CN113624665A - 一种抗肿瘤候选化合物在治疗结直肠癌药物中的应用及测定方法 - Google Patents

一种抗肿瘤候选化合物在治疗结直肠癌药物中的应用及测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种抗肿瘤候选化合物在治疗结直肠癌药物中的应用及测定方法，并提供一种LC‑MS/MS测定人血浆中药物含量的方法，评估体内药代动力学。包括：检测化合物对结直肠癌的细胞毒性以及凋亡和周期变化，采用C18色谱柱分离化合物，电喷雾离子源（ESI）多反应监测（MRM）模式扫描，确定CPUL1的含量。该技术可应用于抗肿瘤候选化合物作用机制的初步研究，该LC‑MS/MS方法操作便捷、灵敏度高，检测范围低至1ng/ml，重现性好，样品前处理简单，并适用于吩嗪系列结构类似物的构效关系与体内外动力学评估，具有高效和低成本的优势，为新药成药性研究提供技术支持，在一定程度上加快抗肿瘤药物研究和开发进程。

Description

一种抗肿瘤候选化合物在治疗结直肠癌药物中的应用及测定 方法
技术领域
本发明属于医药技术领域。具体涉及一种候选化合物在结直肠癌治疗方面的应用及使用LC-MS/MS测定其含量的方法。
背景技术
结直肠癌是当今最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率居高不下。随着医疗水平的不断提升,结直肠癌患者的生存期显著延长，但是发生转移的患者也逐渐增多，临床上使用药物化疗的病人中，产生不同程度耐药的肿瘤患者占90％。因此，不断开发新型抗肿瘤药，提高药物的安全性，克服肿瘤耐药的发生成为攻克癌症的主要任务。
吩嗪是一类天然或合成的含氮杂环化合物。这类化合物的抗生素特性在150年前就已为人所知，许多此类化合物作为潜在的抗肿瘤药物，具有重要的应用前景。CPUL1是人工合成的抗肿瘤吩嗪类候选化合物，在抗肿瘤方面具有潜在的应用价值，但是它仍处于临床前开发阶段，还没有系统研究CPUL1的含量测定和药代动力学，并且目前为止，生物样品中吩嗪类化合物定量方法报道很少，这些阻碍了它的应用和发展。
Figure BDA0003188647930000011
CPUL1
CPUL1是本实验发现的化合物，本发明首次验证了对于直肠癌的治疗作用。
基于上述，有必要研究其对结直肠癌的治疗作用，并建立快速准确的化合物分析测定方法，为吩嗪系列结构类似物的构效关系与体内外动力学评估及药物开发奠定基础。
发明内容
本发明的目的之一在于提供CPUL1在结直肠癌治疗方面的发现。
本发明的目的之二在于提供一种检测人血浆中化合物CPUL1的方法。
本发明的目的之三在于提供CPUL1在结直肠癌细胞中的代谢动力学检测。
本发明为了实现以上三个目的采用的技术方案如下：
依据本发明的第一方面，提供了抗肿瘤候选化合物CPUL1在结直肠癌治疗方面的应用，其抑制结直肠癌细胞增殖，诱导结直肠癌细胞的凋亡，并使细胞周期停滞于G1－S期，具体包括如下步骤：
(1)细胞毒性检测
将细胞接种于96孔板，接种量为5000个/孔，待细胞生长贴壁后，根据相应分组加入指示药物处理48h，避光条件下，Cell Counting Kit-8(CCK-8)与无血清培养基以1：9的比例配制混合溶液，吸弃含药培养基，按100ul/孔加入上述混合溶液，恒温培养箱中进一步孵育0.5-2h，在450nm波长下检测吸光度，细胞活力＝(A处理组-A空白对照)/(A对照组-A空白对照)×100％。
(2)细胞凋亡检测
将细胞接种于6孔板，生长至80％左右时给予药物干预，待细胞生长贴壁后，根据相应分组加入指示药物处理48h后，将含药培养基转移至离心管，贴壁细胞用PBS润洗后，加入200ul的无EDTA胰蛋白酶消化液，吹下细胞并收集至对应离心管，离心(1000rmp*5min,室温)，弃上清，加入PBS重悬，离心(1000rmp*5min,4℃)，收集细胞沉淀，加入AnnexinV-FITC结合液重悬细胞沉淀，暗室室温放置20min,流式细胞仪检测，以上实验重复3次。
(3)细胞周期检测
将细胞接种于6孔板，生长至80％左右时给予药物干预，待细胞生长贴壁后，根据相应分组加入指示药物处理48h后，将含药培养基转移至离心管，贴壁细胞用PBS润洗后，加入200ul胰蛋白酶消化液，吹下细胞并收集至对应离心管，离心(1000rmp*5min,室温)，弃上清，加入PBS重悬，调整细胞浓度为1×106/ml,离心(1000rmp*5min,4℃)，收集细胞沉淀，加入体积分数为70％冷乙醇500ul固定，4℃过夜，PBS洗涤两次，离心(1000rmp*3min,4℃)，加入500ulPI/RNaseA染色工作液，室温避光孵育40min,流式细胞仪检测，以上实验重复3次。
