JP5866739B2 - 膵腫瘍の病型診断方法 - Google Patents
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/154—Methylation markers
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Description
しかしながら、膵癌は、PET−CT等の最新の機器を用いても、未だに早期発見どころか、治癒を望める段階での診断が不可能であることが多く、難治性癌の代表となっている。また、腫瘍の存在が画像診断で判明しても、その生検等による病理学的な質的診断が難しく、「高度な悪性腫瘍であり即侵襲性の高い手術が必要」か、「良性であり経過観察」かの判断に難渋するのも、膵胆管系の腫瘍の特徴である。従って、膵癌の早期診断及び病型診断方法が切望されている。
一方、DNAのメチル化を検出及び分析し、癌の診断を行う方法が一般的に知られている。
例えば、特許文献1は、H19遺伝子、IGF2遺伝子等のターゲット遺伝子のメチル化状態の変化又はその多型性に関して、生物学的試料を分析する工程を含む、被験体が新生物性又は細胞増殖障害を発症する素因を決定する方法を開示する。
特許文献2は、対象からの試料におけるメチル化SPARC核酸分子又はその変異体の検出を含む、癌を診断するための方法を開示する。
特許文献3は、対象由来の核酸含有標本を、少なくとも1つの遺伝子又は該遺伝子の関連調節領域のメチル化状態の判定を与える作用因子と接触させる工程、遺伝子又は調節領域の諸領域の異常メチル化を同定し、それによって対象における膵癌を検出する工程を含む、対象における膵癌を検出する方法を開示する。
特許文献4〜11は、哺乳動物由来の検体に含まれる標的遺伝子のメチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値を測定する工程と、測定されたメチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値と、対照とを比較することにより得られる差異に基づき検体の癌化度を判定する工程とを含む、哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法を開示する。特許文献4〜11において、標的遺伝子としては、disintegrin and metalloproteinase domain 23遺伝子、HAND1遺伝子、Solutecarrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2遺伝子、G−protein coupled somatostatin and angiotensin−like peptide receptor遺伝子、G protein−coupled receptor 7遺伝子、Neurofilament3遺伝子、Fibrillin2遺伝子及びp53−responsive gene 2遺伝子が挙げられている。
しかしながら、特定の遺伝子又はその調節領域のメチル化度を検出することで、膵腫瘍の病型を診断できることは、従来において知られていなかった。
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、被験者由来の膵液サンプルにおいてムチンコアタンパク質をコードする遺伝子の5’側非翻訳領域又は5’側非翻訳領域と翻訳領域とを含む領域のメチル化度を検出することにより、膵腫瘍の病型を診断できることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、以下を包含する。
(1)被験者由来の膵液サンプルにおいて、ムチンコアタンパク質をコードする遺伝子の5’側非翻訳領域又は5’側非翻訳領域と翻訳領域とを含む領域のメチル化度を検出する第1工程と、前記メチル化度を指標として、膵腫瘍を膵癌、膵管内乳頭粘液性腫瘍・胃型、膵管内乳頭粘液性腫瘍・腸型及び膵管内乳頭粘液性腫瘍・膵胆管上皮型から成る群より選択される膵腫瘍の病型に分類する第2工程とを含む、膵腫瘍の病型を判定するための検査方法。
(2)ムチンコアタンパク質をコードする遺伝子がMUC1遺伝子、MUC2遺伝子、MUC4遺伝子及びMUC5AC遺伝子から成る群より選択される、(1)記載の方法。
(3)ムチンコアタンパク質をコードする遺伝子がMUC1遺伝子、MUC2遺伝子、MUC4遺伝子及びMUC5AC遺伝子を含む遺伝子セットである、(2)記載の方法。
(4)MUC1遺伝子、MUC2遺伝子、MUC4遺伝子及びMUC5AC遺伝子の5’側非翻訳領域又は5’側非翻訳領域と翻訳領域とを含む領域がそれぞれ配列番号1〜4に示される塩基配列中に存在する1以上のCpG部位である、(2)又は(3)記載の方法。
(5)MUC1遺伝子、MUC2遺伝子、MUC4遺伝子及びMUC5AC遺伝子の5’側非翻訳領域又は5’側非翻訳領域と翻訳領域とを含む領域がそれぞれ配列番号1〜4に示される塩基配列を含む、(2)〜(4)のいずれか1記載の方法。
(6)第2工程において、膵腫瘍を、
(a)MUC1遺伝子、MUC2遺伝子、MUC4遺伝子及びMUC5AC遺伝子の5’側非翻訳領域又は5’側非翻訳領域と翻訳領域とを含む領域の全てがメチル化である場合に、膵管内乳頭粘液性腫瘍・胃型に分類し、
(b)MUC1遺伝子、MUC2遺伝子、MUC4遺伝子及びMUC5AC遺伝子の5’側非翻訳領域又は5’側非翻訳領域と翻訳領域とを含む領域の全てが非メチル化である場合に、膵管内乳頭粘液性腫瘍・腸型に分類し、
(c)MUC1遺伝子、MUC2遺伝子及びMUC4遺伝子の5’側非翻訳領域又は5’側非翻訳領域と翻訳領域とを含む領域が非メチル化であり、MUC5AC遺伝子の5’側非翻訳領域又は5’側非翻訳領域と翻訳領域とを含む領域がメチル化である場合に、膵癌に分類し、又は、
(d)(a)〜(c)以外の場合に、膵管内乳頭粘液性腫瘍・膵胆管上皮型に分類する、(3)〜(5)のいずれか1記載の方法。
(7)第1工程が、膵液サンプル由来のDNAを重亜硫酸塩処理に供する工程と、ムチンコアタンパク質をコードする遺伝子の5’側非翻訳領域又は5’側非翻訳領域と翻訳領域とを含む領域の外側の領域に対応する第1プライマーセットを用いて重亜硫酸塩処理後のDNAを第1のPCRに供する工程と、ムチンコアタンパク質をコードする遺伝子の5’側非翻訳領域又は5’側非翻訳領域と翻訳領域とを含む領域に対応する第2プライマーセットを用いて第1のPCR後の増幅DNAを第2のPCRに供する工程と、第2のPCR後の増幅DNAを変性剤濃度勾配ゲル電気泳動に供する工程とを含み、第2プライマーセットのプライマーのアニーリング位置は、ムチンコアタンパク質をコードする遺伝子の5’側非翻訳領域又は5’側非翻訳領域と翻訳領域とを含む領域に対して第1プライマーセットのプライマーのアニーリング位置の内側に存在する、(1)〜(6)のいずれか1記載の方法。
(8)第2プライマーセットの一方のプライマーは、5’側にGC−clamp配列を有する、(7)記載の方法。
(9)変性剤濃度勾配ゲルが濃度勾配として変性剤濃度勾配のみを有する、(7)又は(8)記載の方法。
(10)(1)〜(9)のいずれか1記載の方法を実施するために用いることを特徴とする、膵腫瘍の病型を判定するための検査キット。
