KR20100084648A - 증식 표지 및 위장관 암에 대한 예후 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 환자 중 암, 특히 위암 또는 대장암과 같은 위장관 암에 대한 예후를 결정하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 세포 증식 표지에 기초하여 위 또는 대장암과 같은 암의 예후를 예측하기 위한 유전자 마커의 용도에 관한 것이다. 다양한 측면에서, 본 발명은 다른 방법 중에서, 암 환자의 장기 생존 가능성을 예측하기 위한 방법, 암 환자의 치료 계획을 결정하는 방법, 암 환자에 대한 개인화된 유전자 프로필을 제조하는 방법 뿐 아니라, 이 방법을 수행하기 위한 키트 및 장치에 관한 것이다.
Description
본 발명은 환자의 암 특히, 위장관 암의 예후를 결정하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 세포 증식 표지에 기초하여 암, 예를 들어 위장관 암의 예후를 결정하기 위한 유전자 마커의 용도에 관한 것이다.
세포의 증식은 생물체에서 가장 근본적인 과정이고, 이러한 과정은 증식 관련 유전자의 발현 레벨에 의해 정교하게 조절된다(1). 증식 조절의 상실은 암의 특징이고, 이에 성장 조절 유전자가 이웃하는 정상 조직에 비하여 종양에서 비정상적으로 발현된다는 것은 놀라운 것이 아니다(2). 급증하는 변화는 예를 들어 침범 및 전이능력과 같은 세포 특성의 다른 변화를 동반할 수 있으므로, 환자 귀추에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 연관성은 실질적인 관심을 유발시켰고, 많은 연구들이 귀추의 잠재적 표지자로서 종양 세포 증식의 탐구에 몰두하여 왔다.
세포 증식은 대개 유동 세포계수(flow cytometry)에 의해 접근되거나, 또는 더욱 일반적으로 조직에서 증식 마커의 면역조직화학적 평가에 의해 접근되어 왔다(3). 가장 널리 사용되는 증식 마커는 Ki-67로, 휴지기 G0를 제외한 모든 세포 주기상에서 발현되는 단백질이다(4). Ki-67을 사용하여, 악성 종양, 예를 들어 유방암, 폐암, 연조직 종양(soft tissue tumour) 및 성상세포종(astrocytoma)에서 세포 주기 부분과 임상적 결과 사이의 명확한 연관성이 정립되었다(5). 유방암에서, 마이크로어레이 분석에 의해 이러한 연관성이 확인되었으며, 증식성 유전자 발현 프로필을 이끌어 내어, 증가된 재발 위험에 있는 환자를 식별하는데 적용되어 왔다(6).
그러나, 대장암(colorectal cancer: CRC)에서 증식 지수(proliferation index: PI)는 예후 인자로서 충돌하는 결과를 낳았으며, 이에 따라 임상 상황에 적용될 수 없다(하기 참조). 연구는 환자의 선택, 샘플링 방법, 차단값(cut-off point) 레벨, 항체 선택, 염색 기술 및 데이터가 수집되고 해석되는 방법에 따라 다양화된다. 이러한 연구의 방법적 차이 및 상이함이 부분적으로 (7), (8)의 상충하는 결과를 설명한다. 또한, 증식 마커로서 Ki-67의 용도 역시 한계가 있다. Ki-67 Pl은 활발한 주기의 세포 분획(fraction)을 평가하는 것이나, 세포 주기의 길이에 대하여는 어떠한 의미도 부여하지 않는다(3), (9). 따라서, 유사한 Pl을 가진 종양은 다른 속도의 주기로 인해 다른 비율로 자랄 수 있다. 또한, Ki-67 mRNA는 휴지 세포에서 생산되지 않는 반면, 단백질은 과대평가된 증식 속도를 유도하는 대장 종양 부분에서 여전히 감지될 수 있다(10).
단일 증식 마커를 사용한 예후의 평가가 CRC에서 신뢰할 만한 것으로 보이지 않기 때문에(하기 참조), 위장관암의 예후를 예상하기 위한 도구가 더 필요하다. 본 발명은 예후 암 마커, 구체적으로 위장관암 예후 마커에 기반한 방법 및 조성물을 더 제공하여, 암의 예후 및 치료에 도움이 되도록 한다.
발명의 요약
본 발명의 측면에서, 마이크로어레이 분석은 암세포에 대한 증식 표지를 제공하는 유전자를 확인하는데 사용된다. 이러한 유전자 및 이들 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 본 명세서에서 위장관 암 증식 마커(gastrointestinal cancer proliferation markers: GCPMs)를 의미한다. 본 발명의 하나의 측면에서, 예후를 위한 암은 위장관 암, 특히 위암 또는 대장암이다.
특정한 측면에서, 본 발명은 샘플 중 하나 이상의 GCPM의 발현 레벨을 확인하는 것에 의해 암의 예후를 결정하는 방법을 포함한다. 선택된 GCPM는 세포 증식, 예를 들어 세포 주기 구성요소와 관련된 단백질을 코딩한다. 이러한 GCPM는 추가적으로 예후에 기초하여 특정 암에 대한 가장 우수한 치료 계획을 결정하는 방법에 사용된다. 특정 측면에서, GCPM 레벨은 재발성 종양 조직과 비교하였을 때, 비재발성 종양 조직(non-recurring tumour tissue)에서 더 높다. 이러한 마커는 단독 또는 다른 마커와 조합하여 또는 공지의 암 마커와 조합하여 사용될 수 있다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 (a) 암 샘플을 제공하는 것; (b) 샘플 중 하나 이상의 GCPM 패밀리 구성(GCPM family member)의 발현 레벨을 검출하는 것; 및 (c) 암의 예후를 결정하는 것을 포함하는 암의 예후를 결정하는 방법을 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 GCPM RNA, 예를 들어 하나 이상의 mRNA의 발현 레벨을 검출하는 단계를 포함한다. 추가적인 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 GCPM 단백질의 발현 레벨을 검출하는 단계를 포함한다. 더욱 추가적인 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 GCPM 펩티드의 레벨을 검출하는 단계를 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 샘플 중 하나 이상의 GCPM 패밀리 구성의 발현 레벨을 검출하는 것을 포함한다. 추가적인 측면에서, 상기 GCPM는 세포 증식, 예를 들어 세포 주기 구성과 관련된 유전자이다. 다른 측면에서, 하나 이상의 GCPM는 명세서 중의 표 A, 표 B, 표 C 또는 표 D로부터 선택된다.
더 추가적인 측면에서, 본 발명은 명세서 중 표 A, 표 B, 표 C 또는 표 D에 나타난 하나 이상의 GCPM의 발현 레벨을 검출하는 방법을 포함한다. 더욱 추가적인 측면에서, 본 발명은 CDC2, MCM6, RPA3, MCM7, PCNA, G22P1, KPNA2, ANLN, APG7L, TOPK, GMNN, RRM1, CDC45L, MAD2L1, RAN, DUT, RRM2, CDK7, MLH3, SMC4L1, CSPG6, POLD2, POLE2, BCCIP, Pfs2, TREX1, BUB3, FEN1, DRF1, PREI3, CCNE1, RPA1, POLE3, RFC4, MCM3, CHEK1, CCND1 및 CDC37 중 하나 이상의 발현 레벨을 검출하는 방법을 포함한다. 더욱 추가적인 측면에서, 본 발명은 CDC2, RFC4, PCNA, CCNE1, CCND1, CDK7, MCM 유전자, FEN1, MAD2L1, MYBL2, RRM2 및 BUB3 중 하나 이상의 발현 레벨을 검출하는 것을 포함한다.
추가적인 측면에서, 예를 들어 표 A, 표 B, 표 C 또는 표 D로부터 선택; CDC2, MCM6, RPA3, MCM7, PCNA, G22P1, KPNA2, ANLN, APG7L, TOPK, GMNN, RRM1, CDC45L, MAD2L1, RAN, DUT, RRM2, CDK7, MLH3, SMC4L1, CSPG6, POLD2, POLE2, BCCIP, Pfs2, TREX1, BUB3, FEN1, DRF1, PREI3, CCNE1, RPA1, POLE3, RFC4, MCM3, CHEK1, CCND1 및 CDC37로부터 선택; 또는 CDC2, RFC4, PCNA, CCNE1, CCND1, CDK7, MCM 유전자 (예를 들어, 하나 이상의 MCM3, MCM6 및 MCM7), FEN1, MAD2L1, MYBL2, RRM2 및 BUB3로부터 선택되는, 2 이상, 5 이상, 또는 10 이상, 15 이상, 20 이상, 25 이상, 30 이상, 35 이상, 40 이상, 45 이상, 50 이상 또는 75 이상의 증식 마커 또는 이들의 발현 산물의 발현 레벨이 결정된다.
다른 측면에서, 예를 들어 표 A, 표 B, 표 C 또는 표 D에 리스트된 것; CDC2, MCM6, RPA3, MCM7, PCNA, G22P1, KPNA2, ANLN, APG7L, TOPK, GMNN, RRM1, CDC45L, MAD2L1, RAN, DUT, RRM2, CDK7, MLH3, SMC4L1, CSPG6, POLD2, POLE2, BCCIP, Pfs2, TREX1, BUB3, FEN1, DRF1, PREI3, CCNE1, RPA1, POLE3, RFC4, MCM3, CHEK1, CCND1 및 CDC37 그룹에 리트스된 것; 또는 CDC2, RFC4, PCNA, CCNE1, CCND1, CDK7, MCM 유전자 (예를 들어, 하나 이상의 MCM3, MCM6 및 MCM7), FEN1, MAD2L1, MYBL2, RRM2, 및 BUB3 그룹에 리스트된 모든 증식 마커 또는 이들의 발현 산물의 발현 레벨이 결정된다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 (a) 암 샘플을 제공하는 것; (b) 샘플 중 하나 이상의 GCPM 패밀리 구성의 발현 레벨을 검출하는 것; (c) 하나 이상의 GCPM 패밀리 구성의 발현 레벨에 기초하여 암의 예후를 결정하는 것; 및 (d) 예후에 따라 치료 계획을 결정하는 것을 포함하는 암의 치료 계획을 결정하는 방법을 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 (a) 하나 이상의 GCPM 포획 시약을 가지는 기재; 및 (b) 하나 이상의 포획된 GCPM, 포획 시약 또는 이의 복합체를 검출할 수 있는 검출기를 포함하는 하나 이상의 GCPM를 검출하기 위한 장치를 포함한다.
본 발명의 추가적인 측면은 (a) GCPM 포획 시약; (b) 포획된 GCPM, 포획 시약 또는 이의 복합체를 검출할 수 있는 검출기; 및 선택적으로 (c) 사용을 위한 안내서를 포함하는 암 검출용 키트를 포함한다. 소정의 측면에서, 상기 키트는 또한 포획되는 GCPM를 위한 기재를 포함한다.
본 발명에 따른 추가적 측면은 (a) 하나 이상의 GCPM에 특이적인 포워드 프라이머(forward primer); (b) 하나 이상의 GCPM에 특이적인 리버스 프라이머(reverse primer); (c) PCR 시약; 및 선택적으로 하나 이상의 (d) 반응 바이알(vial) 및 (e) 사용을 위한 안내서를 포함하는 정량적 PCR을 사용하여 하나 이상의 GCPM를 검출하는 방법을 포함한다.
본 발명에 따른 추가적인 측면은 (a) 하나 이상의 GCPM 단백질 또는 펩티드에 특이적인 항체 또는 항체 단편; 및 선택적으로 하나 이상의 (b) 항체 또는 항체 단편에 대한 라벨(label) 및 (c) 사용을 위한 안내서를 포함하는 하나 이상의 GCPM 단백질 또는 펩티드의 존재를 검출하기 위한 키트를 포함한다. 소정의 측면에서, 상기 키트는 또한, 하나 이상의 GCPM 단백질 또는 펩티드를 위한 포획 시약을 가지는 기재를 포함한다.
구체적인 측면에서, 본 발명은 위장관암, 특히 대장암 또는 위암의 예후를 결정하는 방법으로서, (a) 위장관암을 가진 것으로 의심되는 환자로부터 샘플, 예를 들어 종양 샘플을 제공하는 단계; (b) ELISA법을 사용하여 GCPM 단백질의 존재를 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 추가적인 측면에서, 본 발명에 따른 하나 이상의 GCPM는 명세서 중 표 A, 표 B, 표 C 또는 표 D에 기재된 군으로부터 선택된다. 본 발명에 따른 다른 측면 및 실시예는 하기에 기재되어 있다.
도면의 간단한 설명
본 발명은 구체적인 실시예 및 도면을 참조하여 설명된다.
도 1: 명세서에 개시된 유전자 증식 지표(gene proliferation signature: GPS)를 유도 및 적용하는데 사용된 접근법에 대한 개요이다.
도 2A: 73 코오트(Cohort) A 종양을 유전자 증식 표지의 발현 레벨에 따라 2 그룹으로 K-평균 클러스터링한 것이다. 도 2B: Ki-67 PI (%)의 막대 그래프로, 수직선은 모든 샘플에서의 평균 Ki-67 PI을 나타낸다. 약 평균 및 평균 미만의 증식 지수를 가진 종양은 각각 빨강 및 녹색으로 표시되었다. 결과는 증식 표지의 과발현이 항상 더 높은 Ki-67 PI와 관련된 것은 아님을 나타낸다.
도 3: GPS(유전자 증식 표지) 및 Ki-67 PI의 발현 레벨에 따른 카플란-마이어 생존 곡선(Kaplan-Meier survival curve)이다. 전반적 생존(overall survival: OS) 및 재발없는 생존(recurrence-free survival: RFS) 둘 다는 대장암 코오트 A(a, b) 및 대장암 코오트 B(c, d) 중 GPS 발현이 낮은 환자에서 유의하게 더 짧다. Ki-67 PI(e, f)에 따른 코오트 A 환자의 생존율에는 어떠한 차이도 관찰되지 않았다. 로그 순위 테스트(Log rank test)로부터 P값이 나타나 있다.
도 4: 위암 환자 중 GPS(유전자 증식 표지)의 발현 레벨에 따른 카플란-마이어 생존 곡선이다. 전반적인 생존은 이러한 혼합 단계의 38 위암 환자의 코오트 중 GPS 발현이 낮은 환자에서 현저하게 더 짧다. 로그 순위 테스트로부터 P값이 나타나 있다.
도 5: 11개의 QRT-PCR-평가된 유전자(QRT-PCR-validated gene)의 대수기(exponential phase: EP) 중 주기 세포 및 정지기(stationary phase: SP) 중 성장 억제된 세포 사이의 발현 양상을 보여주는 상자-수염 그림(box-and-whisker plot)이다. 상자 범위는 25 내지 75 퍼센트의 데이터를 포함한다. 상자에서 수평선은 평균값을 나타낸다. "수염(whisker)"은 가장 크고 가장 작은 값(극단치 제외)이다. 상자의 끝으로부터 사분 범위의 3/2배를 초과하는 어떠한 지점이라도 극단치가 될 것이며, 점으로 표현된다. Y 축은 셀라인 RNA 및 표준 RNA 사이의 비율의 log 2배 변화를 나타낸다. 분석은 SPSS 소프트웨어를 사용하여 수행되었다.
발명의 상세한 설명
단일의 증식 마커는 신뢰할 만한 CRC 예후를 얻기에 부족하기 때문에, 몇몇 성장 관련 유전자를 마이크로어레이에 의해 동시적으로 분석하는 것이 적용되어, 위장관 종양의 증식 상태를 결정하는 더욱 정량적이면서도 객관적인 방법을 제공한다. 표 1(하기)은 이전에 공개되어 대장암에 대한 예후 인자로서 증식 지수(proliferation index: PI)를 사용하는 데서 보여지는 상충되는 결과를 나타낸다.
표 1: CRC 환자의 생존과 증식 지표의 연관성에 대한 연구 요약
이와 달리, 본 개시 사항은 (i) 셀라인 모델을 사용하여 CRC-특이적 유전자 증식 지표(gene proliferation signature : GPS)를 정의함; 및 (ii) 환자 귀추에 대한 예상에서 GPS의 예후적 유의성 및 2가지 독립적 코오트의 CRC 환자에서 임상-병리적 변수와의 관계를 결정하는 것에 성공하였다.
정의
본 발명의 실시예를 구체적으로 기술하기 전에, 명세서 중 사용된 용어의 정의를 제공하는 것이 유용할 것이다.
본원에서 사용되는 "항체"와 같은 용어는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린(Ig) 분자의 면역적으로 활성 부분 즉, 항원과 특이적으로 결합(면역 반응)하는 항원 결합 부위를 포함하는 분자를 의미한다. 이는 폴리클로날, 모노클로날, 키메라 항체, 단쇄 항체, Fc, Fab, Fab', 및 Fab2 단편 및 Fab 발현 라이브러리를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 항체 분자는 분자 중 존재하는 헤비 체인의 특성에 의해 서로 달라지는 IgG, IgM, IgA, IgE 및 IgD 분류 중 어떠한 것이라도 포함한다. 이들은 또한 하위 분류 예를 들어 IgG1, IgG2 및 기타 다른 것도 포함한다. 라이트 체인은 카파 체인 또는 람다 체인일 수 있다. 본원에 참조되는 항체는 모든 분류, 하위 분류 및 유형에 대한 참조를 포함한다. 또한, 키메라 항체 예를 들어, 하나 이상의 소스 예를 들어 마우스 또는 인간 서열에 특이적인 모노클로날 항체 또는 이의 단편이 포함된다. 더욱이, 카멜리드 항체(camelid antibody), 샤크 항체(shark antibody) 또는 나노바디(nanobody) 역시 포함된다.
용어 "마커"는 생물학적 현상의 존재와 정량적 또는 정성적으로 연관된 분자를 의미한다. "마커"의 예시는 현상을 뒷받침하는 기작과 직접적으로 또는 간접적으로 연관되어 있는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 유전자 또는 유전자 단편, RNA 또는 RNA 단편 또는 펩티드, 올리고펩티드, 단백질 또는 단백질 단편과 같은 폴리펩티드; 또는 관련 대사산물, 부산물 또는 항체 또는 항체 단편과 같은 기타 동정된 분자를 포함한다. 본 발명의 마커는 명세서 중에 개시된 바와 같이 뉴클레오티드 서열(예를 들어 GenBank 서열), 특히 전장 서열, 어떠한 코딩 서열, 어떠한 단편 또는 이의 어떠한 상보적 서열이라도 포함한다.
용어 "GCPM" 또는 "위장관 암 증식 마커" 또는 "GCPM 패밀리 구성"은 본원에 기재된 바와 같이 긍정적 예후, 예를 들어 더 낮은 암의 재발 가능성과 관련된 증가된 발현을 가진 마커를 의미하나, 위장관암의 예후와 관련된 종래 기술에서 알려진 분자는 제외할 수 있다. 용어 GCP는 마커가 위장관 종양에 대하여만 특이적일 것을 요구하지는 않는 것으로 이해될 것이다. 오히려, GCPM의 발현은 악성 종양을 포함한 다른 유형의 종양에서 변형될 수 있다.
GCPM의 예시는 아래에 기재된 표 A, 표 B, 표 C 또는 표 D를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니며, 구체적인 그룹 CDC2, MCM6, RPA3, MCM7, PCNA, G22P1, KPNA2, ANLN, APG7L, TOPK, GMNN, RRM1, CDC45L, MAD2L1, RAN, DUT, RRM2, CDK7, MLH3, SMC4L1, CSPG6, POLD2, POLE2, BCCIP, Pfs2, TREX1, BUB3, FEN1, DRF1, PREI3, CCNE1, RPA1, POLE3, RFC4, MCM3, CHEK1, CCND1 및 CDC37; 및 구체적인 그룹 CDC2, RFC4, PCNA, CCNE1, CCND1, CDK7, MCM 유전자 (예를 들어, 하나 이상의 MCM3, MCM6 및 MCM7), FEN1, MAD2L1, MYBL2, RRM2 및 BUB3를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "암" 및 "암의"는 전형적으로 비정상적 또는 제어되지 않은 세포 성장의 특징을 가지는 포유동물에서의 생리학적 상태를 의미 또는 기술한 것이다. 암 및 암 병리는 예를 들어 전이, 정상적으로 기능하는 주변 세포에 대한 간섭, 비정상 레벨에서 싸이토카인 또는 다른 분비 산물의 방출, 염증성 또는 면역학적 반응의 억제 또는 증대, 종양형성(neoplasia), 전암(premalignancy), 악성종양(malignancy), 주위 또는 거리가 있는 조직 또는 기관, 예를 들어 림프절 침범(invasion) 등과 연관될 수 있다. 구체적으로 위장관암, 예를 들어 식도, 복부, 소장, 대장, 항문 및 직장암이 포함되며, 특히, 위 및 대장암이 포함된다.
