CN110573629A - 用于诊断早期胰腺癌的方法和试剂盒 - Google Patents

用于诊断早期胰腺癌的方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

提供了一种基于核酸的胰腺囊肿液测定法，其用于区分高级别和低级别的导管内乳头状黏液肿瘤。

Description

用于诊断早期胰腺癌的方法和试剂盒
引言
本专利申请要求2017年3月30日提交的美国临时专利申请序列号62/478,860的优先权，所述美国临时专利申请的内容在此通过引用整体并入本文。
背景技术
胰腺导管内乳头状黏液肿瘤(IPMN)是以不同程度细胞学非典型性的肿瘤黏液细胞的导管内增生为特征的肿瘤，其通常形成乳头状突起并导致胰管囊性扩张，从而形成临床上可检测到的肿块。从宏观上讲，IPMN基于胰管系统的不同参与分为主胰管型、混合型和分支胰管型。已证实，主胰管型和混合型IPMN与分支胰管型相比更有可能具有浸润性癌(48％和42％比11％)，随后，主胰管型和混合型IPMN的5年疾病特异性生存率与分支胰管型相比显著更低(65％和77％比91％)。从组织学上讲，IPMN被认为从低级别异型增生(dysplasia)(腺瘤)发展为高级别异型增生(原位癌)和浸润性癌。经切除的非浸润性IPMN患者的5年生存率高达77-94％，而浸润性IPMN的生存率则低得多，为33-43％。鉴于浸润性和非浸润性IPMN之间以及主胰管和分支胰管IPMN之间的生存率存在显著差异，已采用临床准则来辅助临床医生确定何时应该通过手术切除病变。然而，这些准则尽管很灵敏(97-100％)，但已被证明是高度非特异性的(23-30％)，尤其是在分支胰管IPMN中。考虑到无症状囊肿在易患合并症的老年人群中的普遍性，因此需要更特异性的工具来将高风险和恶性病变与低风险病变区分开。为了提高诊断准确性，已经使用了囊肿液进行遗传学改变的分析，并且已建议了一些生物标志物，包括GNAS(鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)，α)、KRAS(GTP酶KRAS原癌基因)、IL1B、粘蛋白和微RNA。参见US2017/0022571；Maker等人,(2011)Ann.Surg.Oncol.(外科肿瘤学年鉴)18(1):199；Maker等人,(2011)Clin.Cancer Res.(临床癌症研究)17(6):1502-8；Maker等人,(2015)J.Am.Coll.Surg.(美国外科医师学会杂志)220(2):243-253。然而，需要临床上高风险病变的特异性标志物的组合来辅助IPMN患者的术前诊断和风险分层。
发明内容
本发明提供了一种区分高风险和低风险的导管内乳头状黏液肿瘤和囊肿异型增生水平的方法，所述方法通过：确定胰腺囊肿液样品中的一种或多种生物标志物信使RNA(mRNA)或者一种或多种生物标志物微RNA(miRNA)的表达水平；将所述一种或多种生物标志物mRNA或者一种或多种生物标志物miRNA的表达水平与囊肿液对照样品中的所述一种或多种生物标志物的表达水平进行比较；以及将所述样品分类为高风险或低风险的导管内乳头状黏液肿瘤。在一个实施方案中，所述mRNA选自ERBB2、GAPDH、GNAS、IL1B、KRAS、MUC-1、MUC-2、MUC-4、MUC-5AC、MUC-7、PGE2-R、PTGER2、PTGES2、PTGS1和TP63。在另一个实施方案中，所述miRNA选自hsa-miR-101、hsa-miR-106b、hsa-miR-10a、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-155、hsa-miR-17-3p、hsa-miR-18a、hsa-miR-21、hsa-miR-217、hsa-miR-24、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-92a和hsa-miR-99b。在另一个实施方案中，所述mRNA或生物标志物miRNA是选自hsa-miR-21、hsa-miR-342-3p、IL1B、KRAS、MUC-4和PTGES2的三种生物标志物。在一个特定的实施方案中，所述生物标志物mRNA是IL1B、MUC4和PTGES2。在另一实施方案中，所述方法包括测量一种或多种生物标志物蛋白质的表达，所述生物标志物蛋白质例如ERRB2、GAPDH、GNAS、IL1B、KRAS、MUC-1、MUC-2、MUC-4、MUC-5AC、MUC-7、PGE2-R和PTGER2。另外，所述方法可以包括将一种或多种生物标志物miRNA和mRNA相对于参考mRNA的相对表达水平归一化的步骤，所述参考mRNA例如RPLP0。还提供了用于区分高风险和低风险导管内乳头状黏液肿瘤和囊肿异型增生水平的试剂盒，所述试剂盒包括用于扩增胰腺囊肿液样品中的一种或多种生物标志物mRNA或者一种或多种生物标志物miRNA的引物集。
附图说明
图1显示了具有交叉验证的Lasso惩罚逻辑回归，其以最佳准确性鉴定三基因囊肿液签名，以预测IPMN中胰腺恶性肿瘤的风险。在该模型中，通过AUC测算，低风险(低级别和中级别异型增生)与高风险(高级别异型增生和浸润性癌症)囊肿的预测准确度为86％；y＝0.36+(-0.06IL1B)+(-0.17MUC4)+(-0.50PTGES2)；AUC＝0.86，p值＝0.002。
具体实施方式
现已开发出一种胰腺囊肿液的测定法，作为一种诊断工具来鉴定具有恶性前期胰腺囊肿且处于进展为恶性肿瘤的高风险的患者。本测定法将差异表达的mRNA和miRNA以及任选地蛋白质纳入到一种快速且简单的测定法中，该测定法可以对经病理证实为低风险和高风险(高级别异型增生)IPMN的患者的囊肿液进行以确定胰腺癌的风险。本发明的测定法可准确地分辨高风险囊肿与低风险囊肿，准确度为86％，从而辅助临床医生确定何时应通过手术来切除病变。
因此，本发明是一种区分高风险(浸润性和高级别异型增生)和低风险(低级别和中级别异型增生)导管内乳头状黏液肿瘤的方法，其通过：确定胰腺囊肿液样品中的一种或多种生物标志物mRNA和一种或多种生物标志物miRNA的表达水平；将所述一种或多种生物标志物mRNA和一种或多种生物标志物miRNA的表达水平与浆液性囊肿液参考样品中的所述一种或多种生物标志物的表达水平进行比较；以及根据所述生物标志物与参考相比的表达水平将所述样品分类为高风险或低风险导管内乳头状黏液肿瘤。
“导管内乳头状黏液肿瘤”或“IPMN”是指在胰管内(导管内)生长的一类肿瘤(赘瘤)，其特征在于由肿瘤细胞产生稠液(黏液性)。导管内乳头状黏液肿瘤很重要，因为如果不对其进行治疗，则其中一些会发展成浸润性癌症(从良性肿瘤转化为恶性肿瘤)。IPMN的组织学级别是基于病变中存在的异型增生的最高水平。这可以通过在EUS-FNA或核心活检期间从囊肿液或壁中获得的细胞学样品来确定。细胞学非典型性的标准包括以下中的至少一项：核质比增加，核大小增加，核拥挤或染色过深。最终，这通过对永久制备的外科胰腺标本进行病理分析来确定。组织学级别按以下方式定义：腺瘤(黏液上皮衬着的胰管扩张，低级别异型增生的标准<1；也称为导管扩张)；中级别(以下标准中的2个以上：上皮簇绒，核假性分层，核非典型性和有丝分裂形态；也称为边界线)；高级别异型增生(通常与高级别核非典型性相关的筛状或实体生长；也称为非浸润性导管内癌或原位癌)；以及浸润性(导管基底膜破裂和增生细胞向胰腺组织的扩张，伴有或不伴有淋巴管浸润)。
