CN103814130B - 胰腺肿瘤的病型诊断方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于提供：可以早期诊断胰腺肿瘤的病型的方法，具体而言，涉及用于判定胰腺肿瘤的病型的检测方法，该方法是在来自受检者的胰液样品中，检测编码粘蛋白核心蛋白的基因的5’侧非翻译区或包含5’侧非翻译区和翻译区的区的甲基化度，以该甲基化度为指标，将胰腺肿瘤分类为选自胰腺癌、胃型胰管内乳头状粘液性肿瘤、肠型胰管内乳头状粘液性肿瘤和胰胆管上皮型胰管内乳头状粘液性肿瘤的胰腺肿瘤的病型。
Description
技术领域
本发明涉及例如使用胰液样品的胰腺肿瘤的病型诊断方法。
背景技术
大部分的胃癌或大肠癌等消化道癌症，由于X射线造影或内窥镜检查等的发达而可以在早期发现和治疗，通过建立每个人的照料(面倒さ)或检查费用等社会体系可以克服、可以说是掌控在“人类的手中”的癌症。
但是，就胰腺癌而言，即使使用PET-CT等最新的仪器，就算可以早期发现，然而在有望治愈的阶段也往往不能诊断，成为难治性癌症的代表。另外，即使通过影像诊断判明肿瘤的存在，也难以通过其活检等进行病理学的定性的诊断，迟迟不能作出“是高度的恶性肿瘤，即需要侵袭性高的手术”或者“是良性的，观察经过”的判断，这也是胰胆管类肿瘤的特征。因此，迫切需要一种胰腺癌的早期诊断和病型诊断方法。
另一方面，通常已知检测和分析DNA的甲基化，进行癌症的诊断的方法。
例如，专利文献1公开了确定受检体产生新生物性或细胞增殖障碍的因素的方法，该方法涉及H19基因、IGF2基因等靶基因的甲基化状态的变化或其多态性，包括分析生物学样品的步骤。
专利文献2公开了用于诊断癌症的方法，该方法包括：检测来自对象的样品中的甲基化SPARC核酸分子或其突变体。
专利文献3公开了检测对象中的胰腺癌的方法，该方法包括下述步骤：使来自对象的含有核酸的标本与提供至少一个基因或该基因的相关调节区的甲基化状态的判定的作用因子接触的步骤；以及鉴定基因或调节区的诸区的异常甲基化，根据其来检测对象中的胰腺癌的步骤。
专利文献4～11公开了评价来自哺乳动物的样本的癌化度的方法，该方法包括下述步骤：测定来自哺乳动物的样本中所含的靶基因的甲基化频率或与其具有相关关系的指标值的步骤；以及通过比较所测定的甲基化频率或与其具有相关关系的指标值和对照，根据得到的差异判定样本的癌化度的步骤。在专利文献4～11中，作为靶基因，可以列举：解联蛋白与金属蛋白酶结构域23基因、HAND1基因、溶质载体家族6神经递质转运蛋白去甲肾上腺素成员2基因、G蛋白偶联的生长抑素和血管紧张肽样肽受体基因、G蛋白偶联的受体7基因、神经丝3基因、肌原纤蛋白2基因和p53应答基因2基因。
但是，以往并不知道：通过检测特定的基因或其调节区的甲基化度，可以诊断胰腺肿瘤的病型。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2008-504018号公报；
专利文献2：日本特表2007-524393号公报；
专利文献3：日本特表2007-524369号公报；
专利文献4：日本特开2005-110645号公报；
专利文献5：日本特开2004-135661号公报；
专利文献6：日本特开2005-087050号公报；
专利文献7：日本特开2005-087049号公报；
专利文献8：日本特开2005-087048号公报；
专利文献9：日本特开2005-087047号公报；
专利文献10：日本特开2005-087046号公报；
专利文献11：日本特开2005-087045号公报。
发明内容
本发明鉴于上述实情，其目的在于：提供可以早期诊断胰腺肿瘤的病型的方法。
为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现：在来自受检者的胰液样品中，通过检测编码粘蛋白核心蛋白的基因的5’侧非翻译区或包含5’侧非翻译区和翻译区的区的甲基化度，可以诊断胰腺肿瘤的病型，从而完成了本发明。
本发明包含下述内容。
(1)用于判定胰腺肿瘤的病型的检测方法，该方法包括下述步骤：步骤1，在来自受检者的胰液样品中，检测编码粘蛋白核心蛋白的基因的5’侧非翻译区或包含5’侧非翻译区和翻译区的区的甲基化度；以及步骤2，以上述的甲基化度为指标，将胰腺肿瘤分类为选自胰腺癌、胃型胰管内乳头状粘液性肿瘤、肠型胰管内乳头状粘液性肿瘤和胰胆管上皮型胰管内乳头状粘液性肿瘤的胰腺肿瘤的病型。
(2)(1)所述的方法，其中，编码粘蛋白核心蛋白的基因选自MUC1基因、MUC2基因、MUC4基因和MUC5AC基因。
(3)(2)所述的方法，其中，编码粘蛋白核心蛋白的基因为包含MUC1基因、MUC2基因、MUC4基因和MUC5AC基因的基因组(geneset)。
(4)(2)或(3)所述的方法，其中，MUC1基因、MUC2基因、MUC4基因和MUC5AC基因的5’侧非翻译区或包含5’侧非翻译区和翻译区的区分别为存在于SEQIDNO:1～4所示的核苷酸序列(塩基配列)中的1个以上的CpG位点。
(5)(2)～(4)中任一项所述的方法，其中，MUC1基因、MUC2基因、MUC4基因和MUC5AC基因的5’侧非翻译区或包含5’侧非翻译区和翻译区的区分别包含SEQIDNO:1～4所示的核苷酸序列。
(6)(3)～(5)中任一项所述的方法，其中，在步骤2中，
(a)当MUC1基因、MUC2基因、MUC4基因和MUC5AC基因的5’侧非翻译区或包含5’侧非翻译区和翻译区的区全部为甲基化时，将胰腺肿瘤分类为胃型胰管内乳头状粘液性肿瘤；
(b)当MUC1基因、MUC2基因、MUC4基因和MUC5AC基因的5’侧非翻译区或包含5’侧非翻译区和翻译区的区全部为非甲基化时，将胰腺肿瘤分类为肠型胰管内乳头状粘液性肿瘤；
(c)当MUC1基因、MUC2基因和MUC4基因的5’侧非翻译区或包含5’侧非翻译区和翻译区的区为非甲基化、而MUC5AC基因的5’侧非翻译区或包含5’侧非翻译区和翻译区的区为甲基化时，将胰腺肿瘤分类为胰腺癌；或者
(d)在(a)～(c)以外的情况下，将胰腺肿瘤分类为胰胆管上皮型胰管内乳头状粘液性肿瘤。
(7)(1)～(6)中任一项所述的方法，其中，步骤1包括：将来自胰液样品的DNA供给亚硫酸氢盐处理的步骤；使用编码粘蛋白核心蛋白的基因的5’侧非翻译区或包含5’侧非翻译区和翻译区的区的外侧区域所对应的第1引物组，将亚硫酸氢盐处理后的DNA供给第一PCR的步骤；使用编码粘蛋白核心蛋白的基因的5’侧非翻译区或包含5’侧非翻译区和翻译区的区所对应的第2引物组，将第一PCR后的扩增DNA供给第二PCR的步骤；将第二PCR后的扩增DNA供给变性剂浓度梯度凝胶电泳的步骤，其中，第2引物组的引物的退火位置相对于编码粘蛋白核心蛋白的基因的5’侧非翻译区或包含5’侧非翻译区和翻译区的区存在于第1引物组的引物的退火位置的内侧。