(11)ムチンコアタンパク質をコードする遺伝子の5’側非翻訳領域又は5’側非翻訳領域と翻訳領域とを含む領域の外側の領域に対応する第1プライマーセットと、ムチンコアタンパク質をコードする遺伝子の5’側非翻訳領域又は5’側非翻訳領域と翻訳領域とを含む領域に対応する第2プライマーセットとを含み、第2プライマーセットのプライマーのアニーリング位置が、ムチンコアタンパク質をコードする遺伝子の5’側非翻訳領域又は5’側非翻訳領域と翻訳領域とを含む領域に対して第1プライマーセットのプライマーのアニーリング位置の内側に存在する、(10)記載のキット。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2011−144847号の明細書及び/又は図面に記載される内容を包含する。
図1Bは、被メチル化によってヒトMUC1遺伝子の発現を調節するプロモーター領域の配列及び隣接する翻訳領域の配列(配列番号6;ただし、Bisulfite処理後のDNA配列であり、且つ非メチル化シトシンから変換されたウラシルをチミンで表示する)を示す。
図2Aは、被メチル化によってヒトムチンコアタンパク質2(MUC2)遺伝子の発現を調節するプロモーター領域の配列及び隣接する翻訳領域の配列(配列番号7)を示す。
図2Bは、被メチル化によってヒトMUC2遺伝子の発現を調節するプロモーター領域の配列及び隣接する翻訳領域の配列(配列番号8;ただし、Bisulfite処理後のDNA配列であり、且つ非メチル化シトシンから変換されたウラシルをチミンで表示する)を示す。
図3Aは、被メチル化によってヒトムチンコアタンパク質4(MUC4)遺伝子の発現を調節するプロモーター領域の配列及び隣接する翻訳領域の配列(配列番号9)を示す。
図3Bは、被メチル化によってヒトMUC4遺伝子の発現を調節するプロモーター領域の配列及び隣接する翻訳領域の配列(配列番号10;ただし、Bisulfite処理後のDNA配列であり、且つ非メチル化シトシンから変換されたウラシルをチミンで表示する)を示す。
図4Aは、被メチル化によってヒトムチンコアタンパク質5AC(MUC5AC)遺伝子の発現を調節するプロモーター領域の配列(配列番号11)を示す。
図4Bは、被メチル化によってヒトMUC5AC遺伝子の発現を調節するプロモーター領域の配列(配列番号12;ただし、Bisulfite処理後のDNA配列であり、且つ非メチル化シトシンから変換されたウラシルをチミンで表示する)を示す。
図5は、IPMN−gastricにおけるメチル化解析と免疫染色の結果を示す。
図6−1は、IPMN−intestinalにおけるメチル化解析と免疫染色の結果を示す。
図6−2は、IPMN−intestinalにおけるメチル化解析と免疫染色の結果を示す。
図7−1は、IPMN−PBにおけるメチル化解析と免疫染色の結果を示す。
図7−2は、IPMN−PBにおけるメチル化解析と免疫染色の結果を示す。
図8は、PDACにおけるメチル化解析と免疫染色の結果を示す。
図9は、MUC1遺伝子のメチル化解析に基づく統計解析の結果を示す。
図10は、MUC2遺伝子のメチル化解析に基づく統計解析の結果を示す。
図11は、MUC4遺伝子のメチル化解析に基づく統計解析の結果を示す。
図12は、MUC5AC遺伝子のメチル化解析に基づく統計解析の結果を示す。
図13は、4種のムチン遺伝子のメチル化解析の結果に基づく病型予測を示す。
図14は、4種のムチン遺伝子のメチル化解析の結果に基づく病型予測を示す。
本発明に係る膵腫瘍の病型を判定するための検査方法(以下、「本方法」と称する)は、膵腫瘍患者等の被験者由来の膵液サンプルにおいて、ムチンコアタンパク質をコードする遺伝子の5’側非翻訳領域又は5’側非翻訳領域と翻訳領域とを含む領域のメチル化度を検出する第1工程と、当該メチル化度を指標として、膵腫瘍を膵癌、膵管内乳頭粘液性腫瘍・胃型、膵管内乳頭粘液性腫瘍・腸型及び膵管内乳頭粘液性腫瘍・膵胆管上皮型から成る群より選択される膵腫瘍の病型に分類する第2工程とを含む。換言すれば、本方法は、膵腫瘍の病型の診断方法、膵腫瘍の病型を判定するための評価方法、又は膵腫瘍の病型を判定するための情報を収集する方法とすることができる。本方法によれば、低侵襲性で得られる膵液サンプルにおいて、膵腫瘍の病型を早期に診断することができる。
ここで、ムチンコアタンパク質をコードする遺伝子(又はムチン遺伝子とも称される)としては、例えばムチンコアタンパク質(MUC)1遺伝子、MUC2遺伝子、MUC4遺伝子及びMUC5AC遺伝子が挙げられる。特に、本方法における膵腫瘍の分類工程(第2工程)において、膵腫瘍を膵癌、膵管内乳頭粘液性腫瘍・胃型、膵管内乳頭粘液性腫瘍・腸型及び膵管内乳頭粘液性腫瘍・膵胆管上皮型から成る群より選択される病型に高度に分類すべく、MUC1遺伝子、MUC2遺伝子、MUC4遺伝子及びMUC5AC遺伝子を含む遺伝子セットを、ムチンコアタンパク質をコードする遺伝子とすることが好ましい。
また、メチル化度検出の標的配列(標的領域)であるムチンコアタンパク質をコードする遺伝子の5’側非翻訳領域は、ムチンコアタンパク質をコードする遺伝子の5’側上流に位置する非翻訳領域(UTR)であり、特にムチンコアタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域を含む領域である。さらに、ムチンコアタンパク質をコードする遺伝子の5’側非翻訳領域と翻訳領域とを含む領域は、プロモーター領域等の5’非翻訳領域と当該5’非翻訳領域に隣接する翻訳領域(コーディング領域)とを含む領域である。
本方法においては、ムチンコアタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域又は当該プロモーター領域と翻訳領域とを含む領域に存在する1以上(1又は複数)のCpG部位を、メチル化度を検出すべき標的配列とすることができる。ここで、CpG部位とは、5’−シトシン−グアニン−3’(5’−CG−3’)のジヌクレオチドを意味する。2以上のCpG部位を標的配列とする場合には、各CpG部位を個別に、又は2以上のCpG部位を含む領域を標的配列としてもよい。
図1〜4は、それぞれ被メチル化によってヒトMUC1、MUC2、MUC4及びMUC5AC遺伝子の発現を調節するプロモーター領域の配列及び隣接する翻訳領域の配列を示す。図1〜4において、(TIS)は転写開始部位(transcription initiation site)を示し、四角で囲こまれたCGは被メチル部位(CpG部位)を示し、太い四角で囲まれたCGは、ヒトMUC遺伝子の発現に関与する被メチル化部位(CpG部位)を示す。また、図1B、図2B、図3B及び図4Bにおいて、イタリックのTは、Bisulfite処理により非メチル化シトシンから変換されたウラシルをチミンで表示したものである。なお、転写開始部位(TIS)以降の塩基配列は、翻訳領域(コーディング領域)である。
図1Aは、被メチル化によってヒトMUC1遺伝子の発現を調節するプロモーター領域の配列及び隣接する翻訳領域の配列(配列番号5)を示す。図1Bは、当該配列のBisulfite処理後のDNA配列(配列番号6)を示し、非メチル化シトシンから変換されたウラシルをチミンで表示する。図1において、下記で説明する第2プライマーセットに相当するPrimer 1−3とPrimer 1−4との間の領域(配列番号1)は、CpG部位(又はCpGアイランド)172−181を有する(Norishige Yamada,Yukari Nishida,Hideaki Tsutsumida,Tomofumi Hamada,Masamichi Goto,Michiyo Higashi,Mitsuharu Nomoto and Suguru Yonezawa(2008)MUC1 expression is regulated by DNA methylation and histone H3−K9 modification in cancer cells.Cancer Res.,68(8):2708−16と同様に、CpG部位の番号は、ヒトMUC1遺伝子の推定プロモーター上流(当該遺伝子の転写開始点より上流2,753bp)より順にナンバリングされている)。
