WO2007088971A1 - がん予後判定に利用できる遺伝子群 - Google Patents

がん予後判定に利用できる遺伝子群 Download PDF

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transcript
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metastatic breast
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Toshiyuki Saito
Yoji Mikami
Masahiro Kinugasa
Kazuya Mori
Michiyo Sugimoto
Koji Uchida
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Messengerscape Co., Ltd.
Oriental Yeast Co., Ltd.
National Institute Of Radiological Sciences
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a novel method for determining the possibility of lymph node metastasis of breast cancer. More specifically, the present invention relates to a method for determining the possibility of lymph node metastasis of breast cancer based on comparing the expression level of a marker gene having a specific nucleotide sequence between metastatic breast cancer cells and non-metastatic breast cancer cells.
  • Breast cancer has rapidly increased in Japan, and is the first female affected person.
  • Breast cancer is a cancer in which female hormones (estrogens) are involved, and long periods of exposure to estrogen, such as early menarche, late menopause, late first-born age, or older and not born, help breast cancer. It is considered as an easy condition.
  • estrogen estrogens
  • high-fat diet due to Westernization of diet due to Westernization of diet
  • Obesity is also considered to be involved, especially in postmenopausal women, because estrogen is made in adipose tissue. Lifestyles such as women's social advancement are also considered to be related to the rise in breast cancer incidence in Japan.
  • Breast cancer can be roughly divided into three types: non-invasive cancer, invasive cancer, and Paget's disease. Most breast cancers that cause lumps are invasive cancers: hard cancer, papillary duct cancer, solid duct cancer There are general types of cancer and special types such as mucinous cancer.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-284594
  • Patent Document 2 JP 2003-284596 A
  • the present inventors have conducted extensive research, and the expression level of a specific marker gene is different from that of non-metastatic breast cancer cells or tissues in metastatic breast cancer cells or tissues.
  • the present inventors have found that it can be applied to the determination of the possibility of lymph node metastasis of breast cancer, and have completed the present invention. That is, the means for solving the problems are as follows.
  • Lymph node metastasis of breast cancer characterized by using a difference in the expression level of a marker gene as an index between human metastatic breast cancer tissue (or cells) and non-metastatic breast cancer tissue (or cells) How to determine the possibility.
  • Marker genes are GenBank accession numbers NM000903, NM006804, NM033547, CR 611676, NM177967, NM152558, NM178167, NM003752, AK131568, CR592336, N M178507, NM002862, NM006913, NM005794, NM014164, NM014164, NM0008888 and 3296 bp.
  • FIG. L Diagram showing comparison of expression levels of marker gene transcript (transcript # 1) by HiCEP method.
  • FIG. 2 Comparison of expression levels of marker gene transcript (transcript # 2) by HiCEP method.
  • FIG. 3 Comparison of expression levels of marker gene transcript (transcript # 3) by HiCEP method.
  • FIG. 4 Comparison of expression levels of marker gene transcripts (transcript # 4) by HiCEP method.
  • FIG. 5 A comparison of the expression levels of marker gene transcripts (transcript # 5) by HiCEP method.
  • FIG. 6 A comparison of the expression levels of marker gene transcripts (transcript # 6) by HiCEP method.
  • FIG. 7 is a diagram showing a comparison of expression levels of marker gene transcripts (transcript # 7) by HiCEP method.
  • FIG. 8 Diagram showing comparison of expression levels of marker gene transcript (transcript # 8) by HiCEP method.
  • FIG. 9 Comparison of expression levels of marker gene transcripts (transcript # 9) by HiCEP method.
  • FIG. 10 is a diagram showing a comparison of expression levels of marker gene transcripts (transcript number # 10) by HiCEP method.
  • FIG. 1l A comparison of the expression levels of marker gene transcripts (transcript # 11) by HiCEP method.
  • FIG. 13 shows a comparison of expression levels of marker gene transcripts (transcript number # 13) by HiCEP method.
  • FIG. 14 shows a comparison of the expression levels of marker gene transcripts (transcript number # 14) by HiCEP method.
  • FIG. 15 is a diagram showing a comparison of the expression levels of marker gene transcripts (transcript number # 15) by HiCEP method.