(8)(7)所述的方法，其中，第2引物组的一个引物在5’侧具有GC-夹序列。
(9)(7)或(8)所述的方法，其中，变性剂浓度梯度凝胶只具有变性剂浓度梯度作为浓度梯度。
(10)用于判定胰腺肿瘤的病型的检测试剂盒，其特征在于：为了实施(1)～(9)中任一项所述的方法而使用该检测试剂盒。
(11)(10)所述的试剂盒，该试剂盒包含：编码粘蛋白核心蛋白的基因的5’侧非翻译区或包含5’侧非翻译区和翻译区的区的外侧区域所对应的第1引物组；以及编码粘蛋白核心蛋白的基因的5’侧非翻译区或包含5’侧非翻译区和翻译区的区所对应的第2引物组，其中，第2引物组的引物的退火位置相对于编码粘蛋白核心蛋白的基因的5’侧非翻译区或包含5’侧非翻译区和翻译区的区存在于第1引物组的引物的退火位置的内侧。
本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本国专利申请2011-144847号的说明书和/或附图中记载的内容。
附图说明
图1A显示通过被甲基化来调节人粘蛋白核心蛋白1(MUC1)基因的表达的启动子区的序列和相邻的翻译区的序列(SEQIDNO:5)；
图1B显示通过被甲基化来调节人MUC1基因的表达的启动子区的序列和相邻的翻译区的序列(SEQIDNO:6；但是，是亚硫酸氢盐处理后的DNA序列，并且用胸腺嘧啶表示由非甲基化胞嘧啶转换的尿嘧啶)；
图2A显示通过被甲基化来调节人粘蛋白核心蛋白2(MUC2)基因的表达的启动子区的序列和相邻的翻译区的序列(SEQIDNO:7)；
图2B显示通过被甲基化来调节人MUC2基因的表达的启动子区的序列和相邻的翻译区的序列(SEQIDNO:8；但是，是亚硫酸氢盐处理后的DNA序列，并且用胸腺嘧啶表示由非甲基化胞嘧啶转换的尿嘧啶)；
图3A显示通过被甲基化来调节人粘蛋白核心蛋白4(MUC4)基因的表达的启动子区的序列和相邻的翻译区的序列(SEQIDNO:9)；
图3B显示通过被甲基化来调节人MUC4基因的表达的启动子区的序列和相邻的翻译区的序列(SEQIDNO:10；但是，是亚硫酸氢盐处理后的DNA序列，并且用胸腺嘧啶表示由非甲基化胞嘧啶转换的尿嘧啶)；
图4A显示通过被甲基化来调节人粘蛋白核心蛋白5AC(MUC5AC)基因的表达的启动子区的序列(SEQIDNO:11)；
图4B显示通过被甲基化来调节人MUC5AC基因的表达的启动子区的序列(SEQIDNO:12；但是，是亚硫酸氢盐处理后的DNA序列，并且用胸腺嘧啶表示由非甲基化胞嘧啶转换的尿嘧啶)；
图5显示IPMN-胃型中的甲基化分析和免疫染色的结果；
图6-1显示IPMN-肠型中的甲基化分析和免疫染色的结果；
图6-2显示IPMN-肠型中的甲基化分析和免疫染色的结果；
图7-1显示IPMN-PB中的甲基化分析和免疫染色的结果；
图7-2显示IPMN-PB中的甲基化分析和免疫染色的结果；
图8显示PDAC中的甲基化分析和免疫染色的结果；
图9显示基于MUC1基因的甲基化分析的统计分析结果；
图10显示基于MUC2基因的甲基化分析的统计分析结果；
图11显示基于MUC4基因的甲基化分析的统计分析结果；
图12显示基于MUC5AC基因的甲基化分析的统计分析结果；
图13显示基于4种粘蛋白基因的甲基化分析结果的病型预测；
图14显示基于4种粘蛋白基因的甲基化分析结果的病型预测。
具体实施方式
以下，对本发明进行详细说明。
本发明所涉及的用于判定胰腺肿瘤的病型的检测方法(以下，称作“本方法”)包括下述步骤：步骤1，在来自胰腺肿瘤患者等受检者的胰液样品中，检测编码粘蛋白核心蛋白的基因的5’侧非翻译区或包含5’侧非翻译区和翻译区的区的甲基化度；以及步骤2，以该甲基化度为指标，将胰腺肿瘤分类为选自胰腺癌、胃型胰管内乳头状粘液性肿瘤、肠型胰管内乳头状粘液性肿瘤和胰胆管上皮型胰管内乳头状粘液性肿瘤的胰腺肿瘤的病型。换言之，本方法可以作为胰腺肿瘤的病型的诊断方法、用于判定胰腺肿瘤的病型的评价方法、或收集用于判定胰腺肿瘤的病型的信息的方法。根据本方法，在以低侵袭性得到的胰液样品中，可以早期诊断胰腺肿瘤的病型。
这里，作为编码粘蛋白核心蛋白的基因(或者还称作粘蛋白基因)，例如可以列举：粘蛋白核心蛋白(MUC)1基因、MUC2基因、MUC4基因和MUC5AC基因。特别是，在本方法中的胰腺肿瘤的分类步骤(步骤2)中，为了将胰腺肿瘤高度地分类为选自胰腺癌、胃型胰管内乳头状粘液性肿瘤、肠型胰管内乳头状粘液性肿瘤和胰胆管上皮型胰管内乳头状粘液性肿瘤的病型，优选将包含MUC1基因、MUC2基因、MUC4基因和MUC5AC基因的基因组作为编码粘蛋白核心蛋白的基因。
另外，作为甲基化度检测的靶序列(靶区)的编码粘蛋白核心蛋白的基因的5’侧非翻译区，是位于编码粘蛋白核心蛋白的基因的5’侧上游的非翻译区(UTR)，特别是包含编码粘蛋白核心蛋白的基因的启动子区的区。而且，包含编码粘蛋白核心蛋白的基因的5’侧非翻译区和翻译区的区是包含启动子区等的5’非翻译区和与该5’非翻译区相邻的翻译区(编码区)的区。
在本方法中，可以将存在于编码粘蛋白核心蛋白的基因的启动子区或包含该启动子区和翻译区的区的1个以上(1个或多个)的CpG位点作为应该检测甲基化度的靶序列。这里，CpG位点是指5’-胞嘧啶-鸟嘌呤-3’(5’-CG-3’)的二核苷酸。以2个以上的CpG位点作为靶序列时，可以将各CpG位点单独作为靶序列，或者将包含2个以上的CpG位点的区作为靶序列。
图1～4分别显示通过被甲基化来调节人MUC1、MUC2、MUC4和MUC5AC基因的表达的启动子区的序列和相邻的翻译区的序列。在图1～4中，(TIS)显示转录起始位点(transcriptioninitiationsite)，用四边形围起来的CG显示被甲基化位点(CpG位点)，用粗的四边形围起来的CG显示参与人MUC基因的表达的被甲基化位点(CpG位点)。另外，在图1B、图2B、图3B和图4B中，斜体的T是指用胸腺嘧啶表示通过亚硫酸氢盐处理由非甲基化胞嘧啶转换的尿嘧啶。需要说明的是，转录起始位点(TIS)以后的核苷酸序列为翻译区(编码区)。
图1A显示通过被甲基化来调节人MUC1基因的表达的启动子区的序列和相邻的翻译区的序列(SEQIDNO:5)。图1B显示该序列的亚硫酸氢盐处理后的DNA序列(SEQIDNO:6)，用胸腺嘧啶表示由非甲基化胞嘧啶转换的尿嘧啶。图1中，相当于下述说明的第2引物组的引物1-3和引物1-4之间的区(SEQIDNO:1)具有CpG位点(或CpG岛)172-181(与NorishigeYamada,YukariNishida,HideakiTsutsumida,TomofumiHamada,MasamichiGoto,MichiyoHigashi,MitsuharuNomoto和SuguruYonezawa(2008)MUC1expressionisregulatedbyDNAmethylationandhistoneH3-K9modificationincancercells.CancerRes.,68(8):2708-16一样，CpG位点的编号是从人MUC1基因的推定启动子上游(从该基因的转录起始点起上游2,753bp)起依次编号)。