図2Aは、被メチル化によってヒトMUC2遺伝子の発現を調節するプロモーター領域の配列及び隣接する翻訳領域の配列(配列番号7)を示す。図2Bは、当該配列のBisulfite処理後のDNA配列(配列番号8)を示し、非メチル化シトシンから変換されたウラシルをチミンで表示する。図2において、下記で説明する第2プライマーセットに相当するPrimer 2−3とPrimer 2−4との間の領域(配列番号2)は、CpG部位37−43を有する(Norishige Yamada,Tomofumi Hamada,Masamichi Goto,Hideaki Tsutsumida,Michiyo Higashi,Mitsuharu Nomoto and Suguru Yonezawa(2006)MUC2 expression is regulated by histone H3 modification and DNA methylation in pancreatic cancer.Int.J.Cancer,119(8):1850−7と同様に、CpG部位の番号は、ヒトMUC2遺伝子の推定プロモーター上流(当該遺伝子の転写開始点より上流1,989bp)より順にナンバリングされている)。
図3Aは、被メチル化によってヒトMUC4遺伝子の発現を調節するプロモーター領域の配列及び隣接する翻訳領域の配列(配列番号9)を示す。図3Bは、当該配列のBisulfite処理後のDNA配列(配列番号10)を示し、非メチル化シトシンから変換されたウラシルをチミンで表示する。図3において、下記で説明する第2プライマーセットに相当するPrimer 4−3とPrimer 4−4との間の領域(配列番号3)は、CpG部位108−118を有する(Norishige Yamada,Yukari Nishida,Hideaki Tsutsumida,Masamichi Goto,Michiyo Higashi,Mitsuharu Nomoto and Suguru Yonezawa(2009)Promoter CpG methylation in cancer cells contributes to regulation of MUC4.Br.J.Cancer,100(2):344−51と同様に、CpG部位の番号は、ヒトMUC4遺伝子の推定プロモーター上流(当該遺伝子の転写開始点より上流3,622bp)より順にナンバリングされている)。
図4Aは、被メチル化によってヒトMUC5AC遺伝子の発現を調節するプロモーター領域の配列(配列番号11)を示す。図4Bは、当該配列のBisulfite処理後のDNA配列(配列番号12)を示し、非メチル化シトシンから変換されたウラシルをチミンで表示する。図4において、下記で説明する第2プライマーセットに相当するPrimer 5−3とPrimer 5−4との間の領域(配列番号4)は、CpG部位1−3を有する(Yamada N,Nishida Y,Yokoyama S,Tsutsumida H,Houjou I,Kitamoto S,Goto M,Higashi M,Yonezawa S.Expression of MUC5AC,an early marker of pancreatobiliary cancer,is regulated by DNA methylation in the distal promoter region in cancer cells.J Hepatobiliary Pancreat Sci,17(6):844−854,2010と同様に、CpG部位の番号は、ヒトMUC5AC遺伝子の推定プロモーター上流(当該遺伝子の転写開始点より上流3,718bp)より順にナンバリングされている)。
本方法では、ヒトMUC1、MUC2、MUC4及びMUC5AC遺伝子の5’側非翻訳領域又は5’側非翻訳領域と翻訳領域として、上述のそれぞれ第2プライマーセットのプライマー間の配列(すなわち、配列番号1〜4に示される塩基配列)に存在する1以上(1又は複数)のCpG部位(特に、ヒトMUC遺伝子の発現に関与する被メチル化部位)を、メチル化度を検出すべき標的配列とすることができ、特に、ヒトMUC遺伝子の発現に関与する被メチル化部位(CpG部位)を全て含む、配列番号1〜4に示される塩基配列又は当該塩基配列を含む領域を、メチル化度を検出すべき標的配列とすることが好ましい。
以下、本方法の各工程について説明する。
(1)被験者由来の膵液サンプルにおいて、ムチンコアタンパク質をコードする遺伝子の5’側非翻訳領域又は5’側非翻訳領域と翻訳領域とを含む領域のメチル化度を検出する第1工程
本方法では、先ず膵腫瘍患者等の被験者由来の膵液サンプルを準備する。膵液サンプルは、例えば画像診断のための内視鏡的逆行性膵管造影、並びに膵管鏡検査によって採取することができる。
次いで、得られた膵液サンプルにおいて、ムチンコアタンパク質をコードする遺伝子の5’側非翻訳領域又は5’側非翻訳領域と翻訳領域とを含む領域のメチル化度を検出する。メチル化度の検出(又は測定)は、従来において知られるメチル化を検出する方法であってよく、例えば特定領域におけるメチル化DNAの検出では、重亜硫酸塩(Bisulfite)処理による塩基置換反応を行い、DNAの配列を決定する。当該塩基置換反応では、非メチル化シトシンが重亜硫酸ナトリウムと反応して、ウラシルへと変換される。メチル化シトシンは重亜硫酸ナトリウムと反応しないので、原理上全てのシトシンのメチル化状態を塩基の違いとして検出できる。従来におけるメチル化の検出方法としては、例えばPCRを使用したメチル化特異的PCR(MSP)法、定量的PCRを使用したReal−time MSP法、TAクローニングを使用したBisulfite−sequencing法、質量分析を使用したMassARRAY法、次世代sequencerを使用したパイロシークエンス法等が挙げられる。さらに、重亜硫酸塩反応を必要としないICON−prove法も開発されている。
また、Bisulfite−DGGE法は、AbramsとStanton(Abrams,E.S.及びStanton,V.P.Jr.,Use of denaturing gradient gel electrophoresis to study conformational transitions in nucleic acids.「Methods Enzymol.」,1992年,第212巻,pp.71−104)によって提案された変性剤濃度勾配ゲル電気泳動(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis:DGGE)法を基本とし、P.Guldberg等(Guldberg,P.,Gronbak,K.,Aggerholm,A.,Platz,A.,thor Straten,P.,Ahrenkiel,V.,Hokland,P.,及びZeuthen,J.,Detection of mutations in GC−rich DNA by bisulphite denaturing gradient gel electrophoresis.「Nucleic Acids Res.」,1998年,第26巻,第6号,pp.1548−1549)によって開発された方法である。当該方法では、重亜硫酸塩処理後のサンプルをPCRによって増幅した後、そのアプリコンを、ポリアクリルアミドと変性剤の濃度勾配から成るゲルを使用した電気泳動に供する。ポリアクリルアミドの濃度勾配に基づき二本鎖DNAの分子量の違いによる分離を行い、さらに変性剤の濃度勾配に基づき二本鎖DNAの変性度の差異による分離を行い、目的領域中のウラシル(非メチル化シトシン)とシトシン(メチル化シトシン)の違いによる分離が行われる。当該方法は、MSP法と同様に視覚的評価を行うことができ、さらに、電気泳動後のゲル中のバンドをシークエンス反応に転用することができる。また、Bisulfite−sequencing法と比較すると、Bisulfite−DGGE法によれば大幅な時間短縮を行うことができる。
