限制性dNTPs以6.25μM的浓度对四个小鼠RNA样品进行多重一步反转录PCR。将β-肌动蛋白作为参考基因,并且Oasl2作为靶。三个小鼠细胞株(B6,B34和Cg)暴露于Borelia Burgdorferi。来自小鼠血液的RNA,并且使用小鼠RiboPureTM-血液RNA分离试剂盒(Mouse RiboPureTM-Blood RNA Isolation Kit)(生命科技公司)(LifeTechnologies)提取三个细胞株。RT-PCR的一个步骤在20μL的50μM dNTPs,3mM MgCl2,500μg/ml牛血清白蛋白,0.5XPlus(BioFire Diagnostics公司),0.5μM的每一引物,0.4U KlenTaq1TM(Ab Petides),64ng抗-Taq抗体(eEnzyme),0.6U转录子反转录酶(Roche)以及50到200ng纯化的RNA。RT-PCR在LightCycler 480(Roche)如下进行:在42℃反转录15分钟,在初始的95℃变性15秒后,然后在95℃下10秒并在62℃下30秒,进行40个循环。紧跟着产生PCR熔解曲线,并且如前面描述的进行分析。为了进行对比,使用II反转录试剂盒获得cDNA进行的qPCR获得的ΔCqs。ΔCq和熔解峰高度相关很好。在4个小鼠样品中,Oasl2峰高度的不同反映了Oasl2基因表达相对于β-肌动蛋白的不同。
小鼠血液和细胞B6中Oasl2基因表达水平是相同的,而在ΔCq和熔解峰高度细胞B34和Cg表达的较Oasl2少(图14)。这个一步PCR也可以与β-肌动蛋白和Oasl2的两步PCR获得结果进行比较,其将用于反转录的随机六聚物作为具有200μM的标准dNTP浓度的第一步骤,随后用6.25μM浓度的dNTP进行第二步qPCR。各技术间的结果相关性好。
实施例13-稀释系列的标准曲线
图15A示例性说明了从使用质粒DNA的稀释系列产生标准曲线,其具有1011到101拷贝,与104拷贝的人类基因组DNA一起扩增,使用不同浓度的dNTPs。将人类和质粒DNA浓度之间的比率与相对峰高度相对在人类和质粒DNA之间的相对峰高度做图。在6.25μM dNTPs中看到了拷贝数间最好的分离,虽然所有dNTP浓度显示比率在0.1和1000之间的某些分离。为了进一步开发这个范围,相同质粒的2倍稀释系列在220和29之间使用,并且与214拷贝的人类基因组DNA混合。如在图15B中看到的,6.25μM的dNTPs显示了接近线性关系,具有3.13μM和12.5μM的显示类似的结果,这表明标准曲线可以用于确定高拷贝数。
图16A相关峰高度对拷贝数的比率做图,其中CXCL9扩增子以1011到101拷贝提供,并且用104拷贝的小鼠β-肌动蛋白cDNA作为参考基因扩增。25μM的dNTPs用于每一反应。可以看出在拷贝数和峰高度间相关好。因此,可以理解的是这个公开的方法可以用于确定相对拷贝数或实际拷贝数。图16B示例性说明通过qPCR方法确定的拷贝数与这里公开的方法确定的拷贝数之间线性相关。在qPCR方法中,CXCL9靶基因与小鼠参考基因分开扩增。在峰高度方法中,CXCL9靶用104拷贝的小鼠β-肌动蛋白cDNA参考基因并且25μM的dNTPs进行扩增。可见拷贝数从0.1到100,000相关好,这表明相对峰高度测定可以具有大的动态范围。
实施例14-用拷贝数变异确定的单个等位基因的扩增
脊髓性肌萎缩症(SMA)是一种常见的退行性遗传病。大多数案例是由在SMN1基因的杂合缺失导致的。非常接近的相关基因,SMN2,其与SMN1的不同仅仅在于外显子7的单个碱基(c.840C>T)。SMN1和SMN2两者公用的引物扩增已经被用于建立SMA特征性SMN1杂合缺失[30]。此外,SMN1和SMN2不同部分产生复杂类型的异源双链体,其能与表征基因型的每一基因的拷贝数匹配。在正常个体中,SMN1拷贝数可以从1到4变化,并且SMN2的拷贝数可以从0到6变化。然而,这个方法的一个缺点是恒定比率不能构成区别。例如,SMN1:SMN2的拷贝数是1:1,2:2和3:3,所有这些给出相同的比率和相同的熔解曲线。