용어 "대장암"은 결장, 직장에 대한 암 및 특히 선암(adenocarcinomas)을 포함하며, 또한 상피성암(carcinomas)(예를 들어, 편평 총배설강 암(squamous cloacogenic carcinomas)), 흑색종(melanomas), 림프종 및 육종(sarcomas)을 포함할 수 있다. 표피양(epidermoid : 비각질 편평세포 또는 기저세포양(basaloid)) 암종 또한 포함된다. 암은 특정 유형의 폴립(polyp) 또는 기타 병변, 예를 들어 관상 선종, 관상융모성 선종(예를 들어, 융모샘 폴립), 융모성(예를 들어 유두) 선종(선암과 함께 또는 선암없이), 과용종 폴립(hyperplastic polyps), 과오종(hamartomas), 유년성 (juvenile) 폴립, 폴리포이드 암종(polypoid carcinomas), 슈도폴립(pseudopolyp), 지방종 또는 평활근종과 연관될 수 있다. 암은 가족성 용종증과 관련될 수 있고 가드너 증후군(Gardner's syndrome) 또는 포이츠예거 (Peutz-Jeghers) 증후군과 같은 관련 조건과 연관될 수 있다. 암은 예를 들어 만성 누공(chronic fistulas), 자극된 항문 피부(irradiated anal skin), 백반증, 서혜 림프 육아종, 보웬병(Bowen's disease)(상피내암종), 음부사마귀(condyloma acuminatum) 또는 인간 유두종 바이러스와 연관될 수 있다. 다른 측면에서, 암은 기저세포 암종, 유방외 파제트병(extramammary Paget's disease), 총배설강 암종 또는 악성 흑색종과 연관될 수 있다.
용어 "차별적으로 발현되는 유전자," "차별적 유전자 발현" 등의 문구는 유전자의 발현이 개체(예를 들어, 테스트 샘플) 구체적으로 암 예를 들어 위장관 암 내에서, 대조군 개체(예를 들어 대조군 샘플)에서의 발현에 비해 더 높은 또는 더 낮은 레벨로 활성화되는 것을 의미한다. 용어는 또한 유전자의 발현이 동일한 질병의 다른 단계; 재발 또는 비재발성 질병에서; 또는 더 높은 또는 더 낮은 레벨의 증식을 나타내는 세포에서 더 높은 또는 더 낮은 레벨로 활성화되는 것을 포함한다. 차별적으로 발현되는 유전자는 폴리뉴클레오티드 레벨에서 또는 폴리펩티드 레벨에서 활성화되거나 또는 저해될 수 있으며, 선택적 스플라이싱(alternative splicing)하여 다른 폴레펩티드 산물을 만들어 낼 수 있다. 이러한 차이는 예를 들어 mRNA 레벨, 표면 발현, 분비 또는 기타 폴리펩티드의 구분에 의해 입증될 수 있다.
차별적 유전자 발현은 2 이상의 유전자 또는 이들의 유전자 산물 사이의 비교; 또는 2 이상의 유전자 또는 이들의 유전자 산물 사이에 발현 비율의 비교; 또는 정상 개체 및 질병에 걸린 개체 사이; 또는 동일한 질병의 다양한 단계 사이; 또는 재발 및 비재발성 질병 사이; 또는 더 높은 및 더 낮은 레벨의 증식성을 가진 세포 사이; 또는 정상 조직 및 질병에 걸린 조직, 구체적으로 암 또는 위장관암 사이에 차이가 있는, 동일한 유전자의 차별적으로 처리된 두 산물에 대한 비교를 포함할 수 있다. 차별적 발현은 예를 들어 정상 및 질병에 걸린 세포 중 또는 다른 질환 진행 또는 질병 단계를 겪고 있는 세포 중 또는 다른 레벨의 증식을 나타내는 세포 중에서, 유전자 또는 이의 발현 산물에서의 시간적 또는 세포적 발현 패턴의 정량적 차이 뿐 아니라, 정성적 차이 둘 다를 포함한다.
용어 "발현"은 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드, 특히 유전자 또는 유전자의 일부로부터의 RNA 산물(예를 들어 mRNA)을 포함하며, RNA 또는 유전자 또는 일부 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 산물 및 발현에 관련된 검출가능한 물질의 형상을 포함한다. 예를 들어, 단백질-단백질 상호작용, 단백질-뉴클레오티드 상호작용 등으로부터 복합체의 형성은 용어 "발현"의 범주 내에 포함된다. 다른 실시예는 예를 들어 하이브리다이제이션 프로브(hybridization probe) 또는 항체와 같은 바인딩 리간드(binding ligand)의 유전자 또는 기타 올리고뉴클레오티드, 단백질 또는 단백질 단편에의 결합 및 바인딩 리간드의 가시화(visualization)이다. 이에 따라, 마이크로어레이 상에, 노던블랏(Northern blot)과 같은 하이브리다이제이션 블랏 상에 또는 웨스턴 블랏(Northern blot)과 같은 이뮤노블랏 (immunoblot)상에 또는 비드 어레이(bead array) 상의 점(spot)의 증가된 강도, 또는 PCR 분석에 의한 증가된 강도는 생물학적 분자를 뒷받침하는 "발현"이라는 용어의 범위 내에 포함된다.
용어 "위암"은 복부 및 주변 조직의 암, 특히 선암을 포함하며, 림프종 및 평활근육종 또한 포함한다. 암은 위 궤양 또는 위 폴립과 연관될 수 있으며, 돌출(protruding), 침투(penetrating), 퍼짐(spreading) 또는 이러한 분류의 조합 또는 경우에 따라서, 표면형(상승된, 평평한 또는 가라앉은) 또는 함요형(excavated)으로 분류될 수 있다.
용어 "장기 생존"은 수술 또는 기타 치료 후 5년 이상, 더 바람직하게 8년 이상, 가장 바람직하게 10년 이상 동안 생존하는 것을 의미하는 데 사용된다.
용어 "마이크로어레이"는 포획제, 바람직하게 기재 상의 폴리뉴클레오티드(예를 들어 프로브) 또는 폴리펩티드의 질서있는 배열을 의미한다. 예를 들어 Microarray Analysis, M. Schena, John Wiley & Sons, 2002; Microarray Biochip Technology, M. Schena, ed., Eaton Publishing, 2000; Guide to Analysis of DNA Microarray Data, S. Knudsen, John Wiley & Sons, 2004; 및 Protein Microarray Technology, D. Kambhampati, ed., John Wiley & Sons, 2004 참조.
용어 "올리고뉴클레오티드"는 폴리뉴클레오티드, 일반적으로 단일 가닥 디옥시라이보뉴클레오티드, 단일 또는 이중 가닥 라이보뉴클레오티드, RNA: DNA 하이브리드 및 이중 가닥 DNA를 포함하는 프로브 또는 프라이머를 의미하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 단일 가닥 DNA 프로브 올리고뉴클레오티드는 종종 화학적 방법에 의해 합성되는데, 예를 들어 상업적으로 시판되고 있는 자동화된 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하거나, 다양한 기타 방법에 의해 합성될 수 있으며, in vitro 발현 시스템, 재조합 기술 및 세포와 생물체에서의 발현을 포함한다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 단수 또는 복수로 사용하는 경우 일반적으로 폴리라이보뉴클레오티드 또는 폴리디옥시라이보뉴클레오티드를 의미할 수 있으며, 변형되지 않은 RNA 또는 DNA, 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있다. 이는 단일 및 이중 가닥의 DNA, 단일 및 이중 가닥 부분을 포함하는 DNA, 단일 및 이중 가닥의 RNA 및 단일 및 이중 가닥 부분을 포함하는 RNA, 단일 가닥의 또는 더욱 일반적으로 이중 가닥일 수 있는 DNA와 RNA를 포함하거나 단일 및 이중 가닥 부분을 포함하는 하이브리드 분자를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, RNA 또는 DNA 또는 RNA 및 DNA 모두를 포함하는 삼중 가닥 부분도 포함된다. 구체적으로, mRNAs, cDNAs 및 지노믹 DNA(genomic DNA)가 포함된다. 용어는 하나 이상의 변형된 염기, 예를 들어 트리튬 처리된 염기(tritiated bases) 또는 특이적 염기, 예를 들어 이노신(inosine)을 포함하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 코딩 또는 코딩하지 않는 서열 또는 센스 또는 안티센스 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 "폴리펩티드"는 올리고펩티드, 펩티드 또는 단백질 서열 또는 이의 단편을 의미하며, 자연적으로 존재, 재조합, 합성 또는 반합성 분자를 의미한다. "폴리펩티드"가 인용되는 부분은 자연적으로 존재하는 단백질 분자의 아미노산 서열을 의미하고, "폴리펩티드" 등과 같은 용어는 아미노산 서열을 전장 분자에 대한 완전한, 원래의 아미노산 서열에 제한함을 의미하는 것은 아니다. "폴리펩티드" 등과 같은 용어의 각 참조는 전장 서열 뿐 아니라, 이의 어떠한 단편, 유도체 또는 변형물이라도 포함할 수 있음을 이해할 것이다.
용어 "예후"는 의학적 귀추(예를 들어 장기 생존 가능성)에 대한 예상을 의미하며, 음성적 (부정적) 예후 또는 나쁜 결과는 재발, 병의 진행(예를 들어, 종양 성장 또는 전이, 또는 약 저항성) 또는 치명성(mortality)를 포함하고, 양성적 (긍정적) 예후 또는 좋은 결과는 질병의 차도(disease remission: 예를 들어 질병없는 상태), 개선(amelioration: 예를 들어, 종양 퇴행) 또는 안정화(stabilization)를 포함한다.
용어 "예후 지표," "지표"등은 2 이상의 마크 세트, 예를 들어 GCPM을 의미하며, 세트로 함께 분석되는 경우 사건 예를 들어 대장암의 진단적 결과에 대한 결정 또는 예상할 수 있도록 한다. 2 이상의 마커를 포함하는 표지의 사용으로 개인적 변수에 대한 영향을 감소시킬 수 있고, 더 용이한 예상을 허용한다. GCPM의 예시는 구체적인 그룹 CDC2, MCM6, RPA3, MCM7, PCNA, G22P1, KPNA2, ANLN, APG7L, TOPK, GMNN, RRM1, CDC45L, MAD2L1, RAN, DUT, RRM2, CDK7, MLH3, SMC4L1, CSPG6, POLD2, POLE2, BCCIP, Pfs2, TREX1, BUB3, FEN1, DRF1, PREI3, CCNE1, RPA1, POLE3, RFC4, MCM3, CHEK1, CCND1 및 CDC37; 및 구체적인 그룹 CDC2, RFC4, PCNA, CCNE1, CCND1, CDK7, MCM 유전자 (예를 들어, 하나 이상의 MCM3, MCM6, 및 MCM7), FEN1, MAD2L1, MYBL2, RRM2 및 BUB3를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 본문에서, 어떠한 특정 세트에 리스트된 마커(예를 들어 지료)에 대한 "하나 이상의" "둘 이상의" "5 이상의" 등의 언급은 리스트된 마커 중 어느 하나 또는 어떠한 것 및 모든 조합을 의미한다.
용어 "예상 방법"은 통계학, 기계적 학습, 인공적 지능 및 데이터 마이닝(data mining)의 분야에서부터 더 넓은 속의 방법까지 포함하여 정의되며, 예상 모델에 구체화하여 사용될 수 있다. 이들은 상세한 설명 항목에서 더 설명된다.
용어 "예상 모델"은 예상 방법을 데이터 수집에 적용하여 얻어진 구체적 수학적 모델을 의미한다. 구체적인 실시예에서, 이러한 데이트 세트(data set)는 재발 및 비재발성 대장암 환자로부터 가져온 조직 샘플에서 유전자 활성의 측정으로 이루어지며, 각 샘플의 부류(재발 또는 비재발)는 알려져 있다. 이러한 모델은 (1) 알려지지 않은 재발 상태의 샘플을 하나의 재발 또는 비재발로 분류하거나 (2) 알려지지 않은 샘플 중에서 구체화된 수집 유전자의 mRNA 발현 레벨에 대한 측정 또는 발현 산물에 기초하여 알려지지 않은 샘플이 재발할 가능성을 나타내는 개연론에 의거한 예상(즉, 확률로 해석될 수 있는 비율 또는 백분율 중 어느 하나를 유도)을 만든다. 이러한 유전자 특이적 측정방법에 대한 구체적인 설명을 조합하여 분류를 만들고, 개연론에 의거한 예상은 모델을 만드는데 사용된 예상 모델의 구체적인 기작에 따라 달라진다.
용어 "증식"은 증가된 세포 크기 또는 세포수를 유도하는 과정을 의미하며, 하나 이상의 종양 또는 세포성장, 신생혈관형성, 신경분포 및 전이를 포함할 수 있다.
용어 "qPCR" 또는 "QPCR"은 기술한 바와 같이 예를 들어 PCR 기술: Quantitative PCR, J.W. Larrick, ed., Eaton Publishing, 1997 및 A-Z of Quantitative PCR, S. Bustin, ed., IUL Press, 2004. 에서와 같은 정량적 폴리머레이즈 체인 반응(polymerase chain reaction)을 의미한다.
용어 "종양"은 악성 또는 양성과 무관하게, 모든 종양성 세포 성장 및 증식(neoplastic cell growth and proliferation)과 모든 전암 및 암 세포와 조직을 의미한다.
예상 모델의 효율성 언급에 적용되는 경우, "민감도" "특이성"(또는 "선택성") 및 "분류 비율"은 다음을 의미한다:
"민감도"는 (모델에 의해) 또한 양성적이라고 예상되는 전적으로 양성인 샘플의 비율을 의미한다. 암 재발에 대한 테스트에서 모델에 의해 재발할 것이라고 예상되는 재발 종양의 비율이 될 것이다. "특이성" 또는 "선택성"은 (모델에 의해) 또한 음성적이라고 예상되는 전적으로 음성인 샘플의 비율을 의미한다. CRC 재발에 대한 테스트에서, 이는 모델에 의해 비재발성일 것으로 예상되는 비재발성 샘플의 비율과 동일하다. "분류 비율"은 예상 모델에 의해 (양성 또는 음성인 것으로) 정확하게 분류된 모든 샘플의 비율이다.
본원에 정의된 "엄격 조건(Stringent condition)" 또는 "고엄격 조건(high stringency condition)"은 전형적으로: (1) 세척에 낮은 이온력 및 높은 온도를 적용, 예를 들어 50℃에서 0.015 M 소디움 클로라이드/0.0015 M 소디움 시트레이트(citrate)/0.1% 소디움 도데실 설페이트를 적용한다; (2) 하이브리다이제이션 동안 변형제(denaturing agent) 예를 들어, 포름아마이드 e.g. 50% (v/v) 포름아마이드와 pH 6.5에서 0.1% 소 항체 알부민/0.1% 피콜(Ficoll)/0.1% 폴리비닐피롤리돈/50 mM 소디움 포스페이트 버퍼를 42℃에서 750 mM 소디움 클로라이드, 75 mM 소디움 시트레이트를 함께 적용한다; (3) 42℃에서 50% 포름아마이드, 5X SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 소디움 시트레이트), 50 mM 소디움 포스페이트 (pH 6.8), 0.1% 소디움 파이로포스페이트(pyrophosphate), 5X Denhardt 용액, 초음파 처리된 연어 정자 DNA (50 ㎍/ml), 0.1% SDS 및 10% 덱스트란 설페이트를 적용하여 42℃의 0.2X SSC (sodium chloride/sodium citrate) 및 55℃ 의 50% 포름아마이드 중에서 세척한 다음, 55℃에서 0.1X SSC 포함 EDTA 를 포함하는 고엄격 세척을 적용한다.
"중간적 엄격 조건(moderately stringent condition)"은 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989에 기재된 바와 같이 확인될 수 있으며, 위에서 언급된 조건보다 덜 엄격한 세척 용액 및 하이브리다이제이션 조건(예를 들어 온도, 이온력 및 % SDS)의 사용을 포함한다. 중간적 엄격 조건의 예시는 20% 포름아마이드, 5X SSC (150 mM NaCl, 15 mM 트리소디움 시트레이트), 50 mM 소디움 포스페이트(pH 7.6), 5X Denhardt 용액, 10% 덱스트란 설페이트 및 20 mg/ml 변성되고 엇갈린 연어 정자 DNA(denatured sheared salmon sperm DNA)를 포함하는 용액을 37℃에서 밤새 인큐베이션한 다음, 1X SSC로 약 37-50℃에서 필터를 세척하는 것이다. 당업자는 프로브 길이 등과 같은 인자에 맞도록 필요한 만큼 온도, 이온력 등을 조정하는 방법을 인식할 것이다.
본 발명의 지침은 다른 것을 의미하지 않는 이상, 분자 생물학(재조합 기술 포함), 미생물학, 세포생물학 및 생화학의 종래 기술을 적용할 것이며, 이는 당업 기술의 범위 내에 있다. 이러한 기술들은 예를 들어 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Sambrook et al., 1989; Oligonucleotide Synthesis, MJ Gait, ed., 1984; Animal Cell Culture, R.I. Freshney, ed., 1987; Methods in Enzymology, Academic Press, Inc.; Handbook of Experimental Immunology, 4th edition, D .M. Weir & CC. Blackwell, eds., Blackwell Science Inc., 1987; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987; Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., 1987; 및 PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al., eds., 1994과 같은 문헌에 충분히 설명되어 있다.
발명에 대한 구체적인 실시예
몇몇 악성 종양에서 세포 증식은 귀추(outcome)의 표지자이다. 그러나, 대장암에서 조화를 이루지 못하는 결과가 보고되었다. 이러한 결과는 단일 증식 마커에 기반한 것으로, 본 발명은 이러한 한계를 극복하여 더 확정적인 결론에 도달할 수 있도록 하고, 대장암에서 세포의 증식에 대한 예후적 역할을 결정할 수 있도록 하는 마이크로어레이의 용도를 개시한다. 본원에 나타난 마이크로어레이 기반 증식 연구는 대장암에서 증식 표지의 감소된 비율이 불량한 결과와 연관되어 있음을 의미한다. 본 발명은 이에, 암으로부터 조기 사항의 위험이 높은 환자를 확인하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 질병의 예후 예를 들어 위장관암을 포함한 암의 재발 가능성에 대한 결정을 위한 마커를 제공한다. 본 발명에 따른 방법을 사용하여, 수 많은 마커가 위장관 암의 진행과 연관되어 있으며, 암의 예후를 결정하는 데 사용될 수 있음을 밝혀 내었다. 다양한 단계의 대장암을 가진 환자로부터 채취한 마이크로어레이 분석은 마커 발현의 특정한 패턴이 암의 예후와 연관되어 있다는 놀라운 발견으로 이끌었다.
소정의 GCPMs, 예를 들어 세포 증식과 관련된 마커에서의 증가는 양성적 예후를 의미한다. 이는 표준적 치료 이후 암, 특히 위 또는 대장암과 같은 위장관 암의 감소된 재발 가능성을 포함할 수 있다. 역으로, 이러한 마커에서의 감소는 음성적 예후를 의미한다. 이는 질병의 진행 또는 암, 특히 위 또는 대장암과 같은 위장관 암의 증가된 재발 가능성을 포함할 수 있다. 발현의 감소는 예를 들어 테스트 샘플(예를 들어 종양 샘플)과 양성적 예후와 관련된 샘플을 비교하여 결정될 수 있다. 발현 증가는 예를 들어 테스트 샘플(예를 들어 종양 샘플)과 음성적 예후와 관련된 샘플을 비교하여 결정될 수 있다.