关于胰腺病变包括胰腺囊肿的鉴定、分类和表征的其它信息，如当前在外科领域中的实践，可见于专著如John L.Cameron编辑的Current Surgical Therapy(最新外科疗法),(第9版,1397页,Philadelphia,PA,Mosby/Elsevier,2008)，以及本领域已知的类似文本、综述、手册和论文。本发明方法中使用的样品可通过内窥镜超声引导下的细针穿刺液抽吸、十二指肠液收集、胰管抽吸或手术期间直接收集囊肿液获得。
出于本发明的目的，“高风险IPMN”是指浸润性和高级别异型增生IPMN，而“低风险IPMN”是指低级别和中级别异型增生。理想地，本发明的方法将高风险的IPMN与低风险的IPMN区分开来，以鉴定处于发展为恶性肿瘤的高风险的患者。
生物标志物是一种有机生物分子，其在胰腺液样品中的存在已证实可将样品分类为发展为恶性肿瘤的高风险或低风险IPMN。在一个优选的实施方案中，生物标志物在取自一种表型状态(例如，具有高风险IPMN)的受试者与另一种表型状态(例如，具有低风险IPMN)的受试者的样品中差异表达。当组合评定时，本发明的生物标志物提供用于确定受试者是否属于一种表型状态或另一种表型状态。因此，它们可用作疾病(诊断)、药物的治疗效果(治疗诊断技术)、药物毒性以及为受试者选择合适的治疗(例如手术干预)的标志物。
mRNA生物标志物
如本领域常规的，mRNA或信使RNA是编码蛋白质的氨基酸序列的RNA的亚型。本发明的方法包括在来自患者的样品中确定或测量一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或更多种生物标志物mRNA的表达水平，所述生物标志物mRNA选自ERBB2、GAPDH、GNAS、IL1B、KRAS、MUC-1、MUC-2、MUC-4、MUC-5AC、MUC-7、PGE2-R、PTGER2、PTGES2、PTGS1和/或TP63。这些mRNA以表1中所示的GENBANK登记号在本领域中是已知的。
表1
在一些实施方案中，如果mRNA水平相比于参考或对照水平高或低至少20％、30％、40％、50％、60％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％(或其中衍生的任何范围)，则其与对照或参考水平相比增加或减少。在确定是否存在增加或减少时，这可以包括或不包括使用标准化或归一化的表达水平。
miRNA生物标志物
微RNA(miRNA)是长度为约21-23个核苷酸的非编码RNA分子，其可通过干扰靶基因的转录或通过抑制翻译来调节靶基因表达。本发明的方法还包括在来自患者的样品中确定或测量一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或更多种生物标志物miRNA的表达水平，所述生物标志物miRNA选自hsa-miR-101、hsa-miR-106b、hsa-miR-10a、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-155、hsa-miR-17-3p、hsa-miR-18a、hsa-miR-21、hsa-miR-217、hsa-miR-24、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-92a和/或hsa-miR-99b。这些miRNA以表2中所示的登记号在本领域中是已知的。
表2
hsa-miR 登记号
101 MIMAT0000098
106b MIMAT0000680
10a MIMAT0000253
142-3p MIMAT0000434
155 MIMAT0000646
17-3p MIMAT0000071
18a MIMAT0000072
21 MIMAT0000076
217 MIMAT0000274
24 MIMAT0000079
30a-3p MIMAT0000088
342-3p MIMAT0000753
532-3p MIMAT0004780
92a MIMAT0004507
99b MIMAT0000689
在一些实施方案中，如果miRNA水平相比于参考或对照水平高或低至少20％、30％、40％、50％、60％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％(或其中衍生的任何范围)，则其与对照或参考水平相比增加或减少。在确定是否存在增加或减少时，这可以包括或不包括使用标准化或归一化的表达水平。
蛋白质生物标志物
在一些实施方案中，本发明的方法还包括在来自患者的样品中确定或测量一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或更多种生物标志物蛋白质的表达水平，所述生物标志物蛋白质选自ERRB2、GAPDH、GNAS、IL1B、KRAS、MUC-1、MUC-2、MUC-4、MUC-5AC、MUC-7、PGE2-R和/或PTGER2。这些蛋白质以表3中所示的GENBANK登记号在本领域中是已知的。
表3
使用本文所述的生物标志物，本发明提供了一种通过测量胰腺囊肿液样品中的一种或多种生物标志物mRNA和/或一种或多种生物标志物miRNA以及任选地一种或多种生物标志物蛋白质的表达水平来区分、诊断和治疗高风险IPMN的方法。理想地，测量胰腺囊肿液样品中生物标志物mRNA和miRNA的表达水平，从而提供一种包括测量核酸表达(即基于核酸)的测定法。如在本发明的上下文中所用，胰腺囊肿液的样品包括细胞、核酸、蛋白质和/或细胞的膜提取物，并且可以根据标准临床实践从受试者(例如，人类、家畜或伴侣动物)获得。
通过测量这些核酸分子的水平或量来确定样品中生物标志物mRNA和miRNA的水平或量。可以使用任何可用的方法检测核酸生物标志物，包括但不限于RNA印迹分析(northern blot analysis)、核酸酶保护测定法(NPA)、基因表达系列分析(SAGE)、RNASeq、原位杂交、逆转录酶PCR(RT-PCR)、PCR、定量RT-PCR(qRT-PCR)、微阵列、平铺阵列等。由于易于使用，通常希望使用基于PCR的方法来检测核酸分子。通常，这涉及使样品与两种或更多种与生物标志物的核酸特异性杂交的PCR引物接触，使样品经历PCR扩增的多个步骤并检测扩增序列的量(例如，使用凝胶分析、印迹方法、荧光标记探针和/或掺入插入双链DNA的荧光染料如SYBR Green)。或者，与至少一部分生物标志物核酸相互作用的寡核苷酸、适体、cDNA、抗体或其片段被配置在芯片或晶片上的阵列中，并用于检测生物标志物核酸。简言之，这些技术涉及快速且准确地分析大量基因的方法。通过用寡核苷酸标记基因或使用固定的探针阵列，人们可以采用芯片技术将靶分子分离为高密度阵列，并且基于杂交筛选这些分子(参见例如Pease等人,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊)91(11):5022-6；Fodor等人,(1991)Science(科学)251(4995):767-73)。
用于该实施方案的引物(例如，用于基于PCR的方法)、探针(例如，用于基于杂交的方法)或寡核苷酸(例如，用于基于微阵列的方法)可以从生物标志物核酸(参见表1和表2)的任何区域中选择并且通常特异性地退火和扩增生物标志物核酸分子的至少一部分而不退火或扩增其它编码紧密相关分子的核酸分子。可以通过分析由本文公开的序列提供的序列来选择适用于扩增生物标志物核酸分子的引物。