为了获得SNM1和SMN2的绝对和相对拷贝数,进行特异性等位基因PCR,使用一种常见的引物和两个ARMS特异性等位基因引物,ARMS特异性等位基因引物的3’端在c.840C或c.840T下配对。每一样品上进行两个反应。每一反应用相同的参考基因和低dNTP浓度多重化,在引物限制之前达到早的平台期。在这个实施例中,在单独的反应中确定SNM1和参考基因的拷贝数比率和SNM2和参考基因的拷贝数,虽然可以理解的是,它们能够在同一个反应中确定,示例性地通过使用等位基因的不同的非-ARMS引物,以产生在每一等位基因的不同熔解峰。它们一起确立了SNM1和SNM2的绝对和相对拷贝数。对于这个实施例中等位基因特异性PCR,每一dNTP的浓度被降低到6.25mM并且每一引物的浓度是0.5uM。
CFTR参考基因的引物序列是:
CFTR外显子6F:TTGTGATTACCTCAGAAATGATTGA(SEQ ID NO:1)和
CFTR外显子6R:CATTGCTTCTTCCCAGCAGT(SEQ ID NO:2),产生50bp的扩增子,其在78.5℃熔解。
用相同的正向引物扩增SMN1和SMN2。
SMAF:TTCCTTTATTTTCCTTACAGGGTTT(SEQ ID NO:27),和2个ARMS等位基因特异性引物;
SMA1R:CCTTCCTTCTTTTTGATTTTGTCTG(SEQ ID NO:28),和
SMA2R:CCTTCCTTCTTTTTGATTTTGTCTA(SEQ ID NO:29),产生48bp的产物,SMN1在74.5℃熔解,SNM2在73.7℃下熔解。
在LC480实时PCR设备(Roche)上进行扩增,在初始的95℃变性2分钟后,然后在95℃下10秒并在62℃下30秒,进行32个循环,变化的速率是2.2℃/s。熔解变温发生在60℃到90℃之间(变温速度为0.06℃/s)。结果见图17A,其显示大多样品是具有2拷贝SMN1,并且图17B显示的是具有0,1,2和3拷贝SMN2。
等位基因特异性PCR与dNTP限制的PCR平台期的结合在基因型的确定和等位基因分数估计(allele fraction estimation)上具有很多应用。例如,类似等位基因特异性PCR可以在从病人反转录的肝炎C或HIV cDNA样品上进行,以确定不同基因型或变体的百分比,其影响各种治疗的预后。逃避治疗是用药物治疗病人的常见问题,并且通过抗性克隆(resistant clones)的扩张证明,通过等位基因特异性PCR和dNTP限制能准确测量抗性克隆。
可以理解的是,在此描述的任何方法需要的材料可以作为试剂盒提供,包括下面中的任一个或全部:
适合用于扩增方法的聚合酶或其他酶;
dNTPs,示例性地,量是低于标准PCR体系浓度,示例性地,50μM或更少,包括约为25μM,12.5μM,6.25μM或3.125μM的浓度,或任何两个浓度之间的浓度;
构建用于扩增靶核酸位点的引物;
构建用于扩增参考核酸的引物,这种引物可以与构建用于扩增靶核酸位点的引物以相同或不同的管提供;和
进行扩增并用于确定靶核酸CNV的方案。
没有进一步详细说明,本领域技术人员能够应用前面说明书最全面地利用本发明公开的内容。在此公开的实施例和具体实施方式只是示例性和举例说明,不能作为以任何方式限制本发明的范围。不背离本发明在此公开的潜在原则的上面描述的具体实施方式的细节上的改变,这些对于本领域技术人员来说是显然的,并且有助于本发明的公开。
参考文献
下面每一参考文献的内容,在此作为整体被合并用于参考。
1.Stankiewicz P,Lupski JR(2010)Structural variation in the humangenome and its role in disease.Annu Rev Med 61:437-455.
2.Schneider M,Hirt C,Casaulta C,Barben J,Spinas R,et al.(2007)Largedeletions in the CFTR gene:clinics and genetics in Swiss patients withCF.Clin Genet 72:30-38.
