TWI712693B - Ｓｍｎ基因的ｓｎｐ位點的檢測方法 - Google Patents
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Abstract
一種SMN基因的SNP位點的檢測方法，包括以下步驟：(S10)進行一聚合酶連鎖反應(PCR)，擴增包含一SNP位點的一核酸片段；(S20)對該核酸片段進行一去磷酸化反應；(S30)對該核酸片段進行一延伸反應，其中使用一延伸引子辨識該SNP位點的位置，並在該延伸引子的一3’端延伸與該SNP位點的鹼基互補的一單一核苷酸，而獲得一被延伸的延伸引子；(S40)進行一純化反應，以純化該被延伸的延伸引子；以及(S50)檢測該被延伸的延伸引子的分子量大小，根據該分子量大小決定該被延伸的單一核苷酸的鹼基種類，從而根據該SNP位點的鹼基種類決定是否發生SMN1基因缺失。
Description
本發明關於一種基因缺陷的檢測方法，尤指SMN基因的SNP(單核苷酸多態性)位點的檢測方法。
脊髓性肌肉萎縮症(Spinal Muscular Atrophy)的病因是由於基因缺陷導致脊髓前角運動神經之衰亡與退化，造成肌肉逐漸軟弱無力與麻痺，並伴隨有肌肉萎縮之症狀，其肌肉萎縮呈對稱性、下肢較上肢嚴重且身體近端較遠端易受影響，到目前為止沒有任何治療方法，其依照嚴重程度分為三種類型：嚴重型脊髓性肌肉萎縮症(Werdnig-Hoffmann Disease,SMA type I)：每兩萬名嬰兒中約有一名，為最常見的一型。嬰兒在子宮內或出生後三個月內，便會出現四肢無力、哭聲無力及呼吸困難等症狀。由於患者易感染呼吸道疾病，多在一歲內便可能死於肺炎，如未積極給予支持性呼吸治療，很少會活過三歲。
中間型脊髓性肌肉萎縮症(Intermediate type,SMA type II)：其症狀常發生在出生後半年到一年期間。病患下肢呈現對稱性無力、無法站立行走、肌腱反射減退、舌頭或手部偶爾會顫抖。四分之一患者常在兩歲前死於呼吸道感染，其他存活者，多因持續肌肉無力造成脊椎側彎，
影響肺部功能而導致呼吸困難，需要支持性呼吸治療以維持生命。
輕度型脊髓性肌肉萎縮症(Kugelberg-Welander Disease,SMA type III)：其症狀發生的時間不一定，從一歲多到青少年、成人期都有可能。症狀是輕度對稱的肢體近端肌肉無力，上下樓、行走跑步不便，患者長期存活的情況還算不錯。
脊髓性肌肉萎縮症發生率約為1/10,00至1/25,000，國內優生保健門診曾發現過家族成員接連罹病的家族案例，若以台灣每年有三十萬名新生兒計，一年約有三十多名新病例。脊髓性肌肉萎縮症中90至95%比率之病患屬於第五號染色體SMN1基因(Survival Motor Neuron 1 gene)純合缺失(homozygous deletion)缺陷所導致。
而現行檢測SMN1基因缺陷的方法，是以定量聚合酶連鎖反應(real-time PCR)或是直接定序法，但無論是何種方法皆有靈敏度不高、成本高與效率差的問題。因此勢必要發展出解决上述問題的方法。
本發明的目的，在於提供一種辨識SMN1基因的純合缺失的方法。在本發明的方法操作(1)可以在同一反應中同時偵測多個SNP(單核苷酸多態性)位點，可大幅降低分析成本；(2)操作簡單快速，且適用各種品質之檢體，例如新鮮組織、冷凍組織、石蠟包埋組織(formalin-fixed paraffin-embedded(FFPE)tissue)、細胞株萃取的基因體DNA(genomic DNA)或是血漿cfDNA(circulating cell-free DNA)等；(3)由於所述多個SNP位點位於SMN1基因容易發生缺失的區域，因此藉由檢測所述多個SNP位點能確認SMN1基因的缺失，也能精確偵測到微量檢體中不同大小缺失之差異，具有
極高效率；(4)由於SMN1基因的缺失與否與脊髓性肌肉萎縮症(Spinal Muscular Atrophy,SMA)有高度的關係性，因此可以藉由本發明的方法快速地了解患者的SMN基因的基因型對於脊髓性肌肉萎縮症的研究是非常有價值的。