  • FIG. 16 shows a comparison of the expression levels of marker gene transcripts (transcript number # 16) by HiCEP method.
  • FIG. 17 shows a comparison of expression levels of marker gene transcripts (transcript number # 17) by HiCEP method.
  • the present invention is a method for determining the possibility of metastasis of breast cancer to a lymph node, characterized by using a difference in the expression level of a specific marker gene between metastatic breast cancer cells or tissues and non-metastatic breast cancer cells or tissues as an index. Is the method.
  • the marker gene in the present invention can determine the possibility of metastasis of breast cancer cells by comparing the expression level between metastatic breast cancer cells or tissues and non-metastatic breast cancer cells or tissues. It is a gene to make.
  • the present invention is a method for determining the possibility of lymph node metastasis of breast cancer, wherein the expression level of the marker gene is represented by the mRNA level of the gene. More specifically, total RNA is extracted from cells derived from metastatic breast cancer tissue and cells derived from non-metastatic breast cancer tissue, and the amount of the transcribed mRNA included in the marker gene force is compared. This is a method for determining the possibility of lymph node metastasis of breast cancer.
  • Gene expression analysis methods for measuring mRNA levels of genes include comprehensive transcript profile analysis method (HiCEP method), DNA microarray method, quantitative reverse transcription PCR method (quantitative RT-PCR method), and Northern hybridization. Laws can be applied.
  • gene expression analysis methods that measure mRNA levels without extracting total RNA from cells, such as the in situ hybridization method, can also be applied to the present invention. It is also possible to combine two or more of the above methods to improve detection accuracy. Furthermore, to measure the amount of translation product of this gene, as an example Thus, there is a method for measuring the amount of protein encoded by this gene. Specifically, the amount of a specific protein can be measured by, for example, an immunological measurement method using a specific antibody against the protein.
  • a specific antibody against the protein encoded by this gene can be prepared using the protein encoded by this gene as an immunizing antigen according to a conventional method.
  • the HiCEP method is one of transcript profile analysis methods characterized by comprehensive and high detection sensitivity. The method is briefly described below (for details, refer to Nucleic Acids Res., 2003, Vol. 31, No. 16 e94). Extract and purify ToTal RNA from tissue and cell samples by conventional methods. Synthesizing double-stranded cDNA using 5 'piotin oligo dT. Cleave the cDNA using the restriction enzyme Mspl. After collecting the poly A fragment with avidin beads, connect the 3'-adapter to the Mspl cleavage site. Cleave the fragment with the restriction enzyme Msel. Connect the 3'-adapter to the Msel cutting site.
  • PCR primer with additional 2 bases added to the adapter sequence linked to the 5 'and 3' ends (16 on the 5 'side, 16 on the 3' side, and a fluorescent label on the 5 'side primer) Perform 256 quantitative PCR combinations of these. Apply PCR products to the Fragment Analyzer for each primer combination, and obtain 256 electrophoretic images (gene expression profiles) consisting of multiple fluorescent peaks per sample. By comparing the fluorescence peaks thus obtained between different samples, it is possible to compare the expression levels of the transcripts.
  • the marker gene in the present invention is not particularly limited as long as a marked difference is observed in the expression level between metastatic breast cancer cells or tissues and non-metastatic breast cancer cells or yarns and tissues.
  • a group selected from one or more of the group consisting of homologs is applicable.
  • GenBank registration data the same gene may be registered by different researchers at different times, fields, and names, or there may be splicing variants of the gene polymorphism May be registered as new, there are duplicate base sequence data that can be regarded as the same gene as different registration numbers. Usually, these are collectively referred to as homologues and used in the same meaning in the present invention.
  • the method for determining the possibility of lymph node metastasis of breast cancer of the present invention uses a marker gene that has a significant difference in gene expression level between metastatic breast cancer cells or tissues and non-metastatic breast cancer cells or tissues. It is characterized by that.
  • the “expression level” may be the expression level of mRNA transcribed from the marker gene, or may be the expression level of protein translated from the mRNA.
  • the difference in gene expression level is that when the expression level of metastatic breast cancer cells or tissues is 1, that of non-metastatic breast cancer cells or tissues is desirably 1.5 or more or 2Z3 or less, more desirably 2 or more or 1Z2 or less.