图2A显示通过被甲基化来调节人MUC2基因的表达的启动子区的序列和相邻的翻译区的序列(SEQIDNO:7)。图2B显示该序列的亚硫酸氢盐处理后的DNA序列(SEQIDNO:8)，用胸腺嘧啶表示由非甲基化胞嘧啶转换的尿嘧啶。图2中，相当于下述说明的第2引物组的引物2-3和引物2-4之间的区(SEQIDNO:2)具有CpG位点37-43(与NorishigeYamada,TomofumiHamada,MasamichiGoto,HideakiTsutsumida,MichiyoHigashi,MitsuharuNomotoandSuguruYonezawa(2006)MUC2expressionisregulatedbyhistoneH3modificationandDNAmethylationinpancreaticcancer.Int.J.Cancer,119(8):1850-7一样，CpG位点的编号是从人MUC2基因的推定启动子上游(从该基因的转录起始点起上游1,989bp)起依次编号)。
图3A显示通过被甲基化来调节人MUC4基因的表达的启动子区的序列和相邻的翻译区的序列(SEQIDNO:9)。图3B显示该序列的亚硫酸氢盐处理后的DNA序列(SEQIDNO:10)，用胸腺嘧啶表示由非甲基化胞嘧啶转换的尿嘧啶。图3中，相当于下述说明的第2引物组的引物4-3和引物4-4之间的区(SEQIDNO:3)具有CpG位点108-118(与NorishigeYamada,YukariNishida,HideakiTsutsumida,MasamichiGoto,MichiyoHigashi,MitsuharuNomotoandSuguruYonezawa(2009)PromoterCpGmethylationincancercellscontributestoregulationofMUC4.Br.J.Cancer,100(2):344-51一样，CpG位点的编号是从人MUC4基因的推定启动子上游(从该基因的转录起始点起上游3,622bp)起依次编号)。
图4A显示通过被甲基化来调节人MUC5AC基因的表达的启动子区的序列(SEQIDNO:11)。图4B显示该序列的亚硫酸氢盐处理后的DNA序列(SEQIDNO:12)，用胸腺嘧啶表示由非甲基化胞嘧啶转换的尿嘧啶。图4中，相当于下述说明的第2引物组的引物5-3和引物5-4之间的区(SEQIDNO:4)具有CpG位点1-3(与YamadaN,NishidaY,YokoyamaS,TsutsumidaH,HoujouI,KitamotoS,GotoM,HigashiM,YonezawaS.ExpressionofMUC5AC,anearlymarkerofpancreatobiliarycancer,isregulatedbyDNAmethylationinthedistalpromoterregionincancercells.JHepatobiliaryPancreatSci,17(6):844-854,2010一样，CpG位点的编号是从人MUC5AC基因的推定启动子上游(从该基因的转录起始点起上游3,718bp)起依次编号)。
在本方法中，作为人MUC1、MUC2、MUC4和MUC5AC基因的5’侧非翻译区或5’侧非翻译区和翻译区，可以将存在于上述的各第2引物组的引物间的序列(即SEQIDNO:1～4所示的核苷酸序列)中的1个以上(1个或多个)的CpG位点(特别是，参与人MUC基因的表达的被甲基化位点)作为应该检测甲基化度的靶序列，特别优选将包含所有的参与人MUC基因的表达的被甲基化位点(CpG位点)的、SEQIDNO:1～4所示的核苷酸序列或包含该核苷酸序列的区作为应该检测甲基化度的靶序列。
以下，对本方法的各步骤进行说明。
(1)步骤1，在来自受检者的胰液样品中，检测编码粘蛋白核心蛋白的基因的5’侧非翻译区或包含5’侧非翻译区和翻译区的区的甲基化度
在本方法中，首先，准备来自胰腺肿瘤患者等受检者的胰液样品。胰液样品例如可以通过用于影像诊断的内窥镜的逆行性胰管造影、以及胰管镜检查来采集。
接着，在得到的胰液样品中，检测编码粘蛋白核心蛋白的基因的5’侧非翻译区或包含5’侧非翻译区和翻译区的区的甲基化度。甲基化度的检测(或测定)可以是以往已知的检测甲基化的方法，例如，在特定领域的甲基化DNA的检测中，通过亚硫酸氢盐(Bisulfite)处理进行核苷酸取代反应，确定DNA的序列。在该核苷酸取代反应中，非甲基化胞嘧啶与亚硫酸氢钠反应，转换成尿嘧啶。由于甲基化胞嘧啶不与亚硫酸氢钠反应，所以原理上可以根据核苷酸的不同来检测所有的胞嘧啶的甲基化状态。作为以往的甲基化的检测方法，例如可以列举：使用PCR的甲基化特异性PCR(MSP)法、使用定量的PCR的实时MSP法、使用TA克隆的亚硫酸氢盐-测序法、使用质量分析的MassARRAY法、使用第二代测序仪的焦磷酸测序法等。而且，还开发了不需要亚硫酸氢盐反应的ICON-prove法。
另外，亚硫酸氢盐-DGGE法是以由Abrams和Stanton(Abrams,E.S.和Stanton,V.P.Jr.,Useofdenaturinggradientgelelectrophoresistostudyconformationaltransitionsinnucleicacids.“MethodsEnzymol.”,1992年,第212卷,第71-104页)提案的变性剂浓度梯度凝胶电泳(DenaturingGradientGelElectrophoresis：DGGE)法为基本，由P.Guldberg等(Guldberg,P.,Gronbak,K.,Aggerholm,A.,Platz,A.,thorStraten,P.,Ahrenkiel,V.,Hokland,P.,和Zeuthen,J.,DetectionofmutationsinGC-richDNAbybisulphitedenaturinggradientgelelectrophoresis.“NucleicAcidsRes.”,1998年,第26卷,第6号,第1548-1549页)开发的方法。在该方法中，通过PCR扩增亚硫酸氢盐处理后的样品后，将其扩增子供给使用了由聚丙烯酰胺和变性剂的浓度梯度组成的凝胶的电泳。根据聚丙烯酰胺的浓度梯度，利用双链DNA的分子量的不同进行分离，再根据变性剂的浓度梯度，利用双链DNA的变性度的差异进行分离，并利用目标区中的尿嘧啶(非甲基化胞嘧啶)与胞嘧啶(甲基化胞嘧啶)的不同进行分离。该方法可以与MSP法一样进行视觉评价，而且，可以将电泳后的凝胶中的谱带转用到测序反应中。另外，与亚硫酸氢盐测序法进行比较时，根据亚硫酸氢盐-DGGE法，可以大幅缩短时间。