通常，合适的引物长度为12至30bp，并且产生长度为50、100、200、400、600、1000bp或更长的PCR扩增子。根据该方法，仅当第一核苷酸序列和第二核苷酸序列出现在同一生物标志物核酸分子内时，才获得几何扩增的产物。非简并PCR的基本原理是本领域技术人员已知的，参见例如McPherson等人,PCR,A Practical Approach(实用方法),IRL Press,Oxford,Eng.(1991)。
表4中提供了用于评定mRNA表达的示例性寡核苷酸，正向和反向引物或探针。然而，其它合适的寡核苷酸/引物/探针在本领域中是众所周知的，并且可从商业来源例如Sino Biological、Bio-Rad、OriGene、R&D Systems等获得。
表4
表5中提供了用于评定miRNA表达的示例性寡核苷酸，正向和反向引物或探针。然而，其它合适的寡核苷酸/引物/探针在本领域中是众所周知的，并且可从商业来源例如Sino Biological、Bio-Rad、OriGene、R&D Systems等获得。
表5
在使用结合剂的测定法中测量生物标志物蛋白质的表达，所述结合剂特异性结合生物标志物蛋白质而不结合其它蛋白质。在该实施方案中，使样品与结合生物标志物蛋白质的结合剂(例如抗体)接触，并使用标准测定法(例如免疫测定法)检测所得的生物标志物-结合剂复合物。当结合剂是例如肽适体时，可以通过例如与适体融合的可检测的标志物蛋白质(例如β-半乳糖苷酶、GFP或荧光素酶)直接检测生物标志物-结合剂复合物。随后，将生物标志物-结合剂复合物的水平或量与样品中生物标志物蛋白质的表达水平相关联。
根据本发明使用的结合剂包括抗体或抗体片段，以及肽适体。在本发明的特定实施方案中，结合剂特异性识别表3中列出的生物标志物蛋白质。当结合剂是抗体时，所述抗体可以购自商业来源。或者，可以针对生物标志物蛋白质的抗原片段产生特异性结合或识别生物标志物蛋白质的抗体。本领域技术人员可以使用任何领域公认的用于鉴定此类抗原序列的计算机算法容易地鉴定出合适的抗原区域(例如，Jamison和Wolf(1988)Bioinformatics(生物信息学)4:181-186；Carmenes等人,(1989)Biochem Biophys ResCommun.(生物化学与生物物理学研究通讯)159(2):687-93)。
为了产生抗体，可以通过注射生物标志物蛋白质或其具有抗原性或免疫原性的片段或寡肽来免疫各种宿主，包括山羊、兔、大鼠、小鼠、人类和其它动物。根据宿主物种，可以使用各种佐剂来增强免疫应答。此类佐剂包括但不限于弗氏佐剂，矿物凝胶如氢氧化铝，和表面活性物质如溶血卵磷脂，普朗尼克(pluronic)多元醇，聚阴离子，肽和油乳剂。在用于人类的佐剂中，BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)是特别合适的。
可以通过用生物标志物蛋白质的寡肽、肽或片段使动物免疫来产生针对生物标志物蛋白质的抗体。通常，这样的寡肽、肽或片段具有由至少五个氨基酸残基并且更期望地至少10个氨基酸残基组成的氨基酸序列。生物标志物蛋白质的片段可以通过例如胰蛋白酶消化和从制备型SDS-PAGE凝胶中提取或通过重组片段表达和纯化来产生。此外，可以将生物标志物抗原的氨基酸短片段与另一种蛋白质例如匙孔血蓝蛋白和针对嵌合分子产生的抗体的氨基酸融合。
可以使用通过培养中的连续细胞系提供抗体分子产生的任何技术来制备针对生物标志物蛋白质的单克隆抗体。这些技术包括但不限于杂交瘤技术，人类B细胞杂交瘤技术和EBV杂交瘤技术(Kohler等人,(1975)Nature(自然)256:495-497；Kozbor等人,(1985)J.Immunol.Methods(免疫方法杂志)81:31-42；Cote等人,(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.(美国国家科学院院刊)80:2026-2030；Cole等人,(1984)Mol.CellBiol.(分子细胞生物学)62:109-120)。
此外，可以通过筛选抗体或抗体样分子的文库来分离针对生物标志物蛋白质的抗体，所述分子例如是叉头相关(FHA)结构域，单克隆抗体，微型抗体，亲和体(AFFIBODY)分子，affilin，anticalin，DARPin(即设计的锚蛋白重复蛋白)和nanofitin(也称为affitin)。用于筛选抗体或抗体样分子的文库平台包括但不限于噬菌体展示(参见例如Benhar和Reiter(2002)Curr.Protoc.Immunol.(当前免疫学方案)48:VI:10.19B:10.19B.1-10.19B.31)，酵母展示(参见例如Miller等人,(2005)Prot.Expr.Purif.(蛋白质表达及纯化)42:255-67)和核糖体展示(参见例如Douthwaite等人,(2006)Prot.Eng.Des.Sel.(蛋白质工程设计与选择)19:85-90)。
另外，可以使用为生产人源化和嵌合抗体而开发的技术，将小鼠抗体基因剪接至人类抗体基因以获得具有适当抗原特异性和生物学活性的分子(Morrison等人,(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.(美国国家科学院院刊)81,6851-6855；Neuberger等人,(1984)Nature(自然)312:604-608；Takeda等人,(1985)Nature(自然)314:452-454)。或者，可以使用本领域已知的方法使关于单链抗体生产所述的技术适用于生产特异性的单链抗体。具有相关特异性但具有不同独特型组成的抗体可以通过随机组合免疫球蛋白文库的链改组产生(Burton(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.(美国国家科学院院刊)88:11120-11123)。
还可以通过诱导淋巴细胞群体的体内产生或通过筛选免疫球蛋白文库或高特异性结合试剂的小组来产生抗体，这是本领域众所周知的(Orlandi等人,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.(美国国家科学院院刊)86:3833-3837；Winter等人,(1991)Nature(自然)349:293-299)。
在本文的方法中使用的抗体包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合、单链、Fab片段、双特异性scFv片段、Fd片段和由Fab表达文库产生的片段。例如，片段包括但不限于可以通过胃蛋白酶消化抗体分子而产生的F(ab')2片段和可以通过还原F(ab')2片段的二硫键而产生的Fab片段。或者，可以构建Fab表达文库以允许快速和容易地鉴定具有所需特异性的单克隆Fab片段(Huse等人,(1989)Science(科学)254:1275-1281)。
也考虑双功能抗体(diabody)。双功能抗体是指通过分离结合抗体的结合结构域(重链和轻链两者)并提供连接或可操作地连接同一多肽链上的重链和轻链的连接部分从而保持结合功能而制备的工程化抗体构建体(参见Holliger等人,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊)90:6444；Poljak(1994)Structure(结构)2:1121-1123)。实质上，这形成了完全缩减的抗体，仅具有结合抗原所必需的可变结构域。通过使用太短以至于不允许同一条链上两个结构域之间配对的接头，所述结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。这些二聚体抗体片段或双功能抗体是二价和双特异性的。应该清楚的是，可以使用任何产生双功能抗体的方法，如例如通过引用并入本文的Holliger等人,(1993),同上；Poljak(1994),同上；Zhu等人,(1996)Biotechnology(生物技术)14:192-196；和美国专利号6,492,123所述。