  • the expression level of the marker gene in non-metastatic breast cancer cells or tissues compared to metastatic breast cancer cells or tissues is outside the above range, it is difficult to determine the possibility of lymph node metastasis of breast cancer. Not desirable.
  • the target breast cancers include ductal cancer (papillary ductal carcinoma, solid ductal carcinoma, hard carcinoma, etc.), lobular carcinoma, special type (mucus cancer 'medullary carcinoma / tubular carcinoma), Paget disease, etc.
  • This type of breast cancer can also be applied, but is preferably hard cancer, lobular cancer or solid ductal cancer.
  • RNA transcription level of human metastatic breast cancer tissue and non-metastatic tissue is expressed as a comprehensive high-sensitivity transcript profile analysis technique (known as a technique for gene expression analysis).
  • HiCEP technology (Nucleic Acids Res., 2003, vol.31 (16), e94) was used, and the expression level of each gene was compared between human metastatic breast cancer tissue and non-metastatic tissue.
  • samples were collected from 5 patients with stage II breast cancer (Caucasian) shown in Table 1 (primary cancer. 2 patients with lymph node metastasis, 3 without lymph node, all with TNM classification stage II). Breast cancer tissue (commercially available) was used.
  • Total RNA was extracted from the above specimens using an RNeasy kit (manufactured by Qiagen) by the conventional method of the kit. Using 0.1 g of total RNA derived from each sample as a cage, perform reverse transcription reaction with Super Script First Strand Synthesis System for RT-PCR (manufactured by Invitrogen), and use the resulting reverse transcription product for 80 units of DNA polymerase. The reaction was performed at 16 ° C for 2 hours with 1 (manufactured by Invitrogen), 4 units of RNaseH (manufactured by Invitrogen) and 40 units of E. coli DNA ligase (manufactured by Invitrogen).
  • the resulting double-stranded cDNA was reacted with 40 units of restriction enzyme Msel (New England Biolab) and 50 units of restriction enzyme Mspl (Takara Bio) at 37 ° C for 4 hours.
  • An adapter array was connected to both ends of the.
  • selective PCR was performed, and the reaction product was analyzed by capillary electrophoresis.
  • the gene expression level was measured, the gene expression level was compared between samples, the pattern classification of the expressed genes was performed, and clustering data (expression fluctuation peak) was obtained.
  • transcript numbers 1 to 11 (transcript numbers in Table 1), a fluorescence peak is observed in the sample with “transition”, whereas the peak is zero or zero in the sample with no transition. The expression intensity is less than half that of the sample with metastasis. Conversely, for transcripts 12 through 17, there is a clear fluorescence peak in the sample with no transition, whereas in the sample with transition, the expression intensity is zero or less than half that of the sample with no transition. This indicates that these 17 genes have breast cancer metastasis depending on their expression intensity. It can be seen that this is a distinguishing indicator.
  • MGC16733 similar to CG 12113 transcript sequence containing base sequence (MGC16733), mRNA.