しかしながら、本方法では、メチル化度の検出方法として、微量のDNAサンプルであってもDNAメチル化を検出でき、またDNAメチル化パターン又は連続性を検出できるMSE(Methylation Specific Electrophoresis)法が特に好ましい(国際出願第PCT/JP2011/060339号(国際公開第2011/132798号))。
MSE法は、(a)DNAを重亜硫酸塩処理に供する工程、(b)標的領域の外側の領域に対応する第1プライマーセットを用いて重亜硫酸塩処理後のDNAを第1のPCRに供する工程、(c)標的領域に対応する第2プライマーセットを用いて第1のPCR後の増幅DNAを第2のPCRに供する工程、(d)第2のPCR後の増幅DNAを変性剤濃度勾配ゲル電気泳動に供する工程を含む方法である。
以下に、本方法におけるMSE法の各工程について説明する。
(a)DNAを重亜硫酸塩処理に供する工程
先ず膵液サンプルからDNAを抽出し、当該DNAを重亜硫酸塩処理に供する。当該処理により、非メチル化シトシンが重亜硫酸塩によりスルホン化され、さらに加水分解により脱アミノ化され、さらに、アルカリ存在下での脱スルホン化により、ウラシルに変換される。これに対して、メチル化されたシトシンは、重亜硫酸塩処理してもウラシルに変換されない。このため、CpG含有DNAの塩基配列中のシトシンがメチル化されているか否かを、重亜硫酸塩処理により、ウラシルに変換されているかどうかで区別する。なお、市販の重亜硫酸塩処理用のキット(例えば、EpiTect Bisulfite Kits(QIAGEN社製))を使用して、当該キットのマニュアルに準じて、DNAを重亜硫酸塩処理に供することができる。
(b)重亜硫酸塩処理後のDNAを第1のPCRに供する工程
次いで標的領域(すなわち、ムチンコアタンパク質をコードする遺伝子の5’側非翻訳領域又は5’側非翻訳領域と翻訳領域とを含む領域)の外側の領域に対応する第1プライマーセットを用いて重亜硫酸塩処理後のDNAを第1のPCRに供する。重亜硫酸塩処理後にPCRによる増幅により、非メチル化シトシンがチミンに変換され、もとからDNA配列に存在するチミンと混在するため類似した配列が増加することとなる。当該増加に伴い、PCRにおいてミスアニーリングが生じやすく、PCRのサイクル数を上げると、非特異的アンプリコンが増幅されてしまうこととなる。そこでMSE法では、このようなノイズの発生を防止すべく、標的領域の外側に対応する第1プライマーセットを用いて第1のPCRを行い、次いで、第2のPCR(Nested PCR)を行うことで、当該ノイズを低下させる。当該ノイズの低下により、PCRサイクル数の増加が可能となり、検出限界を向上させることができる(すなわち、微量のDNAサンプルを使用することができる)。
第1プライマーセットの一対のプライマーは、標的領域の外側の領域に対応し、当該外側の領域にアニーリングするように設計される。当該外側の領域は、標的領域の両末端の各々から外側方向に例えば10〜100塩基(好ましくは20〜80塩基)離れた位置とすることができる。また、第1プライマーセットのプライマーの長さとしては、例えば15〜30塩基、好ましくは18〜22塩基が挙げられる。
PCRは、例えば増幅産物の長さやGC含量等を考慮し、PCR反応液組成(例えばPCRバッファー、ポリメラーゼ、dNTPミックス、プライマー等を含む)、熱変性、アニーリング、伸長反応等における温度設定並びにサイクル数を適宜決定し、行うことができる。このようなPCR条件は、例えば使用するポリメラーゼに最適な条件下で行う等適宜決定することができる。なお、当該PCRによれば、非メチル化シトシンから変換されたウラシルは、チミンへと変換される。
(c)第1のPCR後の増幅DNAを第2のPCRに供する工程
第1のPCR後、標的領域に対応する第2プライマーセットを用いて第1のPCR後の増幅DNA(増幅産物)を第2のPCRに供する。当該第2のPCRは、nested PCRと呼ばれるものである。すなわち、第1のPCR後の増幅産物の内側に第2のプライマーセットのプライマーを設計し、第1のPCR後の増幅産物を新たな鋳型として第2のPCRを行う。
第2プライマーセットのプライマーは、アニーニング位置が、標的領域を基準として第1プライマーセットのプライマーのアニーニング位置の内側に存在するように設計する。すなわち、第2プライマーセットのプライマーのアニーニング位置は、標的領域の両末端又はその隣接領域とする。なお、第2プライマーセットのプライマーと第1プライマーセットのプライマーとは、第2プライマーセットのプライマーのアニーリング位置が第1プライマーセットのプライマーのアニーニング位置の内側にある限り、一部重複していてもよい。第2プライマーセットのプライマーの長さとしては、例えば15〜30塩基、好ましくは18〜22塩基が挙げられる。なお、第2のプライマーの一方のプライマー(例えば、フォワード(センス)プライマー)の5’側にGC−clamp配列を付加することで、後続の変性剤濃度勾配ゲル電気泳動工程において、分離能を向上させることができる。ここで、GC−clamp配列とは、30〜50塩基程度のG−Cが豊富で安定な配列を意味し、例えば配列番号13に記載の塩基配列が挙げられる。
また、第1のPCRと同様に、PCRは、標的領域の長さやGC含量等を考慮し、PCR反応液組成(例えばPCRバッファー、ポリメラーゼ、dNTPミックス、プライマー等を含む)、熱変性、アニーリング、伸長反応等における温度設定並びにサイクル数を適宜決定し、行うことができる。
(d)第2のPCR後の増幅DNAを変性剤濃度勾配ゲル電気泳動に供する工程
第2のPCR後、増幅DNAを変性剤濃度勾配ゲル電気泳動に供することで、増幅DNAを分離し、視覚的にメチル化パターンや連続性を評価することができる。
変性剤濃度勾配ゲルは、例えばゲル成分(アクリルアミド)、尿素とホルムアミドとの組合せ等の変性剤、TAEバッファー等を使用して作製される。具体的には、例えばポリアクリルアミドゲルを使用し、且つ変性剤として尿素及びホルムアミドの組合せを使用する場合には、増幅産物の長さ等に応じて、ゲルにおいて例えば6〜15%(好ましくは8〜10%)のアクリルアミド濃度となるように、且つ尿素及びホルムアミドの組合せの濃度勾配が例えば10%→50%〜20%→30%(好ましくは濃度勾配の幅が10%以上)となるように作製する。また、最適条件の検討としては、濃度勾配の幅の広い(10%〜50%)ゲルで検討し、濃度勾配の幅を狭くする方法を検討する。また、検出したバンドがスメアを呈する場合はアクリルアミドの濃度を上げる。なお、変性剤濃度勾配は、電気泳動における陰極から陽極方向へ(DNAが泳動する方向へ)低濃度から高濃度へと勾配をつける。
第2のPCR後の増幅DNA(例えば4〜15μl、好ましくは5〜10μl)を変性剤濃度勾配ゲルにアプライし、電気泳動に供する。電気泳動条件としては、例えば泳動槽温度:60℃、定電圧:70〜250V及び泳動時間:300〜900分が挙げられる。