但是，在本方法中，作为甲基化度的检测方法，特别优选即使是微量的DNA样品也可以检测DNA甲基化、并且还可以检测DNA甲基化图形或连续性的MSE(甲基化特异性电泳)法(国际申请第PCT/JP2011/060339号(国际公开第2011/132798号))。
MSE法包括下述步骤：(a)将DNA供给亚硫酸氢盐处理的步骤；(b)使用靶区的外侧区域所对应的第1引物组，将亚硫酸氢盐处理后的DNA供给第一PCR的步骤；(c)使用靶区所对应的第2引物组，将第一PCR后的扩增DNA供给第二PCR的步骤；(d)将第二PCR后的扩增DNA供给变性剂浓度梯度凝胶电泳的步骤。
以下，对本方法中的MSE法的各步骤进行说明。
(a)将DNA供给亚硫酸氢盐处理的步骤
首先，从胰液样品中提取DNA，将该DNA供给亚硫酸氢盐处理。通过该处理，非甲基化胞嘧啶被亚硫酸氢盐磺化，再通过水解进行脱氨基化，并进一步通过在碱存在下的去磺化而转换成尿嘧啶。相对于此，被甲基化的胞嘧啶即使通过亚硫酸氢盐处理，也不会转换成尿嘧啶。因此，根据通过亚硫酸氢盐处理是否转换成尿嘧啶，来区别含有CpG的DNA的核苷酸序列中的胞嘧啶是否被甲基化。需要说明的是，使用市售的亚硫酸氢盐处理用的试剂盒(例如，EpiTect亚硫酸氢盐试剂盒(QIAGEN公司制))，根据该试剂盒手册，可以将DNA供给亚硫酸氢盐处理。
(b)将亚硫酸氢盐处理后的DNA供给第一PCR的步骤
接着，使用靶区(即，编码粘蛋白核心蛋白的基因的5’侧非翻译区或包含5’侧非翻译区和翻译区的区)的外侧区域所对应的第1引物组，将亚硫酸氢盐处理后的DNA供给第一PCR。在亚硫酸氢盐处理后，通过PCR扩增，非甲基化胞嘧啶转换成胸腺嘧啶，由于一开始就与存在于DNA序列中的胸腺嘧啶混合存在，所以类似的序列增加。随着该增加，在PCR中容易发生误退火，PCR的循环数增加时，非特异性扩增子被扩增。因此，在MSE法中，为了防止产生这样的噪音，使用靶区的外侧所对应的第1引物组进行第一PCR，接着，进行第二PCR(嵌套式PCR)，由此降低该噪音。通过降低该噪音，PCR循环数可以增加，可以提高检测限(即，可以使用微量的DNA样品)。
第1引物组的一对引物被设计成与靶区的外侧区域对应、且在该外侧区域退火。该外侧区域可以是从靶区的两末端分别沿外侧方向离开例如10～100个核苷酸(优选20～80个核苷酸)的位置。另外，作为第1引物组的引物的长度，例如可以列举15～30个核苷酸，优选18～22个核苷酸。
关于PCR，可以考虑例如扩增产物的长度或GC含量等，适当确定PCR反应液组成(例如，包括PCR缓冲液、聚合酶、dNTPMix、引物等)、热变性、退火、伸长反应等中的温度设定以及循环数再进行。这样的PCR条件，例如可以适当确定在最适合于所使用的聚合酶的条件下进行等。需要说明的是，通过该PCR，由非甲基化胞嘧啶转换的尿嘧啶被转换成胸腺嘧啶。
(c)将第一PCR后的扩增DNA供给第二PCR的步骤
第一PCR后，使用靶区所对应的第2引物组，将第一PCR后的扩增DNA(扩增产物)供给第二PCR。该第二PCR还被称作嵌套式PCR。即，在第一PCR后的扩增产物的内侧设计第2引物组的引物，以第一PCR后的扩增产物作为新的模板，进行第二PCR。
第2引物组的引物设计成：其退火位置以靶区为基准存在于第1引物组的引物的退火位置的内侧。即，第2引物组的引物的退火位置为靶区的两末端或其相邻区域。需要说明的是，第2引物组的引物和第1引物组的引物，只要第2引物组的引物的退火位置位于第1引物组的引物的退火位置的内侧即可，可以有一部分重复。作为第2引物组的引物的长度，例如可以列举15～30个核苷酸，优选18～22个核苷酸。需要说明的是，通过在第2引物中的一个引物(例如正向(有义)引物)的5’侧添加GC-夹序列，在后续的变性剂浓度梯度凝胶电泳步骤中，可以提高分离能力。这里，GC-夹序列是指富含30～50个核苷酸左右的G-C且稳定的序列，例如可以列举SEQIDNO:13中记载的核苷酸序列。
另外，与第一PCR一样，可以考虑靶区的长度或GC含量等，适当确定PCR反应液组成(例如，包括PCR缓冲液、聚合酶、dNTPMix、引物等)、热变性、退火、伸长反应等中的温度设定以及循环数，再进行PCR。
(d)将第二PCR后的扩增DNA供给变性剂浓度梯度凝胶电泳的步骤
第二PCR后，通过将扩增DNA供给变性剂浓度梯度凝胶电泳，可以分离扩增DNA，视觉评价甲基化图形或连续性。
关于变性剂浓度梯度凝胶，例如使用凝胶成分(丙烯酰胺)、尿素与甲酰胺的组合等变性剂、TAE缓冲液等来制作。具体而言，例如使用聚丙烯酰胺凝胶、并且使用尿素与甲酰胺的组合作为变性剂时，根据扩增产物的长度等来制作，使在凝胶中例如形成6～15%(优选8～10%)的丙烯酰胺浓度，并且尿素与甲酰胺的组合的浓度梯度例如形成10%→50%～20%→30%(优选浓度梯度的跨度为10%以上)。另外，作为最适条件的研究，用浓度梯度的跨度广(10%～50%)的凝胶进行研究，研究缩小浓度梯度的跨度的方法。另外，当检测的谱带呈成片条带(smear)时，提高丙烯酰胺的浓度。需要说明的是，变性剂浓度梯度是从电泳的阴极向阳极方向(向DNA所泳动的方向)由低浓度到高浓度形成梯度。
将第二PCR后的扩增DNA(例如4～15μl、优选5～10μl)上样到变性剂浓度梯度凝胶中，供给电泳。作为电泳条件，例如泳动槽温度：60℃、恒压：70～250V和泳动时间：300～900分钟。
电泳后，将变性剂浓度梯度凝胶供给溴化乙锭染色、或者Gel-red染色，由此可以视觉观察上样的扩增DNA的谱带。G与C的对中的氢键为3根，而A与T的对中的氢键为2根。因此，与AT的键相比，GC的键对变性剂更具耐性。因此，与具有多个AT键的DNA相比，具有多个GC键的DNA在变性剂浓度梯度凝胶中进一步泳动。
DNA中的非甲基化胞嘧啶转换成尿嘧啶、之后再转换成胸腺嘧啶，因此与具有甲基化胞嘧啶的靶区所对应的扩增DNA相比，具有非甲基化胞嘧啶的靶区所对应的扩增DNA泳动速度慢，位于接近变性剂浓度梯度凝胶的阴极的一侧。另一方面，具有甲基化胞嘧啶的靶区所对应的扩增DNA泳动速度快，位于接近变性剂浓度梯度凝胶的阳极的一侧。因此，根据该泳动的不同，可以判断具有甲基化胞嘧啶的靶区和具有非甲基化胞嘧啶的靶区，可以评价靶区中的甲基化图形或连续性。
(2)步骤2，以检测的甲基化度为指标，将胰腺肿瘤分类为选自胰腺癌、胃型胰管内乳头状粘液性肿瘤、肠型胰管内乳头状粘液性肿瘤和胰胆管上皮型胰管内乳头状粘液性肿瘤的病型