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Abstract

ヒトの転移性乳癌組織（または細胞）と非転移性乳癌組織（又は細胞）との特定遺伝子の発現レベルの差を指標とした、新規な乳癌のリンパ節転移可能性の判定方法を提供することを目的とする。 このため、（１）ヒトの転移性乳癌組織（または細胞）における特定の塩基配列を有する遺伝子の発現レベルを測定し、（２）ヒトの非転移性乳癌組織（または細胞）における上記遺伝子の発現レベルを測定し、（３）上記（１）及び（２）の測定値を比較し、その差異に基づいて乳癌のリンパ節転移可能性を判定することを特徴とする方法を提供する。

Description

明 細 書
がん予後判定に利用できる遺伝子群
技術分野
[0001] 本発明は、新規な乳癌のリンパ節転移可能性の判定方法に関する。より詳細には、 特定の塩基配列を有するマーカー遺伝子の発現レベルを転移性乳癌細胞と非転移 性乳癌細胞とで比較することに基づぐ乳癌のリンパ節転移可能性の判定方法に関 する。
背景技術
[0002] 日本では乳癌が急激に増カロしており、特に女性罹患者の第 1位となっている。乳癌 は、女性ホルモン (エストロゲン）が関与している癌で、初潮が早い、閉経が遅い、初 産年齢が遅いまたは高齢で未産、など、エストロゲンにさらされる期間が長いことが乳 癌に力かりやすい条件として考えられている。また、食生活の欧米化による高脂肪食
、肥満なども関与していると考えられ、これは特に閉経後の女性で、脂肪組織でエス トロゲンが作られているためであると考えられる。また、女性の社会進出などのライフ スタイルも日本における乳癌罹患率の上昇に関係していると考えられる。
[0003] 乳癌は、非浸潤癌、浸潤癌、パジェット病の大きく 3つに分けられるが、しこりを生じる ような乳癌のほとんどが浸潤癌であり、硬癌、乳頭腺管癌、充実腺管癌などの一般的 な癌と、粘液癌などの特殊型とがある。
[0004] 早期乳癌の検診としては乳癌特異的な血液検査法がなぐ触診および X線像診断が 行われている。しカゝし併用した場合でも見落し率は 20%と高ぐ X線像診断には専門 医の判定が必要となる等の問題がある。また、術前、術中の乳癌細胞診断では病理 医による鑑別が必須であるが、病理医不足や鑑別基準のばらつき等の問題があり、 検診から鑑別の間を埋めるべき客観的かつ簡便な検出/診断法が存在しない。近年 、直径 lmm以下の癌組織を検出できる PET診断が行われつつあるが、大規模な設備 が必要であり、簡便に検診に利用することは極めて難しい。
[0005] 近年の研究から、癌が遺伝子の異常を原因とする疾病であることが明らかになりつつ あり、例えば癌組織と正常組織での、特定の遺伝子の発現レベルが異なるという現 象を利用し、癌細胞を検出する方法が提案されている（特許文献 1、 2)。
[0006] 特許文献 1：特開 2003-284594号公報
特許文献 2：特開 2003-284596号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] リンパ節転移性乳癌の場合、乳癌術後において、腫瘍サイズ、切除癌細胞の核異型 度、ホルモン受容体量等の指標を用いて経過を予測し、必要に応じてリンパ節等へ の転移や再発の抑制を目的とする術後補助療法 (アジュバント療法)を行う。しかしな がら、現在のところ、これら指標の予測精度は十分ではなぐ再発リスク低減、適切な 投薬による患者 QOL向上の観点力も精度の高い予後指標が必要とされている。 課題を解決するための手段
[0008] 上記課題に鑑み、本発明者らが鋭意研究を実施し、転移性乳癌細胞又は組織にお Vヽて、特定のマーカー遺伝子の発現レベルが非転移性乳癌細胞又は組織とは異な り、それが乳癌のリンパ節転移可能性の判定に応用しうることを見出し、本発明を完 成させるに至った。すなわち、課題を解決するための手段は以下のとおりである。
[0009] (1)ヒトの転移性乳癌組織 (または細胞）と非転移性乳癌組織 (または細胞）における 、マーカー遺伝子の発現レベルの差を指標にすることを特徴とする、乳癌のリンパ節 転移可能性の判定方法。
(2)マーカー遺伝子の発現レベルが、その遺伝子の mRNA量で表されることを特徴と する、前記（1)に記載の判定方法。