所述结直肠癌细胞系包括但不限于：SW480,HCT-8,HCT-116,SW620,LoVo。
依据本发明的第二方面，提供一种检测人血浆中抗肿瘤候选化合物CPUL1的方法，其LC-MS/MS检测步骤分别如下：
(1)工作溶液的配制：
标准储备液的配制，精密称取CPUL1，用DMSO配制成混合标准品储备液量备用；精密称取内标化合物，配制内标储备液；
标准工作溶液的配制，以乙腈为稀释液，配制成系列标准溶液。
(2)样品前处理：
精确量取90μL空白血浆和10μL的CPUL1工作液至1.5mL离心管中，振荡30s，再加入400μL由乙腈稀释的300ng/ml的内标溶液，充分振荡5min后，离心(14,000rpm×10min,4℃)，取350μL上清至新的1.5mL离心管，离心(14,000rpm×10min,4℃)，取200μL上清于进样瓶中。
(3)LC-MS/MS方法开发
液相色谱条件：色谱柱为Phenomenex Luna C18液相色谱柱(150mm×4.6mmID，3μm)；柱温为40℃；以流动相A(含0.1％乙酸的5mM的乙酸铵)和流动相B(含0.1％乙酸的甲醇)等度洗脱(体积比为5：95)，流速为0.25mL/min；进样量为2μL。
质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，负离子模式检测。气体供应均为高纯氮气。气帘气为12psi；雾化气为35psi；辅助加热气为35psi；碰撞气为Medium；离子喷雾电压为4000V；离子源温度为550℃；扫描方式为多重反应监测模式(MRM),CPUL1的m/z为432.000→65.100和染料木黄酮的m/z为268.900→132.800。
上述分析方法中，所述内标为染料木素。
作为优选，在样品前处理中，选择乙腈作为蛋白沉淀剂。
依据本发明的第三方面，提供了抗肿瘤候选化合物CPUL1在结直肠癌细胞中的代谢动力学检测。CPUL1在人血浆中的药代动力学特点：五种细胞的Cmax和Tmax有所差异，其中LoVo在0.69h出现峰值。
本发明的有益效果：
本发明提示CPUL1具有潜在的抗结直肠癌活性，有可能成为治疗结直肠癌的新药物。
本发明采用操作便捷、成本低而且影响因素少的乙腈沉淀法进行样品前处理，通过LC-MS/MS分析方法可快速、准确检测人血浆中CPUL1的含量。此方法，避免了复杂液相色谱条件的使用，专属性强，在1～1000ng/mL范围具有良好的线性，回归方程为y＝0.00585x+0.00134，r为0.9997，样品批内精密度小于5.23％，准确度在±2.88％以内，批间精密度小于5.17％，准确度在±4.75％以内，回收率RSD小于8.08％，血浆基质效应低，稳定性高。
本发明提示CPUL1在结直肠癌细胞中的代谢动力学相关参数，给药后0-48小时内的Tmax，Cmax和AUC，考察其生物利用度及安全性，为新药开发奠定了基础。
附图说明：
图1CPUL1对结直肠癌细胞系的药效验证，其中结直肠癌细胞分别为；A为HCT-116；B为SW480；C为SW620；D为HCT-8；E为LoVo。
图2为CPUL1对结直肠癌细胞系的凋亡检测,A为SW480；B为HCT-8；C为HCT-116；D为SW620；E为LoVo。
图3为CPUL1对结直肠癌细胞的周期作用分析；A为HCT-116；B为SW480；C为SW620；D为HCT-8；E为LoVo。
图4为CPUL1(左)和内标(右)在人血浆中的典型色谱图，其中A为空白血浆；B为含CPUL1的人血浆；C为含内标的人血浆；D为含CPUL1和内标的人血浆；E标曲最高浓度进样后紧邻的空白血浆；
图5为CPUL1在人血浆中的标准曲线；
图6为结直肠癌细胞系中的CPUL1细胞代谢动力学时间-浓度曲线；其中A为SW480，B为HCT-8，C为LoVo，D为HCT-116，E为SW620。
具体实施方式
下述实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但所述实施例不限制本发明的保护范围。
本发明使用三重四级杆质谱仪(AB Sciex 4000
Figure BDA0003188647930000041
)配有Shimadzu液相色谱仪，化合物CPUL1来自中国药科大学。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例1-3所述结直肠癌细胞包括：SW480,HCT-8,HCT-116,SW620,LoVo。
