CN107022627B

CN107022627B - KPNA2基因的应用和抑制KPNA2基因表达的siRNA的应用

Info

Publication number: CN107022627B
Application number: CN201710324869.5A
Authority: CN
Inventors: 郁雷; 高丽; 吕延杰
Original assignee: Harbin Medical University
Current assignee: Harbin Medical University
Priority date: 2017-05-10
Filing date: 2017-05-10
Publication date: 2020-11-24
Anticipated expiration: 2037-05-10
Also published as: CN107022627A

Abstract

本发明提供了一种KPNA2基因的应用和抑制KPNA2基因表达的siRNA的应用，涉及医药基因工程的技术领域。本发明提供的KPNA2基因作为大肠癌生物标记物的应用，能够有效指导大肠癌的临床分期，也能够准确地判断大肠癌患者的预后。本发明提供的能够抑制KPNA2基因表达的siRNA，能够有效地抑制大肠癌细胞的增值和迁移。本发明还提供了上述siRNA在制备KPNA2基因沉默型大肠癌细胞系的应用，该细胞系可用于探究KPNA2与大肠癌的相关性及其机理，为深入研究KPNA2与大肠癌发生、发展的可能机制提供一种可靠的研究基础，从而给大肠癌的靶向治疗提供有效的治疗靶点。

Description

KPNA2基因的应用和抑制KPNA2基因表达的siRNA的应用

技术领域

本发明涉及医药基因工程技术领域，尤其是涉及一种KPNA2基因的应用和抑制KPNA2基因表达的siRNA的应用。

背景技术

大肠癌作为四方国家发病率排第三位的恶性肿瘤。每年的发病人数约有120万，其中位诊断年龄为70岁，但流行病学统计其发病具有年轻化倾向。在一些西方国家大肠癌的发病率呈现下降趋势，但是在一些国家尤其是发展中国家，大肠癌的发病率仍呈现明显升高趋势。随着我国经济的发展，国民生活方式和饮食结构的改变，大肠癌的发病率在我国呈现出逐年增高的趋势。大肠癌患者的预后与肿瘤分期相关，诊断时所处的分期越早，预后越好。因此，准确的病理分期对治疗方案的制定有着非常重要的意义。在临床实践中，治疗方案的制定和对大肠癌患者预后的判断依靠国际防癌联盟(International Union AgainstCancer，UICC)制定的TNM分期。其中包括原发灶的侵及深度(T分期)，淋巴结(N分期)及远隔脏器(M分期) 转移和肿瘤分化程度。除此之外还包括了一些肿瘤其他的相关因素，包括肿瘤是否穿透肠管侵犯其他组织，检出的淋巴结数目，肿瘤细胞的分化，神经浸润，微淋巴管和血管的癌栓等。即使有以上的危险因素作为TNM分期的补充，在临床实践中有时候却不能准确评估患者术前分期，仍然会经常出现过度治疗甚至治疗不足的现象，从而造成治疗失败。目前尚没有有效的生物标记物来指导大肠癌的临床分期。因此需要寻找新的生物标记物来提高临床分期的准确性迫在眉睫。

随着对抑癌基因和癌基因的定位和功能的研究深入，针对靶基因的治疗已经逐渐成为可能。因此，核胞浆转运蛋白作为存在于细胞质和细胞核之间双向转运蛋白越来越受到关注。核胞浆转运蛋白α2(Karyopherin-a2， KPNA2)作为核胞浆转运蛋白α家族的七个成员之一，由529个氨基酸组成，大小为58KDa。其结构在九十年代中期被确定。KPNA2由亲水性的输入蛋白β结合区域的N末端，无功能的短酸性C-羧基末端和10个重复穿膜结构的中心疏水区组成，这个区域与目标蛋白的核定位信号相结合。输入蛋白β结合区域已经被证明存在自身抑制功能，从而确保KPNA2只有与输入蛋白β结合的时候才会发生移位从而进行物质的核胞浆转运。自从Dahl 发现KPNA2在乳腺癌中的预后价值以来，KPNA2在恶性肿瘤中过表达逐渐引起肿瘤学家的关注。已经证明KPNA2表达增高的肿瘤包括黑色素瘤、卵巢癌、食管癌、肺癌、宫颈癌、前列腺癌、脑癌、肝癌和膀胱癌。同时，有研究发现KPNA2的表达和肿瘤分期之间同样存在着关联，一部分研究证明了随着肿瘤的进展KPNA2的表达也随之增加。除了对肿瘤相关蛋白有相互作用之外，KPNA2还通过其他一些途径参与肿瘤的形成和发展过程。虽然这些途径并不是肿瘤发生的直接原因，但也可以影响到致癌作用。比如激活异常的分化途径，病毒诱导的癌基因和调节免疫功能。

然而，目前国内外尚无关于大肠癌和KPNA2基因表达相关性的文献报道。

因此，探究KPNA2基因作为生物标记物与大肠癌之间的相关性日益成为研究的热点。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种KPNA2基因作为大肠癌生物标记物的应用。

本发明的第二个目的在于提供一种KPNA2基因在制备用于大肠癌筛检试剂中的应用。

本发明的第三个目的在于提供一种抑制KPNA2基因的表达在抑制大肠癌细胞的增殖和迁移中的应用。

本发明的第四个目的在于提供一种siRNA在抑制大肠癌细胞的增值和迁移中的应用。

本发明提供了一种KPNA2基因作为大肠癌生物标记物的应用。

本发明还提供了一种KPNA2基因在制备用于大肠癌筛检试剂中的应用，所述大肠癌筛检试剂用于检测受检体中KPNA2基因的表达量。

进一步地，所述受检体为血清，术后癌症组织的离体样本或癌旁正常黏膜组织。

进一步地，所述应用为评估大肠癌术前分期。

进一步地，所述应用为判断大肠癌术后预后。

本发明还提供了一种抑制KPNA2基因的表达在抑制大肠癌细胞的增殖和迁移中的应用。

进一步地，所述大肠癌细胞为HCT116，SW480，SW620或LOVO。

进一步地，所述抑制KPNA2基因的表达的方法为转染siRNA。

进一步地，所述siRNA的序列为：

KPNA2-siRNA-F：5′-GAGACUUGGUUAUUAAGUA-3′(SEQ ID NO.1)

KPNA2-siRNA-R：5′-AUCAAUCAGAACCUCUUAAUU-3′(SEQ ID NO.2)。

另外，本发明还提供了上述的siRNA在抑制大肠癌细胞的增值和迁移中的应用。

本发明提供的KPNA2基因作为大肠癌生物标记物的应用，填补了现有技术的空白，能够有效指导大肠癌的临床分期，提高临床分期的准确性，对治疗方案的制定意义重大；也能够准确地判断大肠癌患者的预后，进而提高大肠癌患者的五年生存率。本发明提供的能够抑制KPNA2基因表达的siRNA，能够有效地抑制大肠癌细胞的增值和迁移。同时，本发明还提供了上述siRNA在制备KPNA2基因沉默型大肠癌细胞系的应用，该细胞系可用于探究KPNA2与大肠癌的相关性及其机理，为深入研究KPNA2与大肠癌发生、发展的可能机制提供一种可靠的研究基础，从而给大肠癌的靶向治疗提供有效的治疗靶点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1a为本发明实施例2提供的大肠癌旁正常组织无KPNA2表达的免疫组化染色结果图；

图1b为本发明实施例2提供的大肠癌旁正常组织KPNA2低表达的免疫组化染色结果图；

图1c为本发明实施例2提供的大肠癌组织KPNA2低表达的免疫组化染色结果图；

图1d为本发明实施例2提供的大肠癌组织KPNA2高表达的免疫组化染色结果图；

图2为本发明实施例2提供的KPNA2表达与患者5年疾病无进展生存期的生存曲线；

图3为本发明实施例3提供的大肠癌原发灶和癌旁正常组织中应用 RT-PCR检测KPNA2表达的结果图；

图4为本发明实施例4提供的KPNA2在大肠癌患者及健康志愿者血清中的表达的结果图；

图5a为本发明实施例6提供的Western blot检测KPNA2分别在大肠癌细胞系LOVO、SW480、HCT116和SW620中的相对表达的结果图；

图5b为本发明实施例6提供的Western blot检测KPNA2分别在大肠癌细胞系LOVO、SW480、HCT116和SW620中的相对表达的灰度值测定的结果图；

图6a为本发明实施例6提供的Western blot检测大肠癌细胞系接受 KPNA2-siRNA后KPNA2分别在大肠癌细胞系LOVO、SW480、HCT116 和SW620中的相对表达的结果图；

图6b为本发明实施例6提供的Western blot检测大肠癌细胞系接受 KPNA2-siRNA后KPNA2分别在大肠癌细胞系LOVO、SW480、HCT116 和SW620中的相对表达的灰度值测定的结果图；

图7a为本发明实施例7提供的MTT检测四种大肠癌细胞系HCT116 转染KPNA2-siRNA和NC-siRNA后细胞增殖的变化的结果图；

图7b为本发明实施例7提供的MTT检测四种大肠癌细胞系SW620转染KPNA2-siRNA和NC-siRNA后细胞增殖的变化的结果图；

图7c为本发明实施例7提供的MTT检测四种大肠癌细胞系LOVL转染KPNA2-siRNA和NC-siRNA后细胞增殖的变化的结果图；

图7d为本发明实施例7提供的MTT检测四种大肠癌细胞系SW480转染KPNA2-siRNA和NC-siRNA后细胞增殖的变化的结果图；

图8a为本发明实施例8提供的细胞划痕实验0h时细胞迁移变化的结果图；

图8b为本发明实施例8提供的细胞划痕实验12h时细胞迁移变化的结果图；

图8c为本发明实施例8提供的细胞划痕实验24h时细胞迁移变化的结果图；

图8d为本发明实施例8提供的细胞划痕实验12h时细胞迁移变化的灰度值测定结果图；

图8e为本发明实施例8提供的细胞划痕实验0h时细胞迁移变化的灰度值测定结果图；

图9a为本发明实施例8提供的细胞迁移实验的结果图；

图9b为本发明实施例8提供的细胞迁移实验的灰度值测定结果图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种KPNA2基因作为大肠癌生物标记物的应用。

在本发明中，KPNA2基因序列为(SEQ ID NO.9)： GTTCGTTGCAACAAATTGATGAGCAATGCTTTTTTATAATGCCAACTTT GTACAAAAAAGTTGGCATGTCCACCAACGAGAATGCTAATACACCAG CTGCCCGTCTTCACAGATTCAAGAACAAGGGAAAAGACAGTACAGAA ATGAGGCGTCGCAGAATAGAGGTCAATGTGGAGCTGAGGAAAGCTAA GAAGGATGACCAGATGCTGAAGAGGAGAAATGTAAGCTCATTTCCTG ATGATGCTACTTCTCCGCTGCAGGAAAACCGCAACAACCAGGGCACT GTAAATTGGTCTGTTGATGACATTGTCAAAGGCATAAATAGCAGCAAT GTGGAAAATCAGCTCCAAGCTACTCAAGCTGCCAGGAAACTACTTTC CAGAGAAAAACAGCCCCCCATAGACAACATAATCCGGGCTGGTTTGA TTCCGAAATTTGTGTCCTTCTTGGGCAGAACTGATTGTAGTCCCATTCAGTTTGAATCTGCTTGGGCACTCACTAACATTGCTTCTGGGACATCAGA ACAAACCAAGGCTGTGGTAGATGGAGGTGCCATCCGAGCATTCATTTC TCTGTTGGCATCTCCCCATGCTCACATCAGTGAACAAGATGTCTGGGC TCTAGGAAACATTGCAGGTGATGGCTCAGTGTTCCGAGACTTGGTTAT TAAGTACGGTGCAGTTGACCCACTGTTGGCTCTCCTTGCAGTTCCTGA TATGTCATCTTTAGCATGTGGCTACTTACGTAATCTTACCTGGACACTTT CTAATCTTTGCCGCAACAAGAATCCTGCACCCCCGATAGATGCTGTTG AGCAGATTCTTCCTACCTTAGTTCGGCTCCTGCATCATGATGATCCAGA AGTGTTAGCAGATACCTGCTGGGCTATTTCCTACCTTACTGATGGTCCA AATGAACGAATTGGCATGGTGGTGAAAACAGGAGTTGTGCCCCAACT TGTGAAGCTTCTAGGAGCTTCTGAATTGCCAATTGTGACTCCTGCCCT AAGAGCCATAGGGAATATTGTCACTGGTACAGATGAACAGACTCAGG TTGTGATTGATGCAGGAGCACTCGCCGTCTTTCCCAGCCTGCTCACCA ACCCCAAAACTAACATTCAGAAGGAAGCTACGTGGACAATGTCAAAC ATCACAGCCGGCCGCCAGGACCAGATACAGCAAGTTGTGAATCATGG ATTAGTCCCATTCCTTGTCAGTGTTCTCTCTAAGGCAGATTTTAAGACA CAAAAGGAAGCTGTGTGGGCCGTGACCAACTATACCAGTGGTGGAAC AGTTGAACAGATTGTGTACCTTGTTCACTGTGGCATAATAGAACCGTT GATGAACCTCTTAACTGCAAAAGATACCAAGATTATTCTGGTTATCCTG GATGCCATTTCAAATATCTTTCAGGCTGCTGAGAAACTAGGTGAAACT GAGAAACTTAGTATAATGATTGAAGAATGTGGAGGCTTAGACAAAATT GAAGCTCTACAAAACCATGAAAATGAGTCTGTGTATAAGGCTTCGTTA AGCTTAATTGAGAAGTATTTCTCTGTAGAGGAAGAGGAAGATCAAAA CGTTGTACCAGAAACTACCTCTGAAGGCTACACTTTCCAAGTTCAGGA TGGGGCTCCTGGGACCTTTAACTTTTACCCAACTTTCTTGTACAAAGT TGGCATTATAAGAAAGCATTGCTTATCAATTTGTTGCAACGAAC

本发明还提供了一种KPNA2基因在制备用于大肠癌筛检试剂中的应用，大肠癌筛检试剂用于检测受检体中KPNA2基因的表达量。

大肠癌检测试剂包含KPNA2基因引物，例如可以为，但不限于如SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示的序列。

在本发明中，受检体为血清，术后癌症组织的离体样本或癌旁正常黏膜组织。

在一个优选的实施方案中，受检血清为患者术前采的静脉血离心后收集的血清。

根据不同的受检体可采用不同的检测手段，从而能够从多角度全面、准确地筛检大肠癌。

在本发明中，KPNA2基因在制备用于大肠癌筛检试剂中的应用可为评估大肠癌术前分期。

在本发明中，KPNA2基因在制备用于大肠癌筛检试剂中的应用可为判断大肠癌术后预后。

通过对KPNA2基因的检测，可以更加准确地对大肠癌患者进行术前和术后分期，从而对大肠癌患者提供适当的治疗方法。提高大肠癌患者的五年生存率。

在本发明中，大肠癌细胞为HCT116，SW480，SW620或LOVO。

在本发明中，抑制KPNA2基因的表达的方法为转染siRNA。

在本发明中，siRNA的序列为：

KPNA2-siRNA-F：5′-GAGACUUGGUUAUUAAGUA-3′(SEQ ID NO.1)

KPNA2-siRNA-R：5′-AUCAAUCAGAACCUCUUAAUU-3′(SEQ ID NO.2)。

本发明提供的siRNA能够有效沉默KPNA2基因在大肠癌细胞系中的表达，进而有效地抑制大肠癌细胞的增值和迁移。

本发明还提供了上述的siRNA在抑制大肠癌细胞的增值和迁移中的应用。

该细胞系可用于探究KPNA2与大肠癌的相关性及其机理，为深入研究 KPNA2与大肠癌发生、发展的可能机制提供一种可靠的研究基础，从而给大肠癌的靶向治疗提供有效的治疗靶点。

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1患者及标本收集

首先收集2014年1月至2014年6月在哈尔滨医科大学附属二院结直肠外科接受根治手术的30名大肠癌患者(15名男性患者和15名女性患者，覆盖I期到IV期)。这部分患者术前未接受新辅助放化疗。术前收集患者 10mL静脉血，离心后(1000转/分，离心5分钟)收集患者血清存放于-80℃冰箱中备用。收集30名患者术后病灶标本及癌旁正常黏膜组织用于实时逆转录聚合酶链反应(real-time reverse transcriptase polymerase chainreaction, RT-PCR)。手术切除病灶后立即将获得的组织放入液氮中然后放入-80℃冰箱中保存，10％的福尔马林溶液浸泡24小时后石蜡包埋组织。为了探求大肠癌原发灶中KPNA2蛋白的表达与术后临床病理学相关因素和患者术后生存期之间的关系。本实验还收集了2007年1月份到2008年12月份在哈尔滨医科大学附属二院接受大肠癌根治术的患者300例(男性175名，女性125名，年龄分布23-83岁)。术前未接受新辅助治疗，手术标本切除后放置于10％的福尔马林溶液中24小时后石蜡包埋。按常规程序处理组织后进行组织学检查，并由三名经验丰富的病理科医生独立诊断。实验的所有步骤都通过哈尔滨医科大学伦理委员会批准。并且签署了相关书面同意。

实施例2免疫组织化学染色

免疫组织化学染色分析采用亲和素过氧化物酶法。实施例1提供的标本组织用石蜡包埋后，将石蜡组织切成4微米的厚的切片，脱蜡，脱水。甲醇浸泡10分钟后用0.5％过氧化氢终止内源性过氧化物酶活性。应用含有 10％山羊血清磷酸盐缓冲液(PBS液)室温下浸泡1小时消除非特异结合。然后含有鼠抗人KPNA2多克隆抗体(1:300；Wuhan Proteintech,Wuhan, China)PBS液中切片4℃过夜。之后室温下用生物素标记的羊抗鼠免疫球蛋白(IgG；1:400；ZSGB-Bio,Beijing,China)孵育1小时。接下来用链霉素-过氧化物酶处理。切片在含有0.1％3,3-二氨基联苯胺(ZSGB-Bio,Beijing,China) 和0.05％过氧化氢室温下孵育5分钟。然后由三名经验丰富的病理科医师在不了解切片的病理信息的情况下独自对病理切片的免疫组化染色进行评估。病理科医生分别在低倍镜(×40)和高倍镜(×200和×400)对切片的免疫组化结果进行观察。然后对切片的免疫组化染色强度进行评分。结果判定根据染色强度和染色范围进行综合评定。根据染色强度评分：0分(不染色)、1分(轻度染色)、2分(中度染色)、3分(强度染色)。染色范围进行评分：0分(<5％,阴性)、1分(5–25％,散在)、2分(25–50％,局灶)、 3分(>50％，弥散)。免疫组化染色的评分由染色强度和范围的评分相乘得出，分值为0-9分。其中0-4分为弱染色；＞4分为强染色。

根据本实施例提供的免疫组织化学染色，结果如图1a、1b、1c和1d 所示，KPNA2主要表达于大肠癌的细胞核。如图1b和图1d所示，其中大部分肠癌组织和少部分癌旁正常组织免疫组化呈现KPNA2表达阳性。如表 1所示，其中大肠癌KPNA2表达率要显著高于癌旁正常组织的表达(90.8％ vs 14.6％,p<0.001)。300个大肠癌标本中182个标本存在KPNA2强表达。而在300癌旁正常组织中，只有44例切片KPNA2免疫组化表达为阳性。

表1免疫组化染色KPNA2在肿瘤组织和癌旁正常组织中的表达

本实施例还分析了KPNA2的表达强度与一些重要的临床病理特征之间的联系。这些重要的临床病理特征包括：患者年龄、性别、肿瘤体积、肿瘤分布、肿瘤分化程度、TNM分期、肿瘤侵及深度、淋巴结转移、微淋巴管血管浸润和周围神经浸润。经统计我们发现，KPNA2的表达强度与肿瘤体积(p<0.001)、TNM分期(p<0.001)、淋巴结转移(p<0.001)高度相关。除此之外，还与肿瘤分化(p＝0.003)、肿瘤浸润深度(p＝0.010)、微淋巴管血管浸润(LVI)和周围神经浸润(PNI)相关(p＝0.010)。结果如表2所示，对染色评分≥4分为KPNA2高表达，＜4分被认定为低表达，病理的判断依据 UICC。相比病期较早的大肠癌患者，病期晚的大肠癌患者原发灶KPNA2 表达的强度高，并且以上的这些临床病理特征都与患者的预后有着紧密的联系。但KPNA2的表达与患者的年龄(p＝0.502)、性别(p＝0.507)和肿瘤部位(p＝0.607)无显著相关性。这将为大肠癌的术前诊断提供一个有效的生化因子。本实施例中数据均用SPSS软件21.0版本的软件包分析(SPSS Inc., Chicago,IL,USA)。所有的连续变量表示为均数±标准差。χ²试验用于评价 KPNA2表达和其他临床病理因素之间的关系。

表2 KPNA2的免疫组化染色表达强度与临床病理特征之间的联系

同时，本实施例还根据Kaplan–Meier法计算KPNA2表达与患者5年疾病无进展生存期的生存曲线，并通过生存曲线分析原发灶中KPNA2的表达与患者总生存期和疾病无进展生存期的关系。生存率的差异应用log-rank test检验评估，Cox比例风险模型被用来确定KPNA2对生存率有显著的影响。结果如图2所示，大肠癌原发灶中KPNA2的表达增高的患者总生存期和疾病无进展生存期较短，其预后较差。

实施例3实时逆转录聚合酶链反应

按照说明用Trizol试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)提取实施例1提供的30例大肠癌和癌旁正常组织的总RNA。按说明采用RevertAid^TMH Minus First Strand cDNASynthesis Kit(Fermentas,Burlington,Ontario, Canada)进行反转录。KPNA2和甘油醛3-磷酸酯脱氢酶(GAPDH)的引物 (TaKaRa Biotechnology,Dalian,China)分别是：

PCR采用SYBR Green染料法。使用ABI PRISM(R)7500实时定量 PCR仪，按照说明相应程序进行反应。为了证明扩增产物的特意性，引物都进行溶解曲线分析。PCR循环条件如下：

采用相对定量法进行结果分析(2-ΔΔCt method)。每组实验重复3次，取平均值。

结果如图3所示，实验结果证明与癌旁正常组织中KPNA2的表达相比 26例大肠癌标本中KPNA2相对表达增高(26/30,86.7％)。因此RT-PCR的实验结果同样证明了在大肠癌标本中KPNA2的表达要高于癌旁正常组织 (p<0.001)。

因此通过实施例2的免疫组织化学染色和实施例3的RT-PCR两种实验方法，证明了大肠癌组织中KPNA2的表达要显著高于癌旁正常组织，因此， KPNA2可能是促进大肠癌发生和进展的重要因子。

实施例4荧光夹心ELISA

血清中KPNA2的表达通过KPNA2ELISA试剂盒来测得(Shanghai BlueGene BiotechCO.,LTD,Shanghai,China)。待测血清来自由实施例1提供的30名大肠癌患者和10名健康的志愿者。首先将待测血清与 KPNA2-HRP在包被好的96孔板中37℃的环境下孵育1小时。一小时后弃掉混合液，用试剂盒中清洗液洗涤5次。然后用HRP酶底物37℃孵育15 分钟。由于酶-底物反应，待测孔中的溶液将变成蓝色。最后加入终止液，停止酶与底物之间的反应，这时溶液会变成黄色。颜色的强度通过光谱光度测量仪(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)在450nm下测量。由于采用的是KPNA2-HRP共轭结合，颜色的强度与KPNA2的浓度成反比。根据标准曲线计算出KPNA2血清中的表达，非参数Mann-Whitney U检验用于分析ELISA结果的变化。。

结果如图4所示，健康人血清中KPNA2表达水平为6.24±0.42ng/ml，而大肠癌患者术前血清中KPNA2表达水平为7.84±1.11ng/ml。大肠癌患者血清中KPNA2的表达高于健康人血清中表达水平(p<0.001)，因此，KPNA2 可能是促进大肠癌发生和进展的重要因子。

实施例5大肠癌细胞培养及siRNA转染

大肠癌细胞系HCT116，SW480，SW620，LOVO均用含10％灭活新鲜肽牛血清和100U/ml链霉素的RPMI1640培养液培养(Gibco,USA)。其中 HCT116和LOVO是在37℃，5％CO2条件下培养箱中培养。SW480，SW620 是在37℃，无CO2条件下培养箱中培养。每天显微镜下观察细胞生长状态。 2-3天更换细胞培养液。细胞培养两周后应用于实验。

本发明提供的KPNA2-siRNA(siKPNA2)和NC-siRNA(siNC)阴性对照均采购于北京唯尚立德生物科技有限公司，序列如下：

转染前24小时将细胞按3×10⁵接种于6孔板，转染前3小时更换培养液。从-80冰箱中取出KPNA2-siRNA溶液和NC-siRNA溶液(1 ODsiRNA+150μL DEPC水)解冻，分别吸取10μlKPNA2-siRNA溶液和 NC-siRNA溶液用250μl无血清1640培养基稀释，充分混匀制成KPNA2-siRNA和NC-siRNA稀释液。取5μL RNA转染试剂polyfectine (Biowit Technologies,Guangdong,China)分别加入到KPNA2-siRNA溶液和NC-siRNA溶液中，充分混匀，室温下静置15分钟转染大肠癌细胞系。将转染复合物加入到含有细胞和完全培养基的6孔板中，轻柔混匀，培养 4-6个小时后更换培养液。转染后72小时用Western blot检测每个细胞系 KPNA2的干扰效率。

实施例6 Western blot检测大肠癌细胞系KPNA2蛋白表达

分别收集未进行转染实验和转染完毕的大肠癌细胞加入细胞裂解液充分裂解，低温高速离心(4℃，12000R/min，30min)细胞提取上清液总蛋白。上清样本蛋白量为60ug。电泳(12％SDS，PAGE凝胶)、转印(70V， 120min)、5％正常小牛血清封闭，一抗4℃孵育过夜，分别与对应的二抗室温孵育2小时，ECL显色，结果经自动电泳凝胶成像分析仪 (Power/pac200,USA)采集，进行灰度值测定。

如图5a和5b所示，Western blot检测KPNA2在大肠癌细胞系中的表达。其中LOVO的表达率为71％±7％；SW480的表达率为57％±6％；HCT116 的表达率为76％±9％；SW620的表达率为63％±7％。

将KPNA2-siRNA分别转染至大肠癌细胞系LOVO，SW480，HCT116， SW620后72小时，应用western blot检测KPNA2在四种细胞系中的表达。如图6a和6b所示，转染后四种细胞系KPNA2表达均显著下降。其中LOVO 细胞系KPNA2表达下降至转染前的33％±7％，SW480细胞系KPNA2表达下降至转染前的47％±10％，HCT116细胞系KPNA2表达下降至转染前的 21％±9％，SW620细胞系KPNA2表达下降至转染前的38％±11％。四种细胞系中以大肠癌细胞系HCT116转染KPNA2-siRNA后KPNA2蛋白表达下降最为明显。

实施例7 MTT法检测大肠癌细胞增殖

将单个转染KPNA2-siRNA和NC-siRNA的四种大肠癌细胞系悬液接种于96孔培养板中，每孔体积200ul含103个细胞，培养24小时，每孔加入MTT溶液继续培养4小时，吸去上清液，加入150uL DMSO(Sigma，USA)，振荡10分钟，490hm波长下测定24h、48h、72h和96h各孔光吸收值，以不含细胞的等体积培养液作为对照。绘制细胞生长曲线。

结果如图7a、7b、7c和7d所示，将KPNA2-siRNA和NC-siRNA分别转染到四种大肠癌细胞系后，分别在24h、48h、72h和96h应用MTT法观察大肠癌细胞系增殖情况。与NC对照组对比，转染si-KPNA2后四种大肠癌细胞的增殖能力下降。其中以SW480和HCT116细胞增殖所受到的影响最大。

实施例8细胞迁移能力变化

由实施例6的结果可知，四种细胞系中以大肠癌细胞系HCT116转染 KPNA2-siRNA后KPNA2蛋白表达下降最为明显，故本实施例应用大肠癌细胞系HCT116进行实验。

细胞划痕实验

用记号笔在6孔板背面用直尺比量着均匀划横线，间隔0.5-1cm划一道。每孔至少穿过5条线。5×10⁵个HCT116大肠癌细胞在6孔板中培养，当细胞融合率达到100％时用枪头在细胞培养层垂直于背后的横线划痕。PBS液清洗细胞3次，洗脱划落的细胞。加入无血清培养液。放置于37摄氏度5％ CO2培养箱中培养。按着培养0，24h时间点取样显微镜(NikonECLIPSE Ti-E, Nikon,Kobe,Japan)下拍照。使用Image J软件处理细胞划痕实验的图片，计算细胞间距离的平均值，并进行灰度值测定。

结果如图8所示，左侧是NC-siRNA转染对照组，而右侧是 KPNA2-siRNA转染实验组。转染实验完成后，分别观察0h，12h(39±5vs 22±4，P＜0.05)和24h(80±4vs 55±5，P＜0.05)细胞迁移的变化。通过划痕实验可知，接受转染的划痕创伤愈合率在12h和24h较对照组下降。转染 KPNA2-siRNA的大肠癌细胞系HCT116迁移能力明显受到抑制，从而证明了转染后细胞的迁移能力下降(*P＜0.05)。

细胞迁移实验

将大肠癌HCT116细胞经胰酶消化后收集细胞进行细胞计数。取3×10⁵个HCT116大肠癌细胞加入transwell的上层室(24-well insert；8mm pore size； Corning CostarCorp.,Cambridge,MA,USA).在37摄氏度5％CO2环境下孵育细胞24h，使得细胞通过滤过膜迁移到底部。轻轻去除嵌入膜，使得没有迁移的细胞留在滤过膜上并小心地用棉签去除，净化过滤器。过滤器下层的细胞迅速用5％戊二醛固定。固定后用含1％结晶紫溶液的2％乙醇染色。 20min后用去离子水去除多余的结晶紫溶液，用棉签去除多余水分。在显微镜下(Nikon ECLIPSE Ti-E,Nikon,Kobe,Japan)计算滤过器下方细胞数量，并进行灰度值测定。以上实验重复三次。

结果如图9所示，转染KPNA2-siRNA的HCT116大肠癌细胞的迁移能力与对照组比较显著下降(485±67vs 311±51，P＜0.05)。

通过实施例7和实施例8的实验结果可以得出，沉默KPNA2的表达将降低大肠癌细胞的增殖和迁移能力。因此KPNA2作为癌基因在大肠癌的发生发展中可能起着重要的作用。也为大肠癌的靶向治疗找到了一个新的靶点。

由以上实施例的实验结果可以得出，大肠癌中KPNA2的表达要高于癌旁正常组织；KPNA2的异常表达与肿瘤分化、肿瘤体积、TNM分期、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、微淋巴管和微血管浸润等具有预测患者预后相关病理因素相关；原发灶KPNA2高表达的患者术后5年总生存期和5年无疾病进展生存期较差；大肠癌患者血清中KPNA2的表达高于正常人，因此KPNA2对大肠癌具有诊断作用。沉默KPNA2的表达将降低大肠癌细胞的增殖和迁移能力；KPNA2作为癌基因在大肠癌的发生发展中可能起着重要的作用，也为大肠癌的靶向治疗找到了一个新的靶点。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 哈尔滨医科大学

<120> KPNA2基因的应用和抑制KPNA2基因表达的siRNA的应用

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

gagacuuggu uauuaagua 19

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

aucaaucaga accucuuaau u 21

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caaggctgtg gtagatgg 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcggcaaaga ttagaaag 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caatgacccc ttcattgacc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gacaagcttc ccgttctcag 20

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 7

uccuccgaac gugucacguu u 21

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 8

acgugacacg uucggagaau u 21

<210> 9

<211> 1719

<212> DNA

<213> 智人种（Homo sapiens）

<400> 9

gttcgttgca acaaattgat gagcaatgct tttttataat gccaactttg tacaaaaaag 60

ttggcatgtc caccaacgag aatgctaata caccagctgc ccgtcttcac agattcaaga 120

acaagggaaa agacagtaca gaaatgaggc gtcgcagaat agaggtcaat gtggagctga 180

ggaaagctaa gaaggatgac cagatgctga agaggagaaa tgtaagctca tttcctgatg 240

atgctacttc tccgctgcag gaaaaccgca acaaccaggg cactgtaaat tggtctgttg 300

atgacattgt caaaggcata aatagcagca atgtggaaaa tcagctccaa gctactcaag 360

ctgccaggaa actactttcc agagaaaaac agccccccat agacaacata atccgggctg 420

gtttgattcc gaaatttgtg tccttcttgg gcagaactga ttgtagtccc attcagtttg 480

aatctgcttg ggcactcact aacattgctt ctgggacatc agaacaaacc aaggctgtgg 540

tagatggagg tgccatccga gcattcattt ctctgttggc atctccccat gctcacatca 600

gtgaacaaga tgtctgggct ctaggaaaca ttgcaggtga tggctcagtg ttccgagact 660

tggttattaa gtacggtgca gttgacccac tgttggctct ccttgcagtt cctgatatgt 720

catctttagc atgtggctac ttacgtaatc ttacctggac actttctaat ctttgccgca 780

acaagaatcc tgcacccccg atagatgctg ttgagcagat tcttcctacc ttagttcggc 840

tcctgcatca tgatgatcca gaagtgttag cagatacctg ctgggctatt tcctacctta 900

ctgatggtcc aaatgaacga attggcatgg tggtgaaaac aggagttgtg ccccaacttg 960

tgaagcttct aggagcttct gaattgccaa ttgtgactcc tgccctaaga gccataggga 1020

atattgtcac tggtacagat gaacagactc aggttgtgat tgatgcagga gcactcgccg 1080

tctttcccag cctgctcacc aaccccaaaa ctaacattca gaaggaagct acgtggacaa 1140

tgtcaaacat cacagccggc cgccaggacc agatacagca agttgtgaat catggattag 1200

tcccattcct tgtcagtgtt ctctctaagg cagattttaa gacacaaaag gaagctgtgt 1260

gggccgtgac caactatacc agtggtggaa cagttgaaca gattgtgtac cttgttcact 1320

gtggcataat agaaccgttg atgaacctct taactgcaaa agataccaag attattctgg 1380

ttatcctgga tgccatttca aatatctttc aggctgctga gaaactaggt gaaactgaga 1440

aacttagtat aatgattgaa gaatgtggag gcttagacaa aattgaagct ctacaaaacc 1500

atgaaaatga gtctgtgtat aaggcttcgt taagcttaat tgagaagtat ttctctgtag 1560

aggaagagga agatcaaaac gttgtaccag aaactacctc tgaaggctac actttccaag 1620

ttcaggatgg ggctcctggg acctttaact tttacccaac tttcttgtac aaagttggca 1680

ttataagaaa gcattgctta tcaatttgtt gcaacgaac 1719

Claims

1.沉默KPNA2基因siRNA在制备抑制大肠癌细胞系HCT116增殖和迁移的试剂中的应用，其特征在于，所述siRNA的序列为：

KPNA2-siRNA-F：5′-GAGACUUGGUUAUUAAGUA-3′（SEQ ID NO.1）

KPNA2-siRNA-R：5′-AUCAAUCAGAACCUCUUAAUU-3′（SEQ ID NO.2）。