JP4192740B2 - マルチプレックスｐｃｒ用プライマーパネル、それを用いるマルチプレックスｐｃｒ法、及び遺伝子解析方法 - Google Patents
マルチプレックスｐｃｒ用プライマーパネル、それを用いるマルチプレックスｐｃｒ法、及び遺伝子解析方法 Download PDFInfo
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Description
本発明は、生化学、分子生物学、臨床に関し、より詳しくはＤＮＡ解析・検査分野に関し、特に、ヒトの男性のＹ染色体欠失突然変異の検出に関する。
現在市販されている遺伝子検出用キットは、研究用途を主眼に置いているためターゲットとする遺伝子座が多く、マルチプレックスＰＣＲの歩留まりが悪くなる問題や、得られるデータの解析が複雑になる問題などがある。一方、検査受託事業においては、目的遺伝子座に焦点を当て、確実に検査結果を出すことを目的とした遺伝子検出用キットが用いられている。例えば、http//61.194.2.85/srlinfo/kensa_ref_CD/KENSA/SRL2223.htm（ＳＲＬ）、http//61.194.2.85/srlinfo/kensa_ref_CD/KENSA/SRL2425.htm（ＳＲＬ）、http//www.promega.co.jp/Cre_Html.PHP3?pGMPID=0104003（Ｐｒｏｍｅｇａ）に記載の遺伝子検出用キットが挙げられる。しかし、これらはスループットと解析価格の点で課題を有している。
また、米国特許第５，７５０，０１５号明細書、米国特許第６，００１，２２９号明細書、及び米国特許第６，０３３，５４６号明細書には、マイクロチップ電気泳動について記載されている。
そこで本発明の目的は、確実にマルチプレックスＰＣＲを行うことができ、分離データからの解釈がしやすいように設計されたマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネル、そのプライマーパネルを用いたマルチプレックスＰＣＲ法、及びそのマルチプレックスＰＣＲ法を用いた遺伝子解析法を提供することにある。
すなわち本発明は、
染色体上の特定の領域をＰＣＲ増幅するオリゴヌクレオチドプライマー対であって、前記オリゴヌクレオチドプライマー対のいずれか一方のオリゴヌクレオチドプライマーは、前記特定の領域の一方の端からの配列と相補的な配列を有し、前記オリゴヌクレオチドプライマー対のいずれか他方のオリゴヌクレオチドプライマーは、前記特定の領域の他方の端からの配列と相補的な配列を有し、前記オリゴヌクレオチドプライマーはそれぞれ鎖長が１５〜２５ｂｐ、ＧＣ含有率が３０〜６０％、下記式：
Ｔｍ＝［２℃×（Ａ＋Ｔ）＋４℃×（Ｃ＋Ｇ）］（式中、Ａはアデニンの数、Ｔはチミンの数、Ｃはシトシンの数、Ｇはグアニンの数を表す。）
で計算されるＴｍ値が５２〜７２、かつ３´末端がＧ又はＣであるオリゴヌクレオチドプライマー対を含み、
増幅すべき前記特定の領域の数が６〜２０であり、前記特定の領域のうち少なくとも１つがＰＣＲ増幅の陽性対照であり、かつ、増幅によって得られる前記特定の領域の配列を有するＰＣＲ産物の鎖長が５０〜６００ｂｐであるように設計され、且つ
ＳＲＹ遺伝子座位を目的領域とする前記特定の領域をＰＣＲ増幅するための配列番号１及び２の配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー対、
ＡＭＥＬＹ遺伝子座位を目的領域とする前記特定の領域をＰＣＲ増幅するための配列番号３及び４の配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー対、
ＤＢＹ遺伝子座位を目的領域とする前記特定の領域をＰＣＲ増幅するための配列番号５及び６の配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー対、
ＲＢＭ遺伝子座位を目的領域とする前記特定の領域をＰＣＲ増幅するための配列番号７及び８の配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー対、
ＤＡＺ遺伝子座位を目的領域とする前記特定の領域をＰＣＲ増幅するための配列番号９及び１０の配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー対、及び
ＰＣＲ増幅の陽性対照であるＡＭＥＬＸ遺伝子座位を目的領域とする前記特定の領域をＰＣＲ増幅するための配列番号１１及び１２の配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー対を少なくとも含む、マルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネルである。
染色体上の特定の領域をＰＣＲ増幅するオリゴヌクレオチドプライマー対であって、前記オリゴヌクレオチドプライマー対のいずれか一方のオリゴヌクレオチドプライマーは、前記特定の領域の一方の端からの配列と相補的な配列を有し、前記オリゴヌクレオチドプライマー対のいずれか他方のオリゴヌクレオチドプライマーは、前記特定の領域の他方の端からの配列と相補的な配列を有し、前記オリゴヌクレオチドプライマーはそれぞれ鎖長が１５〜２５ｂｐ、ＧＣ含有率が３０〜６０％、下記式：
Ｔｍ＝［２℃×（Ａ＋Ｔ）＋４℃×（Ｃ＋Ｇ）］（式中、Ａはアデニンの数、Ｔはチミンの数、Ｃはシトシンの数、Ｇはグアニンの数を表す。）