3.Quemener S,Chen JM,Chuzhanova N,Benech C,Casals T,et al.(2010)Complete ascertainment of intragenic copy number mutations(CNMs)in the CFTRgene and its implications for CNM formation at other autosomal loci.Hum Mutat31:421-428.
4.Hartmann C,John AL,Klaes R,Hofmann W,Bielen R,et al.(2004)LargeBRCA1 gene deletions are found in 3%of German high-risk breast cancerfamilies.Hum Mutat 24:534.
5.Agata S,Dalla Palma M,Callegaro M,Scaini MC,Menin C,et al.(2005)Large genomic deletions inactivate the BRCA2 gene in breast cancer families.JMed Genet 42:e64.
6.Petrij-Bosch A,Peelen T,van Vliet M,van Eijk R,Olmer R,et al.(1997)BRCA1 genomic deletions are major founder mutations in Dutch breast cancerpatients.Nat Genet 17:341-345.
7.Gonzalez E,Kulkarni H,Bolivar H,Mangano A,Sanchez R,et al.(2005)Theinfluence of CCL3L1 gene-containing segmental duplications on HIV-1/AIDSsusceptibility.Science 307:1434-1440.
8.Huik K,Sadam M,Karki T,Avi R,Krispin T,et al.(2010)CCL3L1 copynumber is a strong genetic determinant of HIV seropositivity in Caucasianintravenous drug users.J Infect Dis 201:730-739.
9.Cunningham D,Humblet Y,Siena S,Khayat D,Bleiberg H,et al.(2004)Cetuximab monotherapy and cetuximab plus irinotecan in irinotecan-refractorymetastatic colorectal cancer.N Engl J Med 351:337-345.
10.Hirsch FR,Varella-Garcia M,Cappuzzo F,McCoy J,Bemis L,et al.(2007)Combination of EGFR gene copy number and protein expression predicts outcomefor advanced non-small-cell lung cancer patients treated with gefitinib.AnnOncol 18:752-760.
11.Algars A,Lintunen M,Carpen O,Ristamaki R,Sundstrom J(2011)EGFRgene copy number assessment from areas with highest EGFR expression predictsresponse to anti-EGFR therapy in colorectal cancer.Br J Cancer 105:255-262.
12.Dahabreh IJ,Linardou H,Kosmidis P,Bafaloukos D,Murray S(2011)EGFRgene copy number as a predictive biomarker for patients receiving tyrosinekinase inhibitor treatment:a systematic review and meta-analysis in non-small-cell lung cancer.Ann Oncol 22:545-552.
13.Visakorpi T,Hyytinen E,Kallioniemi A,Isola J,Kallioniemi OP(1994)Sensitive detection of chromosome copy number aberrations in prostate cancerby fluorescence in situ hybridization.Am J Pathol 145:624-630.
14.Wang F,Fu S,Shao Q,Zhou YB,Zhang X,et al.(2013)High EGFR copynumber predicts benefits from tyrosine kinase inhibitor treatment for non-small cell lung cancer patients with wild-type EGFR.J Transl Med 11:90.
15.International Human Genome Sequencing C(2004)Finishing theeuchromatic sequence of the human genome.Nature 431:931-945.
16.Sharp AJ,Locke DP,McGrath SD,Cheng Z,Bailey JA,et al.(2005)Segmental duplications and copy-number variation in the human genome.Am J HumGenet 77:78-88.
17.Urban AE,Korbel JO,Selzer R,Richmond T,Hacker A,et al.(2006)High-resolution mapping of DNA copy alterations in human chromosome 22using high-density tiling oligonucleotide arrays.Proc Natl Acad Sci USA 103:4534-4539.
18.Komura D,Shen F,Ishikawa S,Fitch KR,Chen W,et al.(2006)Genome-widedetection of human copy number variations using high-density DNAoligonucleotide arrays.Genome Res 16:1575-1584.
19.Lai WR,Johnson MD,Kucherlapati R,Park PJ(2005)Comparative analysisof algorithms for identifying amplifications and deletions in array CGHdata.Bioinformatics 21:3763-3770.
20.Xi R,Hadjipanayis AG,Luquette LJ,Kim TM,Lee E,et al.(2011)Copynumber variation detection in whole-genome sequencing data using the Bayesianinformation criterion.Proc Natl Acad Sci USA 108:E1128-1136.
