TWI586810B

TWI586810B - Ｎｒａｓ基因的突變位點的檢測方法

Info

Publication number: TWI586810B
Application number: TW105122630A
Authority: TW
Inventors: 張宏名; 林建興; 張書銘
Original assignee: 豐技生物科技股份有限公司
Priority date: 2016-07-18
Filing date: 2016-07-18
Publication date: 2017-06-11
Also published as: TW201809278A

Description

NRAS基因的突變位點的檢測方法

本發明關於一種基因突變位點的方法，尤指NRAS基因的突變位點的檢測方法。

大腸直腸癌是所有癌症發生及死亡率的第三位。在台灣地區，大腸癌發生、死亡人數，每年呈快速增加的趨勢，2006年發生人數首次超越肝癌，成為我國癌症發生人數最多的癌症，2012年發生人數已超過14,965人，而2004年至2011轉移性大腸直腸癌占18.9以上。大腸癌的治療目前仍然以手術切除為主，合併肝轉移的病人，可以將轉移肝臟的腫瘤切除的病人約占10%。90%的病人發現時是不能切除的；但是經過化學與標靶治療後其中約有20%的病人肝臟部份的病灶是可以手術切除。而可手術切除者其年存活率也相對提高。由此可見，化學與標靶治療對于大腸直腸癌合併肝轉移的病人在臨床治療上是有其重要性。

爾必得舒(Erbitux or Cetuximab)是一個阻斷表皮生長因子(Epidermal Growth Factor Receptor)的標靶治療藥劑，可以抑制腫瘤細胞增殖及導致細胞凋亡(apoptosis)。增加化學治療的緩解率，但是也有許多文獻證實如果KRAS與NRAS基因有突變，則爾必得舒是無效的。因此轉移性大腸直腸癌的病患在決定是否用爾必得舒治療前，需先檢測KRAS與NRAS基因是否突變。KRAS與NRAS基因野生型的病患可以獲益，提高疾病控制率。為了了解NRAS的各突變位點與阻斷表皮生長因子的標靶治療藥劑感受性之間的關係，必需發展出能夠迅速且精確檢測NRAS的各突變位點的方法。而現行檢測NRAS突變的方法，是從血漿中取得游離DNA，以螢光定量聚合酶連鎖反應(real-time PCR)或是直接定序法，但無論是何種方法皆有靈敏度不高、成本高與效率差的問題。因此勢必要發展出解决上述問題的方法。

本發明的目的，在於提供一種辨識NRAS基因的突變位點的方法，其利用偵測核酸片段的分子量，而無需像傳統定序方法利用膠體電泳，由於不同分子的分子量皆不同，因此可以精確地偵測僅有一鹼基差異的兩個不同的核酸片段，因此在辨識核酸片段時，穩定性及準確度高非常多。此外在本發明的方法操作可以在同一反應中同時偵測高達26型的NRAS 2、3、4號外顯子的突變類型，可大幅降低分析成本，操作簡單快速，且適用各種品質之檢體，包含新鮮組織、冷凍組織、石蠟包埋組織(formalin-fixed paraffin-embedded(FFPE)tissue)、細胞株萃取的基因體DNA(genomic DNA)或是血漿cfDNA(circulating cell-free NDA)，比現有技術更能偵測到微量檢體中細微突變比率之差異，具有極高效率。

為達上述目的並解決習知技術之缺點，本發明提供一種NRAS基因的一突變位點的檢測方法，包括以下步驟：(S10)對一待測檢體進行一聚合酶連鎖反應(PCR)，其中使用一對擴增引子，擴增該待測檢體中包含該突變位點的一段核酸片段，而獲得一被擴增的核酸片段； (S20)對該被擴增的核酸片段進行去磷酸化反應，以去除用於該聚合酶連鎖反應的核苷酸材料5’端的磷酸根；(S30)對該被擴增的核酸片段進行一延伸反應，其中使用一延伸引子辨識該突變位點的位置，並在該延伸引子的3’端延伸與該突變位點的鹼基互補的單一核苷酸，而獲得一被延伸的延伸引子；(S40)進行純化反應，以純化該被延伸的延伸引子；以及(S50)以一質譜儀檢測該被延伸的延伸引子的分子量大小，根據該分子量大小決定該被延伸的單一核苷酸的鹼基種類，從而決定該突變位點的基因型；其中該延伸引子包括選自於SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17與SEQ ID NO：18所組成的一群組中的一者。

