JP5745848B2 - 胃腸癌での増殖の徴候及び予後 - Google Patents
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Description
本発明は、癌、特に胃腸癌の予後を患者において判断するための方法及び組成物に関する。具体的には、本発明は、癌、例えば胃腸癌などの予後を細胞増殖の徴候に基づき判断するための遺伝子マーカーの使用に関する。
細胞増殖は生体における最も基本的なプロセスであり、そのようなものとして増殖関連遺伝子の発現レベルにより正確に調節される(1)。増殖制御の喪失は癌の特徴であり、従って、成長調節遺伝子が腫瘍中で、隣接する正常組織と比較し、異常に発現されていることは驚くべきことではない(2)。増殖変化は、細胞特性、例えば侵襲及び転移能などにおける他の変化を伴いうるため、患者の転帰に影響を及ぼしうる。この関連は実質的な興味を集めており、多くの試験が、転帰の潜在的な指標としての腫瘍細胞増殖の探索に充てられてきた。
本発明の特定の局面では、マイクロアレイ解析を使用し、癌細胞の増殖徴候を提供する遺伝子を同定する。これらの遺伝子、及びそれらの遺伝子によりコードされるタンパク質を、本明細書では胃腸癌増殖マーカー(GCPM)と呼ぶ。本発明の一局面では、予後診断のための癌は、胃腸癌、特に胃癌及び結腸直腸癌である。
単一の増殖マーカーは、信頼できるCRC予後診断を得るために不十分であるため、マイクロアレイによるいくつかの成長関連遺伝子の同時分析を用いて、胃腸腫瘍の増殖状態を判断するためのより定量的で客観的な方法を提供した。表1(以下)は、結腸直腸癌のための予後因子としての増殖指数(PI)の使用のために示した、以前に発表された矛盾する結果を例証する。
本発明の実施態様を詳細に記載する前に、本明細書で使用する用語のいくつかの定義を提供すると有用でありうる。
「予後徴候」、「徴候」などの用語は、2つ又はそれ以上のマーカー、例えばGCPMのセットを指し、セットとして一緒に分析された場合、事象、例えば、結腸直腸癌の予後転帰の判断又は予測が可能になる。2つ又はそれ以上のマーカーを含む徴候の使用によって、個々の変動の効果が低下し、よりしっかりとした予測を可能にする。GCPMの非限定的な例は、表A、表B、表C、又は表Dに含まれ、本明細書において以下で、限定はされないが、特定の群CDC2、MCM6、RPA3、MCM7、PCNA、G22P1、KPNA2、ANLN、APG7L、TOPK、GMNN、RRM1、CDC45L、MAD2L1、RAN、DUT、RRM2、CDK7、MLH3、SMC4L1、CSPG6、POLD2、POLE2、BCCIP、Pfs2、TREX1、BUB3、FEN1、DRF1、PREI3、CCNE1、RPA1、POLE3、RFC4、MCM3、CHEK1、CCND1、及びCDC37;ならびに特定の群CDC2、RFC4、PCNA、CCNE1、CCND1、CDK7、MCM遺伝子(例、MCM3、MCM6、及びMCM7の1つ又は複数)、FEN1、MAD2L1、MYBL2、RRM2、及びBUB3を含む。
細胞増殖は、一部の悪性腫瘍における転帰の指標である。結腸直腸癌では、しかし、結果の不一致が報告されている。これらの結果は単一の増殖マーカーに基づくため、本発明は、この限界を克服し、より確定的な結論に達し、そして結腸直腸癌での細胞増殖の予後診断的な役割を決定するためのマイクロアレイの使用を開示する。本明細書で示すマイクロアレイベースの増殖試験は、結腸直腸癌における増殖徴候の低下率が不良転帰と関連することを示す。本発明は、従って、癌からの早期死亡の高リスクにある患者を特定するために使用できる。
表A:高及び低増殖状態にある細胞株間で異なって発現される増殖関連遺伝子
コンフルエント(低増殖)及び半コンフルエント(高増殖)状態にある細胞株間で異なって発現された遺伝子(図1を参照のこと)を、30K MWG Biotechアレイでのマイクロアレイ解析により同定した。表Aは、細胞増殖関連として遺伝子オントロジー分析により分類されたこれらの遺伝子のサブセットを含む。
表B:公知の細胞増殖関連遺伝子遺伝子
オントロジー分析により細胞増殖関連として分類され、Affymetrix HG-U133プラットフォーム上に存在する全ての遺伝子
以下のアプローチ:GCPMに選択的なオリゴヌクレオチドプローブを使用したマイクロアレイアプローチ;GCPM特異的プライマー及びプローブを使用した腫瘍サンプルでのリアルタイムqPCR;リンパ節、血液、血清、糞便、又は尿サンプルでの、GCPM特異的プライマー及びプローブを使用したリアルタイムqPCR;酵素結合免疫吸着測定法(ELISA);抗マーカー抗体を使用した免疫組織化学的検査;及びコンピュータを使用したアレイ又はqPCRの分析は、GCPMファミリーメンバーを含む増殖マーカーを検出するために使用できる非限定的な方法である。