各种免疫测定法可用于测量结合剂与生物标志物蛋白质的结合，从而确定生物标志物蛋白质的表达。使用多克隆或单克隆抗体或其片段进行竞争性结合(例如ELISA)、乳胶凝集测定法、夹心免疫测定法、凝胶扩散反应、原位免疫测定法、免疫放射测定法、蛋白质印迹分析、狭缝印迹测定法和动力学(例如BIACORETM分析)的多种方案在本领域中是众所周知的。此类免疫测定法通常涉及特定抗体与其同源抗原之间复合物形成的测量。利用对两个非干扰表位有反应性的单克隆抗体的基于双位点的单克隆免疫测定法是合适的，但是也可以使用竞争性结合测定法。对于一般免疫测定法的综述，还参见Methods inCellBiology:Antibodies in Cell Biology(细胞生物学方法：细胞生物学中的抗体)(1993)Asai编,第37卷；Basic and Clinical Immunology(基础和临床免疫学)(1991)Stites和Teff编,第7版。
在一个实施方案中，蛋白质标志物分析涉及使用特异性结合标志物蛋白质的第一抗体。在某些实施方案中，通过检测第一抗体上的标记来检测抗体结合。在另一个实施方案中，通过检测第二抗体或试剂与第一抗体的结合来检测第一抗体。在另一个实施方案中，第二抗体被标记。
在一些实施方案中，使用自动化检测测定法。免疫测定的自动化方法是本领域众所周知的，并且可以在本发明中使用。在一些实施方案中，结果的分析和呈现也是自动化的。例如，在一些实施方案中，使用基于与癌症标志物对应的一系列蛋白质的存在或不存在产生预后的软件。
可以合理设计或在适体文库(例如，由法国里昂的Aptanomics SA提供)中筛选特异性结合生物标志物蛋白质的肽适体。通常，肽适体是合成识别分子，其设计是基于抗体的结构。肽适体由两端都连接至蛋白质骨架的可变肽环组成。这种双重结构限制极大地将肽适体的结合亲和力提高到与抗体相当的水平(纳摩尔范围)。同样，还可以在文库筛选中鉴定与编码生物标志物蛋白质的核酸序列结合的适体。
使用本发明的方法，测定来自患有胰腺癌的受试者的样品中的mRNA和miRNA生物标志物的表达水平。为了最小化样品间差异的影响，通常使用内标或者一种或多种参考miRNA进行该方法。理想的内标在不同的组织中以恒定的水平表达，并且不受实验处理的影响。可用于归一化表达模式的RNA包括例如参考基因β-肌动蛋白、GUSB、RPLP0和TFRC的mRNA。关于其它合适的参考基因的列表，参见例如Eisenberg和Levanon(2003)Trends inGenetics(遗传学趋势)19:362。在某些实施方案中，通过定量方法测定患者样品中生物标志物mRNA和miRNA的水平，然后相对于一种或多种参考mRNA的mRNA表达水平“归一化”所述水平，从而生成生物标志物的归一化表达水平。在某些实施方案中，参考mRNA是RPLP0(核糖体蛋白侧茎亚基P0；GENBANK登记号NM_001002)。
举例说明，通过RT-PCR测量的mRNA或miRNA的水平被称为循环阈值(Ct)值。Ct越低，样品中存在的RNA量越大。例如通过首先确定样品中指定参考mRNA的Ct中的平均表达值(Ct参考)来归一化样品中的mRNA或miRNA的表达值。然后将生物标志物的归一化表达值(Ct生物标志物)计算为Ct生物标志物＝(Ct)(Ct参考)。任选地，可以调节所有生物标志物的归一化表达值，例如，使得所有经过调节的归一化Ct的值都＞0。在某些实施方案中，对生物标志物的表达水平进行处理以获得z转化、log2转化和换算的相对定量(RQ)值(X平均值/标准偏差)。参见例如Cheadle等人,(2003)J.Mol.Diagn.(分子诊断学杂志)5:73-81。另外，可以基于生物标志物预测高风险或低风险IPMN的能力来加权每个生物标志物的表达。
确定归一化的生物标志物的表达水平后，将其与浆液性囊肿液对照样品中相同生物标志物的表达水平进行比较。基于这些比较，当表1和表2的一种或多种mRNA和miRNA的表达与对照样品中相同生物标志物的表达水平相比增加或减少(例如，至少2倍或更高)时，样品被分类为高风险IPMN。此外，当表1和表2中的一种或多种mRNA和miRNA的表达与对照样品中相同生物标志物的表达水平相当类似时，将该样品分类为低风险IPMN。在一些实施方案中，本发明的方法还将包括阳性和/或阴性对照以评定所述方法的准确性。
或者，在获得归一化的生物标志物表达水平后，将它们与预定的表达截点(cutpoint)进行比较。在某些实施方案中，截点定义了(a)高风险IPMN的归一化表达水平与可疑的表达水平(即“较高”截点)和(b)低风险IPMN的归一化表达水平与可疑的表达水平(即“较低”截点)之间的数值边界。如果归一化的生物标志物表达水平不是可疑的，则可以明确地将归一化的生物标志物表达水平指定为高风险IPMN或低风险IPMN表达水平。因此，从中获得归一化的生物标志物表达水平的样品如果不是可疑的，则可以被指定为高风险IPMN或低风险IPMN样品。
如上所述，对截点进行了统计验证，因为它们已在(通过其它“已确立”方法)已知为高风险IPMN或低风险IPMN的现有样品上进行了“训练”。或者，用于测定法的确定的截点可以基于使用本领域已知的各种统计检验的qRT-PCR或其它检验测定法。此类统计检验可包括但不限于：Pearson相关性，T检验，Mann-Whitney U检验，二项式检验，Wilcoxon符号秩检验，方差分析以及许多其它检验。
一旦使用训练样品确定截点，重要的就是使用与训练样品相同的测定参数(例如，相同的引物、扩增条件、归一化对照、数据处理方法等)来测定测试样品，以便使用测试样品获得的结果可以直接与截点进行比较，以确定测试样品的状态。
本发明的方法可用于预测从恶性前期囊肿到恶性肿瘤的转变，从而为临床医生提供治疗IPMN患者的必要信息。例如，具有低风险病变的患者可能不需要手术，因此可以免除胰腺切除术的身体、情绪和经济费用。相比之下，临床医生可以建议具有高风险病变的患者在发生胰腺癌之前进行手术。因此，本发明还提供了预防性或治疗性治疗被鉴定为具有胰腺癌高风险IPMN的受试者的额外步骤，以预防、延迟、改善、减慢或逆转胰腺癌的发展或进展。预防或治疗涉及施用药学有效量的胰腺癌治疗剂或者施用一种或多种旨在治疗和/或预防胰腺癌的其它疗法(例如，放射疗法、化学疗法、免疫疗法、另一种类型的抗癌药、手术，或前述中的两种或更多种的组合)。如本文所用，术语“预防”涵盖避免癌症的发展以及延迟癌症的发作。在某些实施方案中，将旨在治疗胰腺癌的两种或更多种疗法的组合施用于受试者。在某些实施方案中，用激酶抑制剂治疗所述受试者。
另外，本发明的方法可以包括在施用药物或疗法后的各个时间确定生物标志物表达。在第一时间(例如，在给予药物或治疗之前)从受试者的生物样品中检测到的生物标志物水平高于在第二时间(例如，在给予药物或治疗之后)从同一受试者的可比较生物样品中检测到的生物标志物水平，指示受试者中的胰腺癌正在消退。