在本發明之一實施例中，該一對擴增引子分別包括選自於SEQ ID NO：1與SEQ ID NO：2；EQ ID NO：3與SEQ ID NO：4；及EQ ID NO：5與SEQ ID NO：6所組成的一群組中的一者；在本發明之一實施例中，該擴增引子的5’端增加一不與包含該突變位點的核酸片段互補的TAG核酸片段，以增加該擴增引子與該延伸引子之間的分子量差距。

在本發明之一實施例中，該TAG核酸片段包括SEQ ID NO：19。

為達上述目的並解決習知技術之缺點，本發明提供一種NRAS基因的多個突變位點的檢測方法，包括以下步驟：(S100)對一待測檢體進行一聚合酶連鎖反應(PCR)，其中使用多對擴增引子，擴增該待測檢體中多段核酸片段，該各段核酸片段包含一個該突變位點，而獲得該被擴增的多個核酸片段；(S200)對該被擴增的多個核酸片段進行去磷酸化反應，以去除用於該聚合酶連鎖反應的核苷酸材料5’端的磷酸根；(S300)對該被擴增的多個核酸片段進行延伸反應，其中使用多個延伸引子辨識該多個突變位點的位置，並在該各個延伸引子的3’端延伸與該各個突變位點的鹼基互補的單一核苷酸，而獲得多個被延伸的延伸引子；(S400)進行純化反應，以純化該多個被延伸的延伸引子；以及(S500)以一質譜儀檢測該多個被延伸的延伸引子的分子量大小，根據該各個分子量大小決定該各個被延伸的單一核苷酸的鹼基種類，從而決定該各個突變位點的基因型；其中該多個延伸引子包括選自於SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17與SEQ ID NO：18所組成的一群組中的至少二者。

在本發明之一實施例中，其中該多對擴增引子分別包括選自於SEQ ID NO：1與SEQ ID NO：2；EQ ID NO：3與SEQ ID NO：4；及EQ ID NO：5與SEQ ID NO：6所組成的一群組中的至少二者。

在本發明之一實施例中，該擴增引子的5’端增加一不與該突變位點的核酸片段互補的TAG核酸片段，以增加該擴增引子與該延伸引子之間的分子量差距。

在本發明之一實施例中，該TAG核酸片段包括SEQ ID NO：19。

S10-S50‧‧‧步驟

第1圖為根據本發明的一實施例中的一步驟流程圖；第2A圖與第2B圖為根據本發明一實施例中，使用延伸引子SEQ ID NO：16對陰性對照組與待測檢體的NRAS基因的2號外顯子的12號密碼子的突變位點進行檢測的結果，其中第2A圖為陰性對照組而第2B圖為待測檢體；及第3A圖與第3B圖為根據本發明一實施例中，使用延伸引子SEQ ID NO：7對陰性對照組與待測檢體的NRAS基因的3號外顯子的61號密碼子的突變位點進行檢測的結果，其中第3A圖為陰性對照組而第3B圖為待測檢體。

請參考第1圖，其為根據本發明的一實施例中的步驟流程圖。一種NRAS基因的突變位點的檢測方法，包括以下步驟：(S10)對一待測檢體進行一聚合酶連鎖反應(PCR)，其中使用成對擴增引子，擴增該待測檢體中包含該突變位點的核酸片段，而獲得被擴增的核酸片段；(S20)對該被擴增的核酸片段進行去磷酸化反應，以去除用於該聚合酶連鎖反應的核苷酸材料的5’端的磷酸根；(S30)對該被擴增的核酸片段進行一延伸反應，其中使用\延伸引子辨識該突變位點的位置，並在該延伸引子的3’端延伸與該突變位點的鹼基互補的單一核苷酸，而獲得被延伸的延伸引子；(S40)進行純化反應，以純化該被延伸的延伸引子；以及(S50)以一質譜儀檢測該被延伸的延伸引子的分子量大小，根據該分子量大小決定該被延伸的單一核苷酸的鹼基種類，從而決定該突變位點的基因型。