上に列挙する技術の内、最も高感度で最もフレキシブルな定量方法はRT−PCRであり、正常組織及び腫瘍組織中で、薬物処置を伴う又は伴わない、異なるサンプル集団においてRNAレベルを比較するために、発現のパターンを特徴付けるために、密接に関連するRNAの間で識別するために、そしてRNA構造を解析するために使用できる。
RT−PCR技術のより最近のバリエーションは、リアルタイム定量的PCRであり、二重標識蛍光発生プローブ(即ち、TaqMan@プローブ)を通じてPCR産物の蓄積を測定する。リアルタイムPCRは、定量的競合PCR及び定量的比較PCRの両方に適合する。前者は各標的配列のための内部コンペティターを正規化のために使用し、後者はサンプル内に含まれる正規化遺伝子、又はRT−PCRのためのハウスキーピング遺伝子を使用する。さらなる詳細については、例えば、Held et al., Genome Research 6: 986-994 (1996)を参照のこと。
遺伝子発現の差異は、また、マイクロアレイ技術を使用して同定又は確認できる。このように、GCPMの発現プロファイルは、新鮮な腫瘍組織又はパラフィン包埋腫瘍組織のいずれかにおいて、マイクロアレイ技術を使用して測定できる。この方法では、目的のポリヌクレオチド配列(cDNA及びオリゴヌクレオチドを含む)を、マイクロチップ基材上に配置、又は整列させる。整列させた配列(即ち、捕捉プローブ)を、次に、目的の細胞又は組織からの特異的ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせる。RT−PCR方法と同様に、RNAの供給源は、典型的に、ヒト腫瘍又は腫瘍細胞株、及び対応する正常組織又は正常細胞株から単離された全RNAである。このように、RNAは、種々の原発腫瘍又は腫瘍細胞株から単離できる。RNAの供給源が原発腫瘍である場合、RNAは、例えば、凍結又は保管されたパラフィン包埋固定(例、ホルマリン固定)組織サンプルから抽出でき、これらは日常的に調製され、日々の診療で保存される。
mRNA抽出のための一般的方法は当技術分野において周知であり、Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997)を含む、分子生物学の標準的テキストに開示されている。パラフィン包埋組織からのRNA抽出のための方法は、例えば、Rupp and Locker, Lab Invest. 56: A67 (1987)、及びDe Sandres et al., BioTechniques 18: 42044 (1995)に開示されている。特に、RNA単離は、例えばQiagenなどの製造業者からの精製キット、緩衝液セット、及びプロテアーゼを使用し、製造業者の説明書に従って実施できる。例えば、培養中の細胞からの全RNAを、Qiagen RNeasyミニカラムを使用して単離できる。他の市販のRNA単離キットは、MasterPure Complete DNA and RNA Purification Kit(EPICENTRE(D, Madison, WI))、及びParaffin Block RNA Isolation Kit(Ambion, Inc.)を含む。組織サンプルからの全RNAをRNA Stat-60(Tel-Test)を使用して単離できる。腫瘍から調製したRNAは、例えば、塩化セシウム密度勾配遠心法により単離できる。
免疫組織化学的方法は、また、本発明の増殖マーカーの発現レベルを検出するのに適する。このように、抗体又は抗血清、好ましくはポリクローナル抗血清、及び最も好ましくは各マーカーに特異的なモノクローナル抗体を使用して、発現を検出する。抗体は、抗体自体を、例えば、放射性標識、蛍光標識、ハプテン標識(例えば、ビオチン)、又は酵素(例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ)での直接標識により検出できる。あるいは、未標識一次抗体を標識二次抗体(一次抗体に特異的な抗血清、ポリクローナル抗血清、又はモノクローナル抗体を含む)と共に使用する。免疫組織化学プロトコール及びキットは、当技術分野において周知であり、市販されている。
有意と見なされる遺伝子の選択への早期アプローチは、目的の2群間での所定の遺伝子の「倍率変化」を単に見ることを含む。このアプローチでは最も目覚ましく変化すると思われる遺伝子に焦点を合わせ、基礎統計の考察によって、分散(又はノイズレベル)が非常に高い場合(マイクロアレイ実験でしばしば見られる)、外見的に大きな倍率変化が偶然だけにより頻繁に起こりうることを認める。