電気泳動後、変性剤濃度勾配ゲルをエチジウムプロマイド染色、もしくはゲルレッドによる染色に供することで、アプライした増幅DNAのバンドを視覚的に観察することができる。GとCとの対における水素結合は3本であり、一方、AとTとの対における水素結合は2本である。従って、GCの結合は、ATの結合よりも変性剤に対して耐性を有する。そのため、GCの結合を多数有するDNAは、ATの結合を多数有するDNAと比べて変性剤濃度勾配ゲルにおいてより泳動することとなる。
DNAにおける非メチル化シトシンがウラシル、そしてチミンに変換されているため、非メチル化シトシンを有する標的領域に対応する増幅DNAは、メチル化シトシンを有する標的領域に対応する増幅DNAよりも泳動速度が遅く、変性剤濃度勾配ゲルの陰極に近い側に位置することとなる。一方、メチル化シトシンを有する標的領域に対応する増幅DNAは、泳動速度が早く、変性剤濃度勾配ゲルの陽極に近い側に位置することとなる。従って、当該泳動の違いにより、メチル化シトシンを有する標的領域と非メチル化シトシンを有する標的領域とを判断でき、標的領域におけるメチル化パターン又は連続性を評価することができる。
(2)検出したメチル化度を指標として、膵腫瘍を膵癌、膵管内乳頭粘液性腫瘍・胃型、膵管内乳頭粘液性腫瘍・腸型及び膵管内乳頭粘液性腫瘍・膵胆管上皮型から成る群より選択される病型に分類する第2工程
本方法では、検出したメチル化度を指標として、膵腫瘍を膵癌(PDAC)、膵管内乳頭粘液性腫瘍・胃型(IPMN−gastric)、膵管内乳頭粘液性腫瘍・腸型(IPMN−intestinal)、又は膵管内乳頭粘液性腫瘍・膵胆管上皮型(IPMN−PB(Pancreatobiliary))に分類する。
例えばMSE法におけるDGGE後のゲルの写真におけるバンドの発光強度をImage J等の画像処理ソフトウェアにより数値化し、統計解析ソフトウェア(例えば、統計解析ソフト「R」)により統計処理を行う。当該統計処理により算出されたメチル化DNA含有率を比較し、例えば非メチル化のバンドを示していても全体としては高いメチル化DNAの含有率を示す場合には、メチル化傾向の判別となる。例えば、MUC1遺伝子、MUC2遺伝子、MUC4遺伝子及びMUC5AC遺伝子を含む遺伝子セットにおいて、各種遺伝子のメチル化傾向及び非メチル化傾向の判定では、メチル化DNA含有率について、MUC1遺伝子:50%(±20%)、MUC2遺伝子:70%(±20%)、MUC4遺伝子:50%(±20%)及びMUC5AC遺伝子:60%(±20%)をカットオフ値として設定し、当該4種のムチンコアタンパク質をコードする遺伝子を用いた病型予測において、
(a)IPMN−gastricにおいて、4遺伝子全てメチル化傾向;
(b)IPMN−intestinalにおいて、4遺伝子全て非メチル化傾向;
(c)PDACにおいて、MUC1、MUC2及びMUC4遺伝子が非メチル化傾向、MUC5AC遺伝子がメチル化傾向;及び
(d)IPMN−PBが上記(a)〜(c)以外
として、膵腫瘍を分類することができる。このようにして、予後の極めて悪いPDACか、予後の比較的良い膵管内乳頭粘液性腫瘍(IPMN)のいずれであるか、さらにIPMNにおいても癌化の可能性が高い病型の「IPMN−intestinal」であるのか、比較的安全な病型の「IPMN−gastric」であるのかも含めて早期診断を行うことができる。
以上に説明した本方法は、低侵襲性で得られる膵液サンプルを用いた診断方法であり、現在の各種検査(例えば組織診による診断)に加えることで、より高精度の膵腫瘍検査を実施できる。また、本方法によれば、高度に発達してきた画像診断による存在診断に加え、低侵襲的に採取可能な膵液という排出液を有効に利用し、エピジェネティクス異常を検出することにより、悪性度を推し量る質的診断を加味して、早期に明確な治療戦略を立てることが可能になる。
また、本発明は、本方法を実施するために用いる、膵腫瘍の病型を判定するための検査キット(以下、単に「キット」と称する)に関する。キットは、膵腫瘍の病型の診断キット、膵腫瘍の病型を判定するための評価キット、又は膵腫瘍の病型を判定するための情報を収集するためのキットということもできる。
キットには、例えば上記MSE法を行うための試薬を含むことができる。当該試薬としては、例えば重亜硫酸塩処理用の重亜硫酸塩(重亜硫酸ナトリウム);第1のPCR用の第1プライマーセット;第2のPCR用の第2プライマーセット;第1及び第2のPCRのための反応液組成成分(PCRバッファー、ポリメラーゼ、dNTPミックス等);変性剤濃度勾配ゲル電気泳動用のゲル成分(アクリルアミド等)、変性剤(尿素、ホルムアミド等)、バッファー(TAEバッファー等)等が挙げられる。
下記の実施例で説明するように、第1プライマーセットしては、例えばMUC1遺伝子については、配列番号14に記載の塩基配列から成るプライマーと配列番号15に記載の塩基配列から成るプライマーとのセット;MUC2遺伝子については、配列番号18に記載の塩基配列から成るプライマーと配列番号19に記載の塩基配列から成るプライマーとのセット;MUC4遺伝子については、配列番号22に記載の塩基配列から成るプライマーと配列番号23に記載の塩基配列から成るプライマーとのセット;MUC5AC遺伝子については、配列番号26に記載の塩基配列から成るプライマーと配列番号27に記載の塩基配列から成るプライマーとのセットが挙げられる。また、第2プライマーセットしては、例えばMUC1遺伝子については、配列番号16に記載の塩基配列から成るプライマーと配列番号17に記載の塩基配列から成るプライマーとのセット;MUC2遺伝子については、配列番号20に記載の塩基配列から成るプライマーと配列番号21に記載の塩基配列から成るプライマーとのセット;MUC4遺伝子については、配列番号24に記載の塩基配列から成るプライマーと配列番号25に記載の塩基配列から成るプライマーとのセット;MUC5AC遺伝子については、配列番号28に記載の塩基配列から成るプライマーと配列番号29に記載の塩基配列から成るプライマーとのセットが挙げられる。
さらに、キットは、取扱い説明書、膵腫瘍の病型の判定のための説明書等を含むことができる。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
本実施例では、ヒトの膵癌(PDAC)、膵管内乳頭粘液性腫瘍・胃型(IPMN−gastric)、膵管内乳頭粘液性腫瘍・腸型(IPMN−intestinal)及び膵管内乳頭粘液性腫瘍・膵胆管上皮型(IPMN−PB(Pancreatobiliary))の膵液サンプルにおいて、MUC1、MUC2、MUC4及びMUC5AC遺伝子プロモーター又は当該プロモーターと隣接する翻訳領域上の発現に関与する被メチル化部位(CpG部位)のメチル化解析をMSE法にて行い、また免疫組織化学染色によるこれら遺伝子によりコードされるタンパク質の発現確認を行った。
1.材料及び方法
1−1.サンプル
解析に使用したサンプルのセットを下記の表1に示す。
MSE法を使用して、ヒトMUC1遺伝子プロモーターの発現に関与する被メチル化部位(CpG部位)を解析した。図1Aは、被メチル化によってヒトMUC1遺伝子の発現を調節するプロモーター領域の配列及び隣接する翻訳領域の配列(配列番号5)を示す。図1Bは、当該配列のBisulfite処理後のDNA配列(配列番号6)を示し、非メチル化シトシンから変換されたウラシルをチミンで表示する。図1において、下記で説明するPrimer 1−3とPrimer 1−4との間の領域(配列番号1)は、CpG部位172−181を有し、当該CpG部位を含む領域を標的領域とする。なお、論文(Norishige Yamada,Yukari Nishida,Hideaki Tsutsumida,Tomofumi Hamada,Masamichi Goto,Michiyo Higashi,Mitsuharu Nomoto and Suguru Yonezawa(2008)MUC1 expression is regulated by DNA methylation and histone H3−K9 modification in cancer cells.Cancer Res.,68(8):2708−16)と同様に、CpG部位の番号は、ヒトMUC1遺伝子の推定プロモーター上流(当該遺伝子の転写開始点より上流2,753bp)より順にナンバリングされている。