在本方法中，以检测的甲基化度为指标，将胰腺肿瘤分类为胰腺癌(PDAC)、胃型胰管内乳头状粘液性肿瘤(IPMN-胃型)、肠型胰管内乳头状粘液性肿瘤(IPMN-肠型)、或胰胆管上皮型胰管内乳头状粘液性肿瘤(IPMN-PB(胰胆))。
例如，利用ImageJ等图像处理软件，将MSE法中DGGE后的凝胶的照片中的谱带的发光强度数值化，利用统计分析软件(例如，统计分析软件“R”)进行统计处理。比较通过该统计处理算出的甲基化DNA含量，例如即使显示出非甲基化的谱带，但作为整体显示出高的甲基化DNA的含量时，判别为甲基化倾向。例如，在包含MUC1基因、MUC2基因、MUC4基因和MUC5AC基因的基因组中，在各种基因的甲基化倾向和非甲基化倾向的判定中，关于甲基化DNA含量，将MUC1基因：50%(±20%)、MUC2基因：70%(±20%)、MUC4基因：50%(±20%)和MUC5AC基因：60%(±20%)设定为截断值，在使用该4种编码粘蛋白核心蛋白的基因的病型预测中，可以根据下述(a)～(d)将胰腺肿瘤进行分类：
(a)在IPMN-胃型中，4基因全部有甲基化倾向；
(b)在IPMN-肠型中，4基因全部有非甲基化倾向；
(c)在PDAC中，MUC1、MUC2和MUC4基因有非甲基化倾向，而MUC5AC基因有甲基化倾向；以及
(d)IPMN-PB为上述(a)～(c)以外的情形，
如此操作，包括预后极差的PDAC或预后较好的胰管内乳头状粘液性肿瘤(IPMN)中的任一种、又或者是在IPMN中癌化的可能性也高的病型的“IPMN-肠型”、或者是比较安全的病型的“IPMN-胃型”在内，可以进行早期诊断。
以上说明的本方法是使用以低侵袭性得到的胰液样品的诊断方法，除了可以实施目前的各种检查(例如通过组织诊进行的诊断)外，还可以实施更高精度的胰腺肿瘤检查。另外，根据本方法，除了利用高度发达的影像诊断进行存在诊断外，还可以有效利用可以低侵袭性地采集的胰液这种分泌液，通过检测实验胚胎学异常，增进推测恶性度的定性的诊断，可以早期确立明确的治疗措施。
另外，本发明还涉及为了实施本方法而使用的、用于判定胰腺肿瘤的病型的检测试剂盒(以下，只称作“试剂盒”)。试剂盒还可以称为胰腺肿瘤的病型的诊断试剂盒、用于判定胰腺肿瘤的病型的评价试剂盒、或者用于收集用于判定胰腺肿瘤的病型的信息的试剂盒。
试剂盒中可以包含例如用于进行上述MSE法的试剂。作为该试剂，例如可以列举：亚硫酸氢盐处理用的亚硫酸氢盐(亚硫酸氢钠)；第一PCR用的第1引物组；第二PCR用的第2引物组；用于第一PCR和第二PCR的反应液组成成分(PCR缓冲液、聚合酶、dNTPMix等)；变性剂浓度梯度凝胶电泳用的凝胶成分(丙烯酰胺等)、变性剂(尿素、甲酰胺等)、缓冲液(TAE缓冲液等)等。
如下述实施例中说明的那样，作为第1引物组，例如关于MUC1基因，可以列举由SEQIDNO:14记载的核苷酸序列组成的引物和由SEQIDNO:15记载的核苷酸序列组成的引物的组；关于MUC2基因，可以列举由SEQIDNO:18记载的核苷酸序列组成的引物和由SEQIDNO:19记载的核苷酸序列组成的引物的组；关于MUC4基因，可以列举由SEQIDNO:22记载的核苷酸序列组成的引物和由SEQIDNO:23记载的核苷酸序列组成的引物的组；关于MUC5AC基因，可以列举由SEQIDNO:26记载的核苷酸序列组成的引物和由SEQIDNO:27记载的核苷酸序列组成的引物的组。另外，作为第2引物组，例如，关于MUC1基因，可以列举由SEQIDNO:16记载的核苷酸序列组成的引物和由SEQIDNO:17记载的核苷酸序列组成的引物的组；关于MUC2基因，可以列举由SEQIDNO:20记载的核苷酸序列组成的引物和由SEQIDNO:21记载的核苷酸序列组成的引物的组；关于MUC4基因，可以列举由SEQIDNO:24记载的核苷酸序列组成的引物和由SEQIDNO:25记载的核苷酸序列组成的引物的组；关于MUC5AC基因，可以列举由SEQIDNO:28记载的核苷酸序列组成的引物和由SEQIDNO:29记载的核苷酸序列组成的引物的组。
而且，试剂盒还可以包含操作说明书、用于判定胰腺肿瘤的病型的说明书等。
以下，利用实施例来更详细地说明本发明，但本发明的技术范围并不限于这些实施例。
〔实施例1〕通过4种粘蛋白基因的甲基化分析预测胰腺肿瘤的病型
在本实施例中，在人的胰腺癌(PDAC)、胃型胰管内乳头状粘液性肿瘤(IPMN-胃型)、肠型胰管内乳头状粘液性肿瘤(IPMN-肠型)和胰胆管上皮型胰管内乳头状粘液性肿瘤(IPMN-PB(胰胆))的胰液样品中，通过MSE法进行MUC1、MUC2、MUC4和MUC5AC基因启动子或与该启动子相邻的翻译区上的参与表达的被甲基化位点(CpG位点)的甲基化分析，另外，通过免疫组织化学染色确认由这些基因编码的蛋白的表达。
1．材料和方法
1-1．样品
分析中使用的样品组见下述的表1。
表1
| IPMN-胃型 | 6个样品 |
| IPMN-肠型 | 6个样品 |
| IPMN-PB | 4个样品 |
| PDAC | 2个样品 |
| 总计 | 18个样品 |
1-2．采用MSE法分析参与MUC1基因启动子的表达的被甲基化位点(CpG位点)的甲基化
采用MSE法，分析参与人MUC1基因启动子的表达的被甲基化位点(CpG位点)。图1A显示通过被甲基化来调节人MUC1基因的表达的启动子区的序列和相邻的翻译区的序列(SEQIDNO:5)。图1B显示该序列的亚硫酸氢盐处理后的DNA序列(SEQIDNO:6)，用胸腺嘧啶表示由非甲基化胞嘧啶转换的尿嘧啶。图1中，下述说明的引物1-3和引物1-4之间的区(SEQIDNO:1)具有CpG位点172-181，以包含该CpG位点的区作为靶区。需要说明的是，与论文(NorishigeYamada,YukariNishida,HideakiTsutsumida,TomofumiHamada,MasamichiGoto,MichiyoHigashi,MitsuharuNomotoandSuguruYonezawa(2008)MUC1expressionisregulatedbyDNAmethylationandhistoneH3-K9modificationincancercells.CancerRes.,68(8):2708-16)一样，CpG位点的编号是从人MUC1基因的推定启动子上游(从该基因的转录起始点起上游2,753bp)起依次编号。
使用DNeasy血液&组织试剂盒(QIAGEN公司制)，从胰液样品中提取DNA。
接着，使用EpiTect亚硫酸氢盐试剂盒(QIAGEN公司制)，将所提取的DNA供给亚硫酸氢盐处理。
将亚硫酸氢盐处理后的DNA供给使用了下述引物的PCR。
引物组(小文字的核苷酸序列为GC夹)：
引物1-1：5’-AAAGGGGGAGGTTAGTTGGA-3’(SEQIDNO:14)；
引物1-2：5’-AAACAACCCACTCCCCACCT-3’(SEQIDNO:15)；