データマイニングは、「知識」の抽出、換言すると、「ノウハウ」、又は(通常)大量のデータ(データセット)からの予測能を記載するために使用する用語である。これは、予後徴候を生成するためにこの試験で使用するアプローチである。この試験の場合、「ノウハウ」は、所定のセットの遺伝子発現測定値からの予後、又は「徴候」を的確に予測するための能力である(一般的にこのセクションにおいて、及び、実施例のセクションにおいて詳細に記載される)。
− スプレッドシートプラグイン(複数の業者から得られる)
− R統計環境
− 市販パッケージMatLab、S-plus、SAS、SPSS、STATA
− フリーのオープンソースソフトウェア、例えばOctave(MatLab clone)など
− 多くの多様なC++ライブラリー、市販のクローズソース設定における予測モデルの実行のために使用できる。
方法は、最初にデータマイニングプロセスの工程(上記)を実施し、次に適切な公知のソフトウェアパッケージを適用することによることができる。データマイニングのプロセスのさらなる説明が、多くの極めて良く書かれたテキストに詳細に記載される(49)。
if gene A> x and gene Y > x and gene Z = z
then
class A
else if geneA = q
then
class B
のアルゴリズムの実行である。
予測又は分類は、サンプル(未知のクラス)をその周囲のもの(公知のクラス)と比較することにより行い、近似を距離関数により定義する。多くの異なる距離関数を定義することが可能である。通常使用される距離関数は、ユークリッド距離(ピタゴラス距離の(三角測量と同様の)n次元への延長)、種々の形態の相関(ピアソン相関係数を含む)である。また、通常は、意味のある距離メトリックにより相互に連結されないであろうデータポイントをユーグリッド空間に変換する変換関数が存在し、ユーグリッド距離を次に適用できる(例、マハラノビス距離)。距離メトリックは非常に複雑でありうるが、k−最近接法の基本となる前提は非常に単純であり、本質的に「未知の入力と最も類似のk−データベクターを見出し、それらがいずれのクラスに対応するかを見出し、そして未知の入力がいずれのクラスであるのかに関して投票する」との再記載である。
− ベイジアン・ネットワーク
有向非巡回グラフを使用し、それらの同時確率分布との併用で変数のコレクションを表わし、それを次に使用し、サンプルについてのクラスメンバーシップの確率を決定する。
− 独立成分分析、ここでは独立シグナル(例、クラスメンバーシップ)を変数のコレクションから(成分中に)単離する。これらの成分を次に使用し、サンプルについてのクラスメンバーシップの分類又は予測を産生できる。
集合学習法は、予測方法のコレクションを合わせ、サンプルについてのクラスメンバーシップの同時分類又は予測を産生する。
記載の予測モデルのいずれかの適用は、方法を新たなデータセット(例えば臨床試験からのデータなど)に適用できる前に、訓練及びクロスバリデーション(43、55)の両方を含む。訓練は、目的のデータセットのサブセット(この場合では、結腸直腸癌からの遺伝子発現測定)を取ることを含み、テスト中のクラス(この場合では、再発性腫瘍及び非再発性腫瘍)にわたり層別化する。この訓練セットを使用し、予測モデル(上で定義する)を生成し、それをデータの残り(テストセット)についてテストする。
予後徴候は、1つ又は複数のこれらのマーカーを含み、徴候に由来する1つ又は複数の予測モデルの適用を通じて患者の転帰を判断するために使用できる。特に、臨床医又は研究者は、徴候における1つ又は複数の発現差異(例、発現の増加又は減少)を判断し、予測モデルを適用し、それによりネガティブな予後(患者の疾患再発の可能性)又は、代わりにポジティブな予後(寛解の継続)の可能性を予測できる。
本明細書に記載する実施例は、本発明の実施態様を例証する目的のためである。分析の他の実施態様、方法、及び型は、分子診断技術における当業者の範囲内であり、本明細書では詳細に記載する必要はない。当技術分野の範囲内の他の実施態様は、本発明の一部と見なされる。
実験計画を図1に示す。10の結腸直腸細胞株を培養し、半コンフルエンス及び完全コンフルエンスで回収した。2つの成長段階の遺伝子発現プロファイルを30,000オリゴヌクレオチドアレイで解析し、遺伝子増幅徴候(GPS;表C)を、異なって発現される遺伝子の遺伝子オントロジー分析により同定した。教師なしクラスタリングを次に使用し、GPS発現の類似性に基づき、臨床の結腸直腸サンプルの2つのコホート(コホートA:73オリゴアレイ上の病期I−IV、コホートB:55 Affymetrixチップ上の病期II)を独立的に二分した。Ki−67免疫染色は、コホートA腫瘍からの組織切片でも実施した。これに従い、増殖活性と臨床病理学的パラメータの間の相関を研究した。