膵液サンプルからDNAを、DNeasy Blood & Tissue Kit(QIAGEN社製)を使用して抽出した。
次いで、EpiTect Bisulfite Kits(QIAGEN社製)を使用して、抽出したDNAをBisulfite処理に供した。
Bisulfite処理後のDNAを、以下のプライマーを使用したPCRに供した。
プライマーセット(小文字の塩基配列はGC clampである):
各PCRは、図1に示すように、1stPCRは上記Primer 1−1とPrimer 1−2を用いて、2ndPCR(nested PCR)は上記Primer 1−3とPrimer 1−4を用いて行った。ポリメラーゼは、AmpliTaq Gold(登録商標)Fast PCR Master Mix(Applied Biosystem社製)を使用した。PCR条件及び温度設定を下記表2に示す。
MSE法を使用して、ヒトMUC2遺伝子プロモーターの発現に関与する被メチル化部位(CpG部位)を解析した。図2Aは、被メチル化によってヒトMUC2遺伝子の発現を調節するプロモーター領域の配列及び隣接する翻訳領域の配列(配列番号7)を示す。図2Bは、当該配列のBisulfite処理後のDNA配列(配列番号8)を示し、非メチル化シトシンから変換されたウラシルをチミンで表示する。図2において、下記で説明するPrimer 2−3とPrimer 2−4との間の領域(配列番号2)は、CpG部位37−43を有し、当該CpG部位を含む領域を標的領域とする。なお、論文(Norishige Yamada,Tomofumi Hamada,Masamichi Goto,Hideaki Tsutsumida ,Michiyo Higashi,Mitsuharu Nomoto and Suguru Yonezawa(2006)MUC2 expression is regulated by histone H3 modification and DNA methylation in pancreatic cancer.Int.J.Cancer,119(8):1850−7)と同様に、CpG部位の番号は、ヒトMUC2遺伝子の推定プロモーター上流(当該遺伝子の転写開始点より上流1,989bp)より順にナンバリングされている。
上記1−2節と同様にして、膵液サンプルからDNAをDNeasy Blood & Tissue Kit(QIAGEN社製)を使用して抽出した後、EpiTect Bisulfite Kits(QIAGEN社製)を使用して、抽出したDNAをBisulfite処理に供した。
Bisulfite処理後のDNAを、以下のプライマーを使用したPCRに供した。
プライマーセット(小文字の塩基配列はGC clampである):
各PCRは図2に示すように、1stPCRは上記Primer 2−1とPrimer 2−2を用いて、2ndPCR(nested PCR)は上記Primer 2−3とPrimer 2−4を用いて行った。ポリメラーゼは、AmpliTaq Gold(登録商標)Fast PCR Master Mix(Applied Biosystem社製)を使用した。PCR条件及び温度設定を下記表4に示す。
MSE法を使用して、ヒトMUC4遺伝子プロモーターの発現に関与する被メチル化部位(CpG部位)を解析した。図3Aは、被メチル化によってヒトMUC4遺伝子の発現を調節するプロモーター領域の配列及び隣接する翻訳領域の配列(配列番号9)を示す。図3Bは、当該配列のBisulfite処理後のDNA配列(配列番号10)を示し、非メチル化シトシンから変換されたウラシルをチミンで表示する。図3において、下記で説明するPrimer 4−3とPrimer 4−4との間の領域(配列番号3)は、CpG部位108−118を有し、当該CpG部位を含む領域を標的領域とする。なお、論文(Norishige Yamada,Yukari Nishida,Hideaki Tsutsumida,Masamichi Goto,Michiyo Higashi,Mitsuharu Nomoto and Suguru Yonezawa(2009)Promoter CpG methylation in cancer cells contributes to regulation of MUC4.Br.J.Cancer,100(2):344−51)と同様に、CpG部位の番号は、ヒトMUC4遺伝子の推定プロモーター上流(当該遺伝子の転写開始点より上流3,622bp)より順にナンバリングされている。
上記1−2節と同様にして、膵液サンプルからDNAをDNeasy Blood & Tissue Kit(QIAGEN社製)を使用して抽出した後、EpiTect Bisulfite Kits(QIAGEN社製)を使用して、抽出したDNAをBisulfite処理に供した。
Bisulfite処理後のDNAを、以下のプライマーを使用したPCRに供した。
プライマーセット(小文字の塩基配列はGC clampである):
各PCRは図3に示すように、1stPCRは上記Primer 4−1とPrimer 4−2を用いて、2ndPCR(nested PCR)は上記Primer 4−3とPrimer 4−4を用いて行った。ポリメラーゼは、AmpliTaq Gold(登録商標)Fast PCR Master Mix(Applied Biosystem社製)を使用した。PCR条件及び温度設定を下記表6に示す。
MSE法を使用して、ヒトMUC5AC遺伝子プロモーターの発現に関与する被メチル化部位(CpG部位)を解析した。図4Aは、被メチル化によってヒトMUC5AC遺伝子の発現を調節するプロモーター領域の配列(配列番号11)を示す。図4Bは、当該配列のBisulfite処理後のDNA配列(配列番号12)を示し、非メチル化シトシンから変換されたウラシルをチミンで表示する。図4において、下記で説明するPrimer 5−3とPrimer 5−4との間の領域(配列番号4)は、CpG部位1−3を有し、当該CpG部位を含む領域を標的領域とする。なお、論文(Yamada N,Nishida Y,Yokoyama S,Tsutsumida H,Houjou I,Kitamoto S,Goto M,Higashi M,Yonezawa S.(2010)Expression of MUC5AC,an early marker of pancreatobiliary cancer,is regulated by DNA methylation in the distal promoter region in cancer cells.J Hepatobiliary Pancreat Sci,17(6):844−854)と同様に、CpG部位の番号は、ヒトMUC5AC遺伝子の推定プロモーター上流(当該遺伝子の転写開始点より上流3,718bp)より順にナンバリングされている。
上記1−2節と同様にして、膵液サンプルからDNAをDNeasy Blood & Tissue Kit(QIAGEN社製)を使用して抽出した後、EpiTect Bisulfite Kits(QIAGEN社製)を使用して、抽出したDNAをBisulfite処理に供した。