引物1-3：
5’-cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacggggggAAGAGGTAGGAGGTAGGGGA-3’(SEQIDNO:16)；
引物1-4：5’-AAAACAAAACAAATTCAAAC-3’(SEQIDNO:17)。
关于各PCR，如图1所示，第一PCR使用上述引物1-1和引物1-2来进行，第二PCR(嵌套式PCR)使用上述引物1-3和引物1-4来进行。聚合酶使用AmpliTaqGold(注册商标)FastPCRMasterMix(AppliedBiosystem公司制)。PCR条件和温度设定见下述表2。
表2
接着，使用下述表3所示的DGGE凝胶条件下的变性剂浓度梯度凝胶，将第二PCR后的反应液供给DGGE。需要说明的是，电泳条件如下，泳动槽温度：60℃、恒压：230V、泳动时间：300分钟。电泳槽使用Dcode系统(BIO-RAD公司制)。
表3
1-3．采用MSE法分析参与MUC2基因启动子的表达的被甲基化位点(CpG位点)的甲基化
利用MSE法，分析参与人MUC2基因启动子的表达的被甲基化位点(CpG位点)。图2A显示通过被甲基化来调节人MUC2基因的表达的启动子区的序列和相邻的翻译区的序列(SEQIDNO:7)。图2B显示该序列的亚硫酸氢盐处理后的DNA序列(SEQIDNO:8)，用胸腺嘧啶表示由非甲基化胞嘧啶转换的尿嘧啶。图2中，下述说明的引物2-3和引物2-4之间的区(SEQIDNO:2)具有CpG位点37-43，以包含该CpG位点的区作为靶区。需要说明的是，与论文(NorishigeYamada,TomofumiHamada,MasamichiGoto,HideakiTsutsumida,MichiyoHigashi,MitsuharuNomotoandSuguruYonezawa(2006)MUC2expressionisregulatedbyhistoneH3modificationandDNAmethylationinpancreaticcancer.Int.J.Cancer,119(8):1850-7)一样，CpG位点的编号是从人MUC2基因的推定启动子上游(从该基因的转录起始点起上游1,989bp)起依次编号。
与上述1-2节一样操作，使用DNeasy血液&组织试剂盒(QIAGEN公司制)从胰液样品中提取DNA后，使用EpiTect亚硫酸氢盐试剂盒(QIAGEN公司制)，将所提取的DNA供给亚硫酸氢盐处理。
将亚硫酸氢盐处理后的DNA供给使用了下述引物的PCR。
引物组(小文字的核苷酸序列为GC夹)：
引物2-1：5’-TTTGGGGTTAGGTTTGGAAG-3’(SEQIDNO:18)；
引物2-2：5’-ACCTTCTTCAAAATAAAACAACC-3’(SEQIDNO:19)；
引物2-3：
5’-cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacggggggTTTTAGAGTTTGGGTTTTAG-3’(SEQIDNO:20)；
引物2-4：5’-TAACCTAAATACCAACACACA-3’(SEQIDNO:21)。
关于各PCR，如图2所示，第一PCR使用上述引物2-1和引物2-2来进行，第二PCR(嵌套式PCR)使用上述引物2-3和引物2-4来进行。聚合酶使用AmpliTaqGold(注册商标)FastPCRMasterMix(AppliedBiosystem公司制)。PCR条件和温度设定见下述表4。
表4
接着，使用下述表5所示的DGGE凝胶条件下的变性剂浓度梯度凝胶，将第二PCR后的反应液供给DGGE。需要说明的是，电泳条件和电泳槽与上述1-2节相同。
表5
1-4．采用MSE法分析参与MUC4基因启动子的表达的被甲基化位点(CpG位点)的甲基化
采用MSE法，分析参与人MUC4基因启动子的表达的被甲基化位点(CpG位点)。图3A显示通过被甲基化来调节人MUC4基因的表达的启动子区的序列和相邻的翻译区的序列(SEQIDNO:9)。图3B显示该序列的亚硫酸氢盐处理后的DNA序列(SEQIDNO:10)，用胸腺嘧啶表示由非甲基化胞嘧啶转换的尿嘧啶。图3中，下述说明的引物4-3和引物4-4之间的区(SEQIDNO:3)具有CpG位点108-118，以包含该CpG位点的区作为靶区。需要说明的是，与论文(NorishigeYamada,YukariNishida,HideakiTsutsumida,MasamichiGoto,MichiyoHigashi,MitsuharuNomotoandSuguruYonezawa(2009)PromoterCpGmethylationincancercellscontributestoregulationofMUC4.Br.J.Cancer,100(2):344-51)一样，CpG位点的编号是从人MUC4基因的推定启动子上游(从该基因的转录起始点起上游3,622bp)起依次编号。
与上述1-2节一样操作，使用DNeasy血液&组织试剂盒(QIAGEN公司制)从胰液样品中提取DNA后，使用EpiTect亚硫酸氢盐试剂盒(QIAGEN公司制)，将所提取的DNA供给亚硫酸氢盐处理。
将亚硫酸氢盐处理后的DNA供给使用了下述引物的PCR。
引物组(小文字的核苷酸序列为GC夹)：
引物4-1：5’-TAGTGGGGTGGGGTTGA-3’(SEQIDNO:22)；
引物4-2：5’-AAACACCCAAAAAACCC-3’(SEQIDNO:23)；
引物4-3：
5’-cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacggggggAGGAGAGAAAAGGGTGATTA-3’(SEQIDNO:24);
引物4-4：5’-ACCCAAAAAACCCTCCTCCA-3’(SEQIDNO:25)。
关于各PCR，如图3所示，第一PCR使用上述引物4-1和引物4-2来进行，第二PCR(嵌套式PCR)使用上述引物4-3和引物4-4来进行。聚合酶使用AmpliTaqGold(注册商标)FastPCRMasterMix(AppliedBiosystem公司制)。PCR条件和温度设定见下述表6。
表6
接着，使用下述表7所示的DGGE凝胶条件下的变性剂浓度梯度凝胶，将第二PCR后的反应液供给DGGE。需要说明的是，电泳条件和电泳槽与上述1-2节相同。
表7
1-5．采用MSE法分析参与MUC5AC基因启动子的表达的被甲基化位点(CpG位点)的甲基化