2つのコホートの患者を解析した。コホートAは、ダニディン及びオークランドの病院で1995〜2000年の間に外科手術を受けた73人のニュージーランドの結腸直腸癌患者を含んだ。これらの患者は前向きコホート試験の一部であり、全ての病期を含んだ。腫瘍サンプルを手術現場から新たに収集し、液体窒素中で急速凍結し、そして−80℃で保存した。標本は1人の病理学者(H−S Y)により精査され、TNMシステム(34)に従って病期分類された。73人の患者の内、32人が疾患再発を発生し、41人が最低5年間の追跡調査後に無再発のままであった。全生存期間の中央値は、再発性患者及び無再発患者でそれぞれ29.5ヶ月間及び66ヶ月間であった。20人の患者が5−FUベースの術後アジュバント化学療法を受け、12人の患者が放射線療法を受けた(術前7人及び術後5人)。
コホートAの腫瘍及び細胞株:組織サンプル及び細胞株をホモジナイズし、そしてRNAをTri-Reagent(Progenz, Auckland, NZ)を使用して抽出した。RNAを次に、RNeasy mini column(Qiagen, Victoria, Australia)を使用し、製造業者のプロトコールに従って精製した。各培養物又は腫瘍サンプルから抽出した10マイクログラムの全RNAを、オリゴdTプライミングし、そしてcDNA合成をaa−dUTP及びSuperscript II RNase H-Reverse Transcriptase(Invitrogen)の存在下で行った。Cy色素を、間接的アミノ−アリルcDNA標識方法を使用してcDNA中に取り込ませた。12の異なる細胞株のプールに由来するcDNAを、全てのハイブリダイゼーションのための参照として使用した。個々の結腸直腸癌の細胞株又は組織サンプルからのCy5−dUTPタグ付きcDNAを、参照サンプルからのCy3−dUTPタグ付きcDNAと合わせた。混合物を次にQiaQuick PCR purification Kit(Qiagen, Victoria, Australia)を使用して精製し、MWG 30K Oligo Set(MWG Biotech, NC)でスポットしたマイクロアレイに同時ハイブリダイズした。第2の培養実験からのcDNAサンプルを、追加で、リバース標識を使用してマイクロアレイで分析した。
11の遺伝子(MAD2L1、POLE2、CDC2、MCM6、MCM7、RANSEH2A、TOPK、KPNA2、G22P1、PCNA、及びGMNN)の発現を、細胞培養物からのcDNAを使用してバリデーションした。全RNA(2μg)をSuperscript II RNase H-Reverse Transcriptase kit(Invitrogen)及びオリゴdTプラマー(Invitrogen)を使用して逆転写した。QPCRを、ABI Prism 7900HT Sequence Detection System(Applied Biosystems)で、Taqman Gene Expression Assays(Applied Biosystems)を使用して実施した。相対的倍率変化を、内部コントロールとしてTopoisomerase 3Aを伴う2−ΔΔCT方法36を使用して算出した。参照RNAを、異なる実験間の比較を可能にするための検量用試料として使用した。
Ki−67抗原(MIB-1; DakoCytomation, Denmark)の免疫組織化学的発現を、コホートAからの73のパラフィン包埋した原発結腸直腸腫瘍の4μm切片上で研究した。内因性ペルオキシダーゼ活性を、メタノール中の0.3%過酸化水素でブロックし、抗原を沸騰中のクエン酸緩衝液(pH6)中に回収した。非特異的結合部位を、1% BSAを含む5%通常ヤギ血清でブロックした。一次抗体(1:50希釈)をEnVision system(Dako EnVision, CA)及びDAB substrate kit(Vector laboratories, CA)を使用して検出した。5つの高倍率視野を10×10顕微鏡グリッドを使用して選択し、細胞計数を手動で、盲検様式で、臨床病理学的データの知識なしに実施した。Ki−67増殖指数(PI)を、各腫瘍での陽性染色された核のパーセントで提示した。