為達上述目的並解決習知技術之缺點，本發明提供一種SMN基因的一個SNP(單核苷酸多態性)位點的檢測方法，包括以下步驟：(S10)對一待測檢體進行一聚合酶連鎖反應(PCR)，其中使用一對擴增引子，擴增該待測檢體中包含待檢測的一SNP位點的一段核酸片段，而獲得一被擴增的核酸片段；(S20)對該被擴增的核酸片段進行一去磷酸化反應，以去除用於該聚合酶連鎖反應的核酸片段之一5’端的磷酸根；(S30)對該核酸片段進行一延伸反應，其中使用一延伸引子辨識該SNP位點的位置，並在該延伸引子的一3’端延伸與該SNP位點的鹼基互補的一單一核苷酸，而獲得一被延伸的延伸引子；(S40)進行一純化反應，以純化該被延伸的延伸引子；以及(S50)測量該被延伸的延伸引子的分子量大小，根據該分子量大小決定該被延伸的單一核苷酸的鹼基種類，從而決定該SNP位點是否發生缺失；其中該延伸引子包括選自於SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12所組成的一群組中的一者。
在本發明的一實施例中，該對擴增引子分別包括選自於SEQ
ID NO：1與SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：4與SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：7與SEQ ID NO：8；及SEQ ID NO：10與SEQ ID NO：11所組成的一群組中的一者。
在本發明的一實施例中，其中該擴增引子的5’端增加一不與包含該SNP位點的核酸片段互補的TAG核酸片段，以增加該擴增引子與該延伸引子之間的一分子量差距。
在本發明的一實施例中，該TAG核酸片段包括SEQ ID NO：19。
在本發明的一實施例中，步驟(S50)中，使用一質譜儀測量該被延伸的延伸引子的分子量大小，根據該分子量大小決定該被延伸的單一核苷酸的鹼基種類，從而決定SMN1基因的該SNP位點是否發生缺失。
在本發明的一實施例中，在步驟(S50)中，使用一螢光電泳法檢測多個該被延伸的延伸引子的分子量大小和該些被延伸的延伸引子所被標記的螢光種類，根據各個該分子量大小和螢光種類決定被延伸的各個該單一核苷酸的鹼基種類，從而決定SMN1基因的該SNP位點是否發生缺失。
在本發明的另一實施例中，在步驟(S50)中，當該SNP位點所對應的被延伸的該單一核苷酸的鹼基種類為一種時，則該SNP位點發生缺失；當該SNP位點所對應的被延伸的該單一核苷酸的鹼基種類為兩種時，則SMN1基因的該SNP位點未發生缺失。
本發明還提供一種SMN基因的多個SNP(單核苷酸多態性)位點的檢測方法，包括以下步驟：(S10)對一待測檢體進行一聚合酶連鎖反應(PCR)，其中
使用多對擴增引子，擴增該待測檢體中多個核酸片段，各個該核酸片段包含一個SNP位點，而獲得多個被擴增的核酸片段；(S20)對多個該被擴增的核酸片段進行一去磷酸化反應，以去除用於該聚合酶連鎖反應的核酸片段之一5’端的磷酸根；(S30)對多個該被擴增的核酸片段進行延伸反應，其中使用多個延伸引子辨識多個該SNP位點的位置，並在各個該延伸引子的一3’端延伸與各個該SNP位點的鹼基互補的一單一核苷酸，而獲得多個被延伸的延伸引子；(S40)進行一純化反應，以純化多個該被延伸的延伸引子；以及(S50)檢測多個該被延伸的延伸引子的分子量大小，根據各個該分子量大小，決定各個該被延伸的單一核苷酸的鹼基種類，從而決定各個該SNP位點是否發生缺失；其中多個該延伸引子包括選自於SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12所組成的一群組中的至少二者。
在本發明的一實施例中，多對該擴增引子分別包括選自於SEQ ID NO：1與SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：4與SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：7與SEQ ID NO：8；及SEQ ID NO：10與SEQ ID NO：11所組成的一群組中的至少二者。
在本發明的一實施例中，多對該擴增引子的5’端皆增加一不與包含多個該SNP位點的核酸片段互補的TAG核酸片段，以增加多對該擴增引子與多個該延伸引子之間的一分子量差距。
在本發明的一實施例中，該TAG核酸片段包括SEQ ID NO：19。
在本發明的一實施例中，在步驟(S50)中，使用一質譜儀檢測多個該被延伸的延伸引子的分子量大小，根據各個該分子量大小決定各個該被延伸的單一核苷酸的鹼基種類，從而決定SMN1基因的各個該SNP位點是否發生缺失。
在本發明的另一實施例中，在步驟(S50)中，使用一螢光電泳法，檢測多個該被延伸的延伸引子的分子量大小和該些被延伸的延伸引子所被標記的螢光種類，根據各個該分子量大小和螢光種類決定被延伸的各個該單一核苷酸的鹼基種類，從而決定SMN1基因的各個該SNP位點是否發生缺失。
