CN109957557B

CN109957557B - Dna聚合酶及其制备方法

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Publication number: CN109957557B
Application number: CN201711429299.2A
Authority: CN
Inventors: 张必良; 刘霭珊
Original assignee: Guangzhou Ribobio Co ltd
Current assignee: Guangzhou Ribobio Co ltd
Priority date: 2017-12-26
Filing date: 2017-12-26
Publication date: 2023-01-06
Anticipated expiration: 2037-12-26
Also published as: CN109957557A

Abstract

本发明公开了DNA聚合酶及其制备方法。本发明公开的DNA聚合酶为将序列表中序列1所示的氨基酸序列进行如下至少一种突变得到的蛋白质：将序列1的第1025位的色氨酸残基突变为甘氨酸残基、精氨酸残基或亮氨酸残基；将序列1的第681位的精氨酸残基突变为赖氨酸残基；将序列1的第1462位的赖氨酸残基突变为丝氨酸残基、苯丙氨酸残基或甘氨酸残基；将序列1的第1347位的甘氨酸残基突变为苏氨酸残基或赖氨酸残基；将序列1的第357位的亮氨酸残基突变为丙氨酸残基、甲硫氨酸残基或谷氨酸残基；将序列1的第1256位的亮氨酸残基突变为缬氨酸残基。实验证明，本发明的蛋白质可作为DNA聚合酶进行应用。

Description

DNA聚合酶及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，DNA聚合酶及其制备方法。

背景技术

DNA聚合酶以单链DNA为模板来合成互补DNA链。DNA聚合酶可将游离核苷酸加入新形成链的3＇端，使新链在5＇-3＇方向延伸。

高保真DNA聚合酶是一种具有3＇-5＇DNA外切活性的DNA聚合酶，可利用单链DNA为引物，以DNA为模板进行DNA合成反应。当合成过程中掺入与模板不匹配的碱基时，可利用其3＇-5＇DNA外切活性将错配的碱基切除，然后重新掺入正确的碱基，因此具有校读(proof-reading)活性，即保真性。

来源于Thermococcus kodakaraensis(KOD)的KOD聚合酶是一种具有耐热性的高保真DNA聚合酶，DNA合成出错率约为7.6×10^-6，比Taq酶的保真性高4倍，但与高保真PCR反应的使用需求相比仍有较大差距。同时由于存在3＇-5＇DNA外切的校读活性，因此其DNA延伸速度较低(约1000bp/min)。

为改进高保真DNA聚合酶性能，现有技术提供了以下方案：1、置换或加入其他的结构域：如将KOD聚合酶的DNA聚合结构域置换为Pfu聚合酶的DNA聚合结构域以提高其聚合活性(见专利US9023633.B2)，如加入Sso7结构域以提高延伸性(见专利US8445249.B2)；2、突变：有利的突变可增强酶的相关性能。

但上述方案中：新加入的结构域有可能影响原始酶的结构，因此其融合得到的新蛋白的性能并不是简单两者相加的结果，并且只能针对聚合酶的一种性能进行改变，难以对聚合酶的整体性能(保真性，扩增性、延伸速度等)进行提升。而现有的突变很难筛选出具有叠加效应的突变位点，对酶的性能改造有限。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高KOD聚合酶在PCR中的延伸速度、保真性和PCR产物产量。为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种具有DNA聚合酶活性由KOD聚合酶突变得到的蛋白质，所述蛋白质为将序列表中序列1所示氨基酸序列中的第1025、681、1462、1347、357和1256位中的任一个、任两个、任三个、任四个、任五个或全部进行突变得到的蛋白质。