예를 들어, 예후를 얻기 위해 환자의 샘플(예를 들어 종양 샘플)이 알려진 환자의 결과와 비교될 수 있다. 만약 환자의 샘플이 우수한 결과를 가지는 샘플과 비슷하게 증가된 GCPMs 발현을 나타냈다면 및/또는 불량한 결과를 가진 샘플에 비해 더 높다면, 양성적 예후를 시사한다. 만약 환자의 샘플이 불량한 결과를 가지는 샘플과 비슷하게 감소된 GCPMs 발현을 나타냈다면 및/또는 우수한 결과를 가진 샘플에 비해 더 낮다면 음성적 예후를 시사한다. 경우에 따라서, 환자의 샘플은 활발하게 증식/증식하지 않는 종양 세포 샘플과 비교될 수 있다. 만약 환자의 샘플이 활발하게 증식중인 세포와 비슷한 정도 및/또는 비증식 세포보다 더 높은 정도의 증가된 GCPMs 발현을 나타낸다면, 양성적 예후를 시사한다. 만약, 환자의 샘플이 증식하지 않는 샘플과 비슷한 정도 및/또는 활발하게 증식중인 세포보다 더 낮은 정도의 감소된 GCPMs 발현을 나타낸다면, 음성적 예후를 시사한다.
본 발명은 다양한 단계의 종양을 가진 암 환자로부터 확인되어 표 C에 기재된 유전자 세트를 제공하며, 이는 대장암에 예후적임을 나타낸다. 이러한 유전자는 모두 세포 증식과 연관된 것이며, 세포 증식 유전자 사이의 연관성 및 암 예후에서 이들의 용도가 확립된다. 또한, 표 C에 나타난 예후적 지표의 유전자들은 추가적인 세포 증식 유전자와 연관되어 있음이 밝혀졌다. 이러한 발견에 기초하여, 본 발명은 또한 표 D에 나타난 예후 마커로 사용하기 위한 세포 주기 유전자 세트를 제공하며, 높은 증식 그룹 및 낮은 증식 그룹 사이에서 차별적으로 발현된다. 더욱이, 예후 및 세포 증식 관련 유전자 사이에서 상관성에 대한 놀라운 발견에 기초하여, 본 발명은 또한 높은 증식 상태 및 낮은 증식 상태에 있는 셀라인 사이에서 차별적으로 발현되는 증식 관련 유전자 세트(표 A) 및 알려진 증식 관련 유전자(표 B)를 제공한다. 표 A, 표 B, 표 C 및 표 D에 기재된 유전자는 한 세트의 위장관 암 예후 마커(GCPMs)를 제공한다.
하나의 접근법으로, 마커 패널(예를 들어 GCPMs)의 발현은 선형 판별 분석(Linear Discriminant Analysis: LDA)를 포함한 기술에 의해 분석되어 예후 지수를 산출할 수 있다. 선택된 마커 패널 및 예후 지수 계산은 광범위한 연구 테스트 및 복수의 독립적 임상 발달 연구를 통해 유도될 수 있다.
이에 따라, 개시된 GCPMs는 암의 예후를 결정 및 그 종양에 구체적인 치료 계획을 확립하는 데 유용한 도구를 제공한다. 특히, 양성적 예후는 환자가 표준 또는 덜 침범적인 치료(invasive treatment) 옵션을 추구하도록 결정하는 데 사용될 수 있다. 음성적 예후는 환자가 치료를 끝내거나 매우 공격적이거나 실험적인 치료를 추구하도록 결정하는데 사용될 수 있다. 또한, 환자는 세포 증식 또는 세포 증식 마커(예를 들어 GCPMs)의 발현에 대한 영향에 기초하여 치료를 선택할 수 있다. 본 발명에 따라, 구체적으로 높은 증식성을 가지는 세포를 타겟으로 하거나 또는 구체적으로 세포 증식 마커(예를 들어 GCPMs)의 발현을 감소시키는 치료는 대장암 또는 위암과 같은 위장관암을 가진 환자에게 바람직하지 않을 것이다.
GCPMs의 레벨은 종양 조직, 종양 근위의 조직, 림프절 샘플, 혈액 샘플, 항체 샘플, 소변 샘플 또는 배설물 샘플에서, 어떠한 적합한 기술을 사용하여 검출될 수 있으며, 올리뉴클레오티드 프로브, 정량적 PCR 또는 마커에 대해 증가된 항체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 샘플 중 하나의 GCPMs의 발현 레벨은 그 개체에서 재발 가능성의 지표가 될 것이다. 그러나, 복수의 GCPMs의 존재 및 발현량을 분석하고, 증식 지표를 세우는 것에 의해 예후의 민감성 및 정확성이 증가될 것임을 인식할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 복수의 마커는 암의 예후를 결정하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 한 세트의 마커들, 특히 GCPMs에 관한 것으로 이들의 발현은 구체적으로 암 없이 생존하는 것과 관련된 예후 값(prognostic value)을 가진다. 구체적 측면에서, 암은 위장관암, 특히 위 또는 대장암이며, 추가 측면에서 대장암은 선암(adenocarcinoma)이다.
하나의 측면에서, 본 발명은 암의 재발없이 암환자의 장기 생존 가능성을 예측하는 방법에 관한 것으로, 환자로부터 얻어 샘플 중 모든 RNA 전사물 또는 이들의 산물, 또는 표준 세트의 RNA 전사물 또는 이들의 산물의 발현 레벨에 대하여 표준화된 샘플 중 하나 이상의 증식 마커 또는 이의 발현 산물의 발현 레벨을 결정하는 것을 포함하고, 상기 증식 마커는 표 A, 표 B, 표 C 또는 표 D에 리스트된 하나 이상의 마커의 전사물이다. 특정한 측면에서, 하나 이상의 GCPMs 발현 레벨의 감소는 암의 재발없이 장기간 생존 가능성이 감소된 것임을 의미하는 반면, 하나 이상의 GCPMs 발현 레벨의 증가는 암의 재발없이 장기간 생존 가능성이 증가된 것임을 의미한다.
추가적인 측면에서, 예를 들어 표 A, 표 B, 표 C 또는 표 D로부터 선택되는 바와 같은 증식 마커; CDC2, MCM6, RPA3, MCM7, PCNA1 G22P1, KPNA2, ANLN, APG7L, TOPK, GMNN, RRM1, CDC45L, MAD2L1, RAN, DUT, RRM2, CDK7, MLH3, SMC4L1, CSPG6, POLD2, POLE2, BCCIP, Pfs2, TREX1, BUB3, FEN1, DRF1, PREI3, CCNE1, RPA1, POLE3, RFC4, MCM3, CHEK1, CCND1 및 CDC37로부터 선택되는 바와 같은 증식 마커; CDC2, RFC4, PCNA, CCNE1, CCND1, CDK7, MCM 유전자 (예를 들어, 하나 이상의 MCM3, MCM6 및 MCM7), FEN1, MAD2L1, MYBL2, RRM2 및 BUB3로부터 선택되는 바와 같은 증식 마커 또는 이들의 산물 중 1 이상, 예를 들어 2 이상, 또는 3 이상, 또는 4 이상, 또는 5 이상, 또는 10 이상, 15 이상, 20 이상, 25 이상, 30 이상, 35 이상, 40 이상, 45 이상, 50 이상 또는 75 이상에 대한 발현 레벨이 결정된다.
다른 측면에서, 본 발명의 방법은 예를 들어 표 A, 표 B, 표 C 또는 표 D에 리스트된 바와 같은 증식 마커; 그룹 CDC2, MCM6, RPA3, MCM7, PCNA, G22P1, KPNA2, ANLN, APG7L, TOPK, GMNN, RRM1, CDC45L, MAD2L1, RAN, DUT, RRM2, CDK7, MLH3, SMC4L1, CSPG6, POLD2, POLE2, BCCIP, Pfs2, TREX1, BUB3, FEN1, DRF1, PREI3, CCNE1, RPA1, POLE3, RFC4, MCM3, CHEK1, CCND1 및 CDC37에 리스트된 바와 같은 증식 마커; 그룹 CDC2, RFC4, PCNA, CCNE1, CCND1, CDK7, MCM 유전자 (예를 들어, 하나 이상의 MCM3, MCM6 및 MCM7), FEN1, MAD2L1, MYBL2, RRM2 및 BUB3에 리스트된 바와 같은 모든 증식 마커 또는 그들의 발현 산물에 대한 발현 레벨의 결정을 포함한다.
본 발명은 세트 중 모든 마커의 어세이를 위해 파라핀 포매되어 보관된 생검 물질의 용도를 포함하며, 이에 따라 가장 널리 이용 가능한 유형의 생검 물질과 혼합하여 사용(양립가능: compatible)할 수 있다. 또한, 몇가지 암 조직 수확의 다른 방법, 예를 들어 코어 생검(core biopsy) 또는 세침 흡입 (fine needle aspirate)과 혼합하여 사용할 수 있다. 추가적인 측면에서, RNA는 환자의 고정된 왁스 포매된 암 조직 시편으로부터 분리될 수 있다. 분리는 업계에 알려진 어떠한 기술에 의해서라도 수행될 수 있으며, 예를 들어 코어 생검 조직(core biopsy tissue) 또는 세침 흡입 세포(fine needle aspirate cell)로부터 수행될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 표 A, 표 B, 표 C 또는 표 D로부터 선택되는 바와 같은 마커; CDC2, MCM6, RPA3, MCM7, PCNA, G22P1, KPNA2, ANLN, APG7L, TOPK, GMNN, RRM1, CDC45L, MAD2L1, RAN, DUT, RRM2, CDK7, MLH3, SMC4L1, CSPG6, POLD2, POLE2, BCCIP, Pfs2, TREX1, BUB3, FEN1, DRF1, PREI3, CCNE1, RPA1, POLE3, RFC4, MCM3, CHEK1, CCND1 및 CDC37로부터 선택되는 바와 같은 마커; 또는 CDC2, RFC4, PCNA, CCNE1, CCND1, CDK7, MCM 유전자(예를 들어, 하나 이상의 MCM3, MCM6 및 MCM7), FEN1, MAD2L1, MYBL2, RRM2 및 BUB3로부터 선택되는 바와 같은 마커 중 2 이상의 마커에 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 어레이에 관한 것이다.
특정한 측면에서, 상기 어레이는 표 A, 표 B, 표 C 또는 표 D에 리스트된 마커; 그룹 CDC2, MCM6, RPA3, MCM7, PCNA, G22P1, KPNA2, ANLN, APG7L, TOPK, GMNN, RRM1, CDC45L, MAD2L1, RAN, DUT, RRM2, CDK7, MLH3, SMC4L1, CSPG6, POLD2, POLE2, BCCIP, Pfs2, TREX1, BUB3, FEN1, DRF1, PREI3, CCNE1, RPA1, POLE3, RFC4, MCM3, CHEK1, CCND1 및 CDC37에 리스트된 바와 같은 마커; 그룹 CDC2, RFC4, PCNA, CCNE1, CCND1, CDK7, MCM 유전자 (예를 들어, 하나 이상의 MCM3, MCM6, 및 MCM7), FEN1, MAD2L1, MYBL2, RRM2 및 BUB3에 리스트된 바와 같은 마커 중 3 이상, 또는 5 이상, 또는 10 이상, 또는 15 이상, 또는 20 이상, 25 이상, 30 이상, 35 이상, 40 이상, 45 이상, 50 이상, 또는 75 이상 또는 모두에 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
다른 구체적 측면에서, 상기 어레이는 표 A, 표 B, 표 C 또는 표 D에 리스트된 마커; 그룹 CDC2, MCM6, RPA3, MCM7, PCNA, G22P1, KPNA2, ANLN, APG7L, TOPK, GMNN, RRM1, CDC45L, MAD2L1, RAN, DUT, RRM2, CDK7, MLH3, SMC4L1, CSPG6, POLD2, POLE2, BCCIP, Pfs2, TREX1, BUB3, FEN1, DRF1, PREI3, CCNE1, RPA1, POLE3, RFC4, MCM3, CHEK1, CCND1 및 CDC37로 리스트된 바와 같은 마커; 또는 그룹 CDC2, RFC4, PCNA, CCNE1, CCND1, CDK7, MCM 유전자 (예를 들어, 하나 이상의 MCM3, MCM6 및 MCM7), FEN1, MAD2L1, MYBL2, RRM2 및 BUB3로 리스트된 바와 같은 마커의 풀 세트에 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
폴리뉴클레오티드는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드일 수 있으며, 이들이 배치되는 고체 표면은 예를 들어 글라스일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 본원에서 개시되는 바와 같이 하나 이상의 마커에, 예를 들어 전장 서열, 어떠한 코딩 서열, 단편 또는 이의 상보물에 하이브리다이즈할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 암 진단 받은 환자가 암의 재발없이 장기간 생존할 가능성을 예측하는 방법에 관한 것으로, (1) 환자로부터 얻어, 샘플 중 모든 RNA 전사물 또는 이들의 산물, 또는 표준 세트의 RNA 전사물 또는 이들의 산물의 발현 레벨에 대하여 표준화된 표 A, 표 B, 표 C 또는 표 D에 리스트된 풀 세트 또는 하위 세트(subset) 마커의 RNA 전사물 또는 발현 산물의 발현 레벨을 결정하는 단계; (2) 상기 단계 (1)에서 얻어진 데이터를 통계 분석하는 단계; 및 (3) 장기 생존 가능성이 증가 또는 감소하였는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 환자, 예를 들어 암 환자에 대한 개인화된 유전자 프로필을 제작하는 방법에 관한 것으로, (a) 환자로부터 얻은 위장관 조직으로부터 추출된 RNA를 유전자 발현 분석하는 단계; (b) 표 A, 표 B, 표 C 또는 표 D중 어느 하나에 리스트된 마커 세트로부터 선택된 하나 이상의 마커의 발현 레벨을 결정하는 단계로, 상기 발현 레벨은 대조군 유전자 또는 유전자들에 대해 표준화되어, 선택적으로 표준 세트에서 발견되는 양과 비교되며, (c) 유전자 발현 분석에 의해 얻어진 데이터를 요약하는 보고서를 작성하는 단계를 포함한다. 상기 보고서는 예를 들어 환자의 장기 생존 가능성에 대한 예상 및/또는 환자의 치료 양식에 대한 권고사항을 포함할 수 있다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 예후 방법으로서 (a) 환자로부터 얻은 샘플을 표 A, 표 B, 표 C 또는 표 D로부터 선택되는 하나 이상의 마커의 RNA 전사물 또는 이의 산물의 발현 레벨에 대하여 정량 분석하는 단계 및 (b) 만약 마커 또는 마커들 또는 이의 산물의 표준화된 발현 레벨이 정의된 발현 역치(expression threshold)를 초과하였다면, 환자를 위장관 암의 재발없이 상승된 장기 생존 가능성을 가진 경향이 있는 것으로 식별하는 단계를 포함한다. 경우에 따른 측면에서, 단계 (b)는 만약 마커 또는 마커들 또는 이의 산물의 표준화된 발현 레벨이 정의된 발현 역치 미만으로 감소하였다면, 환자를 감소된 위장관 암의 재발없이 장기 생존 가능성을 가진 경향이 있는 것으로 식별하는 단계를 포함한다.
특히, 증식 마커의 상대적으로 낮은 발현은 불량한 결과와 연관된다. 이는 병의 진행 또는 암, 특히 위암 또는 대장암과 같은 위장관암의 증가된 재발 가능성을 포함할 수 있다. 대조적으로, 증식 마커의 상대적으로 높은 발현은 양호한 결과와 연관된다. 이는 표준 치료 이후 암, 예를 들어 위 또는 대장암과 같은 위장관 암의 감소된 재발 가능성을 포함할 수 있다. 낮은 발현은 예를 들어 테스트 샘플(예를 들어, 종양 샘플)을 양성적 예후와 관련된 샘플과 비교하여 결정될 수 있다. 높은 발현은 예를 들어 테스트 샘플(예를 들어 종양 샘플)을 음성적 예후와 관련된 샘플과 비교하여 결정될 수 있다.
예를 들어, 예후를 얻기 위해서 환자의 샘플(예를 들어 종양 샘플)은 알려진 환자의 결과를 포함하는 샘플과 비교될 수 있다. 만약 환자의 샘플이 높은 GCPMs 발현을 나타내어 양호한 결과를 가지는 샘플과 비슷한 정도이고/이거나, 불량한 결과를 가지는 샘플에 비해 더 높다면, 양성적 예후를 의미한다. 만약 환자의 샘플이 낮은 GCPMs 발현을 나타내어 불량한 결과를 가지는 샘플과 비슷한 정도이고/이거나, 양호한 결과를 가지는 샘플에 비해 더 낮다면, 음성적 예후를 의미한다. 경우에 따라서, 환자의 샘플은 활발하게 증식/비-증식 종양 세포 샘플과 비교될 수 있다. 만약 환자의 샘플이 높은 GCPMs 발현을 나타내어 활발하게 증식하는 세포와 비슷한 정도이고/이거나, 비증식 세포보다 더 높다면, 양성적 예후를 의미한다. 만약 환자의 샘플이 낮은 GCPMs 발현을 나타내어 비증식 세포와 비슷한 정도이고/이거나, 활발하게 증식하는 세포보다 더 낮다면, 음성적 예후를 의미한다.
추가적 예시로서, 환자의 샘플(예를 들어 종양 샘플)로부터 2 이상의 GCPMs를 포함하는 예후 지표의 발현 레벨은 재발/비재발성 암 샘플과 비교될 수 있다. 만약 환자의 샘플이 비재발성 암 샘플과 비교하여 증가 또는 감소된 발현 및/또는 재발성 암 샘플의 발현과 비슷한 발현을 나타냈다면, 음성적 징후를 의미한다. 만약 환자의 샘플이 비재발성 암 샘플과 비슷하고/하거나 재발성 암 샘플보다 더 낮은 또는 더 높은 발현을 나타냈다면, 양성적 예후를 의미한다.
하나의 접근법으로, 예상 모델을 생성하기 위해 예상법은 마커 패널, 예를 들어 표 A, 표 B, 표 C 또는 표 D에 서술된 GCPMs 패널에 적용될 수 있다. 이는 2 이상의 GCPMs을 포함하는 예후 표지의 생성을 포함한다.
따라서, 표 A, 표 B, 표 C 또는 표 D에 개시된 GCPM은 유용한 마커 세트를 제공하여 암의 예후를 결정하고, 그 종양에 특이적인 치료 계획 또는 치료 양식을 확립하기 위한 예상 지표를 생성하도록 한다. 특히, 양성적 예후는 환자가 표준적이거나 덜 침범적 치료 옵션을 추구하도록 결정하는 데 사용될 수 있다. 음성적 예후는 환자가 치료를 끝내거나 매우 공격적이거나 실험적인 치료를 추구하도록 결정하는데 사용될 수 있다. 또한, 환자는 예후 마커(예를 들어 GCPMs)의 발현에 대한 영향에 기초하여 치료를 선택할 수 있다.
GCPM의 레벨은 종양 조직, 종양 근위의 조직, 림프절 샘플, 혈액 샘플, 항체 샘플, 소변 샘플 또는 배설물 샘플에서, 어떠한 적합한 기술을 사용하여 검출될 수 있으며, 올리고뉴클레오티드 프로브, 정량적 PCR 또는 마커에 대해 증가된 항체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 복수의 GCPM의 존재 및 발현량을 예후 지표의 형태로 분석하고, 증식 지표를 세우는 것에 의해 예후의 민감성 및 정확성이 증가될 것임을 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 복수의 마커는 암의 예후를 결정하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 세트 중 마커의 어세이를 위해 파라핀 포매되어 보관된 생검 물질의 용도를 포함하며, 이에 따라 가장 널리 이용 가능한 유형의 생검 물질과 혼합하여 사용할 수 있다. 또한, 몇가지 암 조직 수확의 다른 방법, 예를 들어 코어 생검(core biopsy) 또는 세침 흡입 (fine needle aspirate)과 혼합하여 사용할 수 있다. 소정의 측면에서, RNA는 환자의 고정된 왁스 포매된 암 조직 시편으로부터 분리될 수 있다. 분리는 업계에 알려진 어떠한 기술에 의해서라도 수행될 수 있으며, 예를 들어 코어 생검 조직(core biopsy tissue) 또는 세침 흡입 세포(fine needle aspirate cell)로부터 수행될 수 있다.