(3)マーカー遺伝子が、 GenBank登録番号 NM000903、 NM006804, NM033547, CR 611676、 NM177967, NM152558, NM178167, NM003752, AK131568、 CR592336、 N M178507, NM002862, NM006913、 NM005794, NM014164, NM000853および 3番染 色体 178882962bpから 178883181bpの塩基配列を有する遺伝子またはそのホモログ からなる群のうちの、 1または 2以上より選択されることを特徴とする、前記（1)または（ 2)に記載の判定方法。
(4)ヒトの転移性乳癌組織 (または細胞）と非転移性乳癌組織 (または細胞）における マーカー遺伝子の発現レベルの差が、 2倍以上または 1Z2以下である、前記（1)か ら（3)の 、ずれかに記載の判定方法。
発明の効果
[0010] 本発明の判定方法により、遺伝子レベルにて乳癌のリンパ節転移可能性の判定を迅 速かつ簡便に行うことが可能となり、乳癌の転移防止につなげることができる。
図面の簡単な説明
[0011] [図 l]HiCEP法によるマーカー遺伝子転写物（転写物番号 # 1)の発現量の比較を示 す図。
[図 2]HiCEP法によるマーカー遺伝子転写物 (転写物番号 # 2)の発現量の比較を示 す図。
[図 3]HiCEP法によるマーカー遺伝子転写物 (転写物番号 # 3)の発現量の比較を示 す図。
[図 4]HiCEP法によるマーカー遺伝子転写物（転写物番号 # 4)の発現量の比較を示 す図。
[図 5]HiCEP法によるマーカー遺伝子転写物（転写物番号 # 5)の発現量の比較を示 す図。
[図 6]HiCEP法によるマーカー遺伝子転写物（転写物番号 # 6)の発現量の比較を示 す図。
[図 7]HiCEP法によるマーカー遺伝子転写物 (転写物番号 # 7)の発現量の比較を示 す図。
[図 8]HiCEP法によるマーカー遺伝子転写物（転写物番号 # 8)の発現量の比較を示 す図。
[図 9]HiCEP法によるマーカー遺伝子転写物（転写物番号 # 9)の発現量の比較を示 す図。
[図 10]HiCEP法によるマーカー遺伝子転写物（転写物番号 # 10)の発現量の比較を 示す図。
[図 1 l]HiCEP法によるマーカー遺伝子転写物（転写物番号 # 11)の発現量の比較を 示す図。
[図 12]HiCEP法によるマーカー遺伝子転写物（転写物番号 # 12)の発現量の比較を 示す図。
[図 13]HiCEP法によるマーカー遺伝子転写物（転写物番号 # 13)の発現量の比較を 示す図。
[図 14]HiCEP法によるマーカー遺伝子転写物（転写物番号 # 14)の発現量の比較を 示す図。
[図 15]HiCEP法によるマーカー遺伝子転写物（転写物番号 # 15)の発現量の比較を 示す図。
[図 16]HiCEP法によるマーカー遺伝子転写物（転写物番号 # 16)の発現量の比較を 示す図。
[図 17]HiCEP法によるマーカー遺伝子転写物（転写物番号 # 17)の発現量の比較を 示す図。
発明を実施するための最良の形態
[0012] 本発明は、転移性乳癌細胞又は組織と非転移性乳癌細胞又は組織における、特定 のマーカー遺伝子の発現レベル差を指標にすることを特徴とする、乳癌のリンパ節 転移可能性の判定方法である。本発明におけるマーカー遺伝子とは、その発現レべ ルを転移性乳癌細胞又は組織と非転移性乳癌細胞又は組織とで比較することにより 、該乳癌細胞の転移性の可能性を判定することを可能にする遺伝子のことである。
[0013] 本発明は、先記マーカー遺伝子の発現レベルが、その遺伝子の mRNA量で表される ことを特徴とする、乳癌のリンパ節転移可能性の判定方法である。より詳細には、転 移性乳癌組織由来の細胞と非転移性乳癌組織由来の細胞からトータル RNAを抽出 し、その中に含まれる先記マーカー遺伝子力 転写される mRNA量を比較することを 特徴とする、乳癌のリンパ節転移可能性の判定方法である。遺伝子の mRNA量を測 定する遺伝子発現解析法としては、包括的転写産物プロファイル解析法 (HiCEP法） 、 DNAマイクロアレイ法、定量的逆転写 PCR法（定量 RT-PCR法）、ノザンハイブリダィ ゼーシヨン法などが適用可能である。また、 in situハイブリダィゼーシヨン法のように、 細胞からトータル RNAを抽出せずに mRNA量を測定する遺伝子発現解析法も、本発 明に適用可能である。また、検出精度を向上させるため、上記方法を 2つ以上組み 合わせることも可能である。さらに本遺伝子の翻訳産物量を測定するには、一例とし て、本遺伝子にコードされる蛋白質の量を測定する方法がある。特定蛋白質の量の 測定は、具体的には例えば、該蛋白質に対する特異抗体を用いた免疫学的測定法