利用MSE法，分析参与人MUC5AC基因启动子的表达的被甲基化位点(CpG位点)。图4A显示通过被甲基化来调节人MUC5AC基因的表达的启动子区的序列(SEQIDNO:11)。图4B显示该序列的亚硫酸氢盐处理后的DNA序列(SEQIDNO:12)，用胸腺嘧啶表示由非甲基化胞嘧啶转换的尿嘧啶。图4中，下述说明的引物5-3和引物5-4之间的区(SEQIDNO:4)具有CpG位点1-3，将包含该CpG位点的区作为靶区。需要说明的是，与论文(YamadaN,NishidaY,YokoyamaS,TsutsumidaH,HoujouI,KitamotoS,GotoM,HigashiM,YonezawaS.(2010)ExpressionofMUC5AC,anearlymarkerofpancreatobiliarycancer,isregulatedbyDNAmethylationinthedistalpromoterregionincancercells.JHepatobiliaryPancreatSci,17(6):844-854)一样，CpG位点的编号是从人MUC5AC基因的推定启动子上游(从该基因的转录起始点起上游3,718bp)起依次编号。
与上述1-2节一样操作，使用DNeasy血液&组织试剂盒(QIAGEN公司制)从胰液样品中提取DNA后，使用EpiTect亚硫酸氢盐试剂盒(QIAGEN公司制)，将所提取的DNA供给亚硫酸氢盐处理。
将亚硫酸氢盐处理后的DNA供给使用了下述引物的PCR。
引物组(小文字的核苷酸序列为GC夹)：
引物5-1：5’-AAAGTTTTGGGTGTGTGGAG-3’(SEQIDNO:26)；
引物5-2：5’-TAAATCAATATCCAACCCCCAAC-3’(SEQIDNO:27)；
引物5-3：
5’-cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacggggggTTTATGTTTAGGGGTTTTGG-3’(SEQIDNO:28)；
引物5-4：5’-ACCAACTAACCACCCAAACC-3’(SEQIDNO:29)。
关于各PCR，如图4所示，第一PCR使用上述引物5-1和引物5-2来进行，第二PCR(嵌套式PCR)使用上述引物5-3和引物5-4来进行。聚合酶使用AmpliTaqGold(注册商标)FastPCRMasterMix(AppliedBiosystem公司制)。而且，PCR条件和温度设定见下述表8。
表8
接着，使用下述表9所示的DGGE凝胶条件下的变性剂浓度梯度凝胶，将第二PCR后的反应液供给DGGE。需要说明的是，电泳条件如下，泳动槽温度：60℃、恒压：230V、泳动时间：300分钟。电泳槽使用Dcode系统(BIO-RAD公司制)。
表9
1-6．通过免疫组织化学染色分析由MUC基因编码的蛋白的表达
在人的PDAC、IPMN-胃型、IPMN-肠型和IPMN-PB的手术样本组织样品中，通过免疫组织化学染色分析由MUC1、MUC2、MUC4和MUC5AC基因编码的蛋白的表达。
在检索这些蛋白的表达的免疫组织化学染色时，关于MUC1，不只使用作为现有抗MUC1抗体的“MUC1-DF3”(TFB公司制)，还使用抗“MUC1胞质尾区”的新开发的抗MUC1抗体(来自杂交瘤株MUC1-common(克隆014E)(日本特愿2010-097922(日本特开2011-184427号公报)、保藏号NITEBP-867))。关于MUC2，使用抗MUC2抗体“MUC2-Ccp58”(novo公司制)。关于MUC4，使用作为抗N末端侧亚单元的抗体的抗MUC4抗体“MUC4-8G7”(universityofnebraskamedicalcenter,omaha)和作为抗C末端侧亚单元的抗体的抗MUC4抗体“MUC4-1G8”(zymed公司制)两者。关于MUC5AC，使用抗MUC5AC抗体“Muc5AC”(Novo公司制)。
2．结果
2-1．甲基化分析和免疫染色的结果
结果见图5～8。图5显示IPMN-胃型中的甲基化分析和免疫染色的结果。图6(图6-1和图6-2)显示IPMN-肠型中的甲基化分析和免疫染色的结果。图7(图7-1和图7-2)显示IPMN-PB中的甲基化分析和免疫染色的结果。图8显示PDAC中的甲基化分析和免疫染色的结果。图5～8中，(A)的图示板(panel)是MSE法的凝胶的照片，(B)的图示板是显示通过免疫组织化学染色进行的由人MUC基因编码的蛋白的表达的照片。
在图5～8的(A)的图示板中，凝胶中的变性剂浓度梯度，从电泳中的阴极向阳极方向(从图示板的左侧向右侧方向)由从低浓度到高浓度形成梯度。因此，“U”显示非甲基化，“M”显示甲基化，从绿色到黄色、红色的渐变显示从非甲基化(0%)到甲基化(100%)的程度。
另一方面，在图5～8的(B)的图示板中，“HE”是苏木素-伊红染色的结果。
2-2．基于MSE法的凝胶照片中的谱带的发光强度的统计分析结果
通过ImageJ将图5～8所示的MSE法的DGGE后的凝胶的照片中的谱带的发光强度数值化，利用统计分析软件“R”进行统计处理。
结果见图9～12。图9是关于MUC1基因的统计分析结果。图10是关于MUC2基因的统计分析结果。图11是关于MUC4基因的统计分析结果。图12是关于MUC5AC基因的统计分析结果。另外，在图9～12中，纵轴显示甲基化DNA含量(methylatedDNAcontentratio(甲基化%))。
由图9～12判断显示：关于IPMN-胃型和IPMN-肠型中的MUC1、MUC2、MUC4和MUC5AC基因的甲基化状况，当为IPMN-胃型时，所有的4种粘蛋白基因均为甲基化，当为IPMN-肠型时，所有的4种粘蛋白基因均为非甲基化，在统计处理中也显示出显著差异。
而且，相对于IPMN-PB型，IPMN-胃型在MUC1基因和MUC5AC基因中在甲基化状况的差异上具有倾向。
2-3．基于4种粘蛋白基因的甲基化分析结果的病型预测的结果
基于上述4种粘蛋白基因的甲基化分析结果的病型预测的结果见图13。在图13的左侧的图示板中，“PX”(X为1～18)为各样品。
在图13中，在各种基因的甲基化倾向和非甲基化倾向的判定中，设定MUC1：50%、MUC2：70%、MUC4：50%和MUC5AC：60%作为截断值。
如图13所示，在使用4种粘蛋白基因的病型预测中，在下述(1)～(4)的条件下进行病型预测时，全部具有高的灵敏度和特异度。
(1)在胃型中，4基因全部有甲基化倾向；
(2)在肠型中，4基因全部有非甲基化倾向；
(3)在PDAC(胰腺肿瘤)中，MUC1、MUC2和MUC4基因有非甲基化倾向，而MUC5AC基因有甲基化倾向；
(4)胰胆型为上述以外的情形。
因此，认为利用该MSE法进行的胰液中所含的上述4种基因的甲基化状况的分析给病型预测带来了有用的信息。
需要说明的是，在本实施例中，比较甲基化DNA含量，例如象IPMN-胃型中的MUC1基因那样，即使显示出非甲基化的谱带，但作为整体显示出高的甲基化DNA的含量，判别有甲基化倾向。