所述蛋白质可为将序列表中序列1所示的氨基酸序列进行如下任一个、任两个、任三个、任四个、任五个或全部的突变得到的蛋白质：

A1)将序列1的第1025位的色氨酸残基突变为甘氨酸残基、精氨酸残基或亮氨酸残基；

A2)将序列1的第681位的精氨酸残基突变为赖氨酸残基；

A3)将序列1的第1462位的赖氨酸残基突变为丝氨酸残基、苯丙氨酸残基或甘氨酸残基；

A4)将序列1的第1347位的甘氨酸残基突变为苏氨酸残基或赖氨酸残基；

A5)将序列1的第357位的亮氨酸残基突变为丙氨酸残基、甲硫氨酸残基或谷氨酸残基；

A6)将序列1的第1256位的亮氨酸残基突变为缬氨酸残基。

所述蛋白质具体可为下述B1)、B2)、B3)或B4)：

B1)将序列表中序列1所示的氨基酸序列中的第1025位的色氨酸残基突变为甘氨酸残基、第681位的精氨酸残基突变为赖氨酸残基、第1462位的赖氨酸残基突变为丝氨酸残基和第1347位的甘氨酸残基突变为苏氨酸残基得到的蛋白质；

B2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列中的第1025位的色氨酸残基突变为甘氨酸残基、第681位的精氨酸残基突变为赖氨酸残基、第1462位的赖氨酸残基突变为丝氨酸残基和第357位的亮氨酸残基突变为丙氨酸残基得到的蛋白质；

B3)将序列表中序列1所示的氨基酸序列中的第1025位的色氨酸残基突变为精氨酸残基、第1462位的赖氨酸残基突变为苯丙氨酸残基、第357位的亮氨酸残基突变为甲硫氨酸残基和第1256位的亮氨酸残基突变为缬氨酸残基得到的蛋白质；

B4)将序列表中序列1所示的氨基酸序列中的第1025位的色氨酸残基突变为亮氨酸残基、第1462位的赖氨酸残基突变为甘氨酸残基、第1347位的甘氨酸残基突变为赖氨酸残基和第357位的亮氨酸残基突变为谷氨酸残基得到的蛋白质。

为了使所述蛋白质便于纯化，可在所述蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

本发明还提供了与所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为下述C1)-C5)中的任一种：

C1)编码所述蛋白质的核酸分子；

C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；

C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体、或含有C2)所述表达盒的重组载体；

C4)含有C1)所述核酸分子的重组微生物、或含有C2)所述表达盒的重组微生物、或含有C3)所述重组载体的重组微生物；

C5)含有C1)所述核酸分子的细胞系、或含有C2)所述表达盒的细胞系。

C1)所述核酸分子可为将序列表中序列2所示的cDNA分子或DNA分子进行突变得到的核酸分子。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的所述蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质且具有所述蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码所述蛋白质的氨基酸序列的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

C1)所述核酸分子具体可为将序列表中序列2所示的DNA序列进行如下任一个、任两个、任三个、任四个、任五个或全部的突变得到的核酸分子：

D1)将序列1的第1025位的色氨酸编码DNA突变为甘氨酸编码DNA、精氨酸编码DNA或亮氨酸编码DNA；

D2)将序列1的第681位的精氨酸编码DNA突变为赖氨酸编码DNA；

D3)将序列1的第1462位的赖氨酸编码DNA突变为丝氨酸编码DNA、苯丙氨酸编码DNA或甘氨酸编码DNA；

D4)将序列1的第1347位的甘氨酸编码DNA突变为苏氨酸编码DNA或赖氨酸编码DNA；

D5)将序列1的第357位的亮氨酸编码DNA突变为丙氨酸编码DNA、甲硫氨酸编码DNA或谷氨酸编码DNA；

D6)将序列1的第1256位的亮氨酸编码DNA突变为缬氨酸编码DNA。

进一步，编码B1)所述蛋白质的核酸分子可为将序列2的第2041位的C突变为A、第2042位的G突变为A，第3073位的T突变为G、第3075位的G突变为A，第4039位的G突变为A、第4040位的G突变为C，第4385位的A突变为G、第4386位的G突变为C得到的核酸分子；

编码B2)所述蛋白质的核酸分子可为将序列2的第1069位的C突变为G、第1070位的T突变为C、第1071位的C突变为A，第2041位的C突变为A、第2042位的G突变为A，第3073位的T突变为G、第3075位的G突变为A，第4385位的A突变为G、第4386位的G突变为C得到的核酸分子；

