CN105462942A - Dna聚合酶及其编码基因与应用 - Google Patents

Dna聚合酶及其编码基因与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105462942A
CN105462942A CN201610069460.9A CN201610069460A CN105462942A CN 105462942 A CN105462942 A CN 105462942A CN 201610069460 A CN201610069460 A CN 201610069460A CN 105462942 A CN105462942 A CN 105462942A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna polymerase
sequence
pcr
gene
archaeal dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610069460.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105462942B (zh
Inventor
李卓
卢淑红
陈孜梦
赵文昭
单大鹏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Third Institute of Oceanography SOA
Original Assignee
Third Institute of Oceanography SOA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Third Institute of Oceanography SOA filed Critical Third Institute of Oceanography SOA
Priority to CN201610069460.9A priority Critical patent/CN105462942B/zh
Publication of CN105462942A publication Critical patent/CN105462942A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105462942B publication Critical patent/CN105462942B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07007—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/10—Nucleotidyl transfering
    • C12Q2521/101—DNA polymerase

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种DNA聚合酶及其编码基因与应用。本发明的DNA聚合酶的氨基酸序列如序列表中序列4所示。编码DNA聚合酶的基因序列如序列表中序列3所示。本发明的DNA聚合酶可以在PCR中使用。

Description

DNA聚合酶及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及一种DNA聚合酶及其编码基因与应用。
背景技术
DNA聚合酶是细胞复制DNA的重要作用酶。DNA聚合酶,以DNA为复制模板，将DNA由5'端点开始复制到3'端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成(在具备模板、引物、dNTP等的情况下)及其相辅的活性。
耐热DNA聚合酶多应用在PCR技术中。各种耐热DNA聚合酶均具有5'-3'聚合酶活性，但不一定具有3'-5'和5'-3'的外切酶活性。3'-5'外切酶活性可以消除错配，切平末端；5'-3'外切酶活性可以消除合成障碍。
超嗜热古菌PalaecoccuspacificusDY20341分离自东太平洋洋中脊热液区，其基因组测序已经完成。预测一共有2001个开放阅读框，其中78.11％没有确定的生物学功能。
尽管商业化的DNA聚合酶多种多样，针对不同扩增目的片段所需的特异DNA聚合酶体系仍然是必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种DNA聚合酶。
本发明所提供的DNA聚合酶，其氨基酸序列如序列表中序列4所示。
本发明的另一个目的是提供一种编码DNA聚合酶的基因，其核苷酸序列如序列表中序列3所示。
本发明的又一个目的是提供一种重组表达载体，其多克隆位点上插入有所述的编码DNA聚合酶的基因。
本发明的再一个目的是提供一种重组菌，其含有所述的重组表达载体。
其中，所述重组菌为大肠杆菌。
所述的DNA聚合酶可在PCR中应用。
本发明的又一个目的是提供一种获得目的基因的方法，所述方法包括如下步骤：