現在僅用參考下面非限制性的實施力的方式進一步描述本發明。但是應當理解，下面的實施例僅僅是用做為例證的，不應以任何方式當作上述本發明總體的限制。

決定目標突變位點或突變類型：

本發明的方法針對NRAS的多個突變位點進行檢測，該多個突變位點的突變類型詳細資訊，請見下表一，舉例而言，在表一中，第2號外顯子(exon)中的第12號密碼子(codon)具有6種突變型，例如DNA序列的34號位置的核苷酸鹼基由鳥糞嘌呤(Guanine，G)突變為胸腺嘧啶(Thymine，T)，而胺基酸序列的甘胺酸(Glycine，G)突變成為半胱胺酸(Cysteine，C)，依此類推。而本發明的NRAS基因的突變位點的檢測方法針對表一中的突變位點的突變類型設計多對擴增引子(PCR primer)與多個延伸引子(Extension primer)。

聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction,PCR)和擴增引子與延伸引子的設計：

在本發明方法的步驟(S10)中，對一待測檢體進行一聚合酶連鎖反應(PCR)，其中使用一對擴增引子，擴增該待測檢體中包含該突變位點的一段核酸片段，而獲得一被擴增的核酸片段。

一般而言，在對一待測檢體進行聚合酶連鎖反應之前會先對其進行DNA萃取。舉例而言，以市售DNA萃取套件萃取DNA，例如QIAGEN Blood Mini Kit^®。先以裂解溶液(Lysis buffer)溶解從患者內皮黏膜取樣的細胞，使DNA從細胞內游離出來。在特定條件下DNA通過萃取套件所附的管柱(column)時會與管柱內的一矽膠膜(silica-gel membrane)結合而留在膜上，此時以酒精及沖洗液(wash buffer)清洗，再離心後去除雜質，最後以純水將DNA溶出，而萃取DNA，(詳細的萃取步驟請參閱DNA萃取套件的使用說明書)。以上DNA萃取方法為一實施範例，各種DNA萃取方法皆可以被利用於本法明的突變位點檢測方法，因此不應以此限制本發明的申請專利範圍。

根據上述的突變位點的位置設計一對擴增引子，該一對擴增引子的序列至少部分與包含該突變位點的核酸片段的5’與3’端互補(舉例而言，包含該突變位點的核酸片段約為100個核苷酸大小)。較佳地，該一對擴增引子的序列與包含該突變位點的一段核酸片段的5’與3’端完全互補。由於該成對的擴增引子的序列與包含該突變位點的一段核酸片段互補，因此在聚合酶連鎖反應中(PCR reaction)，該成對的擴增引子會分別辨識與黏合該核酸片段的5’與3’端，而擴增該成對的擴增引子之間的核酸片段。聚合酶連鎖反應中(PCR reaction)的原理應當是本領域一般技術人員所瞭解，所以不再在本說明書中贅述。

關於擴增引子與延伸引子的設計，舉例而言，與包含該突變位點的核酸片段的5’與3’端互補的擴增引子的長度約為20個核苷酸，或是更多或是更少個核苷酸，而在步驟(S30)的延伸反應中，所用的延伸引子的長度約為15-20個核苷酸或是更多或是更少個核苷酸。然而，為了避免擴增引子與延伸引子的片段分量大小太過接近，導致在以質譜儀檢測延伸後的延伸引子時，擴增引子的訊號出現在質譜儀的圖譜當中而產生干擾，在本發明的一實施例當中，在擴增引子的5’端增加了10個核苷酸的TAG核酸片段，以增加擴增引子與延伸引子的分子量差距。舉例而言，一般而言質譜儀用於檢測分子量介於4000Da至9000Da之間的延伸後的延伸引子的訊號，5’端增加了TAG核酸片段的擴增引子的分子量將會遠大於9000Da，因此不會顯示在所觀測的質譜儀圖譜之中。在本發明的一實施例當中，該TAG核酸片段例如為SEQ ID NO：19(ACGTTGGATG)，然而也可以使用其他的TAG核酸片段，其通常不與包含該突變位點的核酸片段互補。然以上所述的擴增引子的長度和分子量，僅為一實施範例，本發明的突變位點的檢測方法，適用於各種長度的擴增引子，因此不應以此限制本發明的申請專利範圍。