在本發明的一實施例中，在步驟(S50)中，當一個該SNP位點所對應的該被延伸的單一核苷酸的鹼基種類為一種時，則決定該SNP位點發生缺失；當一個該SNP位點所對應的被延伸的該單一核苷酸的鹼基種類為兩種時，則決定SMN1基因的該SNP位點未發生缺失。
在本發明的一實施例中，多個該SNP位點為4個。
在本發明的一實施例中，4個該SNP位點中有一者發生缺失，則代表SMN1基因或SMN2基因中發生純合缺失。
在本發明的一實施例中，4個該SNP位點中4個皆發生缺失，並且發生於SMN1基因，則判斷所述待測檢體來自於一脊髓性肌肉萎縮症患者。
S10-S50:步驟
第1圖，其為SMN基因(Survival Motor Neuron gene)的SNP(Single nucleotide polymorphisms，單核苷酸多態性)位點的示意圖。
第2圖為根據本發明的一實施例中的一步驟流程圖；第3A圖至第3C圖為根據本發明一實施例中，使用延伸引子SEQ ID NO：3對陰性對照組與待測檢體的SMN基因的外顯子7的SNP位點進行檢測，其中第3A圖為陰性對照組而第3B圖和第3C圖為待測檢體。
第4A圖至第4B圖為根據本發明一實施例中，使用延伸引子SEQ ID NO：6對陽性對照組與待測檢體的SMN基因的內插子7的第1個SNP位點進行檢測，其中第4A圖為陽性對照組而第4B圖為待測檢體。
請參考第1圖，其為SMN基因(Survival Motor Neuron gene)的SNP(Single nucleotide polymorphisms，單核苷酸多態性)位點的示意圖。SMN基因包含兩個基因，分別為SMN1基因與SMN2基因(Survival Motor Neuron Gene)，兩個基因皆編碼SMN蛋白質，然而SMN1基因與SMN2基因之間有5個核甘酸序列的差異，這5個核甘酸序列的差異被稱為SNP位點，如在第1圖中所示，分別位於內插子6、外顯子7、內插子7及外顯子8。
在內插子6中，SMN1基因的SNP位點的鹼基為G，SMN2基因的SNP位點的鹼基為A；外顯子7中，SMN1基因的SNP位點的鹼基為C，SMN2基因的SNP位點的鹼基為T；內插子7中，SMN1基因的第一個SNP位點的鹼基為A，第二個SNP位點的鹼基為A，SMN2基因的第一個SNP位點的鹼基為G，第二個SNP位點的鹼基為G；外顯子8中，SMN1基因的SNP位點
的鹼基為G，SMN2基因的SNP位點的鹼基為A。
雖然SMN1基因與SMN2基因之間僅有5個核甘酸序列的差異，卻導致SMN1基因與SMN2基因所表現的SMN蛋白質有很大的差異。SMN1基因表現出完整長度的穩定的SMN蛋白，而SMN2基因表現出的蛋白中僅有約15%是完整長度的穩定的SMN蛋白，約85%是縮短長度(truncated)的不穩定的SMN蛋白，也因此僅有SMN1基因所表現的蛋白具有顯著的生物學上的意義，SMN2基因則無。當SMN1基因發生缺陷，則很有可能導致脊髓性肌肉萎縮症，當SMN2基因發生缺陷，則基本上不致病。
典型的SMN1基因的缺陷是發生於外顯子7、內插子7、外顯子8的大範圍缺失(deletion)，導致位於其上的4個SNP位點的同時消失，本發明的檢測方法則可以通過檢測所述4個SNP位點是否缺失，來決定是否SMN1基因的純合缺失缺陷，對於脊髓性肌肉萎縮症的研究是非常有價值的。
請參考第2圖，根據本發明的一實施例中的步驟流程圖。一種SMN基因的SNP位點的檢測方法，包括以下步驟：(S10)對一待測檢體進行一聚合酶連鎖反應(PCR)，其中使用成對擴增引子，擴增該待測檢體中包含一SNP位點的核酸片段，而獲得一被擴增的核酸片段；(S20)對該被擴增的核酸片段進行一去磷酸化反應，以去除用於該聚合酶連鎖反應的核酸片段的一5’端的磷酸根；(S30)對該被擴增的核酸片段進行一延伸反應，其中使用一延伸引子辨識該SNP位點的位置，並在該延伸引子的一3’端延伸與該SNP位點的鹼基互補的一單一核苷酸，而獲得一被延伸的延伸引子；(S40)進行一純化反應，以純化該被延伸的延伸引子；以及(S50)檢測該被延伸的
延伸引子的分子量大小，根據該分子量大小決定該被延伸的單一核苷酸的鹼基種類，從而決定該SNP位點是否發生缺失。
現在僅用參考下面非限制性的實施力的方式進一步描述本發明。但是應當理解，下面的實施例僅僅是用做為例證的，不應以任何方式當作上述本發明總體的限制。
聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction,PCR)和擴增引子與延伸引子的設計：在本發明方法的步驟(S10)中，對一待測檢體進行一聚合酶連鎖反應(PCR)，其中使用一對擴增引子，擴增該待測檢體中包含一SNP位點的一段核酸片段，而獲得一被擴增的核酸片段。
一般而言，在對一代測檢體進行聚合酶連鎖反應之前會先對其進行DNA萃取。舉例而言，以市售DNA萃取套件萃取DNA，例如QIAGEN Blood Mini Kit®。先以裂解溶液(Lysis buffer)溶解從患者內皮黏膜取樣的細胞，使DNA從細胞內游離出來。在特定條件下DNA通過萃取套件所附的管柱(column)時會與管柱內的一矽膠膜(silica-gel membrane)結合而留在膜上，此時以酒精及沖洗液(wash buffer)清洗，再離心後去除雜質，最後以純水將DNA溶出，而萃取DNA，(詳細的萃取步驟請參閱DNA萃取套件的使用說明書)。以上DNA萃取方法為一實施範例，各種DNA萃取方法皆可以被利用於本發明的SNP位點檢測方法，因此不應以此限制本發明的申請專利範圍。
根據上述的SNP位點的位置設計一對擴增引子，該一對擴增引子的序列至少部分與包含該SNP位點的核酸片段的5’與3’端互補(舉例
而言，包含該SNP位點的核酸片段約為100個核苷酸大小)。較佳地，該一對擴增引子的序列與包含該SNP位點的一段核酸片段的5’與3’端完全互補。由於該成對的擴增引子的序列與包含該SNP位點的一段核酸片段互補，因此在聚合酶連鎖反應中(PCR reaction)，該成對的擴增引子會分別辨識與黏合該核酸片段的5’與3’端，而擴增該成對的擴增引子之間的核酸片段。聚合酶連鎖反應中(PCR reaction)的原理應當是本領域一般技術人員所瞭解，所以不再在本說明書中贅述。
關於擴增引子與延伸引子的設計，舉例而言，與包含該SNP位點的核酸片段的5’與3’端互補的擴增引子的長度約為15個核苷酸，或是更多或是更少個核苷酸，而在步驟(S30)的延伸反應中，所用的延伸引子的長度約為17-20個核苷酸或是更多或是更少個核苷酸。然而，為了避免擴增引子與延伸引子的片段分量大小太過接近，導致在以質譜儀檢測延伸後的延伸引子時，擴增引子的訊號出現在質譜儀的圖譜當中而產生干擾，在本發明的一實施例當中，在擴增引子的5’端增加了10個核苷酸的一TAG核酸片段，以增加擴增引子與延伸引子的一分子量差距。舉例而言，一般而言質譜儀用於檢測分子量介於4000Da至9000Da之間的延伸後的延伸引子的訊號，5’端增加了TAG核酸片段的擴增引子的分子量將會遠大於9000Da，因此不會顯示在所觀測的質譜儀圖譜之中。在本發明的一實施例當中，該TAG核酸片段例如為SEQ ID NO：19(ACGTTGGATG)，然而也可以使用其他的TAG核酸片段，其通常不與包含該SNP位點的核酸片段互補。然以上所述的擴增引子的長度和分子量，僅為一實施範例，本發明的SNP位點的檢測方法，適用於各種長度的擴增引子，因此不應以此限制本發明的申請專利範
圍。
在本發明的一實施列中，該用於擴增該核酸片段的聚合酶連鎖反應的反應濃度條件如下：在5μl的反應體積中含有濃度約為40ng/μl的待測檢體DNA、8單位(units)的Taq聚合酶(polymerase)、各為500nmol的一對擴增引子、濃度為2mM的MgCl2、1倍濃度之PCR緩衝液與濃度為50μM的dNTP(PCR accessory and Enzyme kit，從Agena公司購買)。反應溫度條件如下：先以95℃進行2分鐘的變性反應(denature)，接著以95℃進行30秒的變性反應(denature)，以56℃進行30秒黏合反應(annealing)，及以72℃進行1分鐘的延伸反應(extension)，重複此三步驟45循環。以上聚合酶連鎖反應為一實施範例，各種聚合酶連鎖反應皆可以被利用於本發明的SNP位點檢測方法，因此不應以此限制本發明的申請專利範圍。
在本方法的步驟(S10)中，對目的片段進行PCR擴增，擴增反應的條件為本領域技術人員所熟知，在本發明的實施例中也詳細描述了示例性的反應條件。並且根據所使用的本發明引子的具體序列，對擴增反應的條件進行一定的變化或優化也在本領域技術人員能力範圍之內。
請見下表一：在本發明的一個較佳實施例中，當欲檢測的SNP位點為外顯子7的SNP位點，在擴增反應中使用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2做為該對的擴增引子，在之後步驟(S30)的延伸反應中使用SEQ ID NO：3做為該延伸引子。在本發明的另一個較佳實施方案中，當欲檢測的SNP位點為內插子7的第1個SNP位點，在擴增反應中使用SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5做為該對的擴增引子，在之後步驟(S30)的延伸反應中使用SEQ ID NO：6做為該延伸引子。