하나의 측면에서, 본 발명은 예후 예를 들어, 암의 재발없이 암 환자의 장기 생존 가능성을 예측하는 방법에 관한 것으로, 환자로부터 얻어, 샘플 중 기타 다른 RNA 전사물 또는 이들의 산물, 또는 표준 세트의 RNA 전사물 또는 이들의 산물의 발현 레벨에 대하여 표준화된 샘플 중, 하나 이상의 예후 마커 또는 이들의 발현 산물의 발현 레벨을 결정하는 것을 포함한다. 구체적인 측면에서, 상기 예후 마커는 표 A, 표 B, 표 C 또는 표 D에 리트된 하나 이상의 마커이거나, 표 A, 표 B, 표 C 또는 표 D에 리트된 마커로부터 유래된 하나 이상의 예후 표지로 포함된다.
추가적인 측면에서, 표 A, 표 B, 표 C 또는 표 D에 리스트된 마커, 표 A, 표 B, 표 C 또는 표 D에 리스트된 마커로부터 유래된 예후 표지에 대한, 예후 마커 또는 이의 발현 산물의 발현 레벨이 결정된다. 다른 측면에서, 상기 방법은 예를 들어 표 A, 표 B, 표 C 또는 표 D에 리스트된 마커, 또는 표 A, 표 B, 표 C 또는 표 D에 리스트된 마커로부터 유래된 예후 표지에 대한 풀 세트의 예후 마커 또는 이의 발현 산물의 발현 레벨 결정을 포함한다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 예를 들어 표 A, 표 B, 표 C 또는 표 D에 리스트된 마커에 대한 2 이상의 마커 또는 표 A, 표 B, 표 C 또는 표 D에 리스트된 마커로부터 유래된 예후 표지에 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 어레이(예를 들어, 마이크로어레이)에 관한 것이다. 특정한 측면에서, 상기 어레이는 표 A, 표 B, 표 C 또는 표 D에 리스트된 마커로부터 유래된 예후 표지에 또는 예를 들어 예후 표지에 대하여 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구체적인 측면에서, 상기 어레이는 풀 세트의 마커에, 예를 들어 표 A, 표 B, 표 C 또는 표 D에 리스트된 마커에 대하여, 또는 예를 들어 예후 표지에 대하여 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
이러한 어레이이 대하여, 폴리뉴클레오티드는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드일 수 있으며, 이들이 배치되는 고체 표면은 예를 들어 글라스일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 본원에서 개시되는 바와 같이 하나 이상의 마커에, 예를 들어 전장 서열, 어떠한 코딩 서열, 단편 또는 이의 상보물에 하이브리다이즈할 수 있다. 특정한 측면에서, 하나 이상의 GCPM 발현 레벨의 증가 또는 감소는 예를 들어 암의 재발로 인해 감소된 장기 생존 가능성을 의미하는 반면, 하나 이상의 GCPM 발현 레벨에 대한 증가 또는 감소 부족은 암의 재발 없이 증가된 장기 생존 가능성을 의미한다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 (1) 추출 버퍼/시약 및 프로토콜; (2) 역전사 버퍼/시약 및 프로토콜; 및 (3) 정량 RT-PCR 버퍼/시약 및 상기 방법 수행에 적합한 프로토콜을 포함한다. 본 발명의 다른 측면 및 이점은 명세서에 포함된 설명 및 실시예에 기술되어 있다.
표 A: 세포 증식 표지에 대한 GCPM
표 A: 높은 증식 상태 및 낮은 증식 상태의 셀라인 사이에서 차별적으로 발현되는 증식 관련 유전자. 콘플루언트(confluent: 낮은 증식성) 및 세미-콘플루언트(semi-confluent: 높은 증식성) 셀라인 사이에서 차별적으로 발현되는 유전자는 30K MWG Biotech 어레이 상에서 마이크로어레이 분석에 의해 확인되었다. 표 A는 유전자 온톨로지 분석(gene ontology analysis)에 의해 세포 증식과 관련된 것으로 카테고리 분류된 이러한 유전자의 하위 세트를 포함한다.
표 B: 세포 증식 표지에 대한 GCPM
표 B: 알려진 세포 증식 관련 유전자들. 유전자 온톨로지 분석에 의해 세포 증식 관련된 것으로 분류되고, 어피메트릭스 HG-U133 플랫폼(Affymetrix HG-U133 platform) 상에 존재하는 모든 유전자
예후 마커 검출에 대한 일반적인 접근법
다음 접근법은 GCPM 패밀리 구성을 포함한 증식 마커 검출에 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다: GCMP에 대하여 선택적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 마이크로어레이 분석; GCPM 특이적 프라이머 및 프로브를 사용하여 종양 샘플에서 리얼-타임 qPCR (real-time qPCR); GCPM 특이적 프라이머 및 프로브를 사용하여 림프절, 혈액, 항체, 배설물 또는 소변 샘플에서 리얼-타임 qPCR; ELISA(enzyme-linked immunological assays); 항-마커 항체 사용하여 면역조직화학; 및 컴퓨터를 사용하여 어레이 또는 qPCR 데이터 분석.
사용되는 기타 다른 방법들에는 노던 블럿(northern blotting) 및 in situ 하이브리다이제이션(hybridization)(Parker and Barnes, Methods in Molecular Biology 106: 247-283 (1999)); RNase 프로텍션 어세이(RNase protection assays) (Hod, BioTechniques 13: 852-854 (1992)) ; 역전사 폴리머레이즈 체인 리액션(reverse transcription polymerase chain reaction)( RT-PCR; Weis et al., Trends in Genetics 8: 263-264 (1992)); SAGE (serial analysis of gene expression; Velculescu et al., Science 270: 484-487 (1995); and Velculescu et al., Cell 88: 243-51 (1997)), 매스어레이테크놀로지(MassARRAY technology: Sequenom, San Diego, CA) 및 MPSS(massively parallel signature sequencing)에 의한 유전자 발현 분석(Brenner et al., Nature Biotechnology 18: 630-634 (2000))이 포함된다. 경우에 따라서, 항체가 적용되어 DNA 듀플렉스(DNA duplex), RNA 듀플렉스(RNA duplex) 및 DNA-RNA 하이브리드 듀플렉스 또는 DNA-단백질 듀플렉스를 포함하는 특이적 복합체를 인식할 수 있다.
1차 데이터를 수집할 수 있으며, 예를 들어 종양 및 비종양 조직에서의 마커 발현 비교; 재발성 종양 및 비재발성 종양에서 결정된 레벨을 마커 발현 레벨과 비교; 전이를 포함하는 종양 또는 포함하지 않는 종양에서 결정된 레벨과 마커 발현 레벨을 비료; 다른 단계의 종양에서 결정된 레벨과 마커 발현 레벨을 비교; 또는 다른 증식 단계에 있는 세포중에서 결정된 레벨을 마커 발현 레벨과 비교하여, 폴드 체인지 분석(fold change analysis)을 수행할 수 있다. 음성적 또는 양성적 예후는 이러한 분석에 기초하여 결정된다. 종양 마커 발현의 추가적인 분석은 증가 또는 감소된 발현을 나타내는 이러한 마커들을 알려진 위장고나 종양의 발현 프로필과 매치하여, 예후를 제공하는 것을 포함한다.
발현이 증가된 것으로 결론내기 위한 역치는 예를 들어, 1.5 배 또는 2 배 이상의 증가 및 경우에 따른 실시예에서, 3배 이상, 4 배 이상 또는 5 배 이상의 증가로 제공된다. 발현이 감소된 것으로 결론내기 위한 역치는 예를 들어, 1.5 배 또는 2 배 이상의 감소 및 경우에 따른 실시예에서, 3배 이상, 4 배 이상 또는 5 배 이상의 감소로 제공된다. 증가 또는 감소된 발현이 발생한 것으로 결론내기 위한 기타 역치는 본 발명의 범위에서 벗어나지 않고 선택될 수 있는 것으로 이해할 수 있을 것이다.
발현이 증가된 것으로 결론내기 위한 역치는 소정의 마커 및 적용되는 소정의 예상 모델에 따라 달라질 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 특정한 임상적 상황에서 변수가 상당할지라도, 상기 역치는 일반적으로 가장 높은 민감도 및 선택도를 가장 낮은 오류율로 달성하기 위해 설정하는 것이다. 바람직한 역치는 예상 모델의 통계적 가변성을 고려하여 충분한 크기의 표본(population)을 분석하여 결정되며, 예상 모델의 제조에 사용된 샘플의 크기로부터 계산된다. 상기 샘플은 발현이 감소된 것이라 결론내기 위한 역치의 결정에 적용된다. 증가된 또는 감소된 발현이 일어났다고 결론내기 위해, 본 발명의 범주를 벗어나지 않고 기타 다른 역치들 또는 역치를 확립하기 위한 방법이 선택될 수 있다.
예상 모델은 출력물을 수치 예를 들어 지수(score), 가능성 수치 또는 확률로 산출할 수 있다. 이들 예시에서, 역치를 예상 모델에 의해 나온 결과에 적용하는 것이 가능하며, 이러한 케이스에서 발현 값에 대한 역치를 설정하는 데 사용된 바와 같은 유사한 원리가 적용된다.
일단, 종양 샘플 중 하나 이상의 증식마커에 대한 발현 레벨이 얻어지면, 암 재발 가능성이 결정될 수 있다. 본 발명에 따르면, 부정적 예후는 하나 이상의 증식 마커에 대한 감소된 발현과 관련되어 있는 반면, 양성적 예후는 하나 이상의 마커에 대한 증가된 발현과 연관되어 있다. 다양한 측면에서, 본원에 개시된 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 또는 75이상의 마커에서 발현의 증가를 나타낸다. 다른 측면에서, 본원에 개시된 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 또는 75 이상의 마커에서 발현의 감소를 나타낸다.
확인된 유전자로부터, 하나 이상의 GCPMs를 포함하는 증식 지료를 사용하여, 하나 이상의 유전자 발현 레벨을 개시된 증식 지표와 비교함으로써 암의 예후를 결정할 수 있다. 종양 샘플 중 하나 이상의 GCPMs의 발현을 개시된 증식 지표와 비교하여, 암 재발 가능성을 결정할 수 있다. 예후를 확립하기 위한 예후 지표의 발현 레벨의 비교는 앞서 언급한 바와 같이 예상 모델을 적용하여 행해질 수 있다.
암의 재발 가능성을 결정하는 것은 의사에게 큰 의미가 있다. 재발의 높은 가능성은 더 긴 시간 또는 더 높은 복용량의 치료가 주어져야 하고, 암의 재발에 대한 지료에 대하여 환자를 더욱 면밀하게 모니터해야 한다는 것을 의미한다. 또한, 정확한 예후는 환자에 이익이 될 수 있다. 파트너, 가족 및 친구와 함께 환자로 하여금 치료에 관한 결정 뿐 아니라, 그들의 미래 및 생활방식의 변화에 관한 결정을 할 수 있도록 한다. 따라서, 본 발명은 또한, 종양 샘플 중 마커의 발현을 차별적 증식 표지와 매치시켜 확립된 예후를 기반으로 특정 암에 대한 치료 계획을 확립하는 방법을 제공한다.
마커 선택 또는 증식 지표의 확립은 여기 표 A, 표 B, 표 C 또는 표 D에 개시된 GCPM에 제한될 필요는 없으나, 개시된 표지로부터 하나 이상의 GCPM의 사용을 포함할 수 있으며, 또는 개시된 마커 리스트로부터 선택된 GCPM를 사용하여 새로운 표지가 확립될 수 있음을 이해할 수 있 수 있을 것이다. 임의의 표지에 대한 요구는 그것이 충분한 정확도로 재발 가능성을 예측하여 의사가 치료 계획을 확립할 수 있도록 돕는 데 있다.
놀랍게도, 많은 GCPM가 증가된 세포 증식 레벨과 관련되어 있으며, 양성적 예후와 연관되어 있음을 발견하였다. 유사하게, 감소된 발현 레벨의 GCPM와 음성적 예후 예를 들어 증가된 위장관암 재발 가능성 사이에 밀접한 연관성이 있음을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 세포 증식 예를 들어, 세포 주기 구성 요소와 연관된 GCPM 과 같은 마커의 용도를 제공하는 것이다.
본원에 기재된 바와 같이, 암 재발 가능성의 결정은 하나 이상의 증식 특이적 마커에 대한 발현을 측정하여 수행될 수 있다. 본원에 제공되는 방법은 고민감도의 어세이를 포함한다. 특히, qPCR이 매우 민감하며, 샘플 중 매우 낮은 카피 수(예를 들어 1-100)로 존재하는 마커를 검촐하는 데 사용될 수 잇다. 이러한 민감도로, 위장관암의 예후는 믿을만하고, 정확하며, 용이하게 테스트될 수 있다.
역전사 PCR(Reverse Transcription PCR : RT-PCR)
위에 언급한 기술 중, 가장 민감하고 가장 유연한 정량적 방법이 RT-PCR로, 다른 샘플 표본 중, 정상 및 약물 치료 또는 약물 치료 하지 않은 종양 조직에서의 RNA 레벨을 비교, 발현 패턴을 특징화, 밀접하게 관련된 RNA를 구분하고, RNA 구조를 분석하는데 사용될 수 있다.
RT-PCR에서, 첫번째 단계는 타겟 샘플로부터 RNA를 분리하는 것이다. 시작 물질은 전형적으로 인간 종양 또는 종양 셀라인으로부터 분리된 총 RNA로, 정상 조직 또는 정상 셀라인에 각각 대응된다. RNA는 다양한 샘플, 예를 들어 유방, 폐, 결장(예를 들어 대장 또는 소장), 대장, 위, 식도, 항문, 직장, 전립선, 뇌, 간, 신장, 췌장, 비장, 흉선, 고환, 난소, 자궁 등, 조직으로부터 분리될 수 있으며, 일차 종양 또는 종양 셀라인으로부터, 건강한 공여자로부터의 풀(pool)을 이룬 샘플로부터 분리될 수 있다. 만약 RNA 공급원이 종양이라면, RNA는 예를 들어 동결 또는 파라핀 포매되어 보관되고, 고정된(예를 들어, 포르말린으로 고정) 조직 샘플로부터 추출될 수 있다.
RT-PCR에 의한 유전자 발현 프로파일링(profiling)의 제 1 단계는 RNA 주형을 cDNA로 역전사시킨 다음, PCR 반응으로 지수적으로 증가시키는 것이다. 2가지 가장 일반적으로 사용되는 역전사 효소는 AMV-RT(avilo myeloblastosis virus reverse transcriptase) 및 MMLV-RT(Moloney murine leukaemia virus reverse transcriptase)이다. 역전사 단계는 보통 발현 프로파일링의 조건 및 목적에 따라 특이적 프라이머, 랜덤 헥사머(random hexamer) 또는 올리고-dT 프라이머(oligo-dT primer)를 사용하여 준비될 수 있다. 예를 들어, 추출된 RNA는 GeneAmp RNA PCR kit (Perkin Elmer, CA, USA)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 역전사될 수 있다. 유도된 cDNA는 그 다음 연속적 PCR 반응에 주형으로 사용될 수 있다.
비록 PCR 단계는 다양한 열안정성 DNA-의존성 DNA 폴리머레이즈(DNA-dependent DNA polymerase)들을 사용할 수 있지만, 일반적으로 Taq DNA 폴리머레이즈를 적용하며, 이는 5'-3' 뉴클리에이즈(5'-3' nuclease) 활성은 가지나, 3'-5' 프루프리딩 엔도뉴클리에이즈(3'-5' proofreading endonuclease) 활성은 결여되어 있다. 따라서, TaqMan (g) PCR은 일반적으로 타겟 증폭물(amplicon)에 결합된 하이브리다이제이션 프로브를 가수분해하기 위해, Taq의 5' 뉴클리에이즈 활성 또는 Tth 폴리머레이즈을 이용하나, 동등한 5' 뉴클리에이즈 활성을 가진 어떠한 효소라도 사용될 수 있다.
2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머가 사용되어 일반적인 PCR 반응의 증폭물을 생성시킬 수 있다. 제 3 뉴클레오티드 또는 프로브를 디자인하여 2 PCR 프라이머 사이에 위치된 뉴클레오티드 서열을 검출한다. 상기 프로브는 Taq DNA 폴리머레이즈 효소에 의해 연장되지 않는 것이며, 리포터 형광 다이(reporter fluorescent dye) 및 소광 형광 다이(quencher fluorescent dye)로 표지되어 있다. 2개의 다이가 프로브 상에 있기 때문에, 가까이 함께 위치하는 경우, 리포터 다이로부터의 어떠한 레이저 유도 방출이라도 소광 다이(quenching dye)에 의해 소광된다. 증폭 반응하는 동안, Taq DNA 폴리머레이즈 효소는 프로브를 주형에 따라 다른 방식(template-dependent manner)으로 자른다. 제조된 프로브는 용액중에서 분리되어, 방출된 리포터 다이로부터의 시그날은 제 2 플루오로포어(fluorophore)에 대한 소광 효과가 발생하지 않게 된다. 리포터 다이의 한 분자가 각각의 새로운 분자에 대하여 합성되고, 소광되지 않은 리포터 다이의 검출은 정량적 데이터 해석의 기초를 제공한다.
TaqMan RT-PCR은 상업적으로 시판되는 장치, 예를 들어 ABI PRISM 7700tam Sequence Detection System (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 또는 Lightcycler (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)를 사용하여 수행될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 5' 뉴클리에이즈 과정은 ABI PRISM 7700tam Sequence Detection System과 같은 리얼-타임 정량 PCR 장치 상에서 수행될 수 있다. 시스템은 열순환기(thermocycler), 레이저, CCD(charge-coupled device), 카메라 및 컴퓨터로 구성된다. 시스템은 96-웰 포맷(96-well format)으로 열순환기 상에서 증폭된다. 증폭하는 동안, 레이저 유도 형광 신호(laser-induced fluorescent signal)를 모든 96웰에 대하여 피브레 옵틱 케이블(fibre optics cables)을 통해 실시간으로 수집하고, CCD에서 검출한다. 시스템은 장치를 가동하고 데이터를 분석하기 위한 소프트웨어를 포함한다.
5' 뉴클리에이즈 어세이 데이터는 초기에 Ct로 나타나거나, 또는 싸이클의 역치로 표현된다. 위에서 언급된 바와 같이, 형광값(fluorescence value)이 매 싸이클 동안 기록되어 증폭 반응 중 그 지점까지 증폭된 산물의 양을 나타낸다. 형광 신호가 통계적으로 유의한 것으로 처음 기록되는 시점을 역치 사이클(threshold cycle)이라고 한다.
오차 및 샘플과 샘플 변수(sample-to-sample variation)에 대한 영향을 최소화하기 위해 대개 내부 기준(internal standard)을 사용하여 RT-PCR을 수행한다. 이상적인 내부 기준은 다른 조직 중에서 일정한 레벨로 발현되며, 실험적 처리에 의해 영향을 받지 않는다. 유전자 발현의 패턴을 표준화하는데 가장 빈번하게 사용되는 RNA는 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)인 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase)와 액틴에 대한 mRNA이다.
리얼-타임 정량 PCR(Real-time quantitative PCR: qPCR)
최근의 더 다양한 RT-PCR 기술은 리얼 타임 정량 PCR로, 듀얼 라벨 플루오리제닉 프로브(dual-labeled fluorigenic probe; 즉 TaqMan@ probe)를 통해 PCR 산물의 축적을 측정하는 것이다. 리얼 타임 PCR은 정량 경쟁적 PCR(quantitative competitive PCR) 및 정량 비교적 PCT(quantitative comparative PCR) 모두와 혼합 사용(양립) 가능하다. 전자는 표준화를 위한 각 target sequence에 대해 internal competitor를 사용하는 반면, 후자는 샘플 내에 포함된 표준화 유전자 또는 RT-PCR에 대한 하우스키핑 유전자를 사용한다. 더욱 구체적인 사항은, 예를 들어 Held et al., Genome Research 6: 986-994 (1996)를 참조하라.