在本發明的一實施列中，該用於擴增該核酸片段的聚合酶連鎖反應的反應濃度條件如下：在5μl的反應體積中含有濃度約為10ng/μl的待測檢體DNA、8單位(units)的Taq聚合酶(polymerase)、各為500nmol的一對擴增引子、濃度為2mM的MgCl2、1倍濃度之PCR緩衝液與濃度為50μM的dNTP(PCR accessory and Enzyme kit，從Agena公司購買)。反應溫度條件如下：先以95℃進行2分鐘的變性反應(denature)，接著以95℃進行30秒的變性反應(denature)，以56℃進行30秒黏合反應(arnealing)，及以72℃進行1分鐘的延伸反應(extension)，重複此三步驟45循環。以上聚合酶連鎖反應為一實施範例，各種聚合酶連鎖反應皆可以被利用於本法明的突變位點檢測方法，因此不應以此限制本發明的申請專利範圍。

在本方法的步驟(S10)中，對目的片段進行PCR擴增，擴增反應的條件為本領域技術人員所熟知，在本發明的實施例中也詳細描述了示例性的反應條件。並且根據所使用的本發明引子的具體序列，對擴增反應的條件進行一定的變化或優化也在本領域技術人員能力範圍之內。

請見下表二：在本發明的一個優選實施例中，當欲檢測的突變位點為3號外顯子的61號密碼子的突變位點，在擴增反應中使用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2做為該一對的擴增引子，在之後步驟(S30)的延伸反應中使用SEQ ID NO：7做為該延伸引子。在本發明的另一個優選實施方案中，當欲檢測的突變位點為2號外顯子的13號密碼子的突變位點，在擴增反應中使用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4做為該一對的擴增引子，在之後步驟(S30)的延伸反應中使用SEQ ID NO：9做為該延伸引子，依此類推。

在本發明的一個較佳實施例中，當檢測多個突變位點時，在擴增反應中使用該多個突變位點所對應的多對擴增引子，在之後步驟(S30)的延伸反應中使用該多個突變位點所對應的多個延伸引子(例如，將多個擴增引子混和成為一管試劑，且將多個延伸引子混和成為另一管試劑)。在本發明的表二所揭露的所有引子，皆是經過不斷的修正與改良，以確保所有引子之間不會互相作用及相互干擾，故可以同時檢測大量的突變位點，以提高效率，更節省成本。除此之外，可只以取2μl檢體樣本即可進行多個突變檢測，更增加檢測的方便性、成功率與精密度。舉例而言，當欲同時檢測突變位點為3號外顯子的61號密碼子的突變位點以及2號外顯子的13號密碼子的突變位點，可在同一擴增反應中同時使用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2及EQ ID NO：3和SEQ ID NO：4做為該多對的擴增引子，在之後步驟(S30)的延伸反應中使用SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：9做為該延伸引子。

在本發明的一個最佳實施例中，可以同時檢測下表二中所列的所有突變位點，在擴增反應中使用下表二中所列的所有擴增引子，在之後步驟(S30)的延伸反應中使用下表二中所列的所有延伸引子，(例如，將表二中所有擴增引子混和成為一管試劑，且將表二中所有延伸引子混和成為另一管試劑)。在本發明的表二所揭露的所有引子，皆是經過不斷的修正與改良，以確保所有引子之間不會互相作用及相互干擾，故可以同時檢測大量的突變位點，以提高效率，更節省成本。除此之外，可只以取2μl檢體樣本即可進行多個突變檢測，更增加檢測的方便性、成功率與精密度。