在本發明的一個較佳實施例中，當檢測多個SNP位點時，在擴增反應中使用該多個SNP位點所對應的多對擴增引子，在之後步驟(S30)的延伸反應中使用該多個SNP位點所對應的多個延伸引子(例如，將多個擴增引子混和成為一管試劑，且將多個延伸引子混和成為另一管試劑)。在本發明的表一所揭露的所有引子，皆是經過不斷的修正與改良，以確保所有引子之間不會互相作用及相互干擾，故可以同時檢測多個SNP位點，以提高效率，更節省成本。除此之外，可只以取2μl檢體樣本即可進行多個突變檢測，更增加檢測的方便性、成功率與精密度。舉例而言，當欲同時檢測SNP位點為外顯子7的SNP位點以及內插子7的第1個SNP位點，可在同一擴增反應中同時使用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5做為該多對的擴增引子，在之後步驟(S30)的延伸反應中使用SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：6做為該延伸引子。
在本發明的一個最佳實施例中，可以同時檢測下表一中所列的所有SNP位點，在擴增反應中使用下表一中所列的所有擴增引子，在之後步驟(S30)的延伸反應中使用下表一中所列的所有延伸引子，(例如，將表一中所有擴增引子混和成為一管試劑，且將表一中所有延伸引子混和成為另一管試劑)。在本發明的表一所揭露的所有引子，皆是經過不斷的修正與改良，以確保所有引子之間不會互相作用及相互干擾，故可以同時檢測大量的SNP位點，以提高效率，更節省成本。除此之外，可只以取2μl檢體樣本即可進行多個突變檢測，更增加檢測的方便性、成功率與精密度。
去磷酸化反應(SAP酶處理)：
在本發明的步驟(S20)中，對該被擴增的核酸片段進行一去
磷酸化反應，以去除用於該聚合酶連鎖反應的核酸片段的一5’端的磷酸根。舉例而言，使用0.3U蝦鹼磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase,SAP)及1 X SAP緩沖液和，除去該聚合酶連鎖反應產物中的dNTP的5’端的磷酸根及該被擴增的核酸片段的5’端的磷酸根，可以將未反應的dNTP去磷酸化，阻止其參與到後續反應中，以確保延伸反應時只延伸一個碱基。以上去磷酸化反應為一實施範例，各種去磷酸化反應皆可以被利用於本發明的SNP位點檢測方法，因此不應以此限制本發明的申請專利範圍。
延伸反應：
在本發明的步驟(S30)中，對該被擴增的核酸片段進行一延伸反應，其中使用一延伸引子辨識該SNP位點的位置，並在該延伸引子的一3’端延伸與該SNP位點的鹼基互補的一單一核苷酸，而獲得一被延伸的延伸引子。舉例而言，在步驟(S30)的延伸反應中，所用的延伸引子的長度約為15-23個核苷酸或是更多或是更少個核苷酸。該延伸引子的序列與該SNP位點之前的序列互補(即SNP位點5’端之前的序列)，從而黏合在該突變的正前方，以辨識該SNP位點的位置。在適當的聚合酶與反應條件之下，該延伸引子的3’端延伸與該SNP位點的鹼基互補的單一核苷酸，而獲得一被延伸的延伸引子。因此，所獲得的被延伸的延伸引子(即產物)與原本的延伸引子的差別僅在於其3’端多了單一核苷酸。舉例而言，該單一核苷酸的鹼基可以為A、T、C、G四種鹼基，當SNP位點為胸腺嘧啶(Tymine，T)時，該被延伸的單一核苷酸為腺嘌呤(Adenine，A)；當SNP位點為腺嘌呤(Adenine，A)時，該被延伸的單一核苷酸為胸腺嘧啶(Tymine，T)；當SNP位點為胞嘧啶(Cytosine，C)時，該被延伸的單一核苷酸為鳥糞嘌呤(Guanine，G)；當SNP
位點為鳥糞嘌呤(Guanine，G)時，該被延伸的單一核苷酸為胞嘧啶(Cytosine，C)。由於被延伸的單一核苷酸具有不同的鹼基，所以該被延伸的延伸引子具有不同大小的分子量，在之後步驟(S50)中利用質譜儀檢測該被延伸的延伸引子的分子量大小，根據該分子量大小可以得知該被延伸的單一核苷酸的鹼基種類，而決定該SNP位點是否發生缺失。
在本發明的一示例性實施例中，該延伸反應中所用的核苷酸是經過質量修飾的ddNTP，其確保延伸反應只延伸單一核甘酸(因為核苷酸無法再連接至ddNTP缺氧的3’端)，並使該被延伸的延伸引子之間的分子量差距加大，而提高(S50)中利用質譜儀檢測的分辨率提高。四種ddNTP的分子量分別是：ddATP，271.2Da；ddTTP 327.1D；ddCTP 247.2Da，和ddGTP 287.2Da；其中分子量差異在16Da以上。