根据目的基因的序列设计引物，
以含有目的基因的DNA片段或基因组DNA为模板，利用所设计的引物和所述的DNA聚合酶进行PCR，
分离PCR产物获得目的基因。
其中，PCR的缓冲液包括Tris(pH8.8)20mM，MgSO42mM，KCl10mM，(NH4)2SO410mM，TritonX-1000.5mg/L，dNTP0.2mM。
本发明的又一个目的是提供一种PCR反应试剂盒，所述试剂盒包括所述的DNA聚合酶。
其中，所述试剂盒还包括PCR的缓冲液，所述PCR的缓冲液包括Tris(pH8.8)20mM，MgSO42mM，KCl10mM，(NH4)2SO410mM，TritonX-1000.5mg/L，dNTP0.2mM。
本发明的DNA聚合酶，来自超噬热广古菌PalaeococcuspacificusDY20341，具有DNA聚合酶活性。利用本发明的DNA聚合酶，成功扩增出了古菌Thermococcussp.4557的大小不同的基因。此外，使用本发明的DNA聚合酶成功扩增出了商业化的PfuDNA聚合酶所不能扩增的Thermococcussp.4557的GQS-01815基因。
附图说明
图1显示PalaeococcuspacificusDNA聚合酶编码基因片段敲除示意图。
图2显示PalaeococcuspacificusDNA聚合酶基因的克隆；
其中，M：DNA分子量标准，1：PolB-片段1，2：PolB-片段2，3：PolB基因。
图3显示SDS-PAGE电泳分析PolB聚合酶纯化后的蛋白；
其中，M：蛋白分子量标准，1：PolBDNA聚合酶。
图4显示了利用PolB聚合酶PCR扩增出不同的DNA片段。
图5显示了PCR扩增Thermococcussp.4557中GQS_01815基因的结果。
具体实施方式
实施例1
1.获取目的基因(PolB基因)
PalaeococcuspacificusDY20341基因组序列如GenBankAssembly:GCA_000725425.1所示。根据生物信息学方面的基因组和蛋白组分析，获得假定的PalaeococcuspacificusDY20341耐热DNA聚合酶(PolB)序列，如序列表中序列1所示。然而，体外无法获得可溶性的耐热DNA聚合酶。针对编码假定的PalaeococcuspacificusDY20341耐热DNA聚合酶的DNA序列(如序列2所示)进行分析，发现该序列可能包含内含子。
因此，针对编码假定的PalaeococcuspacificusDY20341耐热DNA聚合酶的DNA序列设计引物，通过缺失突变的方法(如图1)将内含子敲除。
引物序列如下：
F1：5’-GATATACATATGATTCTCGACACTGATTAC-3’(下划线为NdeI酶切位点)；
R1：5’-CGATTATGGATGGGTAAAGCGACCTGAAATCTAAATAAACG-3’；
F2：5’-CGTTTATTTAGATTTCAGGTCGCTTTACCCATCCATAATCG-3’
R2：5’-GCTGTAGTCGACACTTTTTGGCTTCAACCAAGC-3’(下划线为SalI酶切位点)。
首先，以PalaeococcuspacificusDY20341基因组DNA为模板分别使用F1和R1引物对以及F2和R2引物对，将被假定的内含子隔开的2个PolB的片段(片段1和片段2)分别扩增出来。然后将2个扩增出的片段等比例混合作为进一步扩增的模板，使用F1和R2引物对，将假定的PolB基因扩增出来。
PCR反应体系为50μl，包括Tris(pH8.8)20mM，MgSO42mM，KCl10mM，(NH4)2SO410mM，TritonX-1000.5mg/L，dNTP0.2mM，上下游引物各50μmol/L，模板DNA100ng，1μlPfuDNA聚合酶1μl。
PCR反应条件：预变性94℃3min，变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1-2min，30个循环，后延伸72℃10min，4℃终止反应。
琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示，分别获得了1241bp的片段1和1131bp的片段2以及2341bp的PolB基因。
2.原核重组表达载体构建
利用酶切连接的方法进行重组表达载体的构建，使用NdeI和SalI双酶切克隆载体pET-15b(Novagen)，参照说明书使用T4连接酶在16℃下将NdeI和SalI双酶切的PolB基因与线性化的pET-15bM连接，构建出原核重组表达载体，将原核重组表达载体转化到E.coliTop10感受态细胞中，挑取氨苄抗性筛选为阳性的菌落，进行菌落PCR验证，验证阳性的结果送上海美吉生物测序。测序结果如序列表中序列3所示，其编码的蛋白序列如序列表中序列4所示。
3.重组蛋白的原核表达及体外纯化
将构建的原核重组表达载体转化进入表达性的大肠杆菌体内，通过调节IPTG浓度以及表达温度对目的基因进行高效诱导表达，获得可溶性即具有生物活性的蛋白酶。