去磷酸化反應(SAP酶處理)：

在本發明的步驟(S20)中，對該被擴增的核酸片段進行去磷酸化反應，以去除用於該聚合酶連鎖反應的核苷酸材料的5’端的磷酸根。舉例而言，使用0.3U蝦鹼磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase,SAP)及1 X SAP緩沖液和，除去該聚合酶連鎖反應產物中的dNTP的5’端的磷酸根及該被擴增的核酸片段的5’端的磷酸根，可以將未反應的dNTP去磷酸化，阻止其參與到後續反應中，以確保延伸反應時只延伸一個碱基。以上去磷酸化反應為一實施範例，各種去磷酸化反應皆可以被利用於本發明的突變位點檢測方法，因此不應以此限制本發明的申請專利範圍。

延伸反應：

在本發明的步驟(S30)中，對該被擴增的核酸片段進行一延伸反應，其中使用一延伸引子辨識該突變位點的位置，並在該延伸引子的3’端延伸與該突變位點的鹼基互補的單一核苷酸，而獲得一被延伸的延伸引子。舉例而言，在步驟(S30)的延伸反應中，所用的延伸引子的長度約為15-20個核苷酸或是更多或是更少個核苷酸。該延伸引子的序列與該突變位點之前的序列互補(即突變位點5’端之前的序列)，從而黏合在該突變的正前方，以辨識該突變位點的位置。在適當的聚合酶與反應條件之下，該延伸引子的3’端延伸與該突變位點的鹼基互補的單一核苷酸，而獲得一被延伸的延伸引子。因此所獲得的被延伸的延伸引子(即產物)與原本的延伸引子的差別僅在於其3’端多了單一核苷酸。舉例而言，該單一核苷酸的鹼基可以為A、T、C、G四種鹼基，當突變位點為胸腺嘧啶(Tymine，T)時，該被延伸的單一核苷酸為腺嘌呤(Adenine，A)；當突變位點為腺嘌呤(Adenine，A)時，該被延伸的單一核苷酸為胸腺嘧啶(Tymine，T)；當突變位點為胞嘧啶(Cytosine，C)時，該被延伸的單一核苷酸為鳥糞嘌呤(Guanine，G)；當突變位點為鳥糞嘌呤(Guanine，G)時，該被延伸的單一核苷酸為胞嘧啶(Cytosine，C)。由於被延伸的單一核苷酸具有不同的鹼基，所以該被延伸的延伸引子具有不同大小的分子量，在之後步驟(S50)中利用質譜儀檢測該被延伸的延伸引子的分子量大小，根據該分子量大小可以得知該被延伸的單一核苷酸的鹼基種類，而決定該突變位點是否發生突變。

在本發明的一示例性實施例中，該延伸反應中所用的核苷酸材料是經過質量修飾的ddNTP，其確保延伸反應只延伸單一核甘酸(因為核苷酸無法再連接至ddNTP缺氧的3’端)，並使該被延伸的延伸引子之間的分子量差距加大，而提高(S50)中利用質譜儀檢測的分辨率提高。四種ddNTP的分子量分別是：ddATP，271.2Da；ddTTP 327.1D；ddCTP 247.2Da，和ddGTP 287.2Da；其中分子量差異在16Da以上。

在本發明的一示例性實施例中，該延伸反應的聚合酶為iPLEX酵素(購自美國Agena公司)。而該適當條件為在terminator mix緩衝溶液下加入聚合酶iPLEX酵素、與延伸引子。進行40次循環的[95℃變性反應(denature)30秒，重複5次小循環的(56℃進行黏合反應(annealing)30秒以及80℃延伸反應(extension)5秒)]，最後以72℃進行延伸反應(extension)1分鐘。以上延伸反應為一實施範例，各種延伸反應皆可以被利用於本法明的突變位點檢測方法，因此不應以此限制本發明的申請專利範圍。