结合本发明的诊断和治疗方法，还提供了一种用于测量本文公开的一种或多种生物标志物的表达的试剂盒。本发明的试剂盒包括容器，该容器包含合适的寡核苷酸或用于杂交的探针或用于扩增编码表1的一种或多种生物标志物mRNA和表2的一种或多种生物标志物miRNA的核酸的引物集。在一个实施方案中，所述试剂盒包括表4和表5中提供的寡核苷酸或引物。在一些实施方案中，所述试剂盒还可包括与表3中列出的生物标志物蛋白质结合的一种或多种结合剂。理想地，至少包括探针或引物，用于测量以下标志物中的至少三种的表达：IL1B、KRAS、PTGER2、PTGES2、hsa-miR-101、hsa-miR-18a、hsa-miR-217和hsa-miR-342-3p。在其它实施方案中，所述试剂盒可包括用于扩增参考mRNA的引物组。在某些实施方案中，所述参考mRNA是RPLP0。用于扩增RPLP0mRNA的示例性引物是：正向引物5'-TGGTCATCCAGCAGGTGTTCGA-3'(SEQ ID NO:58)和反向引物5'-ACAGACACTGGCAACATTGCGG-3'(SEQ ID NO:59)。
所述试剂盒还可包含对于实施本发明必需或方便的其它溶液和对照。容器可以由玻璃、塑料或箔制成，并且可以是小瓶、瓶、小袋、管、袋子等。所述试剂盒还可以包含书面信息，例如实施本发明的程序或分析信息，例如第一容器装置中包含的试剂量以及用于分析和显示结果的软件。所述容器可以与书面信息一起处于另一个容器如盒子或袋子中。
在一个实施方案中，所述试剂盒包括固体支撑物，例如芯片，微量滴定板或在其上附着有捕获试剂(例如抗体或寡核苷酸)的珠粒或树脂，其中所述捕获试剂结合本发明的生物标志物或编码其的核酸。所述试剂盒还可以包括洗涤液或用于制备洗涤液的说明书，其中捕获试剂和洗涤液的组合允许在固体支撑物上捕获生物标志物或生物标志物核酸以用于后续检测。所述试剂盒可以包括一种以上类型的吸附剂，其各自存在于不同的固体支撑物上。
在一些实施方案中，本发明提供了一种试剂盒，其用于进行基于条形码(例如，基于NanoStringTM)的测定法，以定量属于具有胰腺癌的个体的样品中的差异表达分子的图谱的mRNA和miRNA的表达。基于NanoStringTM的测定法描述于US 8,415,102、US 8,519,115和US7,919,237中。
使用本发明的试剂盒和方法，可以对相对基因表达值进行归一化和转化，然后在预测模型中进行评估，以将患者的胰腺IPMN囊肿表征为具有高风险恶性肿瘤(高级别异型增生或浸润性癌症)或低风险恶性肿瘤(低级别或中级别的异型增生)。所述模型可以基于其中将每个基因的表达基于其预测结果的能力进行加权的算法。为了减少或最小化算法中的变量，可以删除对结果无贡献的基因，从而降低模型的复杂性和偏差。
作为示例，预测算法中的生物标志物的数量可以包括六个生物标志物，例如，miR21、miR342、IL1B、KRAS、MUC4和PTGES2。使用公式：y＝0.44+(-0.11miR217)+(0.03miR342)+(-0.08IL1B)+(0.23KRAS)+(-0.25MUC4)+(-0.85PTGES2)，模型的AUC为0.82(p＝0.003)以区分低风险囊肿与高风险囊肿。
作为在Gnas和Kras两者中都存在突变的另一个示例，预测算法中的生物标志物的数量可以包括八个生物标志物，例如，miR342、IL1B、KRAS、MUC4、MUC7、PTGER2、PTGES2和TP63。使用公式：y＝0.49+(0.17miR342)+(-0.17IL1B)+(0.18KRAS)+(-0.27MUC4)+(0.02MUC7)+(0.07PTGER2)+(-0.95PTGES2)+(0.02TP63)，模型的AUC为0.82(p＝0.003)。
作为另一示例，在Gnas或KRAS中存在突变的情况下，预测算法中的生物标志物的数量可以包括三个生物标志物，IL1B、MUC4和PTGES2。使用公式：y＝0.37+(-0.06IL1B)+(-0.01MUC4)+(-0.50PTGES2)，模型的AUC为0.86(p＝0.002)，以预测IPMN将为高风险。
作为又一示例，在Gnas或Kras中存在一个以上突变的情况下，预测算法中的生物标志物的数量可以包括九个生物标志物，miR142、miR342、IL1B、KRAS、MUC4、MUC7、PTGER、TP63和PTGES2。使用公式：y＝0.51+(0.01miR142)+(0.21miR342)+(-0.18IL1B)+(0.20KRAS)+(-0.37MUC4)+(0.09MUC7)+(0.16PTGER2)+(-1.09PTGES2)+(0.07TP63)，模型的AUC为AUC＝0.86(p＝0.002)，预测IPMN将为高风险。
在一个特定的实施方案中，预测算法中的生物标志物的数量仅包括三个基因，即IL1B、MUC4和PTGES2。使用公式：y＝0.37+(-0.06IL1B)+(-0.01MUC4)+(-0.50PTGES2)，模型的AUC为0.86(p＝0.002)，当y大于0.5时，预测IPMN将为高风险。
因此，在某些实施方案中，用于本发明的方法和试剂盒中的生物标志物包括hsa-miR-21、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-342-3p、IL1B、KRAS、MUC4、MUC7、PTGER、TP63和PTGES2。在其它实施方案中，本发明的方法和试剂盒中使用的生物标志物包括IL1B、MUC4和PTGES2。在其它实施方案中，本发明的方法和试剂盒中使用的生物标志物由IL1B、MUC4和PTGES2组成。在其它实施方案中，本发明的方法和试剂盒中使用的生物标志物至少包含IL1B、MUC4和PTGES2，并且可以包括表1-3中的一种或多种标志物。
本发明还涉及一种筛选用于治疗胰腺癌的化合物的方法，其通过：提供胰腺IPMN囊肿液样品和一种或多种测试化合物；使所述胰腺IPMN囊肿液样品与所述测试化合物接触；以及相对于不存在测试化合物的情况，在存在测试化合物的情况下，检测胰腺细胞样品中本文公开的一种或多种生物标志物miRNA、mRNA或蛋白质的表达的变化。在一些实施方案中，细胞是在体外或体内。在其它实施方案中，候选化合物是针对本发明的生物标志物miRNA或mRNA的反义剂(例如，反义或RNAi分子)。在其它实施方案中，候选化合物是与本发明的生物标志物蛋白质特异性结合的抗体。
具体来说，本发明提供了用于鉴定调节剂即候选或测试化合物或试剂(例如蛋白质、肽、拟肽、类肽、小分子或其它药物)的筛选方法，所述调节剂与本发明的生物标志物结合，对例如生物标志物表达或生物标志物活性具有抑制(或刺激)作用，或对例如生物标志物底物的表达或活性具有刺激或抑制作用。
如此鉴定的化合物可用于在治疗方案中直接或间接调节靶基因产物(例如，生物标志物基因)的活性，以阐明靶基因产物的生物学功能，或鉴定破坏正常靶基因相互作用的化合物。抑制生物标志物的活性或表达的化合物可用于治疗增生性病症，例如癌症。
可以使用本领域已知的组合文库方法中的多种方法中的任何一种来获得本发明的测试化合物，所述方法包括生物文库；类肽文库(具有肽功能但具有新型非肽骨架的分子的文库，它们对酶促降解具有抵抗力，但仍保留生物活性)；空间可寻址的平行固相或溶液相文库；需要解卷积的合成文库方法；“单珠粒单化合物”文库方法；以及使用亲和色谱法选择的合成文库方法。生物文库和类肽文库方法优选用于肽文库，而其它四种方法适用于肽、非肽低聚物或者化合物的小分子文库。
在一个实施方案中，一种测定法是基于细胞的测定法，其中将表达生物标志物蛋白质或其生物活性部分的细胞与测试化合物接触，并且确定所述测试化合物调节生物标志物活性的能力。确定测试化合物调节生物标志物活性的能力可以通过监测例如酶活性的变化来实现。所述细胞例如可以是哺乳动物来源。