で計算されるＴｍ値が５２〜７２、かつ３´末端がＧ又はＣであるオリゴヌクレオチドプライマー対を含み、
増幅すべき前記特定の領域の数が６〜２０であり、前記特定の領域のうち少なくとも１つがＰＣＲ増幅の陽性対照であり、かつ、増幅によって得られる前記特定の領域の配列を有するＰＣＲ産物の鎖長が５０〜６００ｂｐであるように設計され、且つ
ＳＲＹ遺伝子座位を目的領域とする前記特定の領域をＰＣＲ増幅するための配列番号１及び２の配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー対、
ＡＭＥＬＹ遺伝子座位を目的領域とする前記特定の領域をＰＣＲ増幅するための配列番号３及び４の配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー対、
ＤＢＹ遺伝子座位を目的領域とする前記特定の領域をＰＣＲ増幅するための配列番号５及び６の配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー対、
ＲＢＭ遺伝子座位を目的領域とする前記特定の領域をＰＣＲ増幅するための配列番号７及び８の配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー対、
ＤＡＺ遺伝子座位を目的領域とする前記特定の領域をＰＣＲ増幅するための配列番号９及び１０の配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー対、及び
ＰＣＲ増幅の陽性対照であるＡＭＥＬＸ遺伝子座位を目的領域とする前記特定の領域をＰＣＲ増幅するための配列番号１１及び１２の配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー対を少なくとも含む、マルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネルである。
本発明は、前記ＰＣＲ産物を電気泳動で分離検出するための、前記のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネルである。
本発明は、前記オリゴヌクレオチドプライマー対のうち少なくとも片方のオリゴヌクレオチドプライマーが標識されている、前記のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネルである。
本発明は、前記標識が蛍光標識、化学発光標識又はアイソトープ標識である、前記のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネルである。
本発明は、前記オリゴヌクレオチドプライマー対のうち少なくとも片方のオリゴヌクレオチドプライマーが標識されている、前記のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネルである。
本発明は、前記標識が蛍光標識、化学発光標識又はアイソトープ標識である、前記のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネルである。
本発明は、前記ＰＣＲ産物の各々が互いに５ｂｐ以上の鎖長の差を有するように設定された、前記のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネルである。
本発明は、前記特定の領域が存在する染色体の長腕側又は短腕側の一方の端に近い領域に対応するＰＣＲ産物の鎖長よりも、他方の端に近い領域に対応するＰＣＲ産物の鎖長の方が常に大きくなるように設定された、前記のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネルである。
本発明は、前記特定の領域が存在する染色体の長腕側又は短腕側の一方の端に近い領域に対応するＰＣＲ産物の鎖長よりも、他方の端に近い領域に対応するＰＣＲ産物の鎖長の方が常に大きくなるように設定された、前記のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネルである。
本発明は、前記のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネルを用いる、マルチプレックスＰＣＲ法である。
本発明は、前記のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネルを用いるマルチプレックスＰＣＲ法によって得られるＰＣＲ産物を、電気泳動によって分離検出する、遺伝子解析方法である。
本発明は、前記電気泳動がマイクロキャピラリー電気泳動である、前記の遺伝子解析方法である。
本発明は、前記電気泳動においてオートローダシステムが用いられる、前記の遺伝子解析方法である。
本発明は、前記電気泳動がマイクロキャピラリー電気泳動である、前記の遺伝子解析方法である。
本発明は、前記電気泳動においてオートローダシステムが用いられる、前記の遺伝子解析方法である。
本発明は、前記検出がＵＶ吸収検出、蛍光検出、電気化学検出、電気伝導度検出、又は化学発光検出である、前記の遺伝子解析方法である。
本発明によれば、確実にマルチプレックスＰＣＲを行うことができ、分離データからの解釈がしやすいように設計されたマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネル、そのプライマーパネルを用いたマルチプレックスＰＣＲ法、及びそのマルチプレックスＰＣＲ法を用いた遺伝子解析法が提供される。また本発明によると、ＤＮＡ多型情報を元に、臨床所見を補完する検査結果が簡便、迅速、データ精度高くかつ安価に提供される。