在本發明的一示例性實施例中，該延伸反應的聚合酶為iPLEX酵素(購自美國Agena公司)。而該適當條件為在terminator mix緩衝溶液下加入聚合酶iPLEX酵素、與延伸引子。先進行95℃變性反應(denature)30秒，再進行40次循環的[95℃變性反應(denature)5秒，重複5次小循環的(56℃進行黏合反應(annealing)30秒以及80℃延伸反應(extension)5秒)]，最後以72℃進行延伸反應(extension)3分鐘。以上延伸反應為一實施範例，各種延伸反應皆可以被利用於本發明的SNP位點檢測方法，因此不應以此限制本發明的申請專利範圍。
在本方法的步驟(S30)中，對目的片段進行延伸，延伸反應的條件與一般聚合酶連鎖反應(PCR)相似，為本領域技術人員所熟知，在本發明的實施例中也詳細描述了示例性的反應條件。並且根據所使用的本發
明引子的具體序列，對延伸反應的條件進行一定的變化或優化也在本領域技術人員能力範圍之內。
關於本發明的該延伸引子的優選實施例，如同上文中所述並請見上表一：當欲檢測的SNP位點為21號外顯子的861號密碼子的SNP位點，在之前步驟(S10)的擴增反應中使用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2做為該一對的擴增引子，在本步驟(S30)的延伸反應中使用SEQ ID NO：3做為該延伸引子，依此類推。
在本發明的一個較佳實施方案中，當檢測多個SNP位點時，在之前步驟(S10)的擴增反應中使用該多個SNP位點所對應的多對擴增引子，在本步驟(S30)的延伸反應中使用該多個SNP位點所對應的多個延伸引子(例如，將多個擴增引子混和成為一管試劑，且將多個延伸引子混和成為另一管試劑)。在本發明的表一所揭露的所有引子，皆是經過不斷的修正與改良，以確保所有引子之間不會互相作用及相互干擾，甚至可以在之前步驟(S10)的擴增反應中使用表一中所列的所有擴增引子，在本步驟(S30)的延伸反應中使用表一中所列的所有延伸引子，故可以同時檢測表一中所列的所有SNP位點，以提高效率，更節省成本。除此之外，可只以取2μl檢體樣本即可進行多個突變檢測，更增加檢測的方便性、成功率與精密度。
純化反應：
在步驟(S40)中，進行純化反應，以純化該被延伸的延伸引子。舉例而言，在延伸反應產物中加入6毫克樹脂(購自美國Agena公司)去除鹽離子後，反應20分鐘後樹脂將充分與反應體系中的陽離子結合，從而使反應體系脫鹽。之後以4000rpm離心五分鐘使樹脂沉降，取上清液。以上純
化反應為一實施範例，各種純化反應皆可以被利用於本發明的SNP位點檢測方法，因此不應以此限制本發明的申請專利範圍。
測量核酸片段大小：
在步驟(S50)中，可以使用一質譜儀檢測該被延伸的延伸引子的分子量大小，根據該分子量大小決定該被延伸的單一核苷酸的鹼基種類，從而決定該SNP位點的基因型。舉例而言，點取約7奈升(nl)純化後的產物至含基質的芯片(SpectroCHIP®)，並使用MassARRAY analyzer 4(Agena)分析質譜儀激發核酸片段群於真空電場中飛行，通過感應器擷取各核酸片段的分子量訊號，而衍伸出各核酸片段的分子量大小，根據各個該分子量大小決定被延伸的各個該單一核苷酸的鹼基種類。並使用TYPER 4.0(Agena)軟體分析質譜數據。上述方法利用質譜儀偵測核酸的片段分子量，而無需像傳統定序方法利用膠體電泳，由於不同分子的分子量皆不同，因此可以精確地偵測僅有一鹼基差異的兩個不同的核酸片段，因此在辨識核酸片段時，穩定性及準確度高非常多。
然而在步驟(S50)中，決定該被延伸的單一核苷酸的鹼基種類的方法，不應該局限於使用質譜儀，在此所提供另一種可替代的實施方式是使用一螢光電泳法，即在步驟(S30)的延伸反應中，先用四種不同顏色的螢光標記分別標示A、T、C和G四種核苷酸，在步驟(S50)中，以膠體電泳區區分核酸片段的大小，其最高可以區分一個鹼基的大小差異的核酸片段，再根據該被延伸的延伸引子被螢光標記所標示的顏色(即螢光種類)，即可判別該被延伸的單一核苷酸的鹼基種類。因此使用螢光電泳法可以作為使用質譜儀的一替代方案。然而在以下的實施例中，是使用質譜儀決定該
被延伸的單一核苷酸的鹼基種類，來做為本發明的一示例性實施例，但不應侷限於使用質譜儀，任何能夠決定該被延伸的單一核苷酸的鹼基種類的方法皆應適用。