将构建的原核重组表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)-CodonPlus-RIL感受态细胞中。转化震荡培养完后取100μl菌液涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素、34μg/ml氯霉素的LB平板上。挑单菌落接种于50ml含有100μg/ml氨苄青霉素、34μg/ml氯霉素的LB液体培养基中在250rpm/min转速下37℃培养12h。取40ml菌液，接种于2.5L含有100μg/ml氨苄青霉素、34μg/ml氯霉素的LB液体培养基中。在250rpm/min转速下37℃培养菌液OD600至0.8，加入IPTG使其终浓度为0.5mM来诱导基因表达，在250rpm/min下37℃振荡培养6h。用12000rpm/min离心5min，收集菌体。超声破碎，离心取上清获得重组蛋白粗液。
为了获得超纯的目的蛋白，利用一系列的层析系统进一步提纯。
首先，使用镍离子亲和层析柱纯化，利用目的蛋白所带亲和标签与树脂特异结合，去除杂蛋白，目的蛋白得以进一步纯化。然后，进行离子交换层析，将上一步得到的蛋白透析到Abuffer(50mMTris-盐酸，pH8.0，50mM氯化钠)中，然后通过HiTrapQ阴离子柱进行纯化。Abuffer预先平衡柱子，再通过Bbuffer(50mMTris盐酸，pH8.0，1M氯化钠)提高盐离子浓度，逐渐的利用离子结合能力的不同将目的蛋白与各种杂蛋白分离。最后，利用分子筛层析做最后一步纯化，4ml蛋白样品上样到XK16-100、填料为SephacrylTMS-200HR的分子筛层析柱子中，分子筛缓冲液(50mMTris-盐酸pH8.0，100mM氯化钠)上样前柱子预先用分子筛缓冲液平衡。上样和洗脱使用的流速为1ml/min。经过这样的纯化程序，最终获得高纯度的目的PolB聚合酶蛋白(93kDa)的浓度为5mg/ml。
SDS-PAGE电泳分析鉴定，鉴定结果如图3所示。
4.DNA延伸活性分析
以古菌Thermococcussp.4557的基因组DNA为模板，利用纯化的目的蛋白酶进行体外PCR扩增来测试该酶的DNA延伸活性。
根据古菌Thermococcussp.4557基因组上六个序列片段，分别命名为“片段1(序列表中序列8)”、“片段2(序列表中序列6)”、“片段3(序列表中序列7)”、“片段4(序列表中序列9)”、“片段5(序列表中序列5)”和“片段6(序列表中序列10)”，并设计相应的引物对，命名为“引物对1”、“引物对2”、“引物对3”、“引物对4”、“引物对5”、“引物对6”。
表1：引物序列
PCR反应体系：50μl，包括Tris(pH8.8)20mM，MgSO42mM，KCl10mM，(NH4)2SO410mM，TritonX-1000.5mg/L，dNTP0.2mM，上下游引物各50μmol/L，模板DNA100ng，PolBDNA聚合酶1μl。
PCR反应条件：预变性94℃3min，变性94℃30s，退火58℃30s，延伸72℃1min，35个循环，后延伸72℃10min，4℃终止反应。
琼脂糖凝胶电泳结果如图4所示，使用目的蛋白酶成功扩增出古菌Thermococcussp.4557的五个大小不同的DNA片段，条带大小分别为378bp、495bp、886bp、1041bp和2685bp。
5.PCR扩增Thermococcussp.4557中GQS_01815基因
使用目前商业化的PfuDNA聚合酶不能扩增出Thermococcussp.4557中GQS_01815基因。而本发明中目的蛋白酶PolB聚合酶可以扩增出相应条带，如图5。
根据Thermococcussp.4557中GQS_01815基因(参见序列表中序列10)设计引物，引物序列见上表引物对6。
以Thermococcussp.4557基因组DNA为模板，使用上述引物序列表中引物对6和本发明的目的蛋白酶进行PCR扩增。以Thermococcussp.4557基因组DNA为模板，使用同样的引物对和PfuDNA聚合酶(TaKaRa)进行PCR扩增。
PCR反应体系：总共50μl，包括Tris(pH8.8)20mM，MgSO42mM，KCl10mM，(NH4)2SO410mM，TritonX-1000.5mg/L，dNTP0.2mM，上下游引物各50μmol/L，模板DNA100ng，PolB或PfuDNA聚合酶1μl。
PCR反应条件：预变性94℃3min，变性94℃30s，退火56℃30s，延伸72℃1.5min，30个循环，后延伸72℃10min，4℃终止反应。
琼脂糖凝胶电泳结果如图5所示，图5中1泳道是Pfu聚合酶扩增结果，没有特异条带扩增出来，而2泳道是本发明的目的蛋白酶扩增条带，扩增片段送上海美吉生物测序。测序结果表明扩增的片段(2595bp)为目的序列。
由此可以表明，使用本发明的目的蛋白酶通过PCR反应成功地扩增出了商业化的PfuDNA聚合酶所不能扩增的Thermococcussp.4557中GQS_01815基因。