下述实施例4的方法学验证试验，均设置六次重复实验
实施例1 CCK8法细胞毒性检测
5种结直肠癌细胞分别在0-20μM的CPUL1浓度范围内，孵育48h后，绘制生长曲线。通过CCK8测定观察到，不同浓度CPUL1均有抑制结直肠癌细胞增殖的作用，并随着浓度的增加细胞增殖抑制率逐步升高，具有显著的浓度依赖性。结果如图1所示，IC50分别为：(1)SW480：2.624；(2)HCT-8：5.349；(3)HCT-116：4.248；(4)SW620:4.096；(5)LoVo：8.555。
实施例2 Annexin V/PI法细胞凋亡检测
5种结直肠癌细胞经过不同浓度的CPUL1干预24h和48h后，使用Annexin V/PI法，检测细胞凋亡率，发现在在药物作用24小时后，凋亡率逐渐升高，可见5种结直肠癌细胞对CPUL1很敏感。图2结果显示CPUL1对结直肠癌细胞均有显著的促凋亡现象。
实施例3 PI染色法细胞周期检测
5种结直肠癌细胞在浓度为2μM的CPUL1干预48h后，使用PI染色法，检测对细胞周期的调节作用。图3结果显示CPUL1使细胞周期停滞于G1－S期，可能是抑制了DNA的合成和有丝分裂，从而引起了结直肠癌细胞周期阻滞。
实施例4方法学验证
(1)专属性和残留：分析空白血浆样本、只含CPUL1的血浆样本、只含内标的血浆样本和含有CPUL1和内标血浆样本。通过比较空白血浆和加标血浆的CPUL1色谱图，观察待测物出峰位置是否有杂质峰干扰(见表1)。空白血浆中无CPUL1和内标的干扰峰，两化合物在只含有CPUL1、只含有内标和同时含有CPUL1和内标的人血浆样品中的保留时间一致，峰形良好，且无相互出峰干扰；在含有CPUL1 10μg/mL的人血浆样本中，CPUL1的保留时间为10.44min，未发现其他化合物的色谱峰；在只添加内标的血浆样本中，内标保留时间为6.69min，CPUL1的峰面积小于LLOQ的20％。标曲最高浓度进样后紧邻的空白血浆样品结果显示，CPUL1的峰面积小于LLOQ的20％，内标峰面积小于LLOQ的5％，未发现其他化合物干扰峰，说明该方法在高浓度样品检测后无残留现象。
表1 CPUL1液相色谱分离条件时间程序
Figure BDA0003188647930000051
(2)线性和LLOQ
配制CPUL1浓度范围为1～1000ng/mL的11份标准曲线工作液，以CPUL1浓度为横坐标，CPUL1和内标峰面积之比为纵坐标，最小二乘法进行线性回归，权重1/x制作标准曲线，得到线性回归方程为y＝0.00585x+0.00134，r为0.9997(见图5)；该方法的定量下限(LLOQ)为1ng/mL，精密度为2.85％，准确度为0.37％(见表2)。
表2 CPUL1的质谱条件优化参数
Figure BDA0003188647930000052
(3)精密度和准确度
制备CPUL1 2、10、100和1000ng/mL四个浓度的加标血浆样品，根据当日工作曲线进行样品浓度考察，对比测得浓度和和理论浓度来计算批内精密度和准确度，连续进样三天计算批间精密度和准确度。本方法样品批内精密度在5.23％以内，准确度在±5.23％以内，批间精密度在5.17％以内，准确度在±4.75％以内(见表3)。
表3血浆样本中CPUL1精密度和准确度
Figure BDA0003188647930000061
(4)质控样品
选取含内标的CPUL1浓度为2、10、100、800ng/mL的血浆样品进行质控样品考察，质控样本数据的精密度和准确度见表4，样本的精密度均小于1.71％，准确度均在±5.76以内。
表4质控样品的精密度和准确度
Figure BDA0003188647930000062
(5)回收率和血浆基质效应
按生物样本前处理方法制备CPUL1浓度为2、10、100和1000ng/mL的血浆样品，进样分析后的峰面积为A1；用生理盐水制备上述四个浓度的样品，检测分析后的峰面积为A2；在90μL血浆中加入含内标的沉淀剂，离心(14000rpm 10min,4℃)后，取上清加入10μL CPUL1工作液，检测分析后得到的峰面积为A3。用A1和A3的比值作为样品回收率；以CPUL1的峰面积A1与A2之比作为基质因子(Matrix factor，MF)。表5为血浆样品CPUL1回收率和基质效应测定结果，样品回收率的％RSD小于8.08％，基质效应因子MF的％RSD小于7.61％，由此证明此方法回收率高，基质效应影响小。
表5血浆样品CPUL1回收率和基质效应测定结果
Figure BDA0003188647930000071