統計分析をSPSS(登録商標)version 14.0.0(SPSS Inc., Chicago, IL)を使用して実施した。Ki−67増殖指数を平均値±SDで提示した。フィッシャー直接検定又はクラスカル・ワリス検定を使用し、分類された群間での差異を、GPS又はKi−67 PIの発現対臨床病理学的パラメータに基づいて評価した。P値≦0.05を有意と見なした。全生存期間(OS)及び無再発生存期間(RFS)を、カプラン・マイヤー法(37)を使用してプロットした。ログランク検定を使用し、分類された群間での生存時間における差異を検定した。相対リスク及び関連する信頼区間も、各変数について、Cox単変量モデルを使用して推定し、そして多変量Cox比例ハザードモデルを、単変量解析において有意であった予測変数を伴う前向き段階的回帰を使用して開発した。K−平均クラスタリング方法を使用し、GPSの発現レベルに基づいて臨床サンプルを分類した。
遺伝子増幅徴候(GPS)を引き出し、適用するために使用するアプローチの概観を図1にまとめる。GPSは、38の有糸分裂の細胞周期遺伝子(表C)を含め、半コンフルエント培養中での周期中の細胞において比較的過剰発現されていた。低増殖は、低GPS発現により定義され、好ましくない臨床病理学的変数、より短い全生存、及び無再発生存と関連した(p<0.05)。関連は、Ki−67増殖指数と臨床病理学的変数又は臨床転帰の間に見出されなかった。
CRC腫瘍の相対的増殖状態及び臨床適用のためのGPSの有用性を検証するために、2つのコホートからのCRC腫瘍をGPS発現に基づき2つのクラスターに層別化した(図1、段階2)。GPSを定義する38の遺伝子の発現値を、腫瘍のマイクロアレイ生成発現プロファイルから最初に得た。各コホートからの腫瘍を、次に、それらのGPS発現レベルの類似性に基づき、K平均教師なしクラスタリングを使用し、2つのクラスター(K=2)に別々に分類した。全ての選別された遺伝子を使用した、2つの定義されたクラスター間でのDE遺伝子の分析によって、GPSが、両方のコホートにおいて、クラスター2(下パネル)と比較し、クラスター1(図2A、上パネル)において上方制御された遺伝子のリスト内に含まれることが明らかになった。このように、クラスター1の腫瘍は高GPS発現により特徴付けられ、クラスター2の腫瘍は低GPS発現により特徴付けられる。
表2には、GPS発現レベルと臨床病理学的変数の間の関連をまとめている。関連は、両方のコホートにおける、低い増殖活性(低GPS発現により定義される)と再発の増加リスクの間に観察された(コホートA及びBについてそれぞれP=0.03及び<0.001)。コホートAでは、低GPS発現が、より高い病期及びリンパ節転移とも関連した(それぞれP=0.006及び0.03)。また、コホートAからのリンパ侵襲を伴う腫瘍は、統計的有意性に達することはないにもかかわらず(P=0.06)、リンパ侵襲を伴わない腫瘍よりも増殖性が低い傾向にあった。関連は、GPS発現レベルと、腫瘍部位、年齢、性別、分化の程度、T病期、血管侵襲、リンパ球浸潤、及び腫瘍辺縁の間に見出されなかった。
患者の転帰を予測する際のGPSの性能を検証するために、カプラン・マイヤー生存分析を使用し、低GPS腫瘍と高GPS腫瘍の間でRFS及びOSを比較した(図3)。全ての患者を術後60ヶ月目に打ち切った。結腸直腸癌コホートAでは、OS及びRFSは、低GPS発現を伴う患者においてより短かった(それぞれログランク検定P=0.04及び0.01)。結腸直腸癌コホートBでは、低GPS発現も減少したOS(P=0.0004)及びRFS(P=0.0002)と関連した。単変量解析においてOS及びRFSを予測するパラメータを多変量モデルにおいて研究した場合、病期は5年OSの独立した予測因子だけであり、病期及びT病期はコホートAにおけるRFSの独立した予測因子であった。コホートBでは、低GPS発現及びリンパ侵襲が、OS及びRFSの両方への独立した寄与を示した。生存分析がリンパ侵襲を伴わないコホートB患者に限定された場合、低GPSは依然としてより短いOS及びRFSに関連し、予測因子としてのGPSの独立性が確認された。生存と単変数及び多変数関連の分析を表3にまとめる。
Ki−67免疫染色は、コホートA腫瘍だけからの組織切片で実施した。なぜなら、パラフィン包埋サンプルがコホートBについて利用不可能であったからである(図1、段階3)。核染色は73すべてのCRC腫瘍で検出された。Ki−67 PIは25%から96%に及び、平均値は76.3±17.5であった。平均Ki−67値をカットオフポイントとして使用し、腫瘍を、低PI又は高PIを伴う2群に割り当てた。Ki−67 PIは、臨床病理学的変数(表2)又は生存のいずれとも関連しなかった(図3)。生存分析が最高Ki−67値及び最低Ki−67値を伴う患者に限定される場合、統計的差異は観察されなかった(データ示さず)。これらの結果の要約は、成長関連遺伝子の低発現が結腸直腸癌における不良転帰と関連することを示し、Ki−67は関連を検出するために十分に高感度ではなかった。これらの知見は、癌からの早期死亡の高リスクにある患者を特定するための追加基準として使用できる。