编码B3)所述蛋白质的核酸分子可为将序列2的第1069位的C突变为A、第1071位的C突变为G，第3073位的T突变为C，第3766位的C突变为G、第3768的C突变为A，第4384位的A突变为T、第4385位的A突变为T、第4386位的G突变为C得到的核酸分子；

编码B4)所述蛋白质的核酸分子可为将序列2的第1069位的C突变为G、第1070位的T突变为A、第1071位的C突变为A，第3073位的T突变为C、第3074位的G突变为T，第4039位的G突变为A、第4040位的G突变为A，第4384位的A突变为G、第4385位的A突变为G得到的核酸分子。

上述生物材料中，C2)所述的含有编码所述蛋白质的核酸分子的表达盒(所述蛋白质基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达所述蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动所述蛋白质基因转录的启动子，还可包括终止所述蛋白质基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

可用现有的表达载体构建含有所述蛋白质基因表达盒的重组载体。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pET-28a。

所述重组载体可为在所述载体的多克隆位点插入所述编码所述蛋白质的核酸分子得到的重组载体。在本发明的实施例中，所述重组载体具体为将pET-28a的XhoI及NcoI识别序列间的DNA片段替换为所述编码所述蛋白质的核酸分子得到的表达所述蛋白质的重组载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为大肠杆菌，如大肠杆菌BL21(DE3)。

在本发明的实施例中，所述重组微生物具体向大肠杆菌BL21(DE3)中导入所述重组载体得到的微生物。

上述生物材料中，所述转基因细胞系可包括繁殖材料，也可不包括繁殖材料。

本发明还提供了所述蛋白质的制备方法，所述方法包括：将所述蛋白质的编码基因导入生物细胞中，使所述编码基因得到表达，得到所述蛋白质。

上述方法中，所述将所述蛋白质的编码基因导入生物细胞可为将含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述生物细胞中，得到重组细胞。

所述蛋白质的编码基因具体可为上文中C1)所述核酸分子。

所述重组表达载体可为将所述蛋白质的编码基因导入表达载体中得到重组载体。所述表达载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pET-28a。

上述方法中，所述生物细胞可为微生物、动物细胞或植物细胞。所述微生物具体可为大肠杆菌，如大肠杆菌BL21(DE3)。

上述方法中，所述使所述蛋白质的编码基因表达具体可为培养所述重组细胞，得到培养物，使所述重组细胞中的所述蛋白质的编码基因得到表达。

上述方法还可包括从所述培养物中纯化所述蛋白质。

本发明还提供了用于体外DNA合成，DNA扩增，或，DNA测序的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包含所述蛋白质。

本发明还提供了下述任一应用：

E1)所述蛋白质在作为DNA聚合酶中的应用；

E2)所述生物材料在制备DNA聚合酶中的应用；

E3)所述蛋白质在DNA聚合反应中的应用；

E4)所述蛋白质在制备聚合酶链式反应产品中的应用；

E5)所述生物材料在聚合酶链式反应中的应用；

E6)所述生物材料在制备聚合酶链式反应产品中的应用；

E7)所述蛋白质的制备方法在制备DNA聚合反应产品中的应用。

实验证明，本发明的蛋白质在作为DNA聚合酶时，与KOD聚合酶相比，其延伸速度、保真性与PCR扩增产物量中的两种性能或三种性能都得到了显著提升，表明，本发明的蛋白质可作为改进的DNA聚合酶进行应用。

附图说明

图1为各KOD聚合酶突变体在不同延伸时间下的产物大小。其中，M为DNA分子量标准，单位为bp。

图2为PCR扩增产物量。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。

延伸速度：是指在PCR反应中DNA聚合酶延伸DNA的平均速度。

保真性：即DNA聚合酶在PCR反应中延伸DNA的精确度，通常通过出错率(掺入不正确的核苷酸，即并不是以模板依赖性方式加入的核苷酸的频率)来测定。高保真性是指出错率低于8×10^-7(例如，低于5×10^-7、4×10^-7、2.5×10^-7)。

实施例1、DNA聚合酶的制备及活性检测

一、DNA聚合酶的制备

以序列表中序列1所示的野生型KOD聚合酶(Thermococcus kodakarensis)的氨基酸序列为基础，用大肠杆菌偏好密码子对其核酸序列进行优化，得到如序列表中序列2所示的野生型KOD聚合酶编码基因。