21.Sepulveda N,Campino SG,Assefa SA,Sutherland CJ,Pain A,et al.(2013)A Poisson hierarchical modelling approach to detecting copy number variationin sequence coverage data.BMC Genomics 14:128.
22.D'Haene B,Vandesompele J,Hellemans J(2010)Accurate and objectivecopy number profiling using real-time quantitative PCR.Methods 50:262-270.
23.Ingham DJ,Beer S,Money S,Hansen G(2001)Quantitative real-time PCRassay for determining transgene copy number in transformedplants.Biotechniques 31:132-134,136-140.
24.Janssen B,Hartmann C,Scholz V,Jauch A,Zschocke J(2005)MLPAanalysis for the detection of deletions,duplications and complexrearrangements in the dystrophin gene:potential and pitfalls.Neurogenetics 6:29-35.
25.Schouten JP,McElgunn CJ,Waaijer R,Zwijnenburg D,Diepvens F,et al.(2002)Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplexligation-dependent probe amplification.Nucleic Acids Res 30:e57.
26.Paxton CN,Brothman AR,Geiersbach KB(2013)Rapid aneusomy detectionin products of conception using the KaryoLite BACs-on-Beads assay.PrenatDiagn 33:25-31.
27.Palais R,Wittwer CT(2009)Mathematical algorithms for high-resolution DNA melting analysis.Methods Enzymol 454:323-343.
28.Press WH,Teukolsky SA,Vetterling WT,Flannery BP(2007)The Art ofScientific Computing:Cambridge University Press.
29.George AM,Oei P,Winship I(2003)False-positive diagnosis of trisomy21 using fluorescence in situ hybridisation(FISH)on uncultured amniotic fluidcells.Prenat Diagn 23:302-305.
30.Dobrowolski SF,Pham HT,Downes FP,Prior TW,Naylor EW,SwobodaKJ.Newborn screening for spinal muscular atrophy by calibrated short-ampliconmelt profiling.Clin Chem.2012 Jun;58(6):1033-9.
序列表
<110> C.威特沃
周路明
R.帕莱斯
<120> 进行聚合酶链式反应的方法及其相关应用
<150> US 61/839,269
<151> 2013-06-25
<160> 29
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> HoJo病毒(HoJo virus)
<400> 1
ttgtgattac ctcagaaatg attga 25
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> HoJo病毒(HoJo virus)
<400> 2
cattgcttct tcccagcagt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> HoJo病毒(HoJo virus)
<400> 3
aacgggaggg gtgtatgttt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> HoJo病毒(HoJo virus)
<400> 4
gcagactagg tgcccaactt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> HoJo病毒(HoJo virus)
<400> 5
acatcattcc actgggaagc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> HoJo病毒(HoJo virus)
<400> 6
ccagagtggg tgcattagga 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> HoJo病毒(HoJo virus)
<400> 7
tcagacttgg acagccacac 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> HoJo病毒(HoJo virus)
<400> 8
cacttgggga attgactcac a 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> HoJo病毒(HoJo virus)
<400> 9
ccttcaggat agcggttgat 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> HoJo病毒(HoJo virus)
<400> 10
cttgagaatg gatgcgaagg 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> HoJo病毒(HoJo virus)
<400> 11
caacaggttg tacagggatg a 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> HoJo病毒(HoJo virus)
<400> 12
agctggtgct ccattcttga 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> HoJo病毒(HoJo virus)
<400> 13
ctcctcatgg ggctaatctg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> HoJo病毒(HoJo virus)
<400> 14
aagtccacag aaggcagacg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> HoJo病毒(HoJo virus)
<400> 15
agccaggttc ttctcatcca 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> HoJo病毒(HoJo virus)
<400> 16
gccaggacgt ctgaagaaag 20
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> HoJo病毒(HoJo virus)
<400> 17
tctgttgatt ctgctgacaa tct 23