(6)稳定性
将样品分别放置4℃和室温下24h，以考察其贮藏稳定性；将样品-80℃反复冻融三次以考察其冻融稳定性；-80℃冻存22天和30天来考察短期冻融稳定性，-80℃冻存60天来考察长期冻融稳定性。方法稳定性在考察的上述条件稳定性测试中，所有的精密度均小于8.50％，准确度均在±10.20％以内，数据如表4所示，说明CPUL1在所考察的五种条件下都具有较好的稳定性。
实施例5 CPUL1代谢动力学检测
采用人源结直肠癌细胞系来考察CPUL1的代谢动力学，细胞接种于24孔板，待其生长贴壁，以给药干预时密度达70％为宜。待细胞贴壁后，根据实验分组加入药物分别处理细胞：48h、24h、12h、8h、4h、2h、1h、45min、30min、15min、5min和0min12个时间点，给药浓度为1.5μmol/L。给药结束后，统一收样，收集培养基至1.5mL EP管中，-80℃冻存。24孔板用预冷的PBS洗涤后加入300μL超纯水，封口膜封闭后置于-80℃反复冻融三个循环，移液枪吹落贴壁细胞，转移至EP管，涡旋振荡器混匀后，转移50μL样品至EP管，同时转移20μ用于蛋白定量后对细胞基质进行校准。向50μL细胞样品中，加入加标沉淀剂200μL，充分震荡后高速离心14000r，10min，取180u上清于EP管中，再次离心14000r，10min，取100u上清于自动进样瓶中进行样品分析。以上样品重复四次。通过应用所开发的LC-MS/MS方法对其进行检测，结果如图6和表6所示。每种细胞的Cmax、Tmax，AUC见表6，SW480，SW620和HCT-8在给药48h出现最高血药浓度。
表6 CPUL1在结直肠癌细胞系中药代动力学参数
Figure BDA0003188647930000081

Claims (8)

1.一种抗肿瘤候选化合物CPUL1在治疗结直肠癌药物中的应用，所述的CPUL1的结构式如下
Figure RE-968533DEST_PATH_IMAGE002
。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所涉及的结直肠癌细胞系分别为：SW480，SW620，HCT-8，HCT-116，LoVo。
3.一种如权利要求1所述的CPUL1的测定方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
（1）工作溶液的配制：标准储备液的配制，精密称取CPUL1，用DMSO配制成混合标准品储备液量备用；精密称取内标化合物，配制内标储备液；标准工作溶液的配制，以乙腈为稀释液，配制成系列标准溶液；
（2）样品前处理：精确量取90μL空白血浆和10μL的CPUL1工作液至1.5mL离心管中，振荡30s，再加入400μL浓度为300ng/ml的内标溶液，充分振荡5min后， 14,000 rpm×10 min离心, 4°C，取350μL上清至新的1.5mL离心管， 14,000 rpm×10 min离心, 4°C，取200μL上清于进样瓶中；
（3）LC-MS/MS方法：液相色谱条件：流动相A：含0.1%乙酸的5mM的乙酸铵和流动相B：含0.1%乙酸的甲醇度洗脱，两者的体积比为5：95，流速为0.25mL/min；进样量为2μL；质谱条件：电喷雾离子源，负离子模式检测；气体供应均为高纯氮；气帘气为12psi；雾化气为35psi；辅助加热气为35psi；碰撞气为Medium；离子喷雾电压为4000V；离子源温度为550℃；扫描方式为多重反应监测模式。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述内标为染料木素。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述样品前处理方法采用乙腈作为沉淀剂。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（3）采用色谱柱为Phenomenex LunaC18液相色谱柱150mm×4.6mmID，3μm。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述化合物在结直肠癌细胞HCT-8，SW620，SW480中的Tmax为48h，HCT-116为8h，LoVo为0.69h。
8.根据权利要求3-7所述的方法，其特征在于：所有用到的水均为超纯水，所有有机试剂均为色谱级。
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