(例えば、 ELISA、ウェスタンブロット、 RIA等）、二次元電気泳動法、高速液体クロマト グラフィーなどにより実施することができる。本遺伝子にコードされる蛋白質に対する 特異抗体は、常法に準じて、本遺伝子にコードされる蛋白質を免疫抗原として調製 することができる。
[0014] なお、 HiCEP法とは、包括的かつ高検出な感度を特徴とする転写物プロファイル解 析手法の一つである。以下、その方法について簡単に記載する（詳細は Nucleic Aci ds Res., 2003, Vol.31, No.16 e94を参考のこと）。組織.細胞サンプルから、常法 により ToTal RNAを抽出 '精製する。 5 'ピオチンオリゴ dTを用いて二本鎖 cDNAを合 成する。制限酵素 Msplを用い cDNAを切断する。アビジンビーズでポリ A側断片を回 収した後、 Mspl切断サイトへ 3'-アダプターを連結する。制限酵素 Mselにより断片を 切断する。 Msel切断サイトへ 3'-アダプターを連結する。 5'および 3'末端に連結された アダプター配列に選択的 2塩基を追加した PCRプライマー（5'側 16本、 3'側 16本、 5' 側プライマーには蛍光標識を施す)を作成し、これらの組み合わせである 256通りの 定量的 PCRを行う。 PCR産物をプライマー組み合わせごとに Fragment Analyzerに掛 け、複数の蛍光ピークからなる電気泳動像 (遺伝子発現プロファイル)を、サンプルに 付き 256個取得する。こうして得た蛍光ピークを異なるサンプル間で比較することによ り、転写物の発現量比較が可能となる。
[0015] 本発明におけるマーカー遺伝子としては、転移性乳癌細胞又は組織と非転移性乳 癌細胞又は糸且織においてその発現量に顕著な差が見られるものであれば特に限定 されず、例えば GenBank登録番号 NM000903、 NM006804, NM033547, CR611676, NM177967, NM152558, NM178167, NM003752, AK131568、 CR592336、 NM 178507 、 NM002862, NM006913、 NM005794, NM014164, NM000853および 3番染色体 1788 82962bpから 178883181bpの塩基配列を有する遺伝子またはそのホモログからなる群 のうちの、 1または 2以上より選択されるものが適用可能である。
[0016] なお、 GenBank登録データにおいては、同一遺伝子を異なる研究者が異なる時期、 分野、名称で登録している場合や、遺伝子多型ゃスプライシングバリアントがあるもの を新規なものとして登録している場合があるため、本来同一遺伝子とみなしてよい塩 基配列データが異なる登録番号として重複して存在する。通常それらを総称してホ モログと称し、本発明にお ヽても同様の意味に用いる。
[0017] 本発明の乳癌のリンパ節転移可能性の判定方法は、転移性乳癌細胞又は組織と非 転移性乳癌細胞又は組織との、遺伝子の発現レベルの差が顕著なものをマーカー 遺伝子とすることを特徴とする。ここで、前記「発現レベル」とは、マーカー遺伝子から 転写される mRNAの発現量であってもよく、前記 mRNAから翻訳されるタンパク質の発 現量であってもよい。遺伝子発現レベルの差としては、転移性乳癌細胞又は組織の 発現レベルを 1とした場合、非転移性乳癌細胞又は組織のそれが望ましくは 1. 5以 上または 2Z3以下、より望ましくは 2以上または 1Z2以下である。一方、転移性乳癌 細胞又は組織と比較した非転移性乳癌細胞又は組織の上記マーカー遺伝子の発 現レベルが上記範囲外では、乳癌のリンパ節転移可能性の判定をすることが困難で あるため、望ましくない。
[0018] 対象となる乳癌は、乳管癌 (乳頭腺管癌、充実腺管癌、硬癌など)、小葉癌、特殊型 ( 粘液癌 '髄様癌 ·管状癌）、パジェット病等、いずれの種類の乳癌でも適用可能であ るが、望ましくは硬癌、小葉癌または充実腺管癌である。