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> HoJo病毒(HoJo virus)
<400> 18
tgaacatacc tttccaattt ttca 24
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> HoJo病毒(HoJo virus)
<400> 19
gggatagaga gctggcttca 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> HoJo病毒(HoJo virus)
<400> 20
gccgaagggc attaatgagt 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> HoJo病毒(HoJo virus)
<400> 21
atgtccggga acacaaagac 20
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> HoJo病毒(HoJo virus)
<400> 22
tcccttccct gattaccttt g 21
<210> 23
<211> 17
<212> DNA
<213> HoJo病毒(HoJo virus)
<400> 23
ccctccgaca gggtgaa 17
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> HoJo病毒(HoJo virus)
<400> 24
agcaaatgtc ccatgtcaac 20
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> HoJo病毒(HoJo virus)
<400> 25
tcattctcgt tttctgaact g 21
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> HoJo病毒(HoJo virus)
<400> 26
atgtttagac tggatagcgt 20
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> HoJo病毒(HoJo virus)
<400> 27
ttcctttatt ttccttacag ggttt 25
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> HoJo病毒(HoJo virus)
<400> 28
ccttccttct ttttgatttt gtctg 25
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> HoJo病毒(HoJo virus)
<400> 29
ccttccttct ttttgatttt gtcta 25
Claims (13)
1.一种进行扩增和确定样品中靶核酸位点的CNV的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:
聚合酶,
dNTPs,其的一种或几种以3.125-25μM的浓度提供,
被构造用于扩增靶核酸位点的引物,和
SMN1和SMN2的通用引物。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,进一步包括被构造用于扩增参考核酸的引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,被构造用于扩增参考核酸的引物与被构造用于扩增靶核酸位点的引物在相同的反应混合物中提供。
4.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,进一步提供用于进行扩增和确定靶核酸位点CNV的方法。
5.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述dNTPs的一种以3.125-25μM的浓度提供。
6.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述dNTPs的两种以3.125-25μM的浓度提供。
7.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述dNTPs的三种以3.125-25μM的浓度提供。
8.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述dNTPs的四种以3.125-25μM的浓度提供。
9.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,进一步包括3’端在c.840C配对的ARMS等位基因特异性引物和3’端在c.840T配对的ARMS等位基因特异性引物。
10.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,进一步提供进行扩增和确定SMN1和SMN2的相对拷贝数的方案。
11.一种进行扩增和确定样品中靶核酸位点的CNV的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:
聚合酶,
dNTPs,其的一种或几种以3.125-25μM的浓度提供,
被构造用于扩增靶核酸位点的引物,和
如下基因的引物:囊性纤维化跨膜传导调节(CFTR)基因,或者,表皮生长因子受体(EGFR)基因。
12.一种进行扩增和确定RNA靶核酸位点的等位基因片段的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:
聚合酶,
dNTPs,其的一种或几种以3.125-25μM的浓度提供,
被构造用于扩增靶核酸位点的引物,和
反转录酶。
13.根据权利要求12所述的试剂盒,其特征在于,进一步包括进行反转录、进行扩增和确定RNA靶核酸位点的等位基因片段的方案。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010202121.XA CN111349692B (zh) | 2013-06-25 | 2014-06-25 | 进行聚合酶链式反应的方法及其相关应用 |
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201361839269P | 2013-06-25 | 2013-06-25 | |
US61/839,269 | 2013-06-25 | ||
PCT/US2014/044154 WO2014210199A2 (en) | 2013-06-25 | 2014-06-25 | Methods of performing polymerase chain reaction and related uses thereof |
CN201480036694.2A CN105378111B (zh) | 2013-06-25 | 2014-06-25 | 进行聚合酶链式反应的方法及其相关应用 |
CN202010202121.XA CN111349692B (zh) | 2013-06-25 | 2014-06-25 | 进行聚合酶链式反应的方法及其相关应用 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201480036694.2A Division CN105378111B (zh) | 2013-06-25 | 2014-06-25 | 进行聚合酶链式反应的方法及其相关应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111349692A CN111349692A (zh) | 2020-06-30 |
CN111349692B true CN111349692B (zh) | 2023-10-13 |
Family
ID=52142831
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202010202121.XA Active CN111349692B (zh) | 2013-06-25 | 2014-06-25 | 进行聚合酶链式反应的方法及其相关应用 |