在本方法的步驟(S30)中，對目的片段進行延伸，延伸反應的條件與一般聚合酶連鎖反應(PCR)相似，為本領域技術人員所熟知，在本發明的實施例中也詳細描述了示例性的反應條件。並且根據所使用的本發明引子的具體序列，對延伸反應的條件進行一定的變化或優化也在本領域技術人員能力範圍之內。

關於本發明的該延伸引子的優選實施例，如同上文中所述並請見上表二：當欲檢測3號外顯子的61號密碼子的突變位點，在之前步驟(S10)的擴增反應中使用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2做為該一對的擴增引子，在本步驟(S30)的延伸反應中使用SEQ ID NO：7做為該延伸引子，依此類推。

在本發明的一個較佳實施方案中，當檢測多個突變位點時，在之前步驟(S10)的擴增反應中使用該多個突變位點所對應的多對擴增引子，在本步驟(S30)的延伸反應中使用該多個突變位點所對應的多個延伸引子(例如，將多個擴增引子混和成為一管試劑，且將多個延伸引子混和成為另一管試劑)。在本發明的表二所揭露的所有引子，皆是經過不斷的修正與改良，以確保所有引子之間不會互相作用及相互干擾，甚至可以在之前步驟(S10)的擴增反應中使用表二中所列的所有擴增引子，在本步驟(S30)的延伸反應中使用表二中所列的所有延伸引子，故可以同時檢測表二中所列的所有突變位點，以提高效率，更節省成本。除此之外，可只以取2μl檢體樣本即可進行多個突變檢測，更增加檢測的方便性、成功率與精密度。

純化反應：

在步驟(S40)中，進行純化反應，以純化該被延伸的延伸引子。舉例而言，在延伸反應產物中加入6毫克樹脂(購自美國Agena公司)去除鹽離子後，反應20分鐘後樹脂將充分與反應體系中的陽離子結合，從而使反應體系脫鹽。之後以4000rpm離心五分鐘使樹脂沉降，取上清液。以上純化反應為一實施範例，各種純化反應皆可以被利用於本法明的突變位點檢測方法，因此不應以此限制本發明的申請專利範圍。

質譜儀測核酸片段大小：

在步驟(S50)中，以一質譜儀檢測該被延伸的延伸引子的分子量大小，根據該分子量大小決定該被延伸的單一核苷酸的鹼基種類，從而決定該突變位點的基因型。舉例而言，點取約7奈升(nl)純化後的產物至含基質的芯片(SpectroCHIP ®)，並使用MassARRAY analyzer 4(Agena)分析質譜儀激發核酸片段群於真空電場中飛行，通過感應器擷取各核酸片段的分子量訊號，而衍伸出各核酸片段的分子量大小。並使用TYPER 4.0(Agena)軟體分析質譜數據。

本發明的檢測結果如第2A圖至第3B圖所示，其橫軸為分子量，縱軸為訊號強度。第2A圖與第2B圖為根據本發明一實施例中，使用延伸引子SEQ ID NO：16對陰性對照組與待測檢體的NRAS基因的2號外顯子的12號密碼子的突變位點進行檢測的結果，其中第2A圖為陰性對照組而第2B圖為待測檢體。由於陰性對照組的20號外顯子的790號密碼子的突變位點沒有發生突變，因此在第2A圖質譜儀的圖譜中，僅有檢測到分子量5623Da的延伸產物的訊號，其代表所延伸的單一核苷酸為G，為未突變基因型。然而在第2B圖質譜儀的圖譜中，不但檢測到分子量5623Da的訊號，還偵測到分子量5662Da的延伸產物的訊號，其分子量對應2號外顯子的12號密碼子的突變位點的胸腺嘧啶(T)點突變，因此可知待測檢體於2號外顯子的12號密碼子的突變位點產生了T的點突變