本発明のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネルは、染色体上の特定の領域をＰＣＲ増幅するオリゴヌクレオチドプライマー対を複数含む。前記オリゴヌクレオチドプライマー対のいずれか一方のオリゴヌクレオチドプライマーは、前記特定の領域が有する配列の一方の端と相補的な配列を有し、前記オリゴヌクレオチドプライマー対のいずれか他方のオリゴヌクレオチドプライマーは、前記配列の他方の端と相補的な配列を有する。
本発明のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネルは、
１．オリゴヌクレオチドプライマーの鎖長が１５〜２５ｂｐであること、
２．オリゴヌクレオチドプライマーのＧＣ含有率が３０〜６０％であること、
３．オリゴヌクレオチドプライマーの融解温度（Ｔｍ値）が５２〜７２であること、
４．オリゴヌクレオチドプライマーの３´末端がＧ又はＣであること、
５．増幅すべき前記特定の領域の数が６〜２０となるように設計されていること、
６．前記特定の領域のうち少なくとも１つがＰＣＲ増幅の陽性対照となるように設計されていること、
７．増幅によって得られるＰＣＲ産物の鎖長が５０〜６００ｂｐとなるように設計されていること、及び
８．ＳＲＹ遺伝子座位を目的領域とする前記特定の領域をＰＣＲ増幅するための配列番号１及び２の配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー対；ＡＭＥＬＹ遺伝子座位を目的領域とする前記特定の領域をＰＣＲ増幅するための配列番号３及び４の配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー対；ＤＢＹ遺伝子座位を目的領域とする前記特定の領域をＰＣＲ増幅するための配列番号５及び６の配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー対；ＲＢＭ遺伝子座位を目的領域とする前記特定の領域をＰＣＲ増幅するための配列番号７及び８の配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー対；ＤＡＺ遺伝子座位を目的領域とする前記特定の領域をＰＣＲ増幅するための配列番号９及び１０の配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー対；及びＰＣＲ増幅の陽性対照であるＡＭＥＬＸ遺伝子座位を目的領域とする前記特定の領域をＰＣＲ増幅するための配列番号１１及び１２の配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー対を少なくとも含むこと
という要件を同時に満たす。
１．オリゴヌクレオチドプライマーの鎖長が１５〜２５ｂｐであること、
２．オリゴヌクレオチドプライマーのＧＣ含有率が３０〜６０％であること、
３．オリゴヌクレオチドプライマーの融解温度（Ｔｍ値）が５２〜７２であること、
４．オリゴヌクレオチドプライマーの３´末端がＧ又はＣであること、
５．増幅すべき前記特定の領域の数が６〜２０となるように設計されていること、
６．前記特定の領域のうち少なくとも１つがＰＣＲ増幅の陽性対照となるように設計されていること、
７．増幅によって得られるＰＣＲ産物の鎖長が５０〜６００ｂｐとなるように設計されていること、及び
８．ＳＲＹ遺伝子座位を目的領域とする前記特定の領域をＰＣＲ増幅するための配列番号１及び２の配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー対；ＡＭＥＬＹ遺伝子座位を目的領域とする前記特定の領域をＰＣＲ増幅するための配列番号３及び４の配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー対；ＤＢＹ遺伝子座位を目的領域とする前記特定の領域をＰＣＲ増幅するための配列番号５及び６の配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー対；ＲＢＭ遺伝子座位を目的領域とする前記特定の領域をＰＣＲ増幅するための配列番号７及び８の配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー対；ＤＡＺ遺伝子座位を目的領域とする前記特定の領域をＰＣＲ増幅するための配列番号９及び１０の配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー対；及びＰＣＲ増幅の陽性対照であるＡＭＥＬＸ遺伝子座位を目的領域とする前記特定の領域をＰＣＲ増幅するための配列番号１１及び１２の配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー対を少なくとも含むこと
という要件を同時に満たす。
以下、本発明のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネルについて詳細に説明する。
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、以下の要件を満たすように設計される。
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、以下の要件を満たすように設計される。