本發明的檢測結果如第3A圖至第4B圖所示，其橫軸為分子量，縱軸為訊號強度。第3A圖至第3C圖為根據本發明一實施例中，使用延伸引子SEQ ID NO：3對陰性對照組與待測檢體的SMN基因的外顯子7的SNP位點進行檢測，其中第3A圖為陰性對照組而第3B圖和第3C圖為待測檢體。在第2A圖質譜儀的圖譜中，檢測到延伸引子SEQ ID NO：3的兩種延伸產物的信號，分別為分子量6920Da的片段以及分子量7000Da的片段，其分別對應SMN1基因的外顯子7的SNP位點的胞嘧啶(C)以及SMN2基因的外顯子7的SNP位點的胸腺嘧啶(T)，代表陰性對照組中SMN1基因和SMN2基因的外顯子7的SNP位點皆沒有發生缺失。
在第3B圖質譜儀的圖譜中，僅檢測到延伸引子SEQ ID NO：3的一種延伸產物的信號，為分子量6920Da的片段，其對應SMN1基因的外顯子7的SNP位點的胸腺嘧啶(T)，代表待測檢體中，SMN1基因的外顯子7的SNP位點沒有發生缺失，而SMN2基和的外顯子7的SNP位點發生缺失。然而如上所述，SMN2基因表現出的蛋白中約85%是縮短長度(truncated)的不穩定的SMN蛋白，SMN2基因所表現的蛋白不具有顯著的生物學上的意義。當SMN2基因發生缺陷，則基本上不致病，因此第3B圖中，待測檢體的來源有較低的風險患有脊髓性肌肉萎縮症。在第3C圖質譜儀的圖譜中，僅檢測到延伸引子SEQ ID NO：3的一種延伸產物的信號，為分子量7000Da的片段，其對應SMN2基因的外顯子7的SNP位點的胸腺嘧啶(T)，代表待測檢體中，
SMN2基因的外顯子7的SNP位點雖沒有發生缺失，但是SMN1基和的外顯子7的SNP位點發生缺失，如上所述，SMN1基因所表現的蛋白是穩定的蛋白，具有顯著的生物學上的意義，因此第3C圖中，待測檢體的來源有很高的風險患有脊髓性肌肉萎縮症。
第4A圖至第4B圖為根據本發明一實施例中，使用延伸引子SEQ ID NO：6對陽性對照組與待測檢體的SMN基因的內插子7的第1個SNP位點進行檢測，其中第4A圖為陽性對照組而第4B圖為待測檢體。在第4A圖質譜儀的圖譜中，僅檢測到延伸引子SEQ ID NO：6的一種延伸產物的信號，為分子量7298Da的片段，其對應SMN2基因的內插子7的第一組SNP位點的鳥糞嘌呤(G)，代表陽性對照組中雖然SMN2基因的內插子7的第一組SNP位點未發生缺失，但是SMN1基因的內插子7的第一組SNP位點發生缺失，因此陽性對照組的來源有很高的風險患有脊髓性肌肉萎縮症。在第4B圖質譜儀的圖譜中，檢測到延伸引子SEQ ID NO：6的兩種延伸產物的信號，為分子量7282Da的片段和7298Da的片段，分別對應SMN1基因的內插子7的SNP位點的腺嘌呤(A)和SMN2基因的內插子7的第一組SNP位點的鳥糞嘌呤(G)，代表待測檢體中，SMN1和SMN2基因的內插子7的第一組SNP位點皆未發生缺失，所述待測檢體的來源有較低的風險患有脊髓性肌肉萎縮症。
然而以上所述的實驗結果，僅為表示本發明的SMN基因的SNP位點的檢測方法實際應用的效果，因此不應以此實驗結果限制本發明的申請專利範圍。
在本發明的SMN基因的多個SNP位點的檢測方法中，該SMN1基因上4個該SNP位點中有一者發生缺失，則代表SMN1基因中發生缺
失。然而一般而言，SMN1基因中的缺失，常發生於外顯子7、內插子7和外顯子8，且通常是大範圍的缺失，因此當該4個SNP位點有一者發生缺失時，通常其他3者也會一同缺失。而僅有SMN1基因所表現的蛋白具有顯著的生物學上的意義，SMN2基因則無，所以4個該SNP位點中4個皆發生缺失，並且皆發生於SMN1基因時，則所述待測檢體可能來自於一脊髓性肌肉萎縮症患者。
然而以上所述的生物分子遺傳學上的特徵，僅為表示本發明的SMN基因的SNP位點的檢測方法對於遺傳學上的重要意義，因此不應以此生物分子遺傳學上的特徵限制本發明的申請專利範圍。
本發明的目的，在於提供一種辨識SMN1基因的缺失的方法。在本發明的方法操作(1)可以在同一反應中同時偵測多個SNP(單核苷酸多態性)位點，可大幅降低分析成本；(2)操作簡單快速，且適用各種品質之檢體，例如新鮮組織、冷凍組織、石蠟包埋組織(formalin-fixed paraffin-embedded(FFPE)tissue)、細胞株萃取的基因體DNA(genomic DNA)或是血漿cfDNA(circulating cell-free DNA)等；(3)由於所述多個SNP位點位於SMN基因容易發生缺失的區域，因此藉由檢測所述多個SNP位點能確認SMN基因的缺失，也能精確偵測到微量檢體中不同大小缺失之差異，具有極高效率；(4)由於SMN1基因的缺失與否與脊髓性肌肉萎縮症(Spinal Muscular Atrophy,SMA)有高度的關係性，因此可以藉由本發明的方法快速地了解患者的SMN基因的基因型對於脊髓性肌肉萎縮症的研究是非常有價值的。