Claims (10)

1.一种DNA聚合酶，其氨基酸序列如序列表中序列4所示。
2.一种编码DNA聚合酶的基因，其核苷酸序列如序列表中序列3所示。
3.一种重组表达载体，其多克隆位点上插入有权利要求2所述的编码DNA聚合酶的基因。
4.一种重组菌，其含有权利要求3所述的重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于所述重组菌为大肠杆菌。
6.权利要求1所述的DNA聚合酶在PCR中的应用。
7.一种获得目的基因的方法，其包括如下步骤：
根据目的基因的序列设计引物，
以含有所述目的基因的DNA片段或基因组DNA为模板，利用所设计的引物和权利要求1所述的DNA聚合酶进行PCR，
分离PCR产物获得所述目的基因。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于PCR的缓冲液包括：TrispH8.820mM、MgSO42mM、KCl10mM，(NH4)2SO410mM，TritonX-1000.5mg/L，dNTP0.2mM。
9.一种PCR反应试剂盒，其包括权利要求1所述的DNA聚合酶。
10.根据权利要求9所述的PCR反应试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括PCR的缓冲液，所述PCR的缓冲液包括：TrispH8.820mM、MgSO42mM、KCl10mM，(NH4)2SO410mM，TritonX-1000.5mg/L，dNTP0.2mM。
CN201610069460.9A 2015-12-28 2016-02-01 Dna聚合酶及其编码基因与应用 Active CN105462942B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610069460.9A CN105462942B (zh) 2015-12-28 2016-02-01 Dna聚合酶及其编码基因与应用

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2015109969782 2015-12-28
CN201510996978 2015-12-28
CN201610069460.9A CN105462942B (zh) 2015-12-28 2016-02-01 Dna聚合酶及其编码基因与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105462942A true CN105462942A (zh) 2016-04-06
CN105462942B CN105462942B (zh) 2018-09-07

Family

ID=55601103

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610069460.9A Active CN105462942B (zh) 2015-12-28 2016-02-01 Dna聚合酶及其编码基因与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105462942B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109957557A (zh) * 2017-12-26 2019-07-02 广州市锐博生物科技有限公司 Dna聚合酶及其制备方法
CN114015672A (zh) * 2021-12-06 2022-02-08 江南大学 一种Pfu DNA聚合酶

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1268975A (zh) * 1997-06-26 2000-10-04 宝酒造株式会社 Dna聚合酶相关因子
US20110086349A1 (en) * 2007-10-05 2011-04-14 Ahmad Anjomshoaa Proliferation Signatures and Prognosis for Gastrointestinal Cancer

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1268975A (zh) * 1997-06-26 2000-10-04 宝酒造株式会社 Dna聚合酶相关因子
US20110086349A1 (en) * 2007-10-05 2011-04-14 Ahmad Anjomshoaa Proliferation Signatures and Prognosis for Gastrointestinal Cancer

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZENG X. ET AL.: "GenBank：CP006019.1", 《NCBI》 *
陈孜孟: "超嗜热古菌Palaeococcus pacificus PolB DNA聚合酶和dUTPase在PCR反应中的应用", 《应用海洋学学报》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109957557A (zh) * 2017-12-26 2019-07-02 广州市锐博生物科技有限公司 Dna聚合酶及其制备方法
CN109957557B (zh) * 2017-12-26 2023-01-06 广州市锐博生物科技有限公司 Dna聚合酶及其制备方法
CN114015672A (zh) * 2021-12-06 2022-02-08 江南大学 一种Pfu DNA聚合酶
CN114015672B (zh) * 2021-12-06 2022-05-31 江南大学 一种Pfu DNA聚合酶

Also Published As

Publication number Publication date
CN105462942B (zh) 2018-09-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PH12019501340A1 (en) Thermostable cas9 nucleases
Jandhyala et al. CynD, the cyanide dihydratase from Bacillus pumilus: gene cloning and structural studies
PH12017502281A1 (en) Thermostable cas9 nucleases
NZ602351A (en) Axmi-115, axmi-113, axmi-005, axmi-163 and axmi-184 : vip3a insecticidal proteins from bacillus thuringiensis and methods for their use
Reichelt et al. Genome-wide binding analysis of the transcriptional regulator TrmBL1 in Pyrococcus furiosus
Kesik-Brodacka et al. A novel system for stable, high-level expression from the T7 promoter
Zhao et al. Complete genome sequence of the anaerobic, halophilic alkalithermophile Natranaerobius thermophilus JW/NM-WN-LF
CN105462942A (zh) Dna聚合酶及其编码基因与应用
CN101556287A (zh) 一种新型蛋白质分子量标准及其制备方法
Näther-Schindler et al. Pyrococcus furiosus flagella: biochemical and transcriptional analyses identify the newly detected flaB0 gene to encode the major flagellin
Pukall et al. Complete genome sequence of Deinococcus maricopensis type strain (LB-34 T)
Kang et al. Complete genome sequence of Erwinia amylovora strain TS3128, a Korean strain isolated in an Asian pear orchard in 2015
TWI660042B (zh) 用以製備目標蛋白的表現構建體與方法
Dąbrowski et al. Novel thermostable ssDNA-binding proteins from Thermus thermophilus and T. aquaticus—expression and purification
CN102021173A (zh) 可溶性截短的人trail活性蛋白的制备方法
CN102703400A (zh) 热启动dna聚合酶及其应用
Gowrishankar et al. In vitro properties of RpoS (σS) mutants of Escherichia coli with postulated N-terminal subregion 1.1 or C-terminal region 4 deleted
CN102676566B (zh) 一种以3’-核苷酸酶为标签的重组蛋白表达纯化系统及方法和应用
Leyva-Illades et al. Effect of a small, acid-soluble spore protein from Clostridium perfringens on the resistance properties of Bacillus subtilis spores
CN101381738B (zh) 一种胞内融合表达型前t载体及其制备与应用
LaButti et al. Permanent draft genome sequence of Dethiosulfovibrio peptidovorans type strain (SEBR 4207 T)
Filipkowski et al. Novel thermostable single-stranded DNA-binding protein (SSB) from Deinococcus geothermalis
JP2011135777A (ja) イムノグロブリン結合タンパク質
CN104630205A (zh) 一种增强DNA聚合酶Dbh持续合成DNA能力的方法
CN104480081A (zh) Sso7d-Sau重组DNA聚合酶

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Li Zhuo

Inventor after: Lu Shuhong

Inventor after: Chen Zimeng

Inventor after: Zhao Wenzhao

Inventor after: Dan Dapeng

Inventor before: Li Zhuo

Inventor before: Lu Shuhong

Inventor before: Chen Zimeng

Inventor before: Zhao Wenzhao

Inventor before: Dan Dapeng

CB03 Change of inventor or designer information