鎖長は１５〜２５ｂｐ、好ましくは２０〜２２ｂｐである。また、ＧＣ含有率は３０％〜６０％、好ましくは３５〜５０％である。本発明においては、後述のＴｍ値を適切な範囲とするために、鎖長及びＧＣ含有率を上記範囲に設定する。
Ｔｍ値は５２〜７２、好ましくは５４〜６０である。本発明において、Ｔｍ値は下記式：
Ｔｍ＝［２℃×（Ａ＋Ｔ）＋４℃×（Ｃ＋Ｇ）］
（式中、Ａはアデニン、Ｔはチミン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニンの、配列中のそれぞれの数を表す。）
で計算される。上記Ｔｍ値より小さいと増幅効率が悪くなり、上記Ｔｍ値より大きいと非特異的増幅が起こりやすくなる。１個のプライマー対においては、Ｔｍ値は互いに同じくらいになるようにする。例えば、２ｂｐ以下の差に収まる様にＴｍ値を設定することが好ましい。
Ｔｍ＝［２℃×（Ａ＋Ｔ）＋４℃×（Ｃ＋Ｇ）］
（式中、Ａはアデニン、Ｔはチミン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニンの、配列中のそれぞれの数を表す。）
で計算される。上記Ｔｍ値より小さいと増幅効率が悪くなり、上記Ｔｍ値より大きいと非特異的増幅が起こりやすくなる。１個のプライマー対においては、Ｔｍ値は互いに同じくらいになるようにする。例えば、２ｂｐ以下の差に収まる様にＴｍ値を設定することが好ましい。
３´末端がＧ又はＣである。こうすることにより、非特異的な増幅を少なくすることができる。上述のようにプライマー対を設計することによって、マルチプレックスＰＣＲを確実に行うことができる。
本発明のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネルは、増幅すべき特定の領域の数を６〜２０、好ましくは６〜１０に絞り込むように設計されている。このように設計することにより、本発明のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネルを用いたマルチプレックスＰＣＲ増幅によって得られるＰＣＲ産物を電気泳動によって分離検出する場合に、データ解析が簡便になる。
さらに、上記特定の領域のうち少なくとも１つがＰＣＲ増幅の陽性対照となるように設計されている。このことにより、本発明のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネルを用いるマルチプレックスＰＣＲ増幅、及びＰＣＲ産物の分離検出が行われたときに、それらが正確に実行されたかどうかが信頼性を持って示される。陽性対照は基本的に１つ設定すればよいが、必要に応じ２〜３個程度設定しても良い。
すなわち、本発明における前記オリゴヌクレオチドプライマー対には、前記陽性対照を増幅するための陽性対照用プライマー対が少なくとも１つ含まれる。
さらに本発明のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネルは、得られるＰＣＲ産物の各々のサイズが鎖長５０〜６００ｂｐ、好ましくは７０〜５００ｂｐとなるように設計される。
本発明のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネルは、上述の要件を同時に満たすことにより、確実なマルチプレックスＰＣＲを可能にする。また、それにより得られるＰＣＲ産物がキャピラリー電気泳動に用いられたときに、微量サンプルでも高速かつ簡便に分離検出することを可能にする。すなわち、分離データからの解釈を容易にする。本発明のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネルを用いることによるマルチプレックスＰＣＲが確実であることはこの分離データから検証することができる。
本発明のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネルは、好ましくは、上述のように、マルチプレックスＰＣＲに用いることによって得られるＰＣＲ産物を電気泳動によって分離検出するために用いられる。微量のサンプルで高速に分離するという観点から、電気泳動法としては、マイクロキャピラリー電気泳動であることがより好ましい。得られるＰＣＲ産物の鎖長及び鎖長の差を上記範囲に設定することにより、得られるＰＣＲ産物が現行のマイクロキャピラリー電気泳動装置によって効率よく分離検出できる。好ましくは、マイクロキャピラリー電気泳動装置として、ＭＣＥ−２０１０（（株）島津製作所製）、Bio Analyzer（アジレント社製）、ＳＶ−１２１０（（株）日立製作所製）等のマイクロチップ電気泳動装置によって分離検出を行うために用いられる。
本発明のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネルにおいては、増幅目的とする領域が存在する染色体の長腕側又は短腕側の一方の端に近い領域に対応するＰＣＲ産物の鎖長よりも、他方の端に近い領域に対応するＰＣＲ産物の鎖長の方が常に大きくなるように、それぞれのプライマー対を設定することが好ましい。こうすることによって、本発明のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネルを用いたマルチプレックスＰＣＲ増幅によって得られるＰＣＲ産物を電気泳動によって分離検出したときに、得られる電気泳動波形データにおいて、目的遺伝子の情報が染色体の一方の端のものから順番に、対応するＰＣＲ産物のピークとして検出され、解析が容易となる。