CN201480036694.2A Active CN105378111B (zh) | 2013-06-25 | 2014-06-25 | 进行聚合酶链式反应的方法及其相关应用 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201480036694.2A Active CN105378111B (zh) | 2013-06-25 | 2014-06-25 | 进行聚合酶链式反应的方法及其相关应用 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10494682B2 (zh) |
EP (1) | EP3013981B1 (zh) |
JP (1) | JP6609551B2 (zh) |
CN (2) | CN111349692B (zh) |
CA (1) | CA2916657C (zh) |
WO (1) | WO2014210199A2 (zh) |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111349692B (zh) | 2013-06-25 | 2023-10-13 | C.威特沃 | 进行聚合酶链式反应的方法及其相关应用 |
US11332781B2 (en) | 2016-06-23 | 2022-05-17 | Canon U.S.A., Inc. | Fitting melting curve data to determine copy number variation |
CN108334745B (zh) * | 2018-03-19 | 2022-02-08 | 青岛理工大学 | 一种聚合酶链反应过程非线性混杂系统建模方法 |
TWI712693B (zh) * | 2018-05-25 | 2020-12-11 | 豐技生物科技股份有限公司 | Smn基因的snp位點的檢測方法 |
GB201812192D0 (en) | 2018-07-26 | 2018-09-12 | Ttp Plc | Variable temperature reactor, heater and control circuit for the same |
DE102018213026A1 (de) * | 2018-08-03 | 2020-02-06 | Robert Bosch Gmbh | Verfahren zur Durchführung einer Echtzeit-PCR |
US20220267852A1 (en) * | 2019-07-26 | 2022-08-25 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Method for detecting or quantifying smn1 gene |
CN111218506B (zh) * | 2020-03-03 | 2022-07-08 | 胜亚生物科技(厦门)有限公司 | 一种smn1和smn2基因拷贝数的检测试剂盒 |
CN113088566B (zh) * | 2021-04-25 | 2023-08-11 | 苏州天隆生物科技有限公司 | 人运动神经元存活基因1拷贝数定量检测试剂盒及分析方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012038503A1 (en) * | 2010-09-23 | 2012-03-29 | Qiagen Gmbh | Method for detecting and/or quantifying human dna |
CN103562407A (zh) * | 2011-02-09 | 2014-02-05 | 伯乐生命医学产品有限公司 | 核酸的分析 |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9401815D0 (en) | 1994-01-31 | 1994-03-23 | Ray Ronnie A | A new method for combined intracellular reverse transciption and amplification |
ATE428801T1 (de) * | 1996-06-04 | 2009-05-15 | Univ Utah Res Found | Überwachung der hybridisierung während pcr |
ES2527068T3 (es) * | 2002-10-23 | 2015-01-19 | University Of Utah Research Foundation | Análisis de fusión de amplicones con colorantes de saturación |
US20060281099A1 (en) * | 2005-06-14 | 2006-12-14 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Q-melt for polymorphism detection |
US8068992B2 (en) | 2005-09-20 | 2011-11-29 | University Of Utah Research Foundation | Melting curve analysis with exponential background subtraction |
ATE508209T1 (de) * | 2006-02-28 | 2011-05-15 | Univ Louisville Res Found | Erkennung von chromosomabnormalitäten im fötus mit hilfe der tandem-einzelnukleotid- polymorphismen |
CN101400806A (zh) * | 2006-03-13 | 2009-04-01 | 和光纯药工业株式会社 | 突变基因的检测方法 |
US9562837B2 (en) * | 2006-05-11 | 2017-02-07 | Raindance Technologies, Inc. | Systems for handling microfludic droplets |
EP2857526B1 (en) * | 2006-12-13 | 2016-08-17 | Luminex Corporation | Systems and methods for multiplex analysis of PCR in real time |
ITUD20060280A1 (it) * | 2006-12-29 | 2008-06-30 | Univ Degli Studi Udine | Sequenza artificiale di dna evente funzione di leader in 5' (5'-utr) ottimizzata per la sovraespressione di proteine eterologhe in pianta |
US20100285468A1 (en) * | 2007-09-24 | 2010-11-11 | Allelogic Biosciences Corporation | Detection and/or quantification of nucleic acids |
EP2326732A4 (en) * | 2008-08-26 | 2012-11-14 | Fluidigm Corp | TEST METHODS FOR INCREASED SURPLUS OF SAMPLES AND / OR TARGETS |
US9062304B2 (en) * | 2009-02-11 | 2015-06-23 | The University Of Rochester | Spatially inhomogenously functionalized porous media and method for use in selective removal of contaminants |