実施例
[0019] 以下に実施例を記載する力 本発明は以下の実施例に限定されるものではない。本 実施例にお 、ては、ヒト転移性乳癌組織と非転移性組織の遺伝子発現レベル (RNA 転写レベル)を、遺伝子発現解析法の一技術として公知の包括的高感度転写産物 プロファイル解析技術（HiCEP技術）（Nucleic Acids Res., 2003, vol.31(16), e94) を用い測定し、各遺伝子に関しその発現レベルをヒト転移性乳癌組織と非転移性組 織で比較した。
[0020] 本実施例では、表 1に示すステージ IIの乳癌患者 (Caucasian) 5名（原発性ガン。リン パ節転移有り 2名、無し 3名。全て TNM分類ステージ II。）より採材された乳癌組織 (巿 販品)を使用した。
[表 1]
Figure imgf000008_0001
[0021] 上記検体から、 RNeasyキット（キアゲン社製）を用いてキット常法によりトータル RNAを 抽出した。各試料由来の 0.1 gのトータル RNAを铸型として Super Script First Stra nd Synthesis System for RT-PCR (インビトロゲン社製）で逆転写反応を行い、得 られた逆転写反応産物を 80ユニットの DNAポリメラーゼ 1 (インビトロゲン社製）、 4ュ- ットの RNaseH (インビトロゲン社製）および 40ユニットの大腸菌 DNAリガーゼ (インビト ロゲン社製)で 16°C、 2時間反応した。得られた二本鎖 cDNAを 40ユニットの制限酵素 Msel (ニューイングランド 'バイオラボ社製)および 50ユニットの制限酵素 Mspl (タカラ バイオ社製)で 37°C、 4時間反応し、得られた DNA断片の両端にアダプター配列を接 続した。こうして得られたアダプター配列付き DNA断片を铸型に用いて選択的 PCRを 行い、その反応産物についてキヤピラリー電気泳動による分析を行った。得られた波 形データを用い、遺伝子発現レベルの測定と試料間の遺伝子発現レベル比較、発 現遺伝子のパターン分類を行 ヽ、クラスタリングデータ (発現変動ピーク)を得た。
[0022] 解析の結果、表 2及び図 1から図 17に示すように、サンプルに供した患者のリンパ節 転移有無に応じて、マーカー遺伝子転写物 17種の蛍光ピーク強度が明瞭な差を示 すことが分かる。なお、この解析においては 1検体につき 2回の測定をおこない、その 結果得られる蛍光ピークを重ねた。マーカー遺伝子転写物に対応するピークを矢印 で示す。
[0023] 転写物番号 1から 11 (転写物番号は表 1のもの）については転移"有り"サンプルにお いて蛍光ピークが認められるのに対し、転移"無し"サンプルではピークがゼロもしく は転移"有り"サンプルの半分以下の発現強度となっている。逆に、転写物 12から 17 については転移"無し"サンプルに明瞭な蛍光ピークが認められるのに対し、転移" 有り"サンプルではピークがゼロもしくは転移"無じ'サンプルの半分以下の発現強度 となっている。このことから、この 17遺伝子は、その発現強度に応じて乳癌転移性を 区別する指標となって 、ることが分かる。
[表 2]
乳癌転移マーカ一となる転写物
転写物番 配列 GenBank登録 ァノテ一シヨン 発現様式 号
# 1 第 16番染色体マイナス鎖 NM_000903 NAD(P)H menadione 転移性乳癌で
68302490bpから 68317861bp の塩 oxidoreductase 1 発現亢進する 基配列を含む転写物配列
# 2 第 3番染色体プラス鎖 178882962bp なし なし
から 178883181bpの塩基配列を含
む 写物配列
# 3 第 1 7番染色体プラス鎖 NM_006804 steroidogenic acute regulatory
35050592bpから 35050643bp の塩 protein related
基配列を含む転写物配列
# 4 第 11番染色体マイナス鎖 醒— 033547 Homo sapiens hypothetical gene
77267542bp力 77272569bp の塩 MGC16733 similar to CG 12113 基配列を含む転写物配列 (MGC16733), mRNA.