またさらに、ＰＣＲ産物の各々の鎖長は互いに５ｂｐ以上差を有するように設定することが好ましく、１０ｂｐ以上の差を有するように設定することがより好ましい。こうすることにより、前記電気泳動の波形データにおけるＰＣＲ産物の各々のピークが十分に離れて検出されるため、目視で簡単に解析できるようになる。
得られるＰＣＲ産物をより容易に検出するために、本発明においては、前記プライマー対の少なくとも１つが標識されていてもよい。標識は、直接的に検出可能なものでも、間接的に検出可能なものでもよく、特に限定されない。例えば、蛍光標識、化学発光標識、アイソトープ標識などを挙げることができる。
本発明のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネルは、必要に応じＰＣＲ試薬、ＤＮＡポリメラーゼ酵素、分子量標識、目的遺伝子座に対応するＤＮＡ配列を含むアンプリマー対照ラダーなどを含み、キットとして用いることができる。このようなキットは、染色体異常の有無を検出する目的においてＤＮＡ多型解析などの遺伝子解析に用いることができる。本発明のＰＣＲ用プライマーパネルによって検出することができる染色体異常としては、染色体上の核酸配列の転座、欠失、重複などを挙げることができる。本発明のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネルを用いると、染色体上の異常配列の有無及び位置を迅速かつ正確に判定することができる。
本発明は、特にＹ染色体欠失突然変異検出のために用いられる。Ｙ染色体欠失突然変異検出のためのマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネルは、前述の鎖長、ＧＣ含有率、Ｔｍ値及び３´末端の条件を満たすオリゴヌクレオチドプライマー対を含み、そのうち、配列番号１及び２、３及び４、５及び６、７及び８、９及び１０に記載の配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー対は、精子形成及び正常男性生殖能力のために必要とされる遺伝子座（すなわち、ＳＲＹ、ＡＭＥＬＹ、ＤＢＹ、ＲＢＭ、ＤＡＺ）を増幅の目的領域とする。このような遺伝子座はＹ染色体上に存在し、その欠失により無精子症、乏精子症、生殖器形成不全、又はエナメル質欠損症を発現する。Ｙ染色体欠失突然変異検出のためのマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネルは、これら目的領域の数と、陽性対照の目的領域の数との和が６〜２０、好ましくは６〜１０となるように選ぶことができる。前記陽性対照用プライマーの目的領域としては、正常妊性男性ＤＮＡや、正常女性ＤＮＡ上の領域が挙げられる。そのうち、配列番号１１及び１２に記載の配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー対は、遺伝子座ＡＭＥＬＸを増幅の目的領域とする。
さらに本発明のＹ染色体欠失突然変異検出のためのマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネルは、得られるＰＣＲ産物の各々のサイズが前述の鎖長を有するように設定する。また、前述の理由により、増幅目的とする領域が存在するＹ染色体の長腕側又は短腕側の一方の端に近い領域に対応するＰＣＲ産物の鎖長よりも、他方の端に近い領域に対応するＰＣＲ産物の鎖長の方が常に大きくなるように、それぞれのプライマー対を設定することが好ましい。さらに前述の理由により、ＰＣＲ産物の各々の鎖長は互いに５ｂｐ以上差を有するように設定することが好ましく、１０ｂｐ以上の差を有するように設定することがより好ましい。
上記本発明のＹ染色体欠失突然変異検出のためのマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネルは、無精子症又は乏精子症などを原因とする不妊症を示す男性のＹ染色体の完全性を評価するのに用いることができる。また、生殖器形成不全の個人の遺伝子型を評価するのに用いることもできる。本発明のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネルを用いると、Ｙ染色体上の欠失突然変異の有無及び位置も迅速かつ正確に判定することができる。
また本発明は、上述のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネルを用いるマルチプレックスＰＣＲ法である。マルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネルが上述のように設計されていることにより、本発明におけるマルチプレックスＰＣＲは従来のものに比べ確実性が高い。
本発明におけるマルチプレックスＰＣＲ反応溶液の組成としては、例えば、全量２０μlの反応溶液の場合は、以下の組成が挙げられる。ＰＣＲバッファー（５〜４０mM Tris-HCl バッファー（ｐＨ８．３）、２５〜２００mM KCl）、１．２５〜５．０mM MgCl2、各０．１２５〜１．０mMdNTPs、各０．２５〜２．０μMフォワードプライマー、各０．２５〜２．０μMリバースプライマー、１０〜１００ng/２０μlゲノムDNA、及び０．２〜２．０U/２０μl Taqポリメラーゼ。反応溶液は、全量が２０μlになるまで滅菌蒸留水を加えて調製することができる。なお、上記濃度は、反応溶液調製後の最終濃度を示す。