通过对序列2进行突变，得到四种突变DNA序列，将这四种突变DNA序列编码的突变KOD聚合酶分别记为KOD_Mu_1#、KOD_Mu_2#、KOD_Mu_3#和KOD_Mu_4#。

KOD_Mu_1#为将序列表中序列1所示的氨基酸序列中的第1025位的色氨酸残基突变为甘氨酸残基、第681位的精氨酸残基突变为赖氨酸残基、第1462位的赖氨酸残基突变为丝氨酸残基和第1347位的甘氨酸残基突变为苏氨酸残基得到的DNA聚合酶；KOD_Mu_1#的编码序列为将序列2的第2041位的C突变为A、第2042位的G突变为A，第3073位的T突变为G、第3075位的G突变为A，第4039位的G突变为A、第4040位的G突变为C，第4385位的A突变为G、第4386位的G突变为C得到的DNA序列，记为KOD_Mu_1#编码基因。

KOD_Mu_2#为将序列表中序列1所示的氨基酸序列中的第1025位的色氨酸残基突变为甘氨酸残基、第681位的精氨酸残基突变为赖氨酸残基、第1462位的赖氨酸残基突变为丝氨酸残基和第357位的亮氨酸残基突变为丙氨酸残基得到的DNA聚合酶；KOD_Mu_2#的编码序列为将序列2的第1069位的C突变为G、第1070位的T突变为C、第1071位的C突变为A，第2041位的C突变为A、第2042位的G突变为A，第3073位的T突变为G、第3075位的G突变为A，第4385位的A突变为G、第4386位的G突变为C得到的DNA序列，记为KOD_Mu_2#编码基因。

KOD_Mu_3#为将序列表中序列1所示的氨基酸序列中的第1025位的色氨酸残基突变为精氨酸残基、第1462位的赖氨酸残基突变为苯丙氨酸残基、第357位的亮氨酸残基突变为甲硫氨酸残基和第1256位的亮氨酸残基突变为缬氨酸残基得到的DNA聚合酶；KOD_Mu_3#的编码序列为将序列2的第1069位的C突变为A、第1071位的C突变为G，第3073位的T突变为C，第3766位的C突变为G、第3768的C突变为A，第4384位的A突变为T、第4385位的A突变为T、第4386位的G突变为C得到的DNA序列，记为KOD_Mu_3#编码基因。

KOD_Mu_4#为将序列表中序列1所示的氨基酸序列中的第1025位的色氨酸残基突变为亮氨酸残基、第1462位的赖氨酸残基突变为甘氨酸残基、第1347位的甘氨酸残基突变为赖氨酸残基和第357位的亮氨酸残基突变为谷氨酸残基得到的DNA聚合酶；KOD_Mu_4#的编码序列为将序列2的第1069位的C突变为G、第1070位的T突变为A、第1071位的C突变为A，第3073位的T突变为C、第3074位的G突变为T，第4039位的G突变为A、第4040位的G突变为A，第4384位的A突变为G、第4385位的A突变为G得到的DNA序列，记为KOD_Mu_4#编码基因。

二、DNA聚合酶的性能检测

1、重组载体的构建

将pET-28a原核表达载体(MerckMillipore产品)的XhoI及NcoI识别序列间的DNA序列替换为野生型KOD聚合酶编码基因，得到重组载体，将该重组载体命名为pET-KOD，pET-KOD能表达野生型KOD聚合酶。

将pET-28a原核表达载体的XhoI及NcoI识别序列间的DNA序列替换为步骤一的KOD_Mu_1#编码基因，得到重组载体，将该重组载体命名为pET-KOD_Mu_1#，pET-KOD_Mu_1#能表达步骤一的KOD_Mu_1#。

将pET-28a原核表达载体的XhoI及NcoI识别序列间的DNA序列替换为步骤一的KOD_Mu_2#编码基因，得到重组载体，将该重组载体命名为pET-KOD_Mu_2#，pET-KOD_Mu_2#能表达步骤一的KOD_Mu_2#。