Bisulfite処理後のDNAを、以下のプライマーを使用したPCRに供した。
プライマーセット(小文字の塩基配列はGC clampである):
各PCRは図4に示すように、1stPCRは上記Primer 5−1とPrimer 5−2を用いて、2ndPCR(nested PCR)は上記Primer 5−3とPrimer 5−4を用いて行った。ポリメラーゼは、AmpliTaq Gold(登録商標)Fast PCR Master Mix(Applied Biosystem社製)を使用した。さらに、PCR条件及び温度設定を下記表8に示す。
ヒトのPDAC、IPMN−gastric、IPMN−intestinal及びIPMN−PBの手術検体組織サンプルにおいて、MUC1、MUC2、MUC4及びMUC5AC遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を免疫組織化学染色に解析した。
これらタンパク質の発現を検索する免疫組織化学染色に際して、MUC1に関しては、従来の抗MUC1抗体である「MUC1−DF3」(TFB社製)のみでなく、「MUC1 cytoplasmic tail」に対する新規開発の抗MUC1抗体(ハイブリドーマ株MUC1−common(clone 014E)由来(特願2010−097922(特開2011−184427号公報)、受託番号NITE BP−867))を用いた。MUC2に関しては、抗MUC2抗体「MUC2−Ccp58」(novo社製)を使用した。MUC4に関しては、N末端側subunitに対する抗体である抗MUC4抗体「MUC4−8G7」(university of nebraska medical center,omaha)とC末端側subunitに対する抗体である抗MUC4抗体「MUC4−1G8」(zymed社製)の双方を用いた。MUC5ACに関しては、抗MUC5AC抗体「Muc5AC」(Novo社製)を用いた。
2.結果
2−1.メチル化解析と免疫染色の結果
結果を図5〜8に示す。図5は、IPMN−gastricにおけるメチル化解析と免疫染色の結果を示す。図6(図6−1及び図6−2)は、IPMN−intestinalにおけるメチル化解析と免疫染色の結果を示す。図7(図7−1及び図7−2)は、IPMN−PBにおけるメチル化解析と免疫染色の結果を示す。図8は、PDACにおけるメチル化解析と免疫染色の結果を示す。図5〜8において、(A)のパネルはMSE法のゲルの写真であり、(B)のパネルは免疫組織化学染色によるヒトMUC遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を示す写真である。
図5〜8の(A)のパネルにおいて、ゲルにおける変性剤濃度勾配は、電気泳動における陰極から陽極方向へ(パネルにおける左側から右側方向へ)低濃度から高濃度へと勾配をつけている。従って、「U」は非メチル化を示し、「M」はメチル化を示し、緑色から黄色、赤色へのグラデーションは、非メチル化(0%)からメチル化(100%)の程度を示す。
一方、図5〜8の(B)のパネルにおいて、「HE」はヘマトキシリン・エオシン染色の結果である。
2−2.MSE法のゲルの写真におけるバンドの発光強度に基づく統計解析の結果
図5〜8に示すMSE法のDGGE後のゲルの写真におけるバンドの発光強度をImage Jにより数値化し、統計解析ソフト「R」により統計処理を行った。
結果を図9〜12に示す。図9は、MUC1遺伝子についての統計解析の結果である。図10は、MUC2遺伝子についての統計解析の結果である。図11は、MUC4遺伝子についての統計解析の結果である。図12は、MUC5AC遺伝子についての統計解析の結果である。また、図9〜12において、縦軸は、メチル化DNA含有率(methylated DNA content ratio(methylation %))を示す。
図9〜12から判るように、IPMN−gastric typeとIPMN−intestinal typeにおけるMUC1、MUC2、MUC4及びMUC5AC遺伝子のメチル化状況は、IPMN−gastricであれば全ての4種のムチン遺伝子がメチル化であり、IPMN−intestinalであれば全ての4種のムチン遺伝子が非メチル化であることが示され、統計処理においても有意差を示す。
さらに、IPMN−gastric typeは、IPMN−PB typeに対して、MUC1遺伝子とMUC5AC遺伝子においてメチル化状況の差に傾向を有していた。
2−3.4種のムチン遺伝子のメチル化解析の結果に基づく病型予測の結果
上記4種のムチン遺伝子のメチル化解析の結果に基づく病型予測の結果を図13に示す。図13の左側のパネルにおいて、「PX」(Xは1〜18である)は、各サンプルである。
図13において、各種遺伝子のメチル化傾向及び非メチル化傾向の判定では、MUC1:50%、MUC2:70%、MUC4:50%及びMUC5AC:60%をカットオフ値として設定した。
図13に示すように、4種のムチン遺伝子を用いた病型予測において、
(1)Gastric typeにおいて、4遺伝子全てメチル化傾向;
(2)Intestinal typeにおいて、4遺伝子全て非メチル化傾向;
(3)PDAC(膵癌)において、MUC1、MUC2及びMUC4遺伝子が非メチル化傾向、MUC5AC遺伝子がメチル化傾向;
(4)Pancreatobiliary typeが上記以外、
の条件で病型予測を行ったところ、全てにおいて高い感度と特異度を有していた。
従って、膵液中に含まれる上記4種の遺伝子のメチル化状況の当該MSE法による解析は、病型予測へ有用な情報をもたらすと考えられる。
なお、本実施例では、メチル化DNA含有率を比較しており、例えばIPMN−gastric typeにおけるMUC1遺伝子のように、非メチル化のバンドを示していても全体としては高いメチル化DNAの含有率を示し、メチル化傾向の判別となる。
また、膵腫瘍の悪性度のイメージは、Gastric(胃型)<Intestinal(腸型)<PB(膵胆管上皮型)<PDAC(膵癌)である。
実施例1と同様に、本実施例では、ヒトの膵癌(PDAC)、膵管内乳頭粘液性腫瘍・胃型(Gastric−type IPMN)、膵管内乳頭粘液性腫瘍・腸型(Intestinal−type IPMN)、及び膵管内乳頭粘液性腫瘍・膵胆管上皮型(P.B.−type IPMN)の膵液サンプルにおいて、4種のムチン遺伝子(MUC1、MUC2、MUC4及びMUC5AC遺伝子)のメチル化解析を行い、当該メチル化解析結果に基づく病型予測を行った。メチル化解析及び病型予測の方法は、実施例1に記載の方法に準じたものである。
解析に使用したサンプルのセットを下記の表10に示す。
上記4種のムチン遺伝子のメチル化解析の結果に基づく病型予測の結果を図14に示す。図14の左側のパネルにおいて、各番号は、サンプル番号である。
図14に示すように、4種のムチン遺伝子を用いた病型予測において、
(1)Gastric typeにおいて、4遺伝子全てメチル化傾向;
(2)Intestinal typeにおいて、4遺伝子全て非メチル化傾向;
(3)PDAC(膵癌)において、MUC1、MUC2及びMUC4遺伝子が非メチル化傾向、MUC5AC遺伝子がメチル化傾向;
(4)Pancreatobiliary typeが上記以外、
の条件で病型予測を行ったところ、全てにおいて高い感度と特異度を有していた。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