本発明におけるマルチプレックスＰＣＲの反応条件は、例えば、最初の変性反応のみ９３〜９５℃で５〜１２分間行い、その後は、変性反応が９３〜９５℃で１０〜４０秒間、アニーリングが５３〜６３℃で０．５〜１．５分間、及び伸長反応が７０〜７３℃で０．５〜２分間のサイクルを２５〜３５サイクル繰り返し、最後に、７０〜７３℃で５〜１５分間の伸長反応を行うことができる。
さらに本発明は、前記マルチプレックスＰＣＲ法を用いて遺伝子解析を行う方法である。本発明における遺伝子解析は、好ましくは染色体異常の有無を検出するためのＤＮＡ解析である。本発明の遺伝子解析法によって、染色体上の核酸配列の転座、欠失、重複などの、主に疾患を発現するあらゆる配列を、従来よりも迅速かつ高い再現性で検出することができる。特に本発明の遺伝子解析法は、Ｙ染色体欠失突然変異検出の目的において用いる。これによって、無精子症又は乏精子症などを原因とする不妊症を示す男性のＹ染色体の完全性を評価することができる。また、生殖器形成不全の個人の遺伝子型を評価することもできる。本発明の遺伝子解析法によると、Ｙ染色体上の欠失突然変異の有無及び位置も、従来よりも迅速かつ高い再現性で検出することができる。
本発明の遺伝子解析法は、具体的には、以下のようにして行うことができる。すなわち、試料からゲノムＤＮＡを抽出し、上述のマルチプレックスＰＣＲ法によってＤＮＡを増幅し、得られたＰＣＲ産物を各種電気泳動法を用いて分離検出し、目的とする遺伝子座のＰＣＲ産物の有無によって、遺伝子の欠失などを判定することができる。
本発明の遺伝子解析法における電気泳動法としては、微量のサンプルで高速に分離するという観点から、マイクロキャピラリー電気泳動であることが好ましい。本発明の遺伝子解析方法においては、上述のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネルの使用によって、現行のマイクロキャピラリー電気泳動装置によってＰＣＲ産物を効率よく分離検出できる。本発明においては、マイクロキャピラリー電気泳動装置としてマイクロチップ電気泳動装置、例えばＭＣＥ−２０１０（（株）島津製作所製）、Bio Analyzer（アジレント社製）、ＳＶ−１２１０（（株）日立製作所製）等が好ましく用いられる。
また本発明においては、電気泳動においてオートローダシステムを用いることが好ましい。このことにより、より多数の微量サンプルをより正確に注入することができるため、ハイスループットな解析を行うことができる。
電気泳動におけるＰＣＲ産物の検出法としては、ＵＶ吸収検出、蛍光検出、電気化学検出、電気伝導度検出、化学発光検出などが挙げられる。マルチプレックスＰＣＲにおいて用いられたプライマーパネルに標識を用いた場合は、その標識を直接的又は間接的に検出できる方法を適宜選択することができる。
本発明の遺伝子解析法においては、上述のように設計されたマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネルを使用するため、上述のようにして得られる分離データの精度が高く、その解釈が従来よりも簡便で、目視でも簡単に行うことができる。従って、Ｙ染色体欠失検査のために本発明の遺伝子解析法が用いられると、ＤＮＡ多型情報や遺伝の欠失情報から臨床所見を補完する検査結果を簡便、迅速、データ精度高く、かつ安価に提供することができる。
［実施例１］
無精子症男性患者１、無精子症男性患者２、無精子症男性患者３、正常妊性男性、及び正常女性の５検体についてＹ染色体欠失の検出を行った。
無精子症男性患者１、無精子症男性患者２、無精子症男性患者３、正常妊性男性、及び正常女性の５検体についてＹ染色体欠失の検出を行った。
（サンプルの調製）
５検体からヒト末梢血の全血２００μlを採取し、ＤＮＡ抽出用キット（QIAamp DNA Blood Mini Kit;キアゲン社製）を使用して、ゲノムＤＮＡを抽出した。
５検体からヒト末梢血の全血２００μlを採取し、ＤＮＡ抽出用キット（QIAamp DNA Blood Mini Kit;キアゲン社製）を使用して、ゲノムＤＮＡを抽出した。
（マルチプレックスＰＣＲ反応溶液組成）
本実施例で用いたＰＣＲ反応溶液の組成を表１に示す。表１の反応溶液は、全量が２０μlになるまで滅菌蒸留水を加えて調製しており、最終濃度は、反応溶液調製後の濃度を表す。
本実施例で用いたＰＣＲ反応溶液の組成を表１に示す。表１の反応溶液は、全量が２０μlになるまで滅菌蒸留水を加えて調製しており、最終濃度は、反応溶液調製後の濃度を表す。
表２に、本実施例で用いたＹ染色体欠失検出プライマーパネルの各々のプライマー対（フォワード（Forward）プライマー及びリバース（Reverse）プライマー）の配列を示す。それぞれのプライマーは、後の電気泳動において、ＰＣＲ産物の各々が、対応するＹ染色体の短腕側の端に近い領域のものから長腕側の端に近い領域のものへ順に検出されるように設計されている。
また、表２に示されている、増幅目的とした遺伝子座SRY、AMELY、DBY、RBMY及びDAZのＹ染色体上の位置を図１に示す。図１中、Ｙｐは短腕、Ｙｑは長腕を表す。AZFa、AZFb、及びAZFcは、無精子症関連領域を表す（AZF: azoospermic factor（無精子症因子））。
（マルチプレックスＰＣＲ反応条件）
反応条件は、最初の変性反応のみ９４℃で１０分間行い、その後は、変性反応が９４℃で３０秒間、アニーリングが５６℃で１分間、及び伸長反応が７２℃で１分間のサイクルを３０サイクル繰り返し、最後に、７２℃で１０分間の伸長反応を行った。