# 5 第 5番染色体プラス鎖 176665540bp CR6 1 1676 Similar to Fxl9-like protein (25
から 176666255bpの塩基配列を含 kDa protein of relevant
む転写^配列 evolutionary and lymphoid
interest) (PRELI) (CGI- 106)
(SBBI12)
# 6 第 13番染色体プラス鎖 98835662bp 匪— 177967 Fhosphoglycerate
から 98835862bp の塩基配列を含む dehydrogenase like 1
転写物配列
# 7 第7番染色体ブラス鎖 2426581bpか NM_152558 IQ motif containing E (IQCE)
ら 2426860bpの塩基配列を含む転写
物配列
# 8 第 16番染色体マイナス鎖 1987788 醒— 178 167 Zinc finger protein 598
bpから 1987865 bp の塩基配列を含
む転写物配列
# 9 第 16番染色体マイナス鎖 228320033 NM_003752 Eukaryotic translation
bpから 28320077 bpの塩基配列を initiation factor 3, s b unit 8, 含む転写物配列 HOkDa
# 1 0 第 17番染色体プラス鎖 35135544 bp AK 13 1568 V-erb-b2 erythroblastic
から 35135831 bpの塩基配列を含む leukemia viral oncogene
転写物配列 homolog 2, neuro/glioblastom
derived oncogene homolog
(avian)
# 1 1 第 17番染色体プラス鎖 35126382 bp CR592336 V-erb-b2 erythroblastic
から 35127393 bpの塩基配列を含む leukemia viral oncogene
転写物配列 homolog 2, neuro/glioblastom
derived oncogene homolog
(avian)
# 1 2 第 11番染色体プラス鎖 119605680 醒— 178507 NS5ATP 13TP2 protein 転移性乳癌で bpカ ら 119605847 bpの塩基酉 S歹を 発現低下する 含む転写物配列
# 1 3 第 20番染色体プラス鎖 25226174 bp 匪— 002862 Fhosphorylase; glycogen; brain
から 25226624 bpの塩基配列を含む
転写物配列
# 1 4 第 6番染色体ブラス鎖 32256007 bp NM_0069 13 Ring finger protein 5
から 32256297 bpの塩基配列を含む
転写物配列
# 1 5 第 14番染色体マイナス鎖 23183541 醒— 005794 Dehydrogenase/reductase (SDR
bpから 23184510 bpの塩基配列を family) member 2
含む転写物配列
# 1 6 第 19番染色体ブラス鎖 40352503 bp醒— 0 14164 FXYD domain containing ion
から 40352595 bpの塩基配列を含む transport regulator 5
転写物配列
# 1 7 第 22番染色体プラス鎮 22700873 bp 醒— 000853 Glutathione S-transferase thet
から 22700983 bpの塩基配列を含む 1
転写物配列 産業上の利用可能性
本発明を構成する遺伝子群を利用することにより、従来の課題であった高感度で客 観的、簡便、迅速な乳癌のリンパ節転移可能性の判定が可能となり、乳癌の予後予 測用マーカーとして利用可能である。

Claims

請求の範囲
[1] ヒトの転移性乳癌組織 (または細胞）と非転移性乳癌組織 (または細胞）における、マ 一力一遺伝子の発現レベルの差を指標にすることを特徴とする、乳癌のリンパ節転 移可能性の判定方法。
[2] マーカー遺伝子の発現レベルが、その遺伝子の mRNA量で表されることを特徴とする 、請求項 1に記載の判定方法。
[3] マーカー遺伝子が、 GenBank登録番号 NM000903、 NM006804, NM033547, CR6116 76、 NM177967, NM152558, NM178167, NM003752, AK131568、 CR592336、 NM17 8507、 NM002862, NM006913、 NM005794, NM014164, NM000853および 3番染色体 178882962bpから 178883181bpの塩基配列を有する遺伝子またはそのホモログから なる群のうちの、 1または 2以上より選択されることを特徴とする、請求項 1または 2に 記載の判定方法。
[4] ヒトの転移性乳癌組織 (または細胞）と非転移性乳癌組織 (または細胞）におけるマー カー遺伝子の発現レベルの差力 2倍以上または 1Z2以下である、請求項 1から 3の V、ずれかに記載の判定方法。
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