[配列表]
Claims (7)
- 被験者由来の膵液サンプルにおいて、MUC1遺伝子の配列番号1に示される塩基配列から成る領域におけるCpG部位、MUC2遺伝子の配列番号2に示される塩基配列から成る領域におけるCpG部位、MUC4遺伝子の配列番号3に示される塩基配列から成る領域におけるCpG部位及びMUC5AC遺伝子の配列番号4に示される塩基配列から成る領域におけるCpG部位のメチル化度を検出する第1工程と、
前記メチル化度を指標として、膵腫瘍を膵癌、膵管内乳頭粘液性腫瘍・胃型及び膵管内乳頭粘液性腫瘍・腸型から成る群より選択される膵腫瘍の病型に分類する第2工程であって、前記MUC1遺伝子の領域におけるCpG部位について50%以上、前記MUC2遺伝子の領域におけるCpG部位について70%以上、前記MUC4遺伝子の領域におけるCpG部位について50%以上及び前記MUC5AC遺伝子の領域におけるCpG部位について60%以上の割合でメチル化されている場合に該CpG部位についてメチル化されている状態と判定し、膵腫瘍を、
(a) 前記MUC1遺伝子の領域におけるCpG部位、前記MUC2遺伝子の領域におけるCpG部位、前記MUC4遺伝子の領域におけるCpG部位及び前記MUC5AC遺伝子の領域におけるCpG部位についてメチル化されている状態である場合に、膵管内乳頭粘液性腫瘍・胃型に分類し、
(b) 前記MUC1遺伝子の領域におけるCpG部位、前記MUC2遺伝子の領域におけるCpG部位、前記MUC4遺伝子の領域におけるCpG部位及び前記MUC5AC遺伝子の領域におけるCpG部位について非メチル化されている状態である場合に、膵管内乳頭粘液性腫瘍・腸型に分類し、又は、
(c) 前記MUC1遺伝子の領域におけるCpG部位、前記MUC2遺伝子の領域におけるCpG部位及び前記MUC4遺伝子の領域におけるCpG部位について非メチル化されている状態であり、前記MUC5AC遺伝子の領域におけるCpG部位についてメチル化されている状態である場合に、膵癌に分類する、
前記第2工程と、
を含む、膵腫瘍の病型を判定するための検査方法。 - 第1工程が、
膵液サンプル由来のDNAを重亜硫酸塩処理に供する工程と、
前記MUC1遺伝子の領域、前記MUC2遺伝子の領域、前記MUC4遺伝子の領域及び前記MUC5AC遺伝子の領域の外側の領域に対応する各第1プライマーセットを用いて重亜硫酸塩処理後のDNAを第1のPCRに供する工程と、
前記MUC1遺伝子の領域、前記MUC2遺伝子の領域、前記MUC4遺伝子の領域及び前記MUC5AC遺伝子の領域に対応する各第2プライマーセットを用いて第1のPCR後の増幅DNAを第2のPCRに供する工程と、
第2のPCR後の増幅DNAを変性剤濃度勾配ゲル電気泳動に供する工程と、
を含み、各第2プライマーセットのプライマーのアニーリング位置は、前記MUC1遺伝子の領域、前記MUC2遺伝子の領域、前記MUC4遺伝子の領域及び前記MUC5AC遺伝子の領域に対して各第1プライマーセットのプライマーのアニーリング位置の内側に存在する、請求項1記載の方法。 - 各第2プライマーセットの一方のプライマーは、5'側にGC-clamp配列を有する、請求項2記載の方法。
- 変性剤濃度勾配ゲルが濃度勾配として変性剤濃度勾配のみを有する、請求項2又は3記載の方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項記載の方法を実施するために用いることを特徴とする、膵腫瘍の病型を判定するための検査キットであって、
請求項1〜4のいずれか1項記載の方法を実施するためのプライマーセットと、
膵腫瘍を、
(a) 前記MUC1遺伝子の領域におけるCpG部位、前記MUC2遺伝子の領域におけるCpG部位、前記MUC4遺伝子の領域におけるCpG部位及び前記MUC5AC遺伝子の領域におけるCpG部位についてメチル化されている状態である場合に、膵管内乳頭粘液性腫瘍・胃型に分類し、
(b) 前記MUC1遺伝子の領域におけるCpG部位、前記MUC2遺伝子の領域におけるCpG部位、前記MUC4遺伝子の領域におけるCpG部位及び前記MUC5AC遺伝子の領域におけるCpG部位について非メチル化されている状態である場合に、膵管内乳頭粘液性腫瘍・腸型に分類し、又は、
(c) 前記MUC1遺伝子の領域におけるCpG部位、前記MUC2遺伝子の領域におけるCpG部位及び前記MUC4遺伝子の領域におけるCpG部位について非メチル化されている状態であり、前記MUC5AC遺伝子の領域におけるCpG部位についてメチル化されている状態である場合に、膵癌に分類する、
ことを説明する膵腫瘍の病型の判定のための説明書と、
を含む、前記キット。 - 前記MUC1遺伝子の領域、前記MUC2遺伝子の領域、前記MUC4遺伝子の領域及び前記MUC5AC遺伝子の領域の外側の領域に対応する各第1プライマーセットと、前記MUC1遺伝子の領域、前記MUC2遺伝子の領域、前記MUC4遺伝子の領域及び前記MUC5AC遺伝子の領域に対応する各第2プライマーセットとを含み、各第2プライマーセットのプライマーのアニーリング位置が、前記MUC1遺伝子の領域、前記MUC2遺伝子の領域、前記MUC4遺伝子の領域及び前記MUC5AC遺伝子の領域に対して各第1プライマーセットのプライマーのアニーリング位置の内側に存在する、請求項5記載のキット。
- 配列番号14に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号15に示される塩基配列から成るプライマーとから成る前記MUC1遺伝子の領域の外側の領域に対応する第1プライマーセット、
配列番号16に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号17に示される塩基配列から成るプライマーとから成る前記MUC1遺伝子の領域に対応する第2プライマーセット、
配列番号18に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号19に示される塩基配列から成るプライマーとから成る前記MUC2遺伝子の領域の外側の領域に対応する第1プライマーセット、
配列番号20に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号21に示される塩基配列から成るプライマーとから成る前記MUC2遺伝子の領域に対応する第2プライマーセット、
配列番号22に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号23に示される塩基配列から成るプライマーとから成る前記MUC4遺伝子の領域の外側の領域に対応する第1プライマーセット、
配列番号24に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号25に示される塩基配列から成るプライマーとから成る前記MUC4遺伝子の領域に対応する第2プライマーセット、
配列番号26に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号27に示される塩基配列から成るプライマーとから成る前記MUC5AC遺伝子の領域の外側の領域に対応する第1プライマーセット、及び、
配列番号28に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号29に示される塩基配列から成るプライマーとから成る前記MUC5AC遺伝子の領域に対応する第2プライマーセット、
を含む、請求項5又は6記載のキット。
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