反応条件は、最初の変性反応のみ９４℃で１０分間行い、その後は、変性反応が９４℃で３０秒間、アニーリングが５６℃で１分間、及び伸長反応が７２℃で１分間のサイクルを３０サイクル繰り返し、最後に、７２℃で１０分間の伸長反応を行った。
得られたＰＣＲ増幅物を、以下の条件でマイクロキャピラリー電気泳動を行った。電気泳動に使用した装置はＭＣＥ−２０１０ＬＩＦ（（株）島津製作所製）、使用したマイクロチップは、ＭＣＥ用マイクロチップ タイプＤ／Ｃ（（株）島津製作所製）である。
（泳動操作）
泳動操作は、以下の手順で行った。
１．マイクロチップへ泳動バッファの充填
なお、泳動バッファには、２％HEC（ヒドロキシエチルセルロース）、５×TBE（トリス−ホウ酸−EDTA）の組成のものを用いた。
２．ポート１の泳動バッファの吸引
３．ポート１へサンプルとして得られた増幅物を注入
４．サンプルのローディング
５．セパレーション
６．データの取得
なお、染色液には30,000倍希釈SYBR Goldを用いた。
泳動操作は、以下の手順で行った。
１．マイクロチップへ泳動バッファの充填
なお、泳動バッファには、２％HEC（ヒドロキシエチルセルロース）、５×TBE（トリス−ホウ酸−EDTA）の組成のものを用いた。
２．ポート１の泳動バッファの吸引
３．ポート１へサンプルとして得られた増幅物を注入
４．サンプルのローディング
５．セパレーション
６．データの取得
なお、染色液には30,000倍希釈SYBR Goldを用いた。
（泳動条件）
泳動プログラムを以下に示す。なお、分離時の電解強度は３００V/cmである。
１：０秒 電圧設定（HV1=0.18kV、HV2=0.60kV、HV3=0.32kV、HV4=0kV）
２：１５秒 電圧設定（HV1=0.18kV、HV2=0.18kV、HV3=0kV、HV4=1.11kV）
３：１５．１秒 データ取得開始
４：１３５．１秒 電圧設定（HV1=0kV、HV2=0kV、HV3=0kV、HV4=0kV）
５：泳動プログラム終了
泳動プログラムを以下に示す。なお、分離時の電解強度は３００V/cmである。
１：０秒 電圧設定（HV1=0.18kV、HV2=0.60kV、HV3=0.32kV、HV4=0kV）
２：１５秒 電圧設定（HV1=0.18kV、HV2=0.18kV、HV3=0kV、HV4=1.11kV）
３：１５．１秒 データ取得開始
４：１３５．１秒 電圧設定（HV1=0kV、HV2=0kV、HV3=0kV、HV4=0kV）
５：泳動プログラム終了
得られた５検体のサンプルの泳動分離波形データを図２〜図６に示す。図２は、無精子症男性患者１(Azo-1)、図３は、無精子症男性患者２(Azo-2)、図４は、無精子症男性患者３(Azo-3)、図５は、正常妊性男性(Control male)、図６は、正常女性(Control female)の泳動分離波形データである。また、図７は、ブランク(Blank)（水）である。これらの図はいずれも、横軸に秒(sec)、縦軸にシグナル強度(mV)を表す。
図５の正常妊性男性においては、未反応プライマー(Primer dimer)、SRY(73bp)、AMELY(130bp)、DBY(192bp)、RBM(239bp)、DAZ(317bp)、及びAMELX(470bp)のピークが検出された。それぞれのピークが示す検出遺伝子、対応するＰＣＲ産物のサイズ、及び検出目的を表３に示す。
図２の無精子症男性患者１においては、上記遺伝子の欠失は認められなかった。図３の無精子症男性患者２においては、AZFc領域のDAZ遺伝子の欠失が認められた（DAZ(-)）。図４の無精子症男性患者３においては、AZFa領域のDBY遺伝子の欠失が認められた（DBY(-)）。図６は正常女性のものであるため、Ｙ染色体上の遺伝子であるSRY、AMELY、DBY、RBM及びDAZの存在は認められない。
また、得られた５検体のサンプル及びブランク（水）の２．５％アガロースゲル電気泳動の結果を図８に示す。図８においても、上記泳動分離波形データによる結果と同様の結果が得られた。すなわち、正常妊性男性（コントロール男性）においては、未反応プライマー、73bpのSRY遺伝子、130bpのAMELY遺伝子、192bpのDBY遺伝子、239bpのRBM遺伝子、317bpのDAZ遺伝子、及び470bpのAMELX遺伝子のバンドが確認された。無精子症男性患者１(Azo-1)においては、上記遺伝子の欠失は認められなかった。無精子症男性患者２(Azo-2)においては、AZFc領域のDAZ遺伝子の欠失が認められた（DAZ(-)）。無精子症男性患者３(Azo-3)においては、AZFa領域のDBY遺伝子の欠失が認められた（DBY(-)）。なお、正常女性（コントロール女性）は、Ｙ染色体上の遺伝子であるSRY、AMELY、DBY、RBM及びDAZの存在は認められない。
［本発明のマルチプレックスＰＣＲ法及び従来のシングルＰＣＲ法による解析結果の比較］
臨床検体として無精子症患者２５名（Azo-1、Azo-2、Azo-3、Azo-4、及び他２１名）、及びコントロールとして正常妊性男性と正常女性との検体を用いて、本発明のプライマーパネルを用いたマルチプレックスＰＣＲ法と、従来より行ってきたシングルＰＣＲ法とによる解析結果に差異がないか検討を行った。この結果を表４に示す。表４中、「シングル」はシングルＰＣＲ法による解析結果を表し、「マルチ」は、本発明のマルチプレックスＰＣＲ法による解析結果を表す。表４が示すように、両方法による解析結果は全て一致していた。