CN111349692B (zh) | 2013-06-25 | 2023-10-13 | C.威特沃 | 进行聚合酶链式反应的方法及其相关应用 |
-
2014
- 2014-06-25 CN CN202010202121.XA patent/CN111349692B/zh active Active
- 2014-06-25 WO PCT/US2014/044154 patent/WO2014210199A2/en active Application Filing
- 2014-06-25 CN CN201480036694.2A patent/CN105378111B/zh active Active
- 2014-06-25 EP EP14816610.1A patent/EP3013981B1/en active Active
- 2014-06-25 JP JP2016523897A patent/JP6609551B2/ja active Active
- 2014-06-25 CA CA2916657A patent/CA2916657C/en active Active
-
2015
- 2015-12-23 US US14/757,825 patent/US10494682B2/en active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012038503A1 (en) * | 2010-09-23 | 2012-03-29 | Qiagen Gmbh | Method for detecting and/or quantifying human dna |
CN103562407A (zh) * | 2011-02-09 | 2014-02-05 | 伯乐生命医学产品有限公司 | 核酸的分析 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Luming Zhou 等.Abstract 4923: Detecting copy number variation using dNTP limited PCR and high-resolution melting.《Cancer Res》.2015,全文. * |
张晓青 等.限量dNTP竞争性PCR结合HRM技术在基因组拷贝数变异疾病检测中的应用.《第一届中国临床分子诊断大会论文集》.2018,第145页. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2014210199A3 (en) | 2015-11-12 |
JP6609551B2 (ja) | 2019-11-20 |
CN111349692A (zh) | 2020-06-30 |
US10494682B2 (en) | 2019-12-03 |
CN105378111A (zh) | 2016-03-02 |
CN105378111B (zh) | 2020-03-20 |
EP3013981A2 (en) | 2016-05-04 |
CA2916657C (en) | 2023-08-29 |
CA2916657A1 (en) | 2014-12-31 |
EP3013981A4 (en) | 2017-03-01 |
JP2016526390A (ja) | 2016-09-05 |
WO2014210199A2 (en) | 2014-12-31 |
US20160153058A1 (en) | 2016-06-02 |
EP3013981B1 (en) | 2021-10-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN111349692B (zh) | 进行聚合酶链式反应的方法及其相关应用 | |
EP2663652B1 (en) | High resolution melting analysis as a prescreening tool | |
CN110719957B (zh) | 用于核酸靶向富集的方法和试剂盒 | |
Herreros-Villanueva et al. | KRAS mutations: analytical considerations | |
WO2017027835A1 (en) | Method of preparing cell free nucleic acid molecules by in situ amplification | |
US10400277B2 (en) | DNA mutation detection employing enrichment of mutant polynucleotide sequences and minimally invasive sampling | |
EP3739064A1 (en) | Comparative analysis of microsatellites by capillary electrophoresis (ce) dna profiles | |
JP5917144B2 (ja) | 疾患関連遺伝子の多型検出用プローブおよびその用途 | |
US7838228B2 (en) | Method of quantitative and/or comparative measurement of mRNA expression levels in small biological samples | |
EP3494236B1 (en) | Method for conducting early detection of colon cancer and/or of colon cancer precursor cells and for monitoring colon cancer recurrence | |
CN110295218B (zh) | 量化靶基因的突变型等位基因负担的方法 | |
US20120108445A1 (en) | Vegf and vegfr1 gene expression useful for cancer prognosis | |
EP3992302A1 (en) | Generic cartridge and method for multiplex nucleic acid detection | |
Wu et al. | High-resolution genomic profiling of disseminated tumor cells in prostate cancer | |
JP6205216B2 (ja) | 変異検出用プローブ、変異検出方法、薬効判定方法及び変異検出用キット | |
JP5570657B2 (ja) | 遺伝子存在量の測定方法 | |
WO2016103727A1 (ja) | 特異的核酸配列の増幅促進方法 | |
Huang et al. | RLP system: A single-tube two-step approach with dual amplification cascades for rapid identification of EGFR T790M | |
Zhou et al. | Competitive PCR for Copy Number Assessment by Restricting dNTPs | |
Gökmen-Polar | Overview of PCR-Based | |
WO2022157764A1 (en) | Non-invasive cancer detection based on dna methylation changes | |
WO2022010917A1 (en) | Methods, compositions, and systems for detecting pnpla3 allelic variants | |
JP2010000003A (ja) | 標的核酸配列のコピー数検出方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |