CN105462942B - Dna聚合酶及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种DNA聚合酶及其编码基因与应用。本发明的DNA聚合酶的氨基酸序列如序列表中序列4所示。编码DNA聚合酶的基因序列如序列表中序列3所示。本发明的DNA聚合酶可以在PCR中使用。

Description

DNA聚合酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种DNA聚合酶及其编码基因与应用。

背景技术

DNA聚合酶是细胞复制DNA的重要作用酶。DNA聚合酶,以DNA为复制模板，将DNA由5'端点开始复制到3'端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成(在具备模板、引物、dNTP等的情况下)及其相辅的活性。

耐热DNA聚合酶多应用在PCR技术中。各种耐热DNA聚合酶均具有5'-3' 聚合酶活性，但不一定具有3'-5'和5'-3'的外切酶活性。3'-5'外切酶活性可以消除错配，切平末端；5'-3'外切酶活性可以消除合成障碍。

超嗜热古菌Palaeo coccus pacificus DY20341分离自东太平洋洋中脊热液区，其基因组测序已经完成。预测一共有2001个开放阅读框，其中78.11％没有确定的生物学功能。

尽管商业化的DNA聚合酶多种多样，针对不同扩增目的片段所需的特异DNA聚合酶体系仍然是必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种DNA聚合酶。

本发明所提供的DNA聚合酶，其氨基酸序列如序列表中序列4所示。

本发明的另一个目的是提供一种编码DNA聚合酶的基因，其核苷酸序列如序列表中序列3所示。

本发明的又一个目的是提供一种重组表达载体，其多克隆位点上插入有所述的编码DNA聚合酶的基因。

本发明的再一个目的是提供一种重组菌，其含有所述的重组表达载体。

其中，所述重组菌为大肠杆菌。

所述的DNA聚合酶可在PCR中应用。

本发明的又一个目的是提供一种获得目的基因的方法，所述方法包括如下步骤：

根据目的基因的序列设计引物，

以含有目的基因的DNA片段或基因组DNA为模板，利用所设计的引物和所述的DNA聚合酶进行PCR，

分离PCR产物获得目的基因。

其中，PCR的缓冲液包括Tris(pH8.8)20mM，MgSO₄2mM，KCl 10mM， (NH₄)₂SO₄10mM，TritonX-100 0.5mg/L，dNTP 0.2mM。

本发明的又一个目的是提供一种PCR反应试剂盒，所述试剂盒包括所述的 DNA聚合酶。

其中，所述试剂盒还包括PCR的缓冲液，所述PCR的缓冲液包括Tris (pH8.8)20mM，MgSO₄2mM，KCl 10mM，(NH₄)₂SO₄10mM，TritonX-100 0.5mg/L，dNTP 0.2mM。

本发明的DNA聚合酶，来自超噬热广古菌Palaeococcus pacificus DY20341，具有DNA聚合酶活性。利用本发明的DNA聚合酶，成功扩增出了古菌 Thermococcus sp.4557的大小不同的基因。此外，使用本发明的DNA聚合酶成功扩增出了商业化的Pfu DNA聚合酶所不能扩增的Thermococcus sp.4557的 GQS-01815基因。

附图说明

图1显示Palaeococcus pacificus DNA聚合酶编码基因片段敲除示意图。

图2显示Palaeococcus pacificus DNA聚合酶基因的克隆；

其中，M：DNA分子量标准，1：PolB-片段1，2：PolB-片段2，3：PolB 基因。

图3显示SDS-PAGE电泳分析PolB聚合酶纯化后的蛋白；

其中，M：蛋白分子量标准，1：PolB DNA聚合酶。

图4显示了利用PolB聚合酶PCR扩增出不同的DNA片段。

图5显示了PCR扩增Thermococcus sp.4557中GQS_01815基因的结果。

具体实施方式

实施例1

1.获取目的基因(PolB基因)

Palaeococcus pacificus DY20341基因组序列如GenBank Assembly: GCA_000725425.1所示。根据生物信息学方面的基因组和蛋白组分析，获得假定的Palaeococcuspacificus DY20341耐热DNA聚合酶(PolB)序列，如序列表中序列1所示。然而，体外无法获得可溶性的耐热DNA聚合酶。针对编码假定的Palaeococcus pacificus DY20341耐热DNA聚合酶的DNA序列(如序列2所示)进行分析，发现该序列可能包含内含子。

因此，针对编码假定的Palaeococcus pacificus DY20341耐热DNA聚合酶的 DNA序列设计引物，通过缺失突变的方法(如图1)将内含子敲除。

引物序列如下：

F1：5’-GATATACATATGATTCTCGACACTGATTAC-3’(下划线为Nde I 酶切位点)；

R1：5’-CGATTATGGATGGGTAAAGCGACCTGAAATCTAAATAAACG-3’；

F2：5’-CGTTTATTTAGATTTCAGGTCGCTTTACCCATCCATAATCG-3’

R2：5’-GCTGTAGTCGACACTTTTTGGCTTCAACCAAGC-3’(下划线为 Sal I酶切位点)。

首先，以Palaeococcus pacificus DY20341基因组DNA为模板分别使用F1 和R1引物对以及F2和R2引物对，将被假定的内含子隔开的2个PolB的片段 (片段1和片段2)分别扩增出来。然后将2个扩增出的片段等比例混合作为进一步扩增的模板，使用F1和R2引物对，将假定的PolB基因扩增出来。

PCR反应体系为50μl，包括Tris(pH8.8)20mM，MgSO₄2mM，KCl 10mM，(NH₄)₂SO₄10mM，TritonX-100 0.5mg/L，dNTP 0.2mM，上下游引物各50μmol/L，模板DNA 100ng，1μl Pfu DNA聚合酶1μl。

PCR反应条件：预变性94℃3min，变性94℃30s，退火55℃30s，延伸 72℃1-2min，30个循环，后延伸72℃10min，4℃终止反应。

琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示，分别获得了1241bp的片段1和1131bp 的片段2以及2341bp的PolB基因。

2.原核重组表达载体构建

利用酶切连接的方法进行重组表达载体的构建，使用Nde I和Sal I双酶切克隆载体pET-15b(Novagen)，参照说明书使用T4连接酶在16℃下将Nde I和 Sal I双酶切的PolB基因与线性化的pET-15bM连接，构建出原核重组表达载体，将原核重组表达载体转化到E.coli Top 10感受态细胞中，挑取氨苄抗性筛选为阳性的菌落，进行菌落PCR验证，验证阳性的结果送上海美吉生物测序。测序结果如序列表中序列3所示，其编码的蛋白序列如序列表中序列4所示。

3.重组蛋白的原核表达及体外纯化

将构建的原核重组表达载体转化进入表达性的大肠杆菌体内，通过调节 IPTG浓度以及表达温度对目的基因进行高效诱导表达，获得可溶性即具有生物活性的蛋白酶。

将构建的原核重组表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)-Codon Plus-RIL感受态细胞中。转化震荡培养完后取100μl菌液涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素、34μg/ml氯霉素的LB平板上。挑单菌落接种于50ml含有100μg/ml氨苄青霉素、34μg/ml氯霉素的LB液体培养基中在250rpm/min转速下37℃培养 12h。取40ml菌液，接种于2.5L含有100μg/ml氨苄青霉素、34μg/ml氯霉素的LB液体培养基中。在250rpm/min转速下37℃培养菌液OD₆₀₀至0.8，加入IPTG使其终浓度为0.5mM来诱导基因表达，在250rpm/min下37℃振荡培养 6h。用12000rpm/min离心5min，收集菌体。超声破碎，离心取上清获得重组蛋白粗液。

为了获得超纯的目的蛋白，利用一系列的层析系统进一步提纯。

首先，使用镍离子亲和层析柱纯化，利用目的蛋白所带亲和标签与树脂特异结合，去除杂蛋白，目的蛋白得以进一步纯化。然后，进行离子交换层析，将上一步得到的蛋白透析到A buffer(50mM Tris-盐酸，pH 8.0，50mM氯化钠) 中，然后通过HiTrap Q阴离子柱进行纯化。A buffer预先平衡柱子，再通过B buffer(50mM Tris盐酸，pH 8.0，1M氯化钠)提高盐离子浓度，逐渐的利用离子结合能力的不同将目的蛋白与各种杂蛋白分离。最后，利用分子筛层析做最后一步纯化，4ml蛋白样品上样到XK16-100、填料为SephacrylTM S-200HR 的分子筛层析柱子中，分子筛缓冲液(50mM Tris-盐酸pH 8.0，100mM氯化钠)上样前柱子预先用分子筛缓冲液平衡。上样和洗脱使用的流速为1ml/min。经过这样的纯化程序，最终获得高纯度的目的PolB聚合酶蛋白(93kDa)的浓度为5mg/ml。

SDS-PAGE电泳分析鉴定，鉴定结果如图3所示。

4.DNA延伸活性分析

以古菌Thermococcus sp.4557的基因组DNA为模板，利用纯化的目的蛋白酶进行体外PCR扩增来测试该酶的DNA延伸活性。

根据古菌Thermococcus sp.4557基因组上六个序列片段，分别命名为“片段1(序列表中序列8)”、“片段2(序列表中序列6)”、“片段3(序列表中序列7)”、“片段4(序列表中序列9)”、“片段5(序列表中序列5)”和“片段6(序列表中序列10)”，并设计相应的引物对，命名为“引物对1”、“引物对2”、“引物对3”、“引物对4”、“引物对5”、“引物对6”。

表1：引物序列

PCR反应体系：50μl，包括Tris(pH8.8)20mM，MgSO₄2mM，KCl 10mM，(NH₄)₂SO₄10mM，TritonX-100 0.5mg/L，dNTP 0.2mM，上下游引物各50μmol/L，模板DNA 100ng，PolB DNA聚合酶1μl。

PCR反应条件：预变性94℃3min，变性94℃30s，退火58℃30s，延伸 72℃1min，35个循环，后延伸72℃10min，4℃终止反应。

琼脂糖凝胶电泳结果如图4所示，使用目的蛋白酶成功扩增出古菌Thermococcussp.4557的五个大小不同的DNA片段，条带大小分别为378bp、 495bp、886bp、1041bp和2685bp。

5.PCR扩增Thermococcus sp.4557中GQS_01815基因

使用目前商业化的Pfu DNA聚合酶不能扩增出Thermococcus sp.4557中 GQS_01815基因。而本发明中目的蛋白酶PolB聚合酶可以扩增出相应条带，如图5。

根据Thermococcus sp.4557中GQS_01815基因(参见序列表中序列10) 设计引物，引物序列见上表引物对6。

以Thermococcus sp.4557基因组DNA为模板，使用上述引物序列表中引物对6和本发明的目的蛋白酶进行PCR扩增。以Thermococcus sp.4557基因组DNA为模板，使用同样的引物对和Pfu DNA聚合酶(TaKaRa)进行PCR扩增。

PCR反应体系：总共50μl，包括Tris(pH8.8)20mM，MgSO₄2mM， KCl 10mM，(NH₄)₂SO₄10mM，TritonX-100 0.5mg/L，dNTP 0.2mM，上下游引物各50μmol/L，模板DNA 100ng，PolB或Pfu DNA聚合酶1μl。

PCR反应条件：预变性94℃3min，变性94℃30s，退火56℃30s，延伸 72℃1.5min，30个循环，后延伸72℃10min，4℃终止反应。

琼脂糖凝胶电泳结果如图5所示，图5中1泳道是Pfu聚合酶扩增结果，没有特异条带扩增出来，而2泳道是本发明的目的蛋白酶扩增条带，扩增片段送上海美吉生物测序。测序结果表明扩增的片段(2595bp)为目的序列。

由此可以表明，使用本发明的目的蛋白酶通过PCR反应成功地扩增出了商业化的Pfu DNA聚合酶所不能扩增的Thermococcus sp.4557中GQS_01815基因。

Claims (10)

1.一种DNA聚合酶，其氨基酸序列如序列表中序列4所示。

2.一种编码DNA聚合酶的基因，其核苷酸序列如序列表中序列3所示。

3.一种重组表达载体，其多克隆位点上插入有权利要求2所述的编码DNA聚合酶的基因。

4.一种重组菌，其含有权利要求3所述的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于所述重组菌为大肠杆菌。

6.权利要求1所述的DNA聚合酶在PCR中的应用。

7.一种获得目的基因的方法，其包括如下步骤：

根据目的基因的序列设计引物，

以含有所述目的基因的DNA片段或基因组DNA为模板，利用所设计的引物和权利要求1所述的DNA聚合酶进行PCR，

分离PCR产物获得所述目的基因。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于PCR的缓冲液由以下组成：Tris pH8.820mM、MgSO₄ 2mM、KCl 10mM，(NH₄)₂SO₄ 10mM，TritonX-100 0.5mg/L，dNTP 0.2mM。

9.一种PCR反应试剂盒，其包括权利要求1所述的DNA聚合酶。

10.根据权利要求9所述的PCR反应试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括PCR的缓冲液，所述PCR的缓冲液由以下组成：Tris pH8.8 20mM、MgSO₄ 2mM、KCl 10mM，(NH₄)₂SO₄10mM，TritonX-100 0.5mg/L，dNTP 0.2mM。