발현 레벨은 RNA 소스로서 고정된, 파라핀 포매된 조직을 사용하여 결정될 수 있다. 본 발명의 하나의 측면에 따르면, PCR 프라이머와 브로브는 증폭될 유전자 중에 존재하는 인트론(intron) 서열에 기반하여 제작된다. 이러한 실시예에서, 프라이머/프로브 제작의 제 1 단계는 유전자 내부 인트론 서열의 설계(delineation)이다. 이는 공개적으로 이용가능한 소프트웨어, 예를 들어 W. J., Genome Res. 12 (4): 656-64 (2002)에 개발된 DNA BLAT 소프트웨어 또는 이의 변형물을 포함하는 BLAST 소프트웨어를 사용하여 수행될 수 있다. 이후 단계는 잘 확립되어 있는 PCR 프라이머 및 프로브 제작 방법을 따를 것이다.
비특이적 신호를 피하기 위해, 프라이머와 프로브를 제작하는 경우 인트론 내부의 반복 서열을 마스크(mask)시키는 것이 유용하다. 이는 온라인 상에서 Baylor College of Medicine을 통해 이용가능한 Repeat Masker 프로그램을 사용하여 수행될 수 있으며, 이는 반복적 구성의 라이브러리에 대한 DNA 서열을 스크린(screen)하고, 반복적 구성이 마스크된 곳에서 쿼리 서열을 되돌려준다. 마스크된 서열은 그 다음, 어떠한 상업적으로 또는 그렇지 않으면 공개적으로 이용가능한 프라이머/프로브 팩키지, 예를 들어 Primer Express (Applied Biosystems); MGB assay-by-design (Applied Biosystems); Primer3 (Steve Rozen and Helen J. Skaletsky (2000) Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers in: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386)를 사용하여 프라이머 및 프로브 서열을 제작하는 데 사용될 수 있다.
PCR 프라이머 디자인에서 고려되는 가장 중요한 요소들은 프라이머 길이, 용융 온도(Tm) 및 G/C 양, 특이성, 상보적 프라이머 서열 및 3' 말단 서열을 포함한다. 일반적으로, 적합한 PCR 프라이머는 일반적으로 17 내지 30 의 길이를 가지며, 약 20-80%, 예를 들어 약 50-60% G+C 염기를 포함한다. 일반적으로 50 내지 80℃, 예를 들어 약 50 내지 70℃ 사이의 Tm이 바람직하다. PCR 프라이머 및 프로브 설계를 위한 추가적 가이드라인은 예를 들어, Dieffenbach, C. W. et al., General Concepts for PCR Primer Design in: PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1995, pp. 133-155; Innis and Gelfand, Optimization of PCRs in: PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, CRC Press, London, 1994, pp. 5-11; 및 Plasterer, T. N. Primerselect: Primer and probe design. Methods Mol. Biol. 70: 520-527 (1997)을 참조하면 되며, 이들의 개시사항 전체는 본원에 참조로서 합체된다.
마이크로어레이 분석(Microarray analysis)
차별적 유전자 발현 또한, 마이크로어레이 기술을 사용하여 확인되거나, 확정될 수 있다. 따라서, GCPM 발현 프로필은 마이크로어레이 기술을 사용하여 처리되지 않은 또는 파라핀 포매된 종양 조직 중에서 측정될 수 있다. 이러한 방법에서, 관심있는 폴리뉴클레오티드 서열(cDNA 및 올리고뉴클레오티드 포함)은 마이크로칩 기재 상에 평판화되거나 어레이된다. 상기 어레이된 서열(즉, 포획 프로브)는 관심있는 세포 또는 조직의 특이적 폴리뉴클레오티드(즉, 타겟)과 하이브리다이즈된다. RT-PCR법에서와 같이, RNA 소스는 일반적으로 인간 종양 또는 종양 셀라인 및 이에 상응하는 정상 조직 또는 셀라인으로부터 분리된 총 RNA이다. 따라서, RNA는 다양한 1차 종양 또는 종양 셀라인으로부터 분리될 수 있다. 만약 RNA 소스가 1차 종양이라면, RNA는 예를 들어 동결되거나, 파라핀 포매되어 보존되고 고정된(예를 들어 포르말린 고정된) 조직 샘플로부터 추출될 수 있으며, 통상적으로 제조되어 매일 임상적 실습에서 보존된 것이다.
마이크로어레이 기술의 구체적인 실시예에서, PCR 증폭된 cDNA 클론의 삽입물(insert)이 기재에 적용된다. 상기 기재는 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 또는 75 이하의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 다른 측면에서, 상기 기재는 10,000 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 마이크로칩상에 고정된 마이크로어레이된 서열은 엄격한 조건하에서 하이브리다이제이션 하기에 적합하다. 다른 실시예에서와 같이, 마이크로어레이를 위한 타겟은 50, 100, 200, 400, 500, 1000 또는 2000 염기 이상의 길이; 또는 50-100, 100-200, 100-500, 100-1000, 100-2000 또는 500-5000 염기 이상의 길이일 수 있다. 추가적인 구체예에서, 마이크로어레이에 대한 포획 프로브는 10, 15, 20, 25, 50, 75, 80 또는 100 염기 이상의 길이; 또는 10-15, 10-20, 10-25, 10-50, 10-75, 10-80 또는 20-80 염기 이상의 길이일 수 있다.
형광으로 표지된 cDNA 프로브는 관심있는 조직으로부터 추출된 RNA의 역전사에 의한 형광 뉴클레오티드 도입을 통해 생성될 수 있다. 칩에 적용되는 표지된 cDNA 프로브는 어레이상 각 스팟(spot)의 DNA에 특이적으로 하이브리다이즈한다. 비특이적으로 결합한 프로브를 제거하기 위하여 엄격한 세척 이후, 상기 칩은 공초점 레이저 현미경(confocal laser microscopy) 또는 다른 검출법, 예를 들어 CCD 카메라에 의해 스캐닝된다. 각 어레이 요소의 하이브리다이제이션에 대한 정량은 상응하는 mRNA 풍부도에 대한 평가를 허용한다. 두가지 컬러의 형광으로 각각 표지된 2가지의 RNA 소스로부터 생성된 cDNA 프로브는 어레이에 쌍으로 하이브리다이즈될 수 있다. 이에 따라, 각 특이적 유전자에 상응하는 2가지 소스로부터의 비교적 풍부한 전사물은 동시에 확정된다.
하이브리다이제이션의 소형화된 규모는 다수의 유전자에 대한 발현을 용이하면서도 빠르게 평가할 수 있도록 한다. 이러한 방법은 세포당 몇몇 복제로 발현되는 거의 희박한 정도의 전사물을 검출하는데 요구되는 민감도를 가지도록 하고, 다른 발현 레벨에서 약 2 배 이상의 차이를 재생산적으로 검출하는데 보여왔다(Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (2): 106-149 (1996)). 마이크로어레이 분석은 상업적으로 시판되는 장치에 의해 제조사의 프로토콜에 따라, 예를 들어 Affymetrix GenChip technology 또는 Incyte's microarray technology에 의해 수행될 수 있다. 큰 규모의 유전자 발현 분석을 위한 마이크로어레이법에 대한 개발은 암 분류에 대한 분자적 마커 및 다양한 종양 유형에서의 결과 예상을 시스템적으로 갖출 수 있도록 한다.
RNA 분리, 정제 및 증폭(RNA isolation, purification, and amplification)
mRNA 추출에 대한 일반적인 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997)을 포함한 분자생물학에 대한 표준 교과서에 개시되어 있다. 파라핀 포매된 조직으로부터 RNA 추출하는 방법은 예를 들어 Rupp and Locker, Lab Invest. 56: A67 (1987) 및 De Sandres et al., BioTechniques 18: 42044 (1995)에 개시되어 있다. 특히, RNA 분리는 Qiagen과 같은 제조사로부터 시판되는 정제 키트, 버버 세트 및 프로테아제를 사용하여, 제조사의 안내에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어 배양된 세포로부터의 총 RNA는 Qiagen RNeasy mini-columns을 사용하여 분리될 수 있다. 기타 상업적으로 시판중인 RNA 분리 키트는 MasterPure Complete DNA and RNA Purification Kit (EPICENTRE (D, Madison, WI) 및 Paraffin Block RNA Isolation Kit (Ambion, Inc.)를 포함한다. 조직 샘플로부터의 총 RNA는 RNA Stat-60 (Tel-Test)를 사용하여 분리될 수 잇다. 종양으로부터 제조된 RNA는 예를 들어 염화세슘 밀도 구배 원심분리(cesium chloride density gradient centrifugation)에 의해 분리될 수 있다.
RNA 소스로 고정되고, 파라핀 포매된 조직을 사용하여 유전자 발현을 프로파일링하기 위한 대표적인 프로토콜의 단계는 mRNA 분리, 정제, 프라이머 연장 및 증폭을 포함하며, 발표된 다양한 저널의 논문에 주어져있다(예를 들어, T. E. Godfrey et al. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000); K. Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001)). 간략하게, 대표적인 프로세스는 약 10 ㎛ 두께 절편의 파라핀 포매된 종양 조직 샘플을 컷팅하는 것으로 시작한다. RNA가 그 다음 추출되며, 단백질 및 DNA는 제거된다. RNA 농축에 대한 분석 이후, 필요에 따라 RNA 복구 및/또는 증폭 단계가 포함될 수 있으며, RNA는 유전자 특이적 프로모터를 사용하여 역전사된 다음 RT-PCR한다. 마지막으로, 데이터는 분석하여, 검사된 종양 샘플 중 확인된 특징적 유전자 발현 패턴에 기초하여 환자에 적합한 가장 우수한 치료 선택을 확인한다.
면역조직화학 및 프로테오믹스(Immunohistochemistry and proteomics)
면역조직화학법은 또한 본 발명의 증식 마커에 대한 발현 레벨을 검출하는 데 적합하다. 따라서, 각 마커에 특이적인 항체 또는 항혈청(antisera), 바람직하게 폴리클로날 항혈청(polyclonal antisera), 더욱 바람직하게 모노클로날 항체가 발현 검출에 사용된다. 상기 항체는 항체 자체에 대한 직접적인 라벨링(labeling) 예를 들어 방사성 라벨, 형광 라벨, 비오틴과 같은 합텐(hapten) 라벨 또는 호스 라디쉬 퍼옥시데이즈(horse radish peroxidise) 또는 알칼린 포스파테이즈(alkaline phosphatase)에 의해 검출될 수 있다. 경우에 따라서, 표지되지 않은 1차 항체가 표지된 2차 항체와 함께 사용되며, 1차 항체에 특이적인 항혈청, 폴리콜로날 항혈청 또는 모노클로날 항체를 포함한다. 면역조직화학의 프로토콜 및 키트는 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 시판중이다.
프로테오믹스는 소정의 시간에서 샘플(예를 들어, 조직, 개체 또는 세포 배양) 중에 존재하는 폴리펩티드를 분석하는데 사용될 수 있다. 특히, 프로테오믹스 기술은 샘플 중 단백질 발현의 광범위한 변화를 평가(또한, 발현 프로테오믹스로도 불림)하는 데 사용될 수 있다. 프로테오믹스 분석은 일반적으로 (1) 샘플 중 각 단백질을 2-D PAGE(2-D gel electrophoresis)에 의해 분리; (2) 젤(gel)로부터 회수된 각 단백질의 확인, 예를 들어, my 매스 스펙트로미트리(my mass spectrometry) 또는 N-터미널 시퀀싱(N-terminal sequencing) 및 (3) 생물정보학(bioinformatics)을 사용한 데이터 분석을 포함한다. 프로테오믹스 방법은 기타 유전자 발현 프로파일링 방법에 유용한 보완책이고, 단독 또는 기타 다른 방법과 함께 사용하여 본 발명의 증식 마커 산물을 검출하는데 사용할 수 있다.
차별적으로 발현된 유전자의 선택(Selection of Differentially Expressed Genes)
유의한 것처럼 보이는 유전자의 선택을 위한 초기 접근법은 해당 2 그룹 간의 소정의 유전자의 "폴드(fold) 변화"를 단순히 살피는 것이었다. 하지만 이러한 접근법은 가장 많은 변화를 보이는 유전자에서는 정확한 결과를 보일지 몰라도, 기본적인 통계학을 고려하면 분산(또는 노이즈 레벨)이 꽤 높은 경우(이는 종종 마이크로어레이 실험에서 관찰된다), 큰 폴드 변화가 단독으로 우연히 빈번하게 발생할 수 있다는 것을 인식하도록 이끌었다.
여기 언급된 바와 같은 마이크로어레이 실험들은 일반적으로 수천개의 유전자에 대한 동시적 측정을 포함한다. 만약, 2 그룹(예를 들어 재발성 및 비재발성 종양) 사이의 특정 유전자에 대한 발현 레벨을 비교한다면, 유의성에 대한 일반적인 테스트(예를 들어 t-테스트)는 적합하지 않는다. 이는 수천 실험의 앙상블에서(이 문맥에서, 각 유전자는 "실험"을 구성), 단독으로 뜻밖에 유의성에 대한 통상의 기준을 통과하는 하나 이상의 실험에 대한 확률은 본질적으로 일치하기 때문이다. 유의성에 대한 시험에서, "귀무가설"(null hypothesis)이 옳다는 가능성을 일반적으로 계산한다. 2 그룹을 비교하는 경우에서, 귀무가설은 2 그룹 사이에 차이가 없다는 것을 말한다. 만약 통계적 시험이 어떠한 역치 미만(대개, 0.05 또는 0.01) 미만의 귀무가설에 대한 가능성을 만들어 낸다면, 우리는 귀무가설을 거절하고, 2 그룹이 현저하게 다르다는 가정을 수용할 수 있다고 말할 것이다. 명확하게 이러한 시험에서, 단독으로 뜻밖에 귀무가설에 대한 거절은 20회 중 1(또는 100 회 중 1)일 것으로 예상할 수 있다. T-테스트 또는 유의성을 위한 기타 유사 통계 테스트의 사용은 마이크로어레이의 맥락에서는 맞지 않는데, 너무 많은 잘못된 양성(또는 유형 1의 오류)을 만들어내기 때문일 것이다.
이러한 유형의 상황에서, 동시에 복수의 가설을 테스트하는 경우, 일반적인 비교 절차 예를 들어 the Bonferroni Method (43)을 적용한다. 그러나, 이러한 시험은 대부분의 마이크로어레이 실험에 대하여 너무 보존적이어서, 너무 많은 잘못된 음성(타입 II) 오류를 야기할 것이다.
더욱 최근의 접근법은 유의한 것으로 주어진 시험에 대한 확률을 적용하는 것을 그만두고, 실험의 하위 세트를 선택하기 위한 수단을 확립하여, 예상된 비율의 유형 I 오류(또는 오류 발견율; 47)가 이를 위해 조절되는 것이다. 다양한 실행을 통해, 이번 조사에서 사용된 것은 이러한 분석이며, 즉 상기 방법들은 BRB Array Tools (48) 및 limma (11,42) package of Bioconductor (that uses the R statistical environment; 10,39)를 제공하였다.
일반적인 데이터 마이닝(Data Mining) 방법: 예후 지표의 생성(Generation of Prognostic Signatures)
데이터 마이닝은 "지식" 즉, "노하우" 또는 (통상) 큰 부피의 데이터(데어터세트)로부터 예상되는 가능성의 추출을 설명하기 위해 사용된 것이다. 이는 예후 지표를 만들기 위해 이번 접근법에 사용된 것이다. 이러한 연구의 경우, "노하우"는 주어진 유전자 세트의 발현 측정으로부터 예후 또는 "표지"(일반적으로 이 항목에서, 실시예 항목에서 더 구체적으로 기술된 바와 같다)를 정확하게 예측하는 능력이다.
이번 연구에서 사용된 방법을 위해 사용되는 구체적인 설명은 실시예 17 내지 20에 기술되어 있다. 그러나, 데이터 마이닝법 중 어떠한 것이라도(실시예에 기술된 것과 여기 기재된 것들 둘 다) 이에 대한 적용은 이러한 일반적인 프로토콜에 따를 수 있다.
데이터 마이닝(49) 및 관련 주요 기계 학습(40)은 복잡하고, 반복적인 수학 업무는 하나 이상의 적합한 컴퓨터 소프트웨어 팩키지(하단 참조)의 사용을 포함한다. 소프트웨어의 사용은 한편으로, 옮은 방법을 충실히 지킨다면, 데이터 마이닝 기술을 성공적으로 사용하기 위해 각 기술 너머의 이론에 대한 복잡함과 완전히 친숙할 필요가 없다는 점에서 장점이 있다. 단점은 데이터마이닝의 적용이 종종 누군가가 데이터를 삽입하여 결과를 받는 "블랙박스"로 보일 수 있다는 것이다. 이것이 달성되는 방법은 종종 최종 사용자로부터 마스크되어 있다(이는 많은 기재된 기술들에서도 동일한 경우이고, 데이터 마이닝을 위해 선택된 통계적 방법에 영향을 미칠 수 있다). 예를 들어, 신경망 및 지지체 벡터 기계는 특히 복잡한 실행을 가져, 최종 사용자가 결정을 만들어 내는데 사용된 "룰(rule)"을 추출하는 것이 어렵다. 한편, K-최근린법(K- nearest neighbor method) 및 선형 판별분석(inear discriminant analysis)은 결정에 대한 매우 투명한 과정을 가지고 있어서, 사용자로부터 숨겨진 것은 아니다.
데이터 마이닝에 2가지 유형의 접근법이 있다: 교사 접근법(supervised approach) 및 비교사 접근법(unsupervised approach). 교사 분석에서, 데이터와 연관된 정보는 예를 들어 범주형(categorical) 데이터(예를 들어 재발성 vs. 비재발성 종양)와 같이 알려진 것이다. 요구되는 것은 관찰되는 반응(예를 들어 재발 vs, 비재발)을 입력 변수에 연결시키는 능력이다. 비교사 분석에서, 데이터세트 내의 부류들은 미리 알려진 것은 아니고, 데이터 마이닝 방법은 데이터세트 내에서 부류 또는 구조를 찾기 위한 시도에 적용된다.
본 발명의 실시예에서는 교사 접근법이 사용되었고 본원에서 더욱 자세히 설명되기는 하지만, 다른 기술이 사용될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
● 데이터 제시. 본 과정은 선택된 데이터 마이닝 기술과 성공적으로 작업할 수 있도록 하는 형태로 데이터를 전환하는 것을 포함한다. 데이터가 숫자인 경우, 즉 본 연구에서와 같이 조사된 데이터가 유전자 발현의 상대적인 레벨을 나타내는 경우, 이는 매우 간단하다. 만약 데이터가 매우 역동적인 범위(즉, 다양한 규모의 수치(many orders of magnitude)를 포괄하는 경우라면, 종종 데이터의 로그값이 사용된다. 데이터가 연구원 각자에 의해 수일에 걸쳐 조사된 별개의 샘플에 대한 많은 측정치를 포함한다면, 시스템 오류가 최소화될 수 있도록 특히 주의를 기울여야 한다. 시스템 오류(즉, 프로토콜 차이, 기계 차이, 작동자 차이, 및 기타의 정량적 인자에서 기인한 오류)의 최소화는 본 발명의 과정에서 "표준화(normalisation)"라고 불린다.
● 특징 선택. 일반적으로 데이터세트는 날마다에 기반(day-to-day basis) 하여 측정하기 위해서 실시되는 것보다 더 많은 데이터 요소를 포함하고, 예측 모델을 만들기 위해 필요한 정보를 제공하지 않는 다수의 요소를 추가적으로 포함한다. 데이터세트를 설명하기 위한 예측 모델의 실제 능력은 데이터세트의 전체 차원(dimensionality)의 일부 하위 세트로부터 유래한다. 이러한 차원은 데이터 세트의 가장 중요한 성분(또는 특징)이다. 마이크로어레이 데이터 맥락에서 중요한 것은, 데이터 세트의 차원은 각각의 유전자라는 것이다. 본원에 기술된 특징 선택은, 가장 "차별적으로 발현된" 유전자를 발견하는 것을 포함한다. 더욱 일반적인 의미에서, 이는 유의성에 대한 일부 통계학적인 시험을 통과한 그룹들을 포함하는데 즉, 조사된 그룹 중 하나 또는 기타 다른 것에서 특정한 변수가 일관성있게 더욱 높거나, 더욱 낮은 수준인 것이다. 때때로, 상기 특징은 가장 큰 분산을 보이는 변수(또는 차원)이다.
특징 선택을 적용하는 것은 예측 모델을 발생시키기 위하여 사용되는 방법과는 완전히 독립적이고, 목적하는 결과를 달성하기 위해 상당한 실험을 포함한다. 본 발명내에서, 유의한 유전자에 대한 선택 및 기존의 성공적인 모델(NZ classifier)과 상관관계 있는 것들을 선택하는 것은 특징 선택에 포함된다. 또한, 데이터 축소 방법(예를 들면, 주성분 분석)을 데이터 세트에 적용할 수도 있다.
● 트레이닝(Training). 일단 데이터 세트의 부류(예를 들면, 재발성/비재발성) 및 특징을 확립하고, 데이터는 데이터 마이닝의 입력수치로서 허용가능한 형태를 나타낸다면, 감소된 데이터 세트(특징에서 기술된 같은 것)가 선택된 예측 모델에 적용된다. 이 모델을 위한 입력수치는 보통 다차원 수치 입력 수치(벡터로 알려져 있음) 형태이고, 이는 출력 정보(부류 라벨 또는 반응)와 관련되어 있다. 트레이닝 과정에서, 선택된 데이터는 예상 모델에 입력한 수치인데, 순차적(신경망과 같은 기술로)으로, 또는 한번에(선형 모델, 선형 판별 분석, 지지 벡터 기계와 같은 회귀 형태를 적용하는 기술로) 입력된다. 일부 경우에(예를 들면, k-최근린법) 데이터 세트(또는 특징 선택 후에 수득된 데이터 세트의 하위 세트)는 그 자체로 모델이다. 검토한 바와 같이, 효과적인 모델은 상세한 수학을 최소한으로 이해하면서 수립될 수 있지만, 다양한 소프트웨어 패키지, 즉 모델의 파라미터(parameter)가 성공적인 결과를 유도하도록 분석 전문가에 의해 미리 결정되어 왔다.
● 평가. 이 단계는 데이터 마이닝 프로토콜의 핵심 단계이고, 이 단계를 잘못 적용하면 오류를 유도하게 된다. 예상 모델의 성공 여부를 테스트하기 위해, 데이터 세트의 일부를 특징 선택 및 트레이닝으로부터 따로 분류한다. 또한, 평가 결과가 특징 선택 및 모델의 트레이닝에 효과가 있도록 사용된다면, 실제 상황에 적용되기 전에 모델을 시험하기 위해서 추가적인 평가를 한다. 만약, 이 과정이 모델에 엄격하게 적용되지 않는다면, 실제 상황에서 실패하기 쉽다. 평가 방법은 아래에서 더욱 상세히 기술한다.
● 적용. 일단 모델이 제작되어 평가되었다면, 최종 사용자가 사용할 수 있도록 몇가지 방식으로 포장되어야 한다. 이는 종종 몇가지 형태, 즉 모델이 삽입된 것에 스프레드시트 적용, 통계적 소프트웨어 패키지의 스크립팅(scripting), 또는 모델을 정보 기술 스태프에 의해 하드-코드(hard-coded) 적용으로 리팩토링(refactoring)하는 것을 포함한다.
빈번하게 사용되는 소프트웨어 패키지의 예는 다음과 같다:
- 여러 판매업자로부터 구입한 스프레드시트 플러그인(plugin)
- R 통계학적 환경
- 시판되는 패키지 MatLab, S-plus, SAS, SPSS, STATA.
- Octave (a MatLab clone)와 같은 무료 소프트웨어
- 다수의 다양화된 C++ 라이브러리, 이는 시판되는 클로즈드-소스 세팅(closed-source setting)으로 예상 모델을 실행하기 위해 사용될 수 있다.
데이터 마이닝 방법의 예시(Examples of Data Mining Methods)
상기 방법은 먼저 데이터 마이닝 과정의 단계(위 참조)를 수행한 다음, 적합한 공지의 소프트웨어 패키지를 적용하여 이루어질 수 있다. 데이터 마이닝 과정의 추가적 설명은 매우 잘 쓰여져 있는 많은 교과서들(49)에 자세히 기술되어 있다.
● 선형 모델(49, 50): 데이터는 선형 회귀 모델의 입력수치로서 처리되고, 이의 부류 라벨이나 반응 변수는 출력수치이다. 부류 라벨, 또는 기타 카테고리 데이터는 수치(보통은 정수)로 변형되어야 한다. 일반적인 선형 모델에서, 부류 라벨이나 반응 변수는 그 자체로 입력 데이터와 선형적으로 관련되어 있지 않지만, "연결 함수"를 사용하여 전환된다. 로그 회귀는 일반화된 선형 모델의 가장 일반적인 형태이다.
● 선형 판별 분석(49, 51, 52). 데이터가 선형으로 분리가능(즉, 데이터의 그룹이나 부류가 역치의 n-차원의 연장인 하이퍼플레인(hyperplane)에 의해 분리될 수 있다)하다면, 이러한 기술이 적용될 수 있다. 이 부류를 분리하기 위해서 조합 변수가 사용되어, 그룹간 변이를 최대화하고 그룹내 변이는 최소화한다. 이의 부산물은 분류 규칙(rule)의 형성이다. 이 규칙을 알려지지 않은 부류의 샘플에 적용하면, 샘플에 대해 만들어질 부류 구성원의 예상 또는 분류를 허용한다. 다양한 선형 판별 분석, 예를 들어 최근접 줄어든 중심(nearest shrunken centroids)이 마이크로 어레이 분석을 위해서 가장 흔히 사용된다.
● 지지 벡터 기계 (53): 가중화된 변수의 측면에서 부류 간의 분리를 최대화하는 모델을 결정하기 위하여, 변수 집합을 중량 집합과 함께 사용한다. 이 모델을 샘플에 적용하면, 이 샘플에 대한 부류 구성원의 분류 또는 예측을 만든다.
● 신경망(52): 데이터를 생물학적인 뉴런과 표면적으로 유사한 신경절에 대한 입력수치로서 처리하고, 모든 신경절로부터의 입력수치를 이들이 연결되어 있는 곳에 적용하여, 입력수치를 출력으로 변형시킨다. 보통 신경망은 "곱셈 및 덧셈" 알고리즘을 사용하여, 다중 연결견 입력 신경절로부터의 입력수치를 단일 출력으로 변형시킨다. 신경절은 입력치가 소정의 역치를 초과하지 않는다면, 출력을 반드시 발생시키지 아니할 수 있다. 각 신경절은 입력 수치, 몇몇 다른 신경절로부터 출력을 가지고, 보통 카테고리 변수와 연결되어 있는 최종 출력 신경절을 가진다. 신경절 수, 신경절의 위상학적 모양(topology)은 거의 무제한적 방식으로 다양화될 수 있고, 다른 방식으로 카테고리화되는 것이 불가능할 수도 있는 매우 잡음 많은 데이터(noisy data)를 분류하는 능력을 제공한다. 가장 일반적인 신경망의 실행은 다중층 신경회로망학습(multi-layer perceptron)이다.
● 분류 및 회귀 트리(54): 여기에서, 변수는 샘플의 부류를 결정하기 위한 단계적인 방식으로 따를 수 있는 규칙의 체계(hierarchy)를 정의하기 위하여 사용된다. 전형적인 과정은 특정한 부류의 출력수치를 유도하는 규칙의 세트, 또는 판별할 능력이 없는 구체적 문장을 발생시키는 것이다. 분류 트리의 예는 예컨대 다음과 같은 알고리즘의 실행이다:
만약 유전자 A>x 이고, 유전자 Y>x 이며, 유전자 Z = z이면, 부류 A
그 외에 유전자 A = q이면, 부류 B
● 최근린법(51, 52). 샘플(알려지지 않은 부류)을 그 주위의 샘플(알려진 부류)과 비교하고, 이를 거리함수에 의해 정의된 근접도를 사용하여 예측 또는 분류를 행한다. 다수의 상이한 거리 함수를 정의하는 것이 가능하다. 보통 사용되는 거리 함수는 유클리드 거리(삼각측량에서와 같은 피타고라스 거리의 연장, n-차원까지), 다양한 형태의 상관관계(피어슨 상관관계(Pearson Correlation) 계수 포함)이다. 유클리드 거리가 적용될 수 있도록(예를 들면, Mahalanobis 거리)하는, 의미있는 거리 매트릭스에 의해 연결 정상적으로 연결되지 않은 데이터 지점을 유클리드 공간으로 전환하는 변형 함수가 있다. 거리 매트릭스는 꽤 복잡하지만, k-최근린의 기본 전제는 꽤 단순하고, 필수적으로 "알려지지 않은 입력수치와 가장 유사한 k-데이터 벡터를 찾고, 이와 상응하는 부류를 찾은 다음, 어떠한 부류가 알려지지 않은 입력 수치인지에 관하여 투표(vote)"하는 것에 대한 재언급(restatement)이다.
● 기타 다른 방법
- 베이지안 네트워크(Bayesian network). 원형 아닌(acyclic) 직접적인 그래프를 사용하여, 조인트 확률 분포와 함께 변수 집합을 나타내고, 이는 그 다음 샘플에 대한 부류 구성원의 확률을 측정하기 위해 사용하였다.
- 독립 성분 분석. 여기에서 독립 신호(예를 들면, 부류 구성원)을 변수 집단으로부터 (성분으로) 재분리한다. 이들 성분은 그 다음, 샘플에 대한 부류 구성원의 분류 또는 예상을 만들어 내기 위해 사용될 수 있다.
예측 방법의 집합에서 앙상블 학습 방법은 조합되어 샘플에 대한 부류 구성원의 결합 분류 또는 예상을 만들어 낸다.
탐색될 수 있는 이들 방법론의 다수의 변형이 있고(49), 다수의 신규 방법론은 지속적으로 정의 및 개발되고 있다. 이들 방법론 중 임의의 하나는 허용가능한 결과를 얻기 위해 사용될 수 있는 것으로 이해된다. 이해 가능한 평가 계획을 통해 모든 결과를 시험하는 것을 확인하여, 과대적합(overfit)되는 것을 피할 수 있도록 특히 주의를 기울여야 한다.
평가(Validation)
기술된 예상 방법의 적용은 새로운 데이터 세트(임상적 시도로부터의 데이터와 같은)에 적용될 수 있기에 앞서, 트레이닝 및 교차 타당성(cross-validation) 평가를 둘 다 포함한다(43, 55). 트레이닝은 관심있는 데이터 세트의 하위 세트(이 경우, 대장암으로부터의 유전자 발현 측정치)을 고려하여, 테스트되고 있는 부류(이 경우 재발 및 비재발 암)에 대해 계층화(stratified)하는 것을 포함한다. 이러한 트레이닝 세트는 예측 모델을 생성시키기 위해 사용되며(위에 정의됨), 이는 나머지 데이터에 대해서도 테스트된다(시험 세트).
그러나, 시험 세트에서 더욱 나은 성능을 수득하기 위하여 예상 모델의 파라미터를 변경시키는 것도 가능하고, 이는 과적합으로서 알려진 상황을 유발할 수도 있으며, 예측 모델이 트레이닝한 데이터 세트 상에서 작동하지만, 임의의 외부의 데이터 세트에서 작동하지 않는다. 이러한 상황을 피하기 위해, 평가 과정은 다음과 같다. 보통 적용되는 주요한 2가지 평가 유형이 있는데, 첫번째(홀드 아웃 평가: hold-out validation)는 데이터 세트를 3가지 그룹: 시험, 트레이닝 및 평가로 분배하는 것을 포함한다. 이러한 평가 세트는 어떠한 경우이든 트레이닝 과정에 어떠한 입력 수치도 가지지 않아서, 매개변수 또는 기타 정제(refinement)의 조정이 시험 세트에 적용되는 동안 발생해야한 한다(하지만 평가 세트에는 그렇지 아니하다). 두번째 주요 유형은 교차 타당성 평가로, 여러가지 방식으로 적용될 수 있고, 아래에 기술한다.
두 가지의 주요 교차 타당성 평가 유형이 있다: K-폴드 교차 타당성 평가 및 리브-원-아웃 교차 타당성 평가(leave- one-out cross-validation)가 그것이다.
K-폴드 교차 타당성 평가: 데이터 세트를 K 하위샘플로 나누는데, 각 하위샘플은 원래 샘플과 대략 동일한 비율을 포함하는 것이다. 각 회의 평가 중에, K 하위샘플 중 하나는 남겨두고, 나머지 데이터세트를 사용하여 트레이닝을 수행한다. 각 라운드에 대한 트레이닝 효율은 얼마나 정확하게 남겨진 그룹의 분류가 이루어졌는지에 의해 측정된다. 이러한 과정을 K-회 반복하고, 이의 전체적인 효율은 예상된 부류를 공지된 부류와 비교하여 확인한다.
리브-원-아웃 교차 타당성 평가: 일반적으로 사용되는 K-폴드 교차 타당성 평가의 변형으로, K=n이고, n은 샘플의 수이다.
표 1 및 2에 기재된 것과 같은 CCPMs의 조합을 예후 예상 모델을 제작하기 위하여 사용할 수 있다.
예후적 표지
이러한 마커들 중 하나 이상의 마커를 포함하는 예후적 표지는 표지로부터 유래된 하나 이상의 예상 모델의 적용을 통해, 환자의 귀추를 결정하는데 사용될 수 있다. 특히, 임상의 또는 연구원은 표지내의 하나 이상의 마커의 차별적 발현(예를 들면, 증가된 또는 감소된 발현)을 결정할 수 있고, 예상 모델을 적용할 수 있으며, 이에 의해 음성적 예후, 예를 들면, 환자의 질병의 재발 가능성을 예상하거나, 또는 경우에 따라서 양성적 예후(지속된 완화 상태)에 대한 가능성을 예상할 수 있다.
더욱 추가적인 측면에서, 본 발명은 암에 대한 치료 계획을 결정하는 방법을 포함하며, (a) 암 샘플을 제공하는 것; (b) 상기 샘플 중 GCPM 패밀리 구성의 발현 레벨을 검출하는 것; (c) GCPM 패밀리 구성의 발현 레벨에 기초하여 암의 예후를 결정하는 것; 및 (d) 예후에 따라 치료 계획을 결정하는 것을 포함한다.
다른 추가적인 측면에서, 본 발명은 GCPM 검출 장치를 포함하며, GCPM 포획 시약을 그 위에 가지는 기재; 및 상기 기재와 관련된 검출기를 포함하며, 상기 검출기는 상기 포획 시약과 관련된 GCPM를 검출할 수 있다. 추가적인 측면에서, 암을 검출하기 위한 키트를 포함하며, 기재; GCPM 포획 시약; 및 사용을 위한 안내서를 포함한다. 더욱 추가적인 측면에서, qPCR을 사용하여 GCPM를 검출하는 방법을 포함하며, CCPM에 특이적인 포워드 프라이머(forward primer); CCPM에 특이적인 리버스 프라이머(reverse primer); PCR 시약; 반응 바이얼; 및 사용을 위한 안내서를 포함한다.
본 발명의 추가적인 측면에서, GCPM 폴리펩티드 또는 펩티드의 존재를 검출하기 위한 키트를 포함하며, 상기 GCPM 폴리펩티드 또는 펩티드에 대한 포획 시약을 가지는 기재; 상기 GCPM 폴리펩티드 또는 펩티드에 특이적인 항체; 상기 GCPM 폴리펩티드 또는 펩티드에 대한 항체에 결합되어 표지(labelling) 가능한 시약; 및 사용을 위한 안내서를 포함한다.
더욱 추가적인 측면에서, 본 발명은 대장암의 예후를 결정하는 방법을 포함하며, 대장암을 가진 것으로 의심되는 환자로부터 종양 샘플을 제공하는 단계; ELISA법을 사용하여 GCPM 폴리펩티드의 존재를 측정하는 단계를 포함한다. 본 발명의 구체적인 측면에서, 본 발명의 GCPM는 표 A, 표 B, 표 C 또는 표 D에 기재된 마커로부터 선택된다. 더욱 구체적인 측면에서, GCPM는 예후 표지로 포함된다.
본원에서 위장관암, 예를 들어 위암 및 대장암에 대하여 구체화하는 반면, 본 발명의 GCPM는 또한 기타 다른 암, 예를 들어 유방암, 전립선암, 난소암, 폐암(예를 들어, 선암 및 특히 소세포폐암), 림프종, 신경교종, 아세포종(예를 들어, 수모세포종) 및 중피종에 대한 예후로 사용될 수 있음을 알 수 있으며, 감소된 또는 낮은 발현은 양성적 예후와 관련되어 있는 반면, 증가된 또는 높은 발현은 음성적 예후와 관련되어 있다.
실시예
본원의 실시예는 본 발명의 구체예를 설명할 목적으로 제공되는 것이다. 다른 구체예, 방법 및 분석 유형도 분자적 진단 업계의 당업자라면 본 발명의 범위내로 인식할 것이고, 여기서 자세히 기술할 필요는 없을 것으로 판단된다. 본 발명의 범위내의 다른 구체예도 본 발명의 일부인 것으로 해석된다.
실시예 1: 세포 배양(Cell cultures)
실험 과정은 표 1에 나타내었다. 10개의 대장암 셀라인을 배양하였으며, 세미 및 풀 콘플루언스(semi- and full-confluence)에서 수확하였다. 2 성장 단계의 유전자 발현 프로필은 30,000 올리고뉴클레오티드 어레이상에서 분석하였고, 유전자 증식 표지(gene proliferation signature: GPS; 표 C)는 차별적으로 발현되는 유전자의 유전자 온톨로지 분석에 의해 확인하였다. 그 다음, 비교사 클러스터링(unsupervised clustering)을 사용하여 GPS 발현의 유사성에 기초한 2 코오트의 임상적 대장 샘플(Cohort A: 올리고 어레이 상에서 73 단계 I-IV, Cohort B: Affymetrix 칩 상에서 55 단계 II)을 독립적으로 둘로 나누었다. 또한, 코오트 A 종양으로부터의 조직 절편(section)에 Ki-67 면역염색(immunostaining)을 수행하였다. 이 다음, 증식 활성 및 임상 병리적 파라미터 사이의 상관관계를 조사하였다.
다른 질병 단계로부터 유래된 10개의 대장암 셀라인이 이번 연구에 포함되었다: DLD-1, HCT-8, HCT-116, HT-29, LoVo, Ls174T, SK-CO-1, SW48, SW480 및 SW620 (ATCC, Manassas, VA). 세포를 10% 태아 소 항체(fetal bovine serum), 100 IU/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신(GIBCO-Invitrogen, CA)이 보충된 알파 최소 필수적 배지에서, 37℃, 5% CO2 습한 대기 조건으로 배양하였다. 제 1 배양은 세미 콘플루언스(50-60%)에 도달하자마자 수확하였다. 제 2 배양된 세포가 풀-콘플루언스에 도달(현미경 또는 육안으로 결정)하자 배지를 교체하였으며, 세포를 24시간 후에 수확하여 성장 억제된 세포로부터 RNA를 준비하였다. 어레이 실험을 각 세포 배양으로부터 추출된 RNA에 대하여 수행하였다. 또한, 제 2 배양 실험을 다음의 동일한 조건으로 실행하였으며, 추출된 RNA는 다이-리버스드 하이브리다이제이션(dye-reversed hybridization)에 사용하였다.
실시예 2: 환자
2 코오트의 환자를 분석하였다. 코오트 A는 Dunedin and Auckland 병원에서 1995 내지 2000 사이에 수술을 경험한 73명의 뉴질랜드 대장암 환자를 포함하였다. 이 환자들은 전향적 코오트 연구(prospective cohort study)의 일부였고, 모든 질병 단계를 포함하였다. 종양 샘플은 수술 극장(operating theatre)으로부터 액체 질소 중에서 동결된 스냅(snap)으로 프레쉬하게 수집된 것이고, -80℃에 보관되었다. 시편은 1명의 병리학자(H-S Y)에 의해 검토되었으며, 종양은 TNM 시스템(34)에 따라 단계 구분되었다. 73명의 환자 중, 32명은 질병이 재발되었고, 41명은 최소 5년의 경토 검토 후 재발이 없었다. 총 생존자의 명균은 재발 및 비재발 환자에 대하여 각각 29.5 및 66개월이었다. 20 명의 환자들은 5-FU 기반 수술 후 보조 화학치료(5-FU-based post-operative adjuvant chemotherapy)를 받았고, 12명의 환자들은 방사선치료를 받았다(7명은 수술전, 5명은 수술후).
코오트 B는 1995 내지 2001년 사이에 Technical University of Munich에서 수술을 경험한 55명의 독일 대장암 환자 그룹으로, 조직 뱅크(tissue bank)에 저장된 프레쉬 동결 샘플을 포함하였다. 55명 모두는 단계 ΙΙ 질병 상태이고, 26명은 질병이 재발(평균 생존 47개월)하였으며, 29명은 재발없는 상태로 남았다(평균 생존 82개월). 어떤 환자도 화학치료 또는 방사선치료를 받지는 않았다. 두 코오트 둘 다에 대한 임상-병리적 변수는 표 2 부분으로 요약된다.
표 2: 임상-병리적 파라미터, 이들과 GPS발현 및 Ki-67 PI의 연관성
실시예 3: 어레이 준비 및 유전자 발현 분석
코오트 A 종양 및 셀라인: 조직 샘플 및 셀라인을 균일화하였으며, Tri-Reagent (Progenz, Auckland, NZ)를 사용하여 RNA를 추출하였다. 이후 RNA를 RNeasy 미니 컬럼(Qiagen, Victoria, Australia)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 정제하였다. oligo-dT를 준비하여, aa-dUTP 및 Superscript II RNase H-Reverse Transcriptase (Invitrogen) 존재하에서, 각 배양액 또는 종양 샘플로부터 추출된 10 마이크로그램의 총 RNA로부터 cDNA 합성을 수행하였다. Cy 다이는 간접 아미노-알릴 cDNA 라벨링법을 사용하여 cDNA로 도입되었다. 12개의 다른 셀라인 풀에서 유래된 cDNA는 모든 하이브리다이제이션에 대한 참조로 사용되었다. 참조 샘플로부터 얻은 Cy3-dUTP-태그된 cDNA를 각 대장암 셀라인 또는 조직 샘플로부터의 Cy5-dUTP-태그된 cDNA와 섞었다. 혼합물은 이후, QiaQuick PCR 정제 키트(Qiagen, Victoria, Australia)를 이용하여 정제되었으며, MWG 30K Oligo Set (MWG Biotech, NC)로 점(spot)찍어진 마이크로어레이에 코-하이브리다이즈(co-hybridize)되었다. 리버스 라벨링(reverse labelling)을 사용하여 마이크로어레이 상에서 제 2 배양 실험으로부터의 cDNA 샘플을 추가적으로 분석하였다.
어레이를 GenePix 4000B Microarray Scanner로 스캔하였으며, GenePix Pro 4.1 Microarray Acquisition 및 Analysis Software (Axon, CA)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 각 채널로부터의 전경(foreground) 강도는 log2로 변형시켜, SNOMAD software (35)를 사용하여 표준화하였다. 표준화된 수치는 BRB-Array Tools Version 3.2 (Dr. Richard Simon and Amy Peng Lam, Biometric Research Branch, National Cancer Institute에 의해 개발)를 사용하여 교정하고, 필터하였다. 낮은 강도의 유전자 및 조직 샘플 또는 셀라인에 걸쳐 20% 초과의 측정치가 손실된 유전자는 추가적인 분석에서 배제되었다.
코오트 B 종양: 총 RNA를 RNeasy Mini Kit를 사용하여 각 종양에서 추출하였으며, RNeasy Columns (Qiagen, Hilden, Germany)에서 정제하였다. 10 마이크로그램의 총 RNA를 사용하여 SuperScript II reverse transcriptase (GIBCO-Invitrogen, NY) 및 oligo-dT-T7 프라이머(Eurogentec, Koeln, Germany)로 이중 가닥의 cDNA를 합성하였다. 비오틴 결합된 cRNA(Biotinylated cRNA)를 Promega RiboMax T7-kit (Promega, Madison, WI) 및 Biotin-NTP labelling mix (Loxo, Dossenheim, Germany)를 사용하여 이중 가닥 cDNA로부터 합성하였다. 그 다음, 비오틴 결합된 cRNA(biotinylated cRNA)를 정제하여 단편화하였다. 단편화된 cRNA를 Affymetrix HGU133A GeneChips (Affymetrix, Santa Clara, CA)에 하이브리다이즈하였으며, 스트렙타비딘-피코에리쓰린(Streptavidin-phycoerythrin)으로 염색하였다. 어레이를 HP-아르곤-이온 레이져 공초점 현미경(HP-argon-ion laser confocal microscope)으로 스캔하였으며, 디지털화된 이미지 데이터를 Affymetrix® 마이로어레이 스위트 5.0 소프트웨어를 통해 처리하였다. 모두 Affymetrix U133A GeneChip 품질 기준을 통과하여, 비정상적 특징을 가진 스캔을 제거하였다. 배경 보정 및 표준화는 R 컴퓨팅 환경(R computing environment)에서, 바이오컨덕터 패키지 어피(Bioconductor package affy)중 실행되는 확고한 멀티어레이 평균 기능을 사용하여 수행되었다.
실시예 4: 정량 리얼-타임 PCR(Quantitative real-time PCR: QPCR)
세포 배양으로부터 얻은 cDNA를 사용하여 11개 유전자(MAD2L1, POLE2, CDC2, MCM6, MCM7, RANSEH2A, TOPK, KPNA2, G22P1, PCNA 및 GMNN)의 발현을 평가하였다. 총 RNA (2 μg)는 Superscript II RNase H-Reverse Transcriptase kit (Invitrogen) 및 oligo dT 프라이머(Invitrogen)를 사용하여 역전사되었다. ABI Prism 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems) 상에서 Taqman Gene Expression Assays (Applied Biosystems)을 사용하여 QPCR을 수행하였다. 상대적인 폴드 변화는 2-ΔΔCT법36을 사용하여, 토포아이소머레이즈 3A(Topoisomerase 3A)를 내부 대조군으로 하여 계산되었다. 참조 RNA를 구경 측정기(calibrator)로 사용하여, 다른 실험들 사이에 비교할 수 있도록 하였다.
실시예 5: 면역조직화학적 분석(Immunohistochemical analysis)
Ki-67 안티젠(MIB-1; DakoCytomation, Denmark)의 면역조직화학적 발현은 코오트 A로부터 얻은 73개 파라핀 포매된 1차 대장암 종양의 4 ㎛ 절편 상에서 조사하였다. 엔도지너스 퍼옥사이드(Endogenous peroxidise) 활성을 메탄올 중 0.3% 수소 퍼옥시다데이즈(hydrogen peroxidise)로 차단하였으며, 안티젠은 끓는 시트레이트 버퍼(pH 6) 에서 재생되었다. 비특이적 결합 사이트는 1% BSA를 포함하는 5% 노말 염소 항체로 차단되었다. EnVision 시스템(EnVision system: Dako EnVision, CA) 및 DAB 기재 키트(DAB substrate kit: Vector laboratories, CA)를 사용하여 1차 항체(1:50으로 희석)를 검출하였다. 10 X 10 현미경 그리드(grid)를 사용하여 5개의 고출력 필드를 선택하였으며, 통상적으로 임상-병리적 데이터의 지식없이 블라인드 방식(blind fashion)으로 세포 계수(count)를 수행하였다. Ki-67 증식 지수(proliferation index (PI))는 각 종양에 대한 양성적으로 염색된 핵의 백분율로 나타내었다.
실시예 6: 통계적 분석(Statistical analysis)
통계적 분석은 SPSS® version 14.0.0 (SPSS Inc., Chicago, IL)을 사용하여 수행하였다. Ki-67 증식 지표들은 평균±표준편차(mean ± SD)로 나타내었다. Fisher's Exact Test 또는 Kruskal-Wallis Test를 사용하여, GPS의 발현 또는 Ki-67 PI vs. 임상 병리적 파라미터에 기초하여 분류된 그룹간의 차이를 평가하였다. P 값(P value) ≤ 0.05를 유의한 것으로 고려하였다. 총 생존(Overall survival: OS) 및 재발 없는 생존(recurrence-free survival: RFS)를 카플란-마이어법을 사용하여 도시하였다(37). 로그 순위 테스트를 사용하여 카테고리된 그룹 사이의 생존 시간에서의 차이에 대해 테스트하였다. 상대적인 위험도 및 관련된 신뢰 간격 또한 Cox 단변수 모델(Cox univariate model)을 사용하여 각 변수에 대하여 평가하였으며, 단변수 분석에서 유의한 예상 변수와 함께 포워드 단계적 회귀(forward stepwise regression)를 사용하여, 다변수의 Cox 비례 위험도 모델을 개발하였다. K-평균 클러스터링 방법은 GPS의 발현 레벨에 기초하여 임상 샘플을 구분하는데 사용되었다.
실시예 7: 대장 셀라인 모델을 사용한 유전자 증식 지표(gene proliferation signature : GPS)의 확인
유전자 증식 지표(GPS)를 도출 및 적용하는데 사용되는 접근법에 대한 개요는 도 1에 요약되어 있다. 38개의 유사분열 세포 주기 유전자(표 C)를 포함하는 GPS는 세미-콘플루언트 배양에서 주기 세포 중 상대적으로 과발현되었다. 낮은 GPS 발현에 의해 정의되는 낮은 증식성은 비우호적 임상-병리 변수, 더 짧은 정도의 총 생존 및 재발없는 생존(p<0.05)과 연관되어 있다. Ki-67 증식 지수 및 임상 병리 변수 또는 임상 결과 사이에 어떠한 관련성도 찾지 못하였다.
표 C: 세포 증식 표지에 대한 GCPMs
GPS는 유전자의 발현이 CRC 세포 증식율과 관련되어 있는 유전자의 하위 세트로 확인되었다. SAM(Statistical Analysis of Microarray:; Reference 38)을 사용하여 대수적으로 자라는 CRC 셀라인(세미-콘플루언트)과 비주기적(non-cycling: 풀리-콘플루언트) CRC 셀라인 사이에서 다르게 발현되는 유전자를 확인하였다(도 1, 단계 1). 유전자 특이적 염색 편향 및 기타 다른 소스의 변수를 조정하기 위해 각 배양 세트를 독립적으로 분석하였다. 양 세트의 배양액 중 두 성장 단계들 사이에서 유의한 발현 차이가 관찰되기 때문에, 분석은 502 DE 유전자에 한정되었다(오류 발견율<1%). 유전자 온톨로지(GO) 분석은 EASE39 사용하여 수행되었으며, DE 유전자에서 현저하게 반향된 생물학적 프로세스 카테고리를 확인하였다.
증식 관련 카테고리는 주로 대수적으로 자라는 세포에서 상향조절(upregulated)된 유전자로 인해 과발현되었다. (i) 이러한 생물학적 프로세스는 가장 과발현된 GO 용어(EASE score=5.5211)이고; (ii) 모든 38개의 유사분열 세포 주기 유전자(표 C)는 성장 억제된 세포와 비교하여, 빠르게 자라는 세포에서 더 높은 레벨로 발현되었기 때문에 유사분열 세포주기 카테고리(GO:0000278)를 GPS로 정의하였다. GPS로부터의 11개 유전자의 발현은 QPCR에 의해 평가되었으며, 어레이 데이터로부터 얻은 대응되는 값과 연관되어 있다. 따라서, QPCR을 통해 증식 표지 유전자의 상승된 발현은 CRC 셀라인에서 증가된 증식과 상관 관계가 있음을 확인하였다(도 5).
실시예 8: 유전자 증식 표지의 발현 레벨에 따른 CRC 샘플의 분류
CRC 종양의 상대적인 증식 상태 및 임상적 적용을 위한 GPS 용도를 검사하기 위해, 두 코오트로부터 얻은 CRC 종양을 GPS 발현에 기초하여 2개의 클러스터로 계층화(stratify) 하였다(도 1, 단계 2). GPS를 정의하는 38개 유전자의 발현값은 먼저 종양의 마이크로어레이로부터 생성된 발현 프로필(microarray-generated expression profile)로부터 얻었다. 각 코오트에서 얻은 종양을 그 다음, K-평균 비교사 클러스터링(K-means unsupervised clustering)을 사용하여 각각 GPS 발현 레벨 유사성에 기초한 2 클러스터(K=2)로 분류하였다. 모든 필터된 유전자를 사용하여 2개의 정의된 클러스터 사이에서의 DE 유전자 분석은 GPS가 양자의 코오트 모두에서 클러스터 2(하부 패널)에 비해 클러스터 1(FIG. 2A, 상부 패널)이 상향조절된 유전자 리스트 내부에 포함되어 있음이 밝혀졌다. 이에 따라, 클러스트 1에서의 종양은 높은 GPS 발현을 특징으로 하는 반면, 클러스터 2에서의 종양은 낮은 GPS 발현을 특징으로 한다.
실시예 9: 낮은 유전자 증식 표지는 비우호적(unfavourable) 임상-병리적 변수와 연관되어 있다
GPS 발현 레벨과 임상 병리적 변수들 사이의 관련성이 표 2에 요약되어 있다. 두 코오트 모두에서 낮은 GPS 발현에 의해 정의되는 낮은 증식 활성과 증가된 재발 위험성 사이에서 관련성이 관찰되었다(코오트 A 및 B 각각에 대하여 P=0.03 및 <0.001). 코오트 A에서, 낮은 GPS 발현은 또한 더 높은 질병 단계 및 림프절 전이(각각 P=0.006 및 0.03)와 관련이 있다. 또한, 비록 통계적 유의성에 도달하지는 못하였을지라도(P=0.06), 코오트 A에서 림프관 침범(lymphatic invasion)을 가진 종양은 림프관 침범을 가지지 않은 종양보다 증식성이 낮은 경향이 있다. GPS 발현 레벨과 종양 지점, 나이, 성, 차이의 정도, T-단계, 관 침범, 림프관 침입의 정도 및 종양 절제면 사이에서 어떠한 상관성도 발견하지 못하였다.
실시예 10: 유전자 증식 표지는 임상적 결과를 예상한다
환자의 귀추를 예상하는데 있어서의 GPS의 성능을 확인하기 위해, 카플란-마이어 생존 분석을 사용하여, 낮은 정도의 GPS 종양 및 높은 정도의 GPS 종양 사이에 RFS 및 OS를 비교하였다(도 3). 모든 환자는 수술 후 60 개월에서 검열되었다. 대장암 코오트 A에서, OS 및 RFS는 낮은 GPS 발현을 가지는 환자에서 더 짧았다(로그 순위 테스트 각각 P=0.04 및0.01). 대장암 코오트 B에서, 낮은 GPS 발현 또한 감소된 OS(P=0.0004) 및 RFS (P=0.0002)와 연관되어 있다. 단변수 분석 중 OS 및 RFS를 예상하는 파라미터는 다변수 모델에서 조사되었으며, 질병 단계는 5년 OS의 유일한 독립적 예측변수인 반면, 질병 단계 및 T-단계는 코오트 A 중 RFS의 독립된 예측변수이었다. 코오트 B에서, 낮은 GPS 발현 및 림프관 침범은 OS 및 RFS 모두에 독립적인 기여도를 나타내었다. 만약 생존 분석이 림프관 침범없이 코오트 B 환자로 제한되었다면, 낮은 GPS는 여전히 더 짧은 OS 및 RFS와 연관되어 있고, 이는 예측변수로서 GPS의 독립성을 확인한 것이다. 생존과 단수 및 복수의 변수의 관련성에 대한 분석은 표 3에 요약되어 있다.
낮은 GPS 발현은 또한, 위암을 가진 환자에서 감소된 5년 총 생존과 관련되어 있다(p=0.008). 낮은 GPS 위 종양 및 높은 GPS 위 종양의 총 생존을 비교하는 카플란-마이어 생존 그래프는 도 4에 표시되어 있다.
표 3: 두 코오트 모두에서 OS 및 RFS 에 대한 예후 인자의 단일변수 및 복수변수 분석
실시예 11: Ki-67은 임상-병리적 변수 또는 생존과 연관되어 있지 않다.
파라핀 포매된 샘플은 코오트 B에 대하여는 이용 불가능하기 때문에, 코오트 A 종양만의 조직 절편에 Ki-67 면역염색을 수행하였다(도 1, 단계 3). 핵 염색은 모든 73개의 CRC 종양 중에서 검출되었다. Ki-67 PI는 25 내지 96%의 범위를 가지고, 평균값은 76.3±±.5이었다. Ki-67 평균 값을 컷-오프 지점으로 사용하여, 종양을 낮은 또는 높은 PI를 가진 2가지 군으로 분류하였다. Ki-67 PI 중 어느 것도 임상-병리적 변수(표 2)와 연관되지 않았으며, 생존(표 3)과도 연관되지 않았다. 생존 분석을 가장 높은 Ki-67 값 및 가장 낮은 Ki-67을 가진 환자로 제한한 경우, 어떠한 통계적 차이도 관찰되지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 이러한 결과의 총합은 성장 관련 유전자의 낮은 발현은 대장암 중 불량한 결과와 연관되어 있고, Ki-67은 관련성을 검출할 수 있을 정도로 충분하게 민감하지 않음을 의미한다. 이러한 발견은 암으로부터 조기에 사망할 위험이 높은 환자를 확인하기 위한 추가적인 기준으로 사용될 수 있다.
실시예 12: 연관된 세포 증식 유전자의 선택
코오트 B(55명의 독일 CRC 환자; 표 2)는 먼저 38개의 유전자 세포 증식 표지(표 C) 및 k-평균 클러스터링 방법(피어슨 중심적이지 않음(Pearson uncentered), 1000 변형(permutation), 80%에 위치한 동일한 클러스터 중 역치의 발생(threshold of occurrence in the same cluster sat at 80%))을 사용하여 낮은 증식그룹 및 높은 증식그룹으로 분류하였다. 그 다음, SAM(Statistical Analysis of Microarrays)을 적용하여 모든 필터된 유전자(16041 유전자)가 분석에 포함된 경우, 낮은 증식 그룹과 높은 증식 그룹(FDR=0) 사이에서 차별적으로 발현된 유전자를 확인하였다. 754개의 유전자가 높은 증식 그룹에서 과발현됨을 발견하였다. 이후, GATHER 유전자 온톨로지 프로그램을 사용하여 차별적으로 발현되는 유전자의 리스트 내에서 가장 과발현되는 유전자 온톨로지 카테고리를 확인하였다. 세포 주기 카테고리는 차별적으로 발현되는 유전자 리스트 내에서 가장 과발현되는 카테고리이었다. 낮은 증식 그룹과 높은 증식 그룹 사이에서 차별적으로 과발현되는 102개의 세포 주기 유전자(원래의 38개의 유전자 표지에 추가)를 표 D에 나타내었다.
표 D: 저증식 및 고증식에서 차별적으로 발현되는 세포 주기 유전자
결론
본 발명은 먼저 대장암에서의 결과 뿐 아니라, 유전자 증식 지표 및 주요한 임상 병리적 변수 사이의 관련성을 보고하는 것이다. 개시된 연구는 in vitro-유래의 복수-유전자 증식 지표를 사용하여, Ki-67 면역염색에 의해 종양의 증식 상태를 조사하였다. 본원의 결과에 따르면, 종양 중 낮은 GPS의 발현은 독립적인 2 코오트의 환자에서 더 높은 재발 위험도 및 더 짧은 생존과 연관되어 있다. 반대로, Ki-67 증식 지료는 어떠한 임상적으로 관련된 평가변수(endpoint)와도 관련이 없다.