在又一个实施方案中，提供了一种无细胞测定法，其中使生物标志物蛋白质或其生物活性部分与测试化合物接触，以及评估所述测试化合物与生物标志物蛋白质或其生物活性部分结合的能力。本发明的测定法中使用的生物标志物蛋白质的优选生物活性部分包括参与与底物或其它蛋白质的相互作用的片段，例如具有高表面概率评分的片段。
无细胞测定法包括在足以使两种组分相互作用并结合的条件和时间下，制备靶基因蛋白和测试化合物的反应混合物，从而形成可以被去除和/或检测的复合物。还可以例如使用荧光能量转移(FRET)来检测两个分子之间的相互作用。或者，可以使用实时生物分子相互作用分析(BIA)来实现生物标志物蛋白质与测试化合物结合的能力。
也可以鉴定生物标志物表达的调节剂。例如，使细胞或无细胞混合物与候选化合物接触，并且相对于在不存在候选化合物的情况下生物标志物mRNA或蛋白质的表达水平评估生物标志物mRNA或蛋白质的表达。当存在候选化合物的情况下生物标志物mRNA或蛋白质的表达大于不存在候选化合物的情况下时，所述候选化合物被鉴定为生物标志物mRNA或蛋白质表达的刺激剂。或者，当存在候选化合物的情况下生物标志物mRNA或蛋白质的表达小于(即统计学上显著小于)不存在候选化合物的情况下时，所述候选化合物被鉴定为生物标志物mRNA或蛋白质表达的抑制剂。可以通过本文所述的用于检测生物标志物mRNA或蛋白质的方法来确定生物标志物mRNA或蛋白质表达的水平。
提供以下非限制性实施例来进一步说明本发明。
实施例1：准确预测具有高恶性可能性的IPMN以供手术切除的单平台囊肿液测定法
生物样品。国际IPMN囊肿液协作组织由在欧洲和美国具有IPMN专业知识的高容量胰腺手术中心的团体组成，其诞生于维罗纳共识会议(Verona Consensus Conference)(Adsay等人,(2016)Ann.Surg.(外科学年鉴)263(1):162-77；Maker等人,(2015)J.Am.Coll.Surg.(美国外科医师学会杂志)220(2):243-53)。IPMN囊肿液样品是在机构审查委员会批准后的前瞻性维护的机构数据库/存储库中获取的。该研究仅包括在最终病理学上已确诊IPMN并经专家胰腺病理学家确定具有特定级别的异型增生的样品。在囊肿中发现的最高级别的异型增生决定了其表征为低级别、中级别、高级别或浸润性癌症。分析通过特定级别单独评估样品，例如低、中、高、浸润性；以及出于风险分层目的，通过“低风险”(低级别和中级别异型增生)或“高风险”(高级别异型增生和浸润性癌症)病理，如在本领域中的多个其它生物标志物研究中所使用(Maker等人,(2011)Ann.Surg.Oncol.(外科肿瘤学年鉴)18(1):199-206；Maker等人,(2011)Clin.Cancer Res.(临床癌症研究)17(6):1502-8)。
mRNA和miRNA的定量分析。使用在用于自动化核酸提取的Maxwell16仪器上实施的Quick-RNATMMicroPrep R1050/R1051(加利福尼亚州尔湾)，从100-400μl IPMN液中提取总RNA。根据制造商的说明，在仪器上进行DNA酶处理。随后，使用定量PCR将总RNA分为两条路径进行mRNA和miRNA分析。
对于mRNA的分析，根据制造商的说明，使用随机引物和高容量cDNA逆转录试剂盒(Thermo Fisher Scientific)对总RNA进行逆转录。利用PreAmp主混合物试剂盒(Thermo Fisher Scientific)，使用预扩增步骤制备cDNA用于定量PCR(qPCR)。根据制造商的说明，将基因表达测定物合并以用作引物，用于预扩增步骤。测定物包括IL1B(Hs01555410_m1)、MUC-1(Hs00159357_m1)、MUC-2(Hs00894025_m1)、MUC-4(Hs00366414_m1)、MUC-5ac(Hs01365616_m1)、MUC-7(Hs00379529_m1)、PTGER2(Hs04183523_m1)、PTGS1(Hs00377726_m1)、PGE2-R(Hs00168755_m1)、KRAS(Hs00364282_m1)、GNAS(Hs00255603_m1)、GADPH(Hs99999905_m1)、RPLP0(Hs99999902_m1)、TP63(Hs00978341_m1)、ERBB2(Hs01001580_m1)、PTGES2(Hs00228159_m1)。然后将预先扩增的cDNA用作qPCR反应的模板，并进行单独的测定。使用ViiA7实时PCR仪器(LifeTechnologies)在384孔板中使用Fast Advanced Mastermix(Thermo FisherScientific)进行反应。所有反应都一式三份地进行，并且体积为10μl。使用比较C(t)方法处理实时数据(Schmittgen和Livak(2008)Nature Protocols(自然-实验手册)3(6):1101-8)。基于整个数据集的性能，所选择的内源对照基因是RPLP0。
miRNA的分析以与mRNA类似的方式进行。使用微RNA逆转录试剂盒(Thermo Fisher Scientific)进行逆转录，其中用miRNA测定物代替随机引物。用于这项研究的测定物包括miR17-3p(hsa-miR-17-3p)、miR142-3p(hsa-miR-142-3p)、miR532-3p(hsa-miR-532-3p)、miR342-3p(hsa-miR-342-3p)、miR30a-3p(hsa-miR-30a-3p)、miR21(hsa-miR-21-5p)、miR155(hsa-miR-155-5p)、mir101(hsa-miR-101-3p)、mir10a(hsa-miR-10a-5p)、miR106b(hsa-miR-106b-5p)、miR18a(hsa-miR-18a-5p)、miR217(hsa-miR-217)、miR24(hsa-miR-24-3p)、miR92a(hsa-miR-92a-3p)、miR99b(hsa-miR-99b-5p)和基因RNU6B。使用单独的miRNA测定法，按照上文关于mRNA测定法所述进行miRNAqPCR。使用RPLP0基因作为内源对照，使用比较C(t)方法处理实时数据。
GNAS和KRAS突变位点的PCR扩增和Sanger测序。在Maxwell16仪器上使用Maxwell16组织DNA试剂盒(Promega，威斯康星州麦迪逊)在100-400μl IPMN液中提取基因组DNA。通过PCR，接着Sanger测序，对KRAS中的密码子12和13以及GNAS中的密码子201进行突变分析。每个50μl PCR反应物均含有1X PCR缓冲液与1.5mM MgCl2、0.5μlDNA聚合酶(Qiagen，马里兰州德国城)、0.2mM dNTP混合物(Sigma-Aldrich Corp.，密苏里州圣路易斯)、20pmol的正向和反向引物以及5μl DNA模板。引物序列如下：KRAS-F5'-TGGTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACCTTAT-3'(SEQ ID NO:60)、KRAS-R 5'-AAACAAGATTTACCTCTATTGTTGGATCATA-3'(SEQ ID NO:61)、GNAS-F 5'-TCTGAGCCCTCTTTCCAAACTAC-3'(SEQ ID NO:62)、GNAS-R 5'-GGACTGGGGTGAATGTCAAGAA-3'(SEQ ID NO:63)(Integrated DNA Technologies，爱荷华州科勒维尔)。KRAS PCR反应物还含有25pmol的LNA寡核苷酸以抑制野生型扩增(Exiqon，马萨诸塞州沃本)。在95℃下初始变性步骤15分钟后，如下进行40个PCR循环：95℃持续30秒，52℃持续30秒，68℃持续30秒，最后的延伸步骤在68℃持续10分钟。纯化扩增产物，并使用PCR引物和BigDye3.1终止子循环测序试剂盒在ABI3130XL遗传分析仪上进行双向测序。手动观察序列色谱图，以确定是否存在突变。对于KRAS密码子12和13，分析灵敏度为1％突变序列，而对于GNAS密码子201，分析灵敏度为15％突变序列。包括适当的阳性和污染对照。突变命名法根据标准指南。