所屬領域之技術人員當可瞭解，在不違背本發明精神下，依
據本發明實施樣態所能進行的各種變化。因此，顯見所列之實施態樣並非用以限制本發明，而是企圖在所附申請專利範圍的定義下，涵蓋於本發明的精神與範疇中所做的修改。
<110> 豐技生物科技股份有限公司
<120> SMN基因的SNP位點的檢測方法
<130> TP171290-TW
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S10-S50:步驟
Claims (9)
- 一種SMN基因的多個SNP(單核苷酸多態性)位點的檢測方法，包括以下步驟：(S10)對一待測檢體進行一聚合酶連鎖反應(PCR)，其中使用多對擴增引子，擴增該待測檢體中多個核酸片段，各個該核酸片段包含一SNP位點，而獲得多個被擴增的核酸片段；(S20)對多個該被擴增的核酸片段進行一去磷酸化反應，以去除用於該聚合酶連鎖反應的核酸片段之一5’端的磷酸根；(S30)對多個該被擴增的核酸片段進行延伸反應，其中使用多個延伸引子辨識多個該SNP位點的位置，並在各個該延伸引子的一3’端延伸與各個該SNP位點的鹼基互補的一單一核苷酸，而獲得多個被延伸的延伸引子；(S40)進行一純化反應，以純化多個該被延伸的延伸引子；以及(S50)檢測多個該被延伸的延伸引子的分子量大小，根據各個該分子量大小，決定各個該被延伸的單一核苷酸的鹼基種類，從而決定各個該SNP位點是否發生缺失；其中每兩個該擴增引子和相對應的該延伸引子分別選自於：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2與SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5與SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8與SEQ ID NO：9；和SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11與SEQ ID NO：12所組成的一群組中的至少二者。
- 如申請專利範圍第1項所述的SMN基因的多個SNP位點的檢測方法，其中多對該擴增引子的5’端皆增加一不與包含多個該SNP位點的核酸片段互補的TAG核酸片段，以增加多對該擴增引子與多個該延伸引子之間的一分子量差距。
- 如申請專利範圍第2項所述的SMN基因的多個SNP位點的檢測方法，其中該TAG核酸片段包括SEQ ID NO：19。
- 如申請專利範圍第1項所述的SMN基因的多個SNP位點的檢測方法，其中在步驟(S50)中，使用一質譜儀檢測多個該被延伸的延伸引子的分子量大小，根據各個該分子量大小決定各個該被延伸的單一核苷酸的鹼基種類，從而決定SMN1基因的各個該SNP位點是否發生缺失。
- 如申請專利範圍第1項所述的SMN基因的多個SNP位點的檢測方法，其中在步驟(S50)中，使用一螢光電泳法，檢測多個該被延伸的延伸引子的分子量大小和該些被延伸的延伸引子所被標記的螢光種類，根據各個該分子量大小和螢光種類決定被延伸的各個該單一核苷酸的鹼基種類，從而決定SMN1基因的各個該SNP位點是否發生缺失。
- 如申請專利範圍第1項所述的SMN基因的多個SNP位點的檢測方法，其中在步驟(S50)中，當一個該SNP位點所對應的該被延伸的單一核苷酸的鹼基種類為一種時，則決定該SNP位點發生缺失；當一個該SNP位點所對應的被延伸的該單一核苷酸的鹼基種類為兩種時，則決定SMN1基因的該SNP位點未發生缺失。
- 如申請專利範圍第1項所述的SMN基因的多個SNP位點的檢測方法，其中多個該SNP位點為4個。
- 如申請專利範圍第7項所述的SMN基因的多個SNP位點的檢測方法，其中4個該SNP位點中有一者發生缺失，則代表SMN1基因和SMN2基因中發生純合缺失。
- 如申請專利範圍第7項所述的SMN基因的多個SNP位點的檢測方法，其中4個該SNP位點中4個皆發生缺失，並且發生於SMN1基因，則判斷所述待測檢體來自於一脊髓性肌肉萎縮症患者。
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