대장 GPS는 38개의 유사분열 세포 주기 유전자를 포함하고, 유방(40), (41), 난소(42), 간 (43), 급성 림프모구성 백혈병(Acute lymphoblastic leukaemia) (44), 신경아세포종(45), 폐편평세포암(lung squamous cell carcinoma) (46), 두경부(47), 전립선(48) 및 복부(49)의 종양에 대하여 정의된 증식 표지의 일부인 코어 세트 유전자(CDC2, RFC4, PCNA, CCNE1, CDK7, MCM 유전자, FEN1, MAD2L1, MYBL2, RRM2 및 BUB3)를 포함한다. 이러한 유전자의 대부분은 빠르게 증식하는 종양에서 매우 과발현되고, 높은 비율의 빠른 주기를 가지는 세포를 반영하는 것임이 확인되었기 때문에, 이는 보존된 패턴의 발현을 나타낸다(50). 따라서, 대장 GPS의 발현 레벨은 종양의 증식 상태에 대한 척도를 제공한다.
이 연구에서, 불량한 결과(질병 단계, 림프절 전이 및 림프관 침범)와 관련된 몇몇 임상 병리적 변수는 코오트 A 환자중에서 낮은 GPS 발현과 연관되어 있다. 전적으로 단계 II 종양으로 구성된 코오트 B에서, 연구는 GPS와 림프관 침범 사이에 관련성을 평가하였다. 이 코오트에서 림프관 침범을 보이는 종양의 수가 작아(5/55), 관련성이 통계적 유의성에 도달하는데 실패하였다. 이론에 구애받지 않고, 더 진행된 종양 중 낮은 GPS 발현은 CRC 진행이 증가된 증식에 의해 유도되는 것은 아님을 의미할 수 있다. 가속된 증식이 종양 형성의 초기 동안 여전히 중요한 구동력일 수는 있지만, 더 진행된 질병은 유전적 불안정성과 같은 과정에 더욱 의존하여, 계속적인 선택을 허용할 수 있다. 우리의 발견과 일치하게, 2개의 큰 규모의 연구는 감소된 발현의 CDK2, cyclin E 및 A와 진행된 단계, 깊은 침투 및 림프절 전이(51), (52) 사이의 연관성을 보고하였다.
낮은 GPS와 비우호적 임상-병리적 변수 사이의 상관성은 GPS 또한 환자의 귀추를 예상함을 제안하였다. 코오트 A 및 B 둘 다에서, 낮은 GPS 발현은 더 높은 재발 위험성과 더 짧은 총 생존 및 재발없는 생존과 연관되어 있었다. 모든 환자가 단계 ΙΙ 종양을 가진 코오트 B에서, 관련성은 다변수 분석에서도 유지된다. 그러나, 환자들이 단계 Ι-ΙV을 가진 코오트 A에서, 관련성은 종양 단계와 독립적이지 않았다. 재발이 있는 환자 및 재발이 없는 환자의 수는 코오트 A 중 질병의 각 단계 내에서 아마도 GPS와 생존 사이의 독립적인 관련성을 입증하기에 부족하였다. 코오트 B에서, 낮은 GPS 발현 및 림프관 침범은 다변수 분석 중 독립 예상변수로 남아, GPS는 동일한 질병 단계 내의 CRC 환자의 귀추에 대한 예상을 향상시킬 수 있음을 제안한다. 림프절의 존재 및 원위 기관의 관여는 종양 전이의 직접적인 표명이기 때문에, 림프절의 존재 및 원위 기관의 관여는 귀추 예측의 가장 강력한 예상변수라는 것은 놀라운 것이 아니다.
코오트 A 환자 중 각각 18% 및 27%가 사용한 방사선치료 또는 화학적 치료와 함께하는 치료는 이번 연구에서 가능한 교락인자(confounding factor)이었다. 이론적으로, 상승된 GPS 발현과 관련된 향상된 생존은 암 치료(53), (54)에 대하여 빨리 증식하는 종양의 더 나은 응답을 반영할 수 있다. 그러나, 치료와 GPS 발현 사이에 어떠한 상관관계도 발견되지 않았다. 더욱이, 코오트 B의 환자 중 누구도 보조 치료를 받지 않았는데, 이는 GPS 및 생존 사이의 연관성은 치료와 무관함을 의미한다. 이번 연구는 종양 증식 및 화학치료 또는 방사선 치료에 대한 반응 사이의 관계를 조사하기 위해 설계된 것은 아님을 주목해야 한다.
샘플 크기 또한, 본 연구에서 Ki-67 PI 를 포함하는 임상-병리적 변수와 생존 사이에 관련성이 부족함을 설명할 수 있다. 위에서 언급한 바와 같이, Ki-67와 CRC 귀추에 대한 기타 다른 연구들은 일치하지 않는 발견을 보고하였다. 그러나, 가장 큰 샘플 사이즈를 포함하는 3개의 다른 CRC 연구에서, 낮은 Ki-67 PI는 더 나쁜 예후와 관련되어 있다(27), (29), (30). 우리는 GPS를 적용하여 동일한 결론에 이를 수 있으나, 더 작은 샘플 사이즈에 기초한 것이다. 복수의 유전자 발현 분석은 이에 따라, Ki-67 PI 에 비해 증식 및 예후 사이의 관계를 평가하는 더 민감한 도구이었다.
낮은 GPS를 가진 종양에서 비우호적 예후 너머의 생물학적 이유는 추가적인 조사에 관여할 것이다. 낮은 GPS의 종양 중 더 나쁜 임상적 결과에 잠재적으로 영향을 주는 기작은 다음을 포함한다: (i) 빠르게 증식하는 종양에 더욱 효과적인 면역 응답(immune response); (ii) 암세포가 세포괴사에 더욱 저항하게 하는 더 높은 레벨의 유전자 손상 및 침범력 상승 뿐 아니라, 안정적인 복제 기작의 동요(perturb smooth replication machinery); (iii) 정상적 줄기 세포와 유사하게 느리게 분화하는 증가된 수의 암 줄기세포이나, 높은 전이 잠재력을 가짐; 및 (iv) 더 높은 비율의 부수체(microsatellite) 불안정 종양으로, 높은 증식성을 가지나 상대적으로 우수한 예후성을 가진다.
결론적으로, 본 발명은 대장암에서 세포 증식의 예후적 역할과 관련하여 충돌하는 이전의 결과들을 명확하게 하였다. GPS는 CRC 셀라인을 사용하여 개발되었고, 2개의 독립적 환자 코오트에 적용되었다. CRC 중 낮은 발현의 성장 관련 유전자는 더욱 진행된 종양 단계(코오트 A)와 관련되어 있고, 동일한 단계 내의 불량한 임상 결과(코오트 B)와 관련이 있음을 밝혀내었다. 복수의 유전자 발현 분석을 통해, 오랫동안 확립된 증식 마커인 Ki-67에 비해, 결과를 예상하기 위한 더욱 강력한 지표임을 나타내었다. 미래의 연구에서, CRC가 유방암 및 폐암(예를 들어 Ki-67 참조)과 같은 다른 통상적인 상피암과 다른 이유를 결정하는 데 유용할 것이다. 이는 중요한 생물학적 뒷받침 기작에 대한 통찰력을 제공할 것이다. 실용적 관점에서, 주어진 병리적 단계 내에서 재발 위험을 계층화하는 능력은 더욱 정확하게 타겟되어야 하는 보조치료를 가능하도록 한다. 따라서, GPS 발현은 재발 및 대장암으로 사망할 위험도가 높은 환자를 확인하기 위한 종래의 단계에 대한 부가물(adjunct)로 사용될 수 있다.
위 명세서 중 언급된 모든 개시사항 및 특허는 본원에 참조로서 합체된다.
상기 설명 중, 정수 또는 구성은 공지의 균등물을 가지는 것임을 참조할 것이며, 이러한 균등물은 위에 언급된 바와 같이 개별적으로 합체된다.
본 발명은 예시 및 가능한 실시예를 참조하여 설명되었으나, 본 발명의 범주 및 요지를 벗어나지 않는다면, 개선 및/또는 변형할 수 있는 것으로 이해된다.
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Claims (45)
- 환자의 위장관암(gastrointestinal cancer)의 진행을 결정하기 위한 표 A, 표 B, 표 C 또는 표 D로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하는 예후 표지(prognostic signature).
- 제 1 항에 있어서,
상기 표지는 CDC2, MCM6, RPA3, MCM7, PCNA1 G22P1, KPNA2, ANLN, APG7L, TOPK, GMNN, RRM1, CDC45L, MAD2L1, RAN, DUT, RRM2, CDK7, MLH3, SMC4L1, CSPG6, POLD2, POLE2, BCCIP, Pfs2, TREX1, BUB3, FEN1, DRF1, PREI3, CCNE1, RPA1, POLE3, RFC4, MCM3, CHEK1, CCND1 및 CDC37중 어느 하나로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하는 예후 표지. - 위장관암의 재발없이 위장관암 환자의 장기 생존 가능성을 예측하는 방법으로서,
상기 방법은 환자로부터 얻어, 위장관 암 조직 샘플 중 모든 RNA 전사물 또는 이들의 산물, 또는 표준 세트의 RNA 전사물 또는 이들의 산물의 발현 레벨에 대하여 표준화된 위장관 샘플 중 하나 이상의 예후 RNA 전사물 또는 이들의 발현 산물의 발현 레벨을 결정하는 것을 포함하고, 상기 예후 RNA 전사물은 표 A, 표 B, 표 C 또는 표 D로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 전사물이며,
위장관암의 재발없이 장기 생존 가능성을 확립하는 것을 포함하는 방법. - 제 3 항에 있어서,
상기 하나 이상의 예후 RNA 전사물 또는 이의 발현 산물은 CDC2, MCM6, RPA3, MCM7, PCNA, G22P1, KPNA2, ANLN, APG7L, TOPK1 GMNN, RRM1, CDC45L, MAD2L1, RAN, DUT, RRM2, CDK7, MLH3, SMC4L1, CSPG6, POLD2, POLE2, BCCIP, Pfs2, TREX1, BUB3, FEN1, DRF1, PREI3, CCNE1, RPA1, POLE3, RFC4, MCM3, CHEK1, CCND1 및 CDC37중 어느 하나로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
상기 방법은 2 이상, 5 이상, 10 이상 또는 15 이상의 예후 RNA 전사물 또는 이의 발현 산물의 발현 레벨을 측정하는 것을 포함하는 방법. - 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 하나에 있어서,
상기 하나 이상의 예후 RNA 전사물 또는 이의 발현 산물의 증가된 발현은 위장관암의 재발없이 증가된 장기 생존 가능성을 의미하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
위장관암 재발없이 장기 생존 가능성을 확립하기 위해, 예측 모델이 적용되고, 예측 방법을 재발 및 비재발성(non-recurring) 종양 샘플 중 예상 표지의 발현 레벨에 적용하여 확립되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 7 항에 있어서,
상기 예상 방법은 선형 모델, 서포트 벡터 기계, 신경망, CART(classification and regression tree), 앙상블 학습 방법(ensemble learning methods), 판별분석(discriminant analysis), 최근린법(nearest neighbor method), 베이지안 네트워크(Bayesian network), 독립 성분 분석(independent components analysis)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 3 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 위장관암은 위암 또는 대장암(colorectal cancer)인 것을 특징으로 하는 방법. - 제 3 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
하나 이상의 예후 RNA 전사물의 발현 레벨이 결정되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 3 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 RNA는 환자의 고정된 또는 왁스 포매된 위장관암 조직 시편(wax- embedded gastrointestinal cancer tissue specimen)으로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 3 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 RNA는 코어 생검 조직(core biopsy tissue) 또는 세침 흡입 세포(fine needle aspirate cell)로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 방법. - 표 A, 표 B, 표 C 또는 표 D로부터 선택되는 둘 이상의 유전자에 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 어레이(array).
- 하기 유전자 중 2 이상에 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제 13 항의 어레이: CDC2, MCM6, RPA3, MCM7, PCNA, G22P1, KPNA2, ANLN, APG7L, TOPK, GMNN, RRM1, CDC45L, MAD2L1, RAN, DUT, RRM2, CDK7, MLH3, SMC4L1, CSPG6, POLD2, POLE2, BCCIP, Pfs2, TREX1, BUB3, FEN1, DRF1, PREI3, CCNE1, RPA1, POLE3, RFC4, MCM3, CHEK1, CCND1 및 CDC37
- 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서,
3 이상, 5 이상, 10 이상 또는 15 이상의 유전자에 하이브리드 하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 어레이. - 제 13 항에 있어서,
하기 유전자 중 2 이상에 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 어레이: CDC2, MCM6, RPA3, MCM7, PCNA, G22P1, KPNA2, ANLN, APG7L, TOPK, GMNN, RRM1, CDC45L, MAD2L1, RAN, DUT, RRM2, CDK7, MLH3, SMC4L1, CSPG6, POLD2, POLE2, BCCIP, Pfs2, TREX1, BUB3, FEN1, DRF1, PREI3, CCNE1, RPA1, POLE3, RFC4, MCM3, CHEK1, CCND1 및 CDC37. - 제 13 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 cDNA인 것을 특징으로 하는 어레이. - 제 17 항에 있어서,
상기 cDNA는 약 500 내지 5000 베이스의 길이인 것을 특징으로 하는 어레이. - 제 13 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 어레이. - 제 19 항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드는 약 20 내지 80 베이스의 길이인 것을 특징으로 하는 어레이. - 제 13 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
고체 표면은 글라스(glass)인 어레이. - 위장관암을 진단받은 환자가 위장관암의 재발없이 장기 생존할 가능성을 예측하는 방법으로서, 상기 방법은
(1) 환자로부터 얻어, 위장관 암 조직 샘플 중 모든 RNA 전사물 또는 이들의 산물, 또는 표준 세트의 RNA 전사물 또는 이들의 산물의 발현 레벨에 대하여 표준화된 위장관 암 조직 샘플에서, 유전자 또는 표 A, 표 B, 표 C 또는 표 D로부터 선택되는 유전자의 RNA 전사물 또는 발현 산물의 발현 레벨을 결정하는 단계;
(2) 상기 단계 (1)에서 얻어진 데이터를 통계 분석으로 처리하는 단계; 및
(3) 장기 생존 가능성이 증가 또는 감소하였는지 여부를 결정하고, 위장관암의 재발없이 장기 생존 가능성을 확립하는 단계를 포함하는 방법. - 제 22 항에 있어서,
하나 이상의 예후 RNA 전사물 또는 이의 발현 산물은 CDC2, MCM6; RPA3, MCM7, PCNA, G22P1, KPNA2, ANLN, APG7L, TOPK, GMNN, RRM1, CDC45L, MAD2L1, RAN, DUT, RRM2, CDK7, MLH3, SMC4L1, CSPG6, POLD2, POLE2, BCCIP, Pfs2, TREX1, BUB3, FEN1, DRF1, PREI3, CCNE1, RPA1, POLE3, RFC4, MCM3, CHEK1, CCND1 및 CDC37중 어느 하나로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 22 항 또는 제 23 항에 있어서,
상기 통계 분석은 콕스 비례적 위험도 모델(Cox proportional hazard model)을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법. - (a) 환자로부터 얻은 위장관 조직으로부터 추출된 RNA를 유전자 발현 분석하는 단계; (b) 표 A, 표 B, 표 C 또는 표 D중 어느 하나에 리스트된 위장관 암 유전자 세트로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현 레벨을 결정하는 단계로, 상기 발현 레벨은 대조군 유전자 또는 유전자들에 대해 표준화되어, 선택적으로 위장관 암 표준 조직 세트에서 발견되는 양과 비교되며, (c) 유전자 발현 분석에 의해 얻어진 데이터를 요약하는 보고서를 작성하는 단계를 포함하는 암 환자에 대한 개인화된 유전자 프로필을 제작하는 방법.
- 제 24 항에 있어서,
상기 위장관 조직은 고정된, 파라핀 포매된 생검 샘플로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 26 항에 있어서,
RNA는 단편화된 것을 특징으로 하는 방법. - 제 22 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 보고서는 환자의 장기 생존 가능성에 대한 예상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 22 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 보고서는 환자의 치료 양식(modality)에 대한 권고사항(recommendation)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - (a) 환자로부터 얻은 위장관 암 세포를 포함하는 샘플을 표 A, 표 B, 표 C 또는 표 D 중 어느 하나로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 RNA 전사물 또는 이의 산물의 레벨에 대하여 정량 분석하는 단계 및 (b) 만약 유전자 또는 유전자들, 또는 이의 산물의 표준화된 발현 레벨이 정의된 발현 역치(expression threshold)를 초과하여 상승하였다면, 환자를 위장관 암의 재발없이 상승된 장기 생존 가능성을 가진 경향이 있는 것으로 식별하는 단계를 포함하는 예후 방법.
- 제 30 항에 있어서,
하나 이상의 예후 RNA 전사물 또는 이의 발현 산물은 CDC2, MCM6, RPA3, MCM7, PCNA, G22P1, KPNA2, ANLN, APG7L, TOPK, GMNN1 RRM1, CDC45L, MAD2L1, RAN, DUT, RRM2, CDK7, MLH3, SMC4L1, CSPG6, POLD2, POLE2, BCCIP, Pfs2, TREX1, BUB3, FEN1, DRF1, PREI3, CCNE1, RPA1, POLE3, RFC4, MCM3, CHEK1, CCND1 및 CDC37 중 어느 하나로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 예후 방법. - 제 30 항 또는 제 31 항에 있어서,
유전자의 RNA 전사물의 레벨은 RNA 전사물 또는 2 이상의 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)의 산물에 대한 평균 레벨과 비교하여 표준화되는 것을 특징으로 하는 예후 방법. - 제 32 항에 있어서,
상기 하우스키핑 유전자는 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), Cypl, 알부민, 액틴(actin), 튜블린(tubulin), HRPT (cyclophiiin hypoxantine phosphoribosyltransferase), L32, 28S 및 185로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 예후 방법. - 제 30 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플은 검출 한도(limit)를 넘어 존재하는 모든 유전자에 대하여 글로벌 유전자 발현 분석하는 것을 특징으로 하는 예후 방법. - 제 30 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서,
유전자의 RNA 전자물의 레벨은 모든 어세이된 유전자(assayed gene) 또는 이의 서브셋(subset)에 대한 RNA 전사물 또는 산물의 평균 신호(mean signal)와 비교하여 표준화되는 것을 특징으로 하는 예후 방법. - 제 30 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서,
RNA 전사물의 레벨은 정량 RT-PCR에 의해 결정되고, 신호는 Ct값인 것을 특징으로 하는 예후 방법. - 제 35 항에 있어서,
어세이된 유전자는 50 이상 또는 100 이상의 암 관련 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 예후 방법. - 제 30 항 내지 제 37 항 중 어느 하나에 있어서,
환자는 인간인 것을 특징으로 하는 예후 방법. - 제 30 항 내지 제 38 항 중 어느 하나에 있어서,
샘플은 고정되고, 파라핀 포매된 조직(FPET: fixed, paraffin- embedded tissue) 샘플, 또는 신선 또는 동결 조직 샘플인 것을 특징으로 하는 방법. - 제 30 항 내지 제 38 항 중 어느 하나에 있어서,
샘플은 세침, 코어 또는 다른 유형의 생검으로부터 얻은 조직 샘플인 것을 특징으로 하는 방법. - 제 30 항 내지 제 40 항 중 어느 하나에 있어서,
정량 분석은 정량 RT-PCR에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 30 항 내지 제 40 항 중 어느 하나에 있어서,
정량 분석은 유전자의 산물을 정량화하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 30 항 내지 제 40 항 중 어느 하나에 있어서,
상기 산물은 면역조직화학(immunohistochemistry) 또는 프로테오믹스 기술에 의해 정량화되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 30 항 내지 제 43 항 중 어느 하나에 있어서,
환자가 위장관 암의 재발없이 증가된 장기 생존 가능성을 가짐을 의미하는 보고서를 준비하는 단계를 더 포함하는 방법. - 제 3 항, 제 25 항 및 제 30 항 중 어느 하나의 방법을 수행하기에 적합한 하나 이상의 (1) 추출 버퍼/시약 및 프로토콜(protocol); (2) 역전사 버퍼/시약 및 프로토콜; 및 (3) 정량 RT-PCR 버퍼/시약 및 프로토콜을 포함하는 키트(kit).
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