统计分析。处理囊肿液基因表达水平以获得RQ值，将其进行z转化，log2转化和换算(X平均值/标准偏差)。Pearson相关系数用于去除截止值为0.7的高度相关变量。然后进行主坐标分析。运行模型，添加来自Kras和Gnas突变分析的测序数据，并评估为+kras突变、+gnas突变、+gnas/+kras突变，或者0、1或2个突变。突变分析作为独立变量被附加到具有22个标志物的数据矩阵上以供学习，并通过支持向量机(SVM)训练算法用于分类和回归分析。评定单独的标志物与异型增生水平的关联。R包glmnet与逻辑回归一起用于样品分类。进行批量效应校正。高度校正的标志物被去除。具有二进制分类和5倍交叉验证的Lasso惩罚逻辑回归利用AUC作为评估标准来创建最佳签名。
选择靶标和囊肿液。本研究涉及14个mRNA标志物、15个miRNA靶标以及GNAS密码子201和KRAS密码子12和13点突变分析。建立了一个多机构国际IPMN囊肿液协作组织，为该研究提供患者样品。对总共134个囊肿液样品进行评估以纳入。确认59个囊肿液样品中有足够的样品液体积具有特定的IPMN病理学和异型增生级别(低级别、中级别、高级别、浸润性)。95％的样品含有足够的基因组材料用于进一步分析。
主成分分析，批量效应校正，混杂因素的消除。主成分分析显示出最小的机构偏差/集群，其已经进行批量效应校正。由于高度校正的生物标志物将在机器学习算法中难以鉴定签名的各个特征，因此在每对标志物之间计算了Pearson相关矩阵。在每组高度相关的标志物(Pearson相关性>0.7)中，保留一个代表性标志物，以使用R包caret进行进一步分析。因此，从分析中去除了混杂标志物(即miR-106B、miR-155、miR-24、miR-532、miR-92A和GNAS)。
特定突变分析。对GNAS密码子201以及KRAS密码子12和13进行测序，以用于突变分析。从囊肿液中收集到具有足够DNA以进行可靠测序的49个样品中，有30个在GNAS或KRAS中含有点突变。对于GNAS，有7个样品具有p.R201H突变，6个样品具有p.R201C突变；而对于KRAS，有7个具有p.G12R突变，14个具有p.G12V突变，8个具有p.G12D突变，1个具有G12F突变，1个具有p.G12A突变并且1个具有p.G13D突变。3个样品各自具有两个KRAS密码子12点突变。9个样品同时含有GNAS密码子201和KRAS密码子12突变，其中1个还含有KRAS密码子13突变。
Lasso回归结果。删除高度相关的标志物后，采用机器学习算法进行特征选择，其鉴定与异型增生/胰腺恶性肿瘤风险水平显著相关的标志物。Lasso(最小绝对收缩和选择运算符)回归分析执行变量选择和正则化两者，其通过更改模型拟合过程以仅选择IPMN等级预测协变量的子集以用于最终模型，从而提高了回归模型的预测准确性和可解释性。在N例患者囊肿液中，其中每个均由以下组成：p个预测基因和异型增生水平作为单个结果；yi是第i个病例的异型增生分类并且xi＝(x1，x2，...，xp)T是第i个病例的基因表达(协变量向量)。这导致Lasso的目标得以解决
其中目的是鉴定出数量最少但最佳的标志物子集，以最小化高风险和低风险IPMN之间的分类误差(Lockhart等人,(2014)Ann.Statist.(统计年刊)42(2):413-68；Friedman等人,(2010)J.Statist.Soft.(统计软件杂志)33(1):1-22)。
在以曲线下面积(AUC)为目标函数的二项式逻辑回归模型中，在miR21、miR342、IL1B、KRAS、MUC4和PTGES2下实现了最大AUC，导致AUC为0.82(p＝0.003)，以区分低风险囊肿与高风险囊肿。进行子集分析，包括涉及Gnas和Kras点突变分析的迭代，以确定最准确的预测生物签名。当考虑到Gnas或Kras中的突变时，使用IL1B、MUC4和PTGES2获得最具预测性的签名，从而构建出精确的等式：y＝0.37+(-0.06IL1B)+(-0.01MUC4)+(-0.50PTGES2)，AUC＝0.86，p值＝0.002(图1)。
有证据支持IPMN从低级别异型增生到腺癌的进展模型，但是，这种转化的时间框架是未知的。一些病变将发展为癌症，而另一些则可能仍处于低风险病变达数十年。尽管理想情况下应在术前确定恶性肿瘤的风险，但是目前，许多处于恶性转化低风险的囊肿正被去除，患者付出了精神、身体和经济上的代价，死亡率风险增加约2％并且术后发病率为约40％。这种风险/效益比是该疾病外科手术决策面临的挑战的关键，其中隐匿性胰腺腺癌遗漏或切除延误致使进展为恶性肿瘤的分枝，可能导致重大的与癌症相关的死亡率。出于这个原因，一些团体甚至主张切除已知低风险的病变。在美国，尽管有多个美国、欧洲和国际指南指导将目前接受IPMN手术切除的绝大多数患者选择为高风险病变，但所述患者仍将根据最终病理确定为低风险囊肿。已证实，指南中预测为高级别异型增生或浸润性癌症高风险的病变中高达65％在最终病理时发现是低风险的，而用相同指南预测为具有恶性肿瘤低风险的其它少量BD-IPMN将显示有高达25％的机会出现高风险病理。
美国的两种最常用的临床决策指南是修订版的Sendai(Fukuoka)和美国胃肠病学协会(AGA)指南。已发现Fukuoka具有较高的假阳性率，对恶性肿瘤的特异性为21％。同一项研究发现，AGA指南的假阳性率较低，特异性为44％，但假阴性率较高，被忽略的恶性肿瘤为12％以上。对当前指南的类似分析支持Fukuoka鉴定高风险囊肿的假阴性率为65-72％，而AGA却错误鉴定了45％的高风险IPMN。因此，本领域需要新颖且可靠的生物标志物，其应能够区分具有最小恶性转化风险的囊肿与具有高风险病理或隐匿性恶性肿瘤的囊肿。
为响应这一需求，现已开发出IPMN囊肿液基因生物签名，其能够以高达86％的准确度区分高风险。所有高风险囊肿均应在其它方面匹配并且医学上适当的个体中通过手术切除，并且低风险囊肿可以最低限度地用此定量数据进行表征，这些定量数据可用于手术知情决策和知情同意书。
通过包括国际多机构群组、大量患者囊肿液样品、大批量运行样品、预选候选生物标志物以及通过5倍交叉验证的可靠统计方法，将本研究中的偏差尽可能地减至最小。有趣的是，当将kras和gnas突变分析添加到模型中时，并未选择它们作为对于预测值的贡献特征，这可能是由于这些突变在IPMN总体上的高存在率。
序列表
<110> 伊利诺伊大学理事会（The Board of Trustees of the University ofIllinois）
<120> 用于诊断早期胰腺癌的方法和试剂盒
<130> UIC0072WO
<150> US 62/478,860
<151> 2017-03-30
<160> 63
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