臨床検体として無精子症患者２５名（Azo-1、Azo-2、Azo-3、Azo-4、及び他２１名）、及びコントロールとして正常妊性男性と正常女性との検体を用いて、本発明のプライマーパネルを用いたマルチプレックスＰＣＲ法と、従来より行ってきたシングルＰＣＲ法とによる解析結果に差異がないか検討を行った。この結果を表４に示す。表４中、「シングル」はシングルＰＣＲ法による解析結果を表し、「マルチ」は、本発明のマルチプレックスＰＣＲ法による解析結果を表す。表４が示すように、両方法による解析結果は全て一致していた。
Claims (11)
- 染色体上の特定の領域をＰＣＲ増幅するオリゴヌクレオチドプライマー対であって、前記オリゴヌクレオチドプライマー対のいずれか一方のオリゴヌクレオチドプライマーは、前記特定の領域の一方の端からの配列と相補的な配列を有し、前記オリゴヌクレオチドプライマー対のいずれか他方のオリゴヌクレオチドプライマーは、前記特定の領域の他方の端からの配列と相補的な配列を有し、前記オリゴヌクレオチドプライマーはそれぞれ鎖長が１５〜２５ｂｐ、ＧＣ含有率が３０〜６０％、下記式：
Ｔｍ＝［２℃×（Ａ＋Ｔ）＋４℃×（Ｃ＋Ｇ）］（式中、Ａはアデニンの数、Ｔはチミンの数、Ｃはシトシンの数、Ｇはグアニンの数を表す。）
で計算されるＴｍ値が５２〜７２、かつ３´末端がＧ又はＣであるオリゴヌクレオチドプライマー対を含み、
増幅すべき前記特定の領域の数が６〜２０であり、前記特定の領域のうち少なくとも１つがＰＣＲ増幅の陽性対照であり、かつ、増幅によって得られる前記特定の領域の配列を有するＰＣＲ産物の鎖長が５０〜６００ｂｐであるように設計され、且つ
ＳＲＹ遺伝子座位を目的領域とする前記特定の領域をＰＣＲ増幅するための配列番号１及び２の配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー対、
ＡＭＥＬＹ遺伝子座位を目的領域とする前記特定の領域をＰＣＲ増幅するための配列番号３及び４の配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー対、
ＤＢＹ遺伝子座位を目的領域とする前記特定の領域をＰＣＲ増幅するための配列番号５及び６の配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー対、
ＲＢＭ遺伝子座位を目的領域とする前記特定の領域をＰＣＲ増幅するための配列番号７及び８の配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー対、
ＤＡＺ遺伝子座位を目的領域とする前記特定の領域をＰＣＲ増幅するための配列番号９及び１０の配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー対、及び
ＰＣＲ増幅の陽性対照であるＡＭＥＬＸ遺伝子座位を目的領域とする前記特定の領域をＰＣＲ増幅するための配列番号１１及び１２の配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー対を少なくとも含む、マルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネル。 - 前記ＰＣＲ産物を電気泳動で分離検出するための、請求項１に記載のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネル。
- 前記オリゴヌクレオチドプライマー対のうち少なくとも片方のオリゴヌクレオチドプライマーが標識されている、請求項１又は２に記載のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネル。
- 前記標識が蛍光標識、化学発光標識又はアイソトープ標識である、請求項３に記載のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネル。
- 前記ＰＣＲ産物の各々が互いに５ｂｐ以上の鎖長の差を有するように設定された、請求項１〜４のいずれか１項に記載のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネル。
- 前記特定の領域が存在する染色体の長腕側又は短腕側の一方の端により近い領域に対応するＰＣＲ産物の鎖長よりも、前記一方の端により近い領域よりも他方の端により近い領域に対応するＰＣＲ産物の鎖長の方が常に大きくなるように設定された、請求項１〜５のいずれか１項に記載のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネル。
- 請求項１〜６のいずれか１項に記載のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネルを用いる、マルチプレックスＰＣＲ法。
- 請求項１〜６のいずれか１項に記載のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーパネルを用いるマルチプレックスＰＣＲ法によって得られるＰＣＲ産物を、電気泳動によって分離検出する、遺伝子解析方法。
- 前記電気泳動がマイクロキャピラリー電気泳動である、請求項８に記載の遺伝子解析方法。
- 前記電気泳動において、オートローダシステムが用いられる、請求項８又は９に記載の遺伝子解析方法。
- 前記検出がＵＶ吸収検出、蛍光検出、電気化学検出、電気伝導度検出、又は化学発光検出である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の遺伝子解析方法。
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