コホートB(55人のドイツ人CRC患者;表2)を、最初に、38の遺伝子細胞増殖徴候(表C)及びK平均クラスタリング方法(ピアソン非中央、1000順列、同じクラスターで発生する閾値を80%に設定)を使用し、低増殖群と高増殖群に分類した。マイクロアレイの統計分析(SAM)を次に適用し、全ての選別された遺伝子(16041の遺伝子)が分析のために含まれた場合に低増殖群と高増殖群の間で異なって発現される(FDR=0)遺伝子を同定した。754の遺伝子が、高増殖群で過剰発現されることが見出された。GATHER遺伝子オントロジープログラムを次に使用し、異なって発現される遺伝子のリスト内で最も過剰提示される遺伝子オントロジーカテゴリーを同定した。細胞周期カテゴリーは、異なって発現される遺伝子のリスト内で最も過剰提示されるカテゴリーであった。低増殖群と高増殖群の間で異なって発現される102の細胞周期遺伝子を(元の38の遺伝子徴候に加えて)表Dに示す。
本発明は、遺伝子増幅徴候と主要な臨床病理学的変数ならびに結腸直腸癌での転帰の間の関連を報告した最初のものである。開示した試験では、インビトロ由来の複数遺伝子増幅徴候を使用し、Ki−67免疫染色により増殖状態を研究した。本明細書の結果によると、腫瘍でのGPSの低発現は、2つの独立した患者のコホートにおける再発のより高いリスク及びより短い生存期間と関連した。対照的に、Ki−67増殖指数は、臨床的に関連するエンドポイントのいずれとも関連しなかった。
Claims (49)
- 複製因子(活性化因子1)4(RFC4)を含む、患者において胃腸癌の進行を判断するための予後マーカー。
- 表A、表B、表C、又は表Dから選択される1つ又は複数のさらなる遺伝子を含む、請求項1に記載のマーカー。
- マーカーが、CDC2、MCM6、RPA3、MCM7、PCNA、G22P1、KPNA2、ANLN、APG7L、TOPK、GMNN、RRM1、CDC45L、MAD2L1、RAN、DUT、RRM2、CDK7、MLH3、SMC4L1、CSPG6、POLD2、POLE2、BCCIP、Pfs2、TREX1、BUB3、FEN1、DRF1、PREI3、CCNE1、RPA1、POLE3、RFC4、MCM3、CHEK1、CCND1、及びCDC37のいずれかから選択される1つ又は複数の遺伝子を含む、請求項1又は2記載のマーカー。
- 胃腸癌の再発を伴わない胃腸癌患者の長期生存の可能性を予測する方法であって、患者から得られた胃腸サンプル中で1つ又は複数の予後診断用RNA転写物又はそれらの発現産物の発現レベル、ここで、胃腸癌組織サンプル中での全てのRNA転写物もしくはそれらの産物、又はRNA転写物もしくはそれらの発現産物の参照セットの発現レベルに対して正規化されている、を決定すること;ここで予後診断用RNA転写物は、複製因子(活性化因子1)4(RFC4)の転写物であり;及び
胃腸癌の再発を伴わない長期生存の可能性を確立すること
を含む方法。 - 予後診断用RNA転写物が、表A、表B、表C、又は表Dから選択される1つ又は複数のさらなる遺伝子を含む、請求項4に記載の方法。
- 少なくとも1つの予後診断用RNA転写物又はその発現産物が、CDC2、MCM6、RPA3、MCM7、PCNA、G22P1、KPNA2、ANLN、APG7L、TOPK、GMNN、RRM1、CDC45L、MAD2L1、RAN、DUT、RRM2、CDK7、MLH3、SMC4L1、CSPG6、POLD2、POLE2、BCCIP、Pfs2、TREX1、BUB3、FEN1、DRF1、PREI3、CCNE1、RPA1、POLE3、RFC4、MCM3、CHEK1、CCND1、及びCDC37のいずれか1つから選択される、請求項5記載の方法。
- 少なくとも2つの予後診断用RNA転写物又はそれらの発現産物の発現レベルを決定することを含む、請求項4〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 1つ又は複数の予後診断用RNA転写物又はそれらの発現産物の発現増加が、胃腸癌の再発を伴わない長期生存の可能性増加を示す、請求項4〜7のいずれか一項記載の方法。
- 予測モデルを適用し、予測方法を再発性腫瘍サンプル及び非再発性腫瘍サンプル中での予測マーカーの発現レベルに適用することで確立し、胃腸癌の再発を伴わない長期生存の可能性を確立する、請求項4〜8のいずれか一項記載の方法。
- 予測方法が、線形モデル、サポートベクターマシン、ニューラルネットワーク、分類ツリー及び回帰ツリー、アンサンブル学習法、判別分析、最短距離法、ベイジアン・ネットワーク、独立成分分析からなる群より選択される、請求項9記載の方法。