第3A圖與第3B圖為根據本發明一實施例中，使用延伸引子SEQ ID NO：7對陰性對照組與待測檢體的NRAS基因的3號外顯子的61號密碼子的突變位點進行檢測的結果，其中第3A圖為陰性對照組而第3B圖為待測檢體。由於陰性對照組的3號外顯子的61號密碼子的突變位點沒有發生突變，因此在第3A圖質譜儀的圖譜中，僅有檢測到分子量5454Da的延伸產物的訊號，其代表所延伸的單一核苷酸為A，為未突變基因型。然而在第3B圖質譜儀的圖譜中，不但檢測到分子量5454Da的延伸產物的訊號，還偵測到分子量5413Da的延伸產物的訊號，其分子量對應3號外顯子的61號密碼子的突變位點的胞嘧啶(C)點突變，因此可知待測檢體於3號外顯子的61號密碼子的突變位點產生了C的點突變。

以上所述的實驗結果，僅為表示本發明的NRAS基因的突變位點的檢測方法實際應用的效果，因此不應以此實驗結果限制本發明的申請專利範圍。

本發明的目的，在於提供一種辨識NRAS基因的突變位點的方法，其利用偵測核酸的片段分子量，而無需像傳統定序方法利用膠體電泳，由於不同分子的分子量皆不同，因此可以精確地偵測僅有一鹼基差異的兩個不同的核酸片段，因此在辨識核酸片段時，穩定性及準確度高非常多。此外在本發明的方法操作可以在同一反應中同時偵測高達26型的NRAS 2、3、4號外顯子的突變類型，可大幅降低分析成本，操作簡單快速，且適用各種品質之檢體，包含新鮮組織、冷凍組織、石蠟包埋組織(formalin-fixed paraffin-embedded(FFPE)tissue)、細胞株萃取的基因體DNA(genomic DNA)或是血漿cfDNA(circulating cell-free DNA)，比現有技術更能偵測到微量檢體中細微突變比率之差異，具有極高效率。

所屬領域之技術人員當可瞭解，在不違背本發明精神下，依據本發明實施樣態所能進行的各種變化。因此，顯見所列之實施態樣並非用以限制本發明，而是企圖在所附申請專利範圍的定義下，涵蓋於本發明的精神與範疇中所做的修改。

<110> 豐技生物科技股份有限公司

<120> NRAS基因的突變位點的檢測方法

<130> TP160131-TW

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 1

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 2

<210> 3

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<213> 人工序列

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<223> 合成引子

<400> 3

<210> 4

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<223> 合成引子

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<223> 合成引子

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 合成引子

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<213> 人工序列

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 8

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 9

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 10

<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 11

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 12

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 13

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 14

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 15

<210> 16

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 16

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 17

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 18

<210> 19

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Synthesized TAG Sequence

<400> 19

S10-S50‧‧‧步驟

Claims

一種NRAS基因的多個突變位點的檢測方法，包括以下步驟：(S100)對一待測檢體進行一聚合酶連鎖反應(PCR)，其中使用多對擴增引子，擴增該待測檢體中多段核酸片段，該各段核酸片段包含一個該突變位點，而獲得該被擴增的多個核酸片段；(S200)對該被擴增的多個核酸片段進行去磷酸化反應，以去除用於該聚合酶連鎖反應的核苷酸材料5’端的磷酸根；(S300)對該被擴增的多個核酸片段進行延伸反應，其中使用多個延伸引子辨識該多個突變位點的位置，並在該各個延伸引子的3’端延伸與該各個突變位點的鹼基互補的單一核苷酸，而獲得多個被延伸的延伸引子；(S400)進行純化反應，以純化該多個被延伸的延伸引子；以及(S500)以一質譜儀檢測該多個被延伸的延伸引子的分子量大小，根據該各個分子量大小決定該各個被延伸的單一核苷酸的鹼基種類，從而決定該各個突變位點的基因型。其中每兩個該擴增引子和相對應的該延伸引子分別選自於：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：9； SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：15；SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：17；以及SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：18所組成的一群組中的至少二者。
如申請專利範圍第1項所述的NRAS基因的多個突變位點的檢測方法，其中該擴增引子的5’端增加一不與包含該突變位點的核酸片段互補的TAG核酸片段，以增加該擴增引子與該延伸引子之間的分子量差距。
如申請專利範圍第2項所述的NRAS基因的多個突變位點的檢測方法，其中該TAG核酸片段包括SEQ ID NO：19。