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<220>
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<211> 22
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 2
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<220>
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catcagctta gctggacact gc 22
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<220>
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gaccacctca ttctcctggc ta 22
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<220>
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aacctaagag cttggaggtc cc 22
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cctctatgag gctgctgaca ag 22
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atcacacgca gcacgccata ca 22
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caggaagaca gagtgtgctg gt 22
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agcttgaatt tactgcagtg aagg 24
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ctttcagtcg gatgtttgca gc 22
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tctcacacag aaatcgcacc cgt 23
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aaacaagatt tacctctatt gttggatcat a 31
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 63
ggactggggt gaatgtcaag aa 22

Claims (15)

1.一种区分高风险和低风险的导管内乳头状黏液肿瘤和囊肿异型增生水平的方法，所述方法包括
a)确定胰腺囊肿液样品中一种或多种生物标志物信使RNA(mRNA)或者一种或多种生物标志物微RNA(miRNA)的表达水平；
b)将所述一种或多种生物标志物mRNA或者一种或多种生物标志物miRNA的表达水平与囊肿液对照样品中的所述一种或多种生物标志物的表达水平进行比较；以及
c)将所述样品分类为高风险或低风险的导管内乳头状黏液肿瘤。
2.权利要求1的方法，其中所述一种或多种mRNA选自ERBB2、GAPDH、GNAS、IL1B、KRAS、MUC-1、MUC-2、MUC-4、MUC-5AC、MUC-7、PGE2-R、PTGER2、PTGES2、PTGS1和TP63。
3.权利要求1的方法，其中所述一种或多种miRNA选自hsa-miR-101、hsa-miR-106b、hsa-miR-10a、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-155、hsa-miR-17-3p、hsa-miR-18a、hsa-miR-21、hsa-miR-217、hsa-miR-24、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-92a和hsa-miR-99b。
4.权利要求1的方法，其中所述一种或多种生物标志物mRNA或生物标志物miRNA是选自hsa-miR-21、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-342-3p、IL1B、KRAS、MUC4、MUC7、PTGER、TP63和PTGES2的三种生物标志物。
5.权利要求1的方法，其中所述一种或多种生物标志物mRNA是IL1B、MUC4和PTGES2。
6.权利要求1的方法，其中步骤a)还包括测量一种或多种生物标志物蛋白质的表达。
7.权利要求6的方法，其中所述一种或多种蛋白质选自ERRB2、GAPDH、GNAS、IL1B、KRAS、MUC-1、MUC-2、MUC-4、MUC-5AC、MUC-7、PGE2-R和PTGER2。
8.权利要求1的方法，所述方法还包括将所述一种或多种生物标志物miRNA和mRNA相对于参考mRNA的相对表达水平进行归一化的步骤。
9.权利要求8的方法，其中所述参考mRNA是RPLP0。
10.一种用于区分高风险和低风险的导管内乳头状黏液肿瘤和囊肿异型增生水平的试剂盒，所述试剂盒包含一个或多个引物集，所述引物集用于扩增
a)选自ERBB2、GAPDH、GNAS、IL1B、KRAS、MUC-1、MUC-2、MUC-4、MUC-5AC、MUC-7、PGE2-R、PTGER2、PTGES2、PTGS1和TP63的生物标志物信使RNA，或
b)选自hsa-miR-101、hsa-miR-106b、hsa-miR-10a、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-155、hsa-miR-17-3p、hsa-miR-18a、hsa-miR-21、hsa-miR-217、hsa-miR-24、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-92a和hsa-miR-99b的生物标志物微RNA。
11.权利要求10的试剂盒，其中所述试剂盒还包含一种或多种结合生物标志物蛋白质的结合剂，所述生物标志物蛋白质选自ERRB2、GAPDH、GNAS、IL1B、KRAS、MUC-1、MUC-2、MUC-4、MUC-5AC、MUC-7、PGE2-R和PTGER2。
12.权利要求10的试剂盒，其中所述试剂盒包含用于扩增选自以下的三种生物标志物的引物集：hsa-miR-21、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-342-3p、IL1B、KRAS、MUC4、MUC7、PTGER、TP63和PTGES2。
13.权利要求10的试剂盒，其中所述试剂盒包含用于扩增IL1B、MUC4和PTGES2的引物集。
14.权利要求10的试剂盒，所述试剂盒还包含用于扩增参考mRNA的引物集。
15.权利要求14的试剂盒，其中所述参考mRNA是RPLP0。
CN201880027143.8A 2017-03-30 2018-03-29 用于诊断早期胰腺癌的方法和试剂盒 Pending CN110573629A (zh)

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