- 胃腸癌が胃癌又は結腸直腸癌である、請求項4〜10のいずれか一項記載の方法。
- 1つ又は複数の予後診断用RNA転写物の発現レベルが決定される、請求項4〜11のいずれか一項記載の方法。
- RNAを患者の固定ワックス包埋胃腸癌組織標本から単離する、請求項4〜12のいずれか一項記載の方法。
- RNAをコア生検組織又は細針吸引細胞から単離する、請求項4〜12のいずれか一項記載の方法。
- 表A、表B、表C、又は表Dから選択される2つ又はそれ以上の遺伝子であって、少なくとも一つの遺伝子が、複製因子(活性化因子1)4(RFC4)である遺伝子にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、患者において胃腸癌の進行を判断するためのアレイ。
- 遺伝子:CDC2、MCM6、RPA3、MCM7、PCNA、G22P1、KPNA2、ANLN、APG7L、TOPK、GMNN、RRM1、CDC45L、MAD2L1、RAN、DUT、RRM2、CDK7、MLH3、SMC4L1、CSPG6、POLD2、POLE2、BCCIP、Pfs2、TREX1、BUB3、FEN1、DRF1、PREI3、CCNE1、RPA1、POLE3、RFC4、MCM3、CHEK1、CCND1、及びCDC37の2つ又はそれ以上にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、請求項15記載のアレイ。
- 少なくとも3つ、少なくとも5つ、少なくとも10、又は少なくとも15の遺伝子にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、請求項15又は請求項16に記載のアレイ。
- 遺伝子:CDC2、MCM6、RPA3、MCM7、PCNA、G22P1、KPNA2、ANLN、APG7L、TOPK、GMNN、RRM1、CDC45L、MAD2L1、RAN、DUT、RRM2、CDK7、MLH3、SMC4L1、CSPG6、POLD2、POLE2、BCCIP、Pfs2、TREX1、BUB3、FEN1、DRF1、PREI3、CCNE1、RPA1、POLE3、RFC4、MCM3、CHEK1、CCND1、及びCDC37にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、請求項15記載のアレイ。
- ポリヌクレオチドがcDNAである、請求項15〜18のいずれか一項記載のアレイ。
- cDNAが500〜5000塩基長である、請求項19記載のアレイ。
- ポリヌクレオチドがオリゴヌクレオチドである、請求項15〜18のいずれか一項記載のアレイ。
- オリゴヌクレオチドが20〜80塩基長である、請求項21記載のアレイ。
- 固体表面がガラスである、請求項15〜22のいずれか一項記載のアレイ。
- 胃腸癌の再発を伴わない、胃腸癌と診断された患者の長期生存の可能性を予測する方法であって:
(1)患者から得られた胃腸癌組織サンプル中で、複製因子(活性化因子1)4(RFC4)を含む遺伝子のRNA転写物又は発現産物の発現レベル、ここで、胃腸癌組織サンプル中での全てのRNA転写物又はそれらの発現産物、又はRNA転写物もしくはそれらの産物の参照セットの発現レベルに対して正規化されている、を決定すること;
(2)工程(1)で得られたデータを統計分析にかけること;及び
(3)長期生存の可能性が増加又は減少しているかを決定すること;
の工程、
及び胃腸癌の再発を伴わない長期生存の可能性を確立すること
を含む方法。 - RNA転写物又は遺伝子の発現産物が、表A、表B、表C、又は表Dから選択される1つ又は複数のさらなる遺伝子を含む、請求項24に記載の方法。
- 少なくとも1つの予後診断用RNA転写物又はその発現産物が、CDC2、MCM6、RPA3、MCM7、PCNA、G22P1、KPNA2、ANLN、APG7L、TOPK、GMNN、RRM1、CDC45L、MAD2L1、RAN、DUT、RRM2、CDK7、MLH3、SMC4L1、CSPG6、POLD2、POLE2、BCCIP、Pfs2、TREX1、BUB3、FEN1、DRF1、PREI3、CCNE1、RPA1、POLE3、RFC4、MCM3、CHEK1、CCND1、及びCDC37のいずれか1つから選択される、請求項24記載の方法。