另外，胰腺肿瘤的恶性度的图像是：Gastric(胃型)<Intestinal(肠型)<PB(胰胆管上皮型)<PDAC(胰腺癌)。
〔实施例2〕通过4种粘蛋白基因的甲基化分析进行的胰腺肿瘤的病型预测2
与实施例1一样，在本实施例中，在人的胰腺癌(PDAC)、胃型胰管内乳头状粘液性肿瘤(胃型IPMN)、肠型胰管内乳头状粘液性肿瘤(肠型IPMN)和胰胆管上皮型胰管内乳头状粘液性肿瘤(P.B.-型IPMN)的胰液样品中，进行4种粘蛋白基因(MUC1、MUC2、MUC4和MUC5AC基因)的甲基化分析，根据该甲基化分析结果进行病型预测。甲基化分析和病型预测的方法依照实施例1记载的方法。
分析中使用的样品组见下述表10。
表10
| 胃型IPMN | 7个样品 |
| 肠型IPMN | 8个样品 |
| P.B.-型IPMN | 5个样品 |
| PDAC | 2个样品 |
| 其他 | 3个样品 |
| 总计 | 25个样品 |
其他样品是指胃型、肠型、P.B.-型、胰腺癌(PDAC)以外的病例样品。
基于上述4种粘蛋白基因的甲基化分析的结果的病型预测结果见图14。在图14的左侧的图示板中，各编号为样品编号。
如图14所示，在使用4种粘蛋白基因的病型预测中，在下述(1)～(4)的条件下进行病型预测时，全部具有高的灵敏度和特异度。
(1)在胃型中，4基因全部有甲基化倾向；
(2)在肠型中，4基因全部有非甲基化倾向；
(3)在PDAC(胰腺肿瘤)中，MUC1、MUC2和MUC4基因有非甲基化倾向，而MUC5AC基因有甲基化倾向；
(4)胰胆型为上述以外的情形。
产业实用性
根据本发明，在以低侵袭性得到的来自受检者的胰液样品中，可以早期诊断胰腺肿瘤的病型。
将本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请作为参考直接纳入本说明书中。
Claims (7)
1.用于判定胰腺肿瘤的病型的检测试剂盒，其特征在于：为了实施用于判定胰腺肿瘤的病型的检测方法而使用该检测试剂盒，
其中，上述试剂盒包含：为了实施用于判定胰腺肿瘤的病型的甲基化度的检测方法即MSE法的试剂；以及用于判定胰腺肿瘤的病型的说明书，
上述检测方法包括下述步骤：
步骤1，在来自受检者的胰液样品中，检测编码包含MUC1基因、MUC2基因、MUC4基因和MUC5AC基因的基因组中的粘蛋白核心蛋白的基因的5’侧非翻译区或包含5’侧非翻译区和翻译区的区的甲基化度；以及
步骤2，以上述的甲基化度为指标，将胰腺肿瘤分类为选自胰腺癌、胃型胰管内乳头状粘液性肿瘤、肠型胰管内乳头状粘液性肿瘤和胰胆管上皮型胰管内乳头状粘液性肿瘤的胰腺肿瘤的病型，
上述说明书对下述内容进行说明：
(a)当MUC1基因、MUC2基因、MUC4基因和MUC5AC基因的5’侧非翻译区或包含5’侧非翻译区和翻译区的区为甲基化时，将胰腺肿瘤分类为胃型胰管内乳头状粘液性肿瘤；
(b)当MUC1基因、MUC2基因、MUC4基因和MUC5AC基因的5’侧非翻译区或包含5’侧非翻译区和翻译区的区为非甲基化时，将胰腺肿瘤分类为肠型胰管内乳头状粘液性肿瘤；
(c)当MUC1基因、MUC2基因和MUC4基因的5’侧非翻译区或包含5’侧非翻译区和翻译区的区为非甲基化、而MUC5AC基因的5’侧非翻译区或包含5’侧非翻译区和翻译区的区为甲基化时，将胰腺肿瘤分类为胰腺癌；或者
(d)在(a)～(c)以外的情况下，将胰腺肿瘤分类为胰胆管上皮型胰管内乳头状粘液性肿瘤，
上述试剂为：亚硫酸氢盐处理用的亚硫酸氢盐；第一PCR用的、编码粘蛋白核心蛋白的基因的5’侧非翻译区或包含5’侧非翻译区和翻译区的区的外侧区域所对应的第1引物组；第二PCR用的、编码粘蛋白核心蛋白的基因的5’侧非翻译区或包含5’侧非翻译区和翻译区的区所对应的第2引物组；用于第一PCR和第二PCR的反应液组成成分；变性剂浓度梯度凝胶电泳用的凝胶成分、变性剂、缓冲液，
上述步骤1中实施的MSE法包括下述步骤：
将来自胰液样品的DNA供给亚硫酸氢盐处理的步骤；
使用编码粘蛋白核心蛋白的基因的5’侧非翻译区或包含5’侧非翻译区和翻译区的区的外侧区域所对应的第1引物组，将亚硫酸氢盐处理后的DNA供给第一PCR的步骤；
使用编码粘蛋白核心蛋白的基因的5’侧非翻译区或包含5’侧非翻译区和翻译区的区所对应的第2引物组，将第一PCR后的扩增DNA供给第二PCR的步骤；以及
将第二PCR后的扩增DNA供给变性剂浓度梯度凝胶电泳的步骤，
其中，第2引物组的引物的退火位置相对于编码粘蛋白核心蛋白的基因的5’侧非翻译区或包含5’侧非翻译区和翻译区的区存在于第1引物组的引物的退火位置的内侧。
2.权利要求1所述的试剂盒，其中，MUC1基因、MUC2基因、MUC4基因和MUC5AC基因的5’侧非翻译区或包含5’侧非翻译区和翻译区的区分别为存在于SEQIDNO:1～4所示的核苷酸序列中的1个以上的CpG位点。
3.权利要求1所述的试剂盒，其中，MUC1基因、MUC2基因、MUC4基因和MUC5AC基因的5’侧非翻译区或包含5’侧非翻译区和翻译区的区分别包含SEQIDNO:1～4所示的核苷酸序列。
4.权利要求1所述的试剂盒，其中，第2引物组的一个引物在5’侧具有GC-夹序列。
5.权利要求1所述的试剂盒，其中，变性剂浓度梯度凝胶只具有变性剂浓度梯度作为浓度梯度。
6.权利要求1～5中任一项所述的试剂盒，该试剂盒包含：分别由SEQIDNO:14～29所示的核苷酸序列组成的引物的组。
7.权利要求6所述的试剂盒，其中，
作为第1引物组，关于MUC1基因，由SEQIDNO:14记载的核苷酸序列组成的引物和由SEQIDNO:15记载的核苷酸序列组成的引物的组；关于MUC2基因，由SEQIDNO:18记载的核苷酸序列组成的引物和由SEQIDNO:19记载的核苷酸序列组成的引物的组；关于MUC4基因，由SEQIDNO:22记载的核苷酸序列组成的引物和由SEQIDNO:23记载的核苷酸序列组成的引物的组；关于MUC5AC基因，由SEQIDNO:26记载的核苷酸序列组成的引物和由SEQIDNO:27记载的核苷酸序列组成的引物的组，
作为第2引物组，关于MUC1基因，由SEQIDNO:16记载的核苷酸序列组成的引物和由SEQIDNO:17记载的核苷酸序列组成的引物的组；关于MUC2基因，由SEQIDNO:20记载的核苷酸序列组成的引物和由SEQIDNO:21记载的核苷酸序列组成的引物的组；关于MUC4基因，由SEQIDNO:24记载的核苷酸序列组成的引物和由SEQIDNO:25记载的核苷酸序列组成的引物的组；关于MUC5AC基因，由SEQIDNO:28记载的核苷酸序列组成的引物和由SEQIDNO:29记载的核苷酸序列组成的引物的组。
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