- 統計分析を、Cox比例ハザードモデルを使用することにより実施する、請求項22又は請求項24〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 癌患者についての個別化されたゲノミクスプロファイルを作成する方法であって:(a)患者から得られた胃腸組織から抽出されたRNAを遺伝子発現解析にかけること;(b)複製因子(活性化因子1)4(RFC4)を含む1つ又は複数の遺伝子の発現レベル、ここで、発現レベルは対照遺伝子に対して正規化され、場合により胃腸癌参照組織セットで見出される量と比較される、を決定すること;及び(c)遺伝子発現解析により得られたデータをまとめる報告を作成すること、の工程を含み、
報告が患者の長期生存の可能性の予測を含む、方法。 - 表A、表B、表C、又は表Dのいずれかに記載の胃腸癌遺伝子から選択される1つ又は複数のさらなる遺伝子の発現レベルの決定を含む、請求項28に記載の方法。
- 胃腸組織が胃腸癌細胞を含む、請求項28記載の方法。
- 胃腸組織が固定パラフィン包埋生検サンプルから得られる、請求項28記載の方法。
- RNAが断片化されている、請求項31記載の方法。
- (a)患者から得られた胃腸癌細胞を含むサンプルを、複製因子(活性化因子1)4(RFC4)を含む1つ以上の遺伝子のRNA転写物、又はその産物のレベルの定量的分析にかけること;及び(b)遺伝子、又はそれらの産物の正規化された発現レベルが、定めた発現閾値を上回る場合、胃腸癌の再発を伴わない長期生存の可能性の増加を有する可能性が高い患者を特定すること
を含む予後診断のためのデータの提供方法。 - サンプルを、表A、表B、表C、又は表Dのいずれかから選択される少なくとも1つのさらなる遺伝子のRNA転写物のレベルの定量的分析にかけることを含む、請求項33に記載の方法。
- 少なくとも1つの予後診断用RNA転写物又はその発現産物が、CDC2、MCM6、RPA3、MCM7、PCNA、G22P1、KPNA2、ANLN、APG7L、TOPK、GMNN、RRM1、CDC45L、MAD2L1、RAN、DUT、RRM2、CDK7、MLH3、SMC4L1、CSPG6、POLD2、POLE2、BCCIP、Pfs2、TREX1、BUB3、FEN1、DRF1、PREI3、CCNE1、RPA1、POLE3、RFC4、MCM3、CHEK1、CCND1、及びCDC37のいずれか1つから選択される、請求項33記載の方法。
- 遺伝子のRNA転写物のレベルが、2つ又はそれ以上のハウスキーピング遺伝子のRNA転写物又は産物の平均レベルに対して正規化される、請求項33〜35のいずれか1項に記載の方法。
- ハウスキーピング遺伝子が、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)、Cypl、アルブミン、アクチン、チューブリン、シクロフィリンヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HRPT)、L32、28S、及び185からなる群より選択される、請求項36記載の方法。
- サンプルを、検出限界を上回り存在する全ての遺伝子の包括的遺伝子発現解析にかける、請求項33〜37のいずれか一項記載の方法。
- 遺伝子のRNA転写物のレベルが、アッセイされた全ての遺伝子又はそのサブセットのRNA転写物又は産物の平均シグナルに対して正規化される、請求項33〜38のいずれか一項記載の方法。
- RNA転写物のレベルを定量的RT−PCRにより測定し、そしてシグナルがCt値である、請求項33〜39のいずれか一項記載の方法。
- アッセイされた遺伝子が少なくとも50又は少なくとも100の癌関連遺伝子を含む、請求項39記載の方法。
- 患者がヒトである、請求項33〜41のいずれか一項記載の方法。
- サンプルが固定パラフィン包埋組織(FPET)サンプル、又は新鮮もしくは凍結組織サンプルである、請求項33〜42のいずれか一項記載の方法。
- サンプルが、細針、コア、又は他のタイプの生検からの組織サンプルである、請求項33〜42のいずれか一項記載の方法。
- 定量分析が定量的RT−PCRにより実施される、請求項33〜44のいずれか一項記載の方法。
- 定量分析が遺伝子の産物を定量することにより実施される、請求項33〜44のいずれか一項記載の方法。
- 産物が免疫組織化学により又はプロテオミクス技術により定量される、請求項33〜44のいずれか一項記載の方法。
- 患者が、胃腸癌の再発を伴わず、長期生存の可能性増加を有することを示す報告を作成する工程をさらに含む、請求項33〜47のいずれか一項記載の方法。
- 請求項4、28、及び33のいずれか一項記載の方法の実施に適する、(1)抽出緩衝液/試薬及びプロトコール;(2)逆転写緩衝液/試薬及びプロトコール;ならびに(3)定量的RT−PCR緩衝液/試薬及びプロトコールの1つ又は複数を含むキット。
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