将pET-28a原核表达载体的XhoI及NcoI识别序列间的DNA序列替换为步骤一的KOD_Mu_3#编码基因，得到重组载体，将该重组载体命名为pET-KOD_Mu_3#，pET-KOD_Mu_3#能表达步骤一的KOD_Mu_3#。

将pET-28a原核表达载体的XhoI及NcoI识别序列间的DNA序列替换为步骤一的KOD_Mu_4#编码基因，得到重组载体，将该重组载体命名为pET-KOD_Mu_4#，pET-KOD_Mu_4#能表达步骤一的KOD_Mu_4#。

2、酶液的制备

将步骤1的5个重组载体pET-KOD、pET-KOD_Mu_1#、pET-KOD_Mu_2#、pET-KOD_Mu_3#和pET-KOD_Mu_4#分别导入BL21(DE3)细胞，将得到的重组菌分别命名为BL21-pET-KOD、BL21-pET-KOD_Mu_1#、BL21-pET-KOD_Mu_2#、BL21-pET-KOD_Mu_3#和BL21-pET-KOD_Mu_4#。将这五种重组菌分别按照如下制备酶液，并将pET-28a原核表达载体导入BL21(DE3)细胞得到的重组菌作为对照：

将重组菌接种至100mL LB培养基中37℃培养8hr，然后加入在培养液中的浓度为0.1mM的IPTG，18℃继续培养16hr。离心收集菌体，用5mL裂解液(50mM Tris、300mMNaCl、5％甘油、pH8.0)重悬菌体，超声裂解菌体得到裂解液，将裂解液离心分离得到上清液。将上清液75℃加热10min，然后离心去除沉淀，然后向该上清液中加入等体积甘油并混合均匀，-20℃保存，即得到KOD酶液、KOD_Mu_1#酶液、KOD_Mu_2#酶液、KOD_Mu_3#酶液和KOD_Mu_4#酶液以及对照酶液。

3、DNA聚合酶活性检测

1)延伸速度

以M13mp18ssDNA为模板、FAM(羟基荧光素)标记的M13F为引物检测KOD聚合酶及其突变体的DNA聚合酶延伸性能，反应体系如表2：

表2、反应体系

M13mp18ssDNA(TAKARA#3518 0.2μg/μL)	0.669pmoL
		FAM-M13F Primer(1pmol/μL)	0.75μL
10×KOD buffer	3μL
		dNTP(2.5mM)(TianGen)	3μL
步骤2得到的酶液(每个反应体系一种)	3μL
		ddH<sub>2</sub>O	补至30μL

其中，FAM-M13F Primer：5’FAM-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’；10×KOD buffer由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度分别为20mM Tris、50mM NaCl、120mM Na₂SO₄和1g/L Tween-20，pH7.4。

按照表2的反应体系的配比，每种酶液配置一种总体系为5μL的反应体系，然后添加1μL 0.1M EDTA(MDBio)，冰上放置，作为NC(阴性对照)组。

按照表2配置各个酶液的反应体系，每种酶液5个反应体系，进行PCR扩增，作为实验组。

将实验组进行PCR扩增，PCR反应程序为：95℃3min、50℃3min、72℃延伸，在延伸时间分别为10s、20s、30s、60s和90s时分别从取出一个反应体系并向取出的反应体系中添加1μL 0.1M EDTA。

反应结束后，将所有体系进行1％碱性琼脂糖电泳，typhoon9400FAM通道扫描，结果见图1。根据图1的结果，统计各酶在各时间点时扩增的DNA的长度，见表3。

结果显示，在延伸时间为10s时，KOD_Mu_1#、KOD_Mu_2#、KOD_Mu_3#及KOD_Mu_4#的DNA延伸速度与KOD聚合酶相比显著提高，延伸速度为10bp/秒～100bp/秒。

在延伸时间为20s时，KOD_Mu_1#、KOD_Mu_2#及KOD_Mu_3#的DNA延伸速度与KOD聚合酶相比，分别提高了7.0、6.5、2.7倍。

在延伸时间为30s时，KOD_Mu_1#、KOD_Mu_2#及KOD_Mu_3#的DNA延伸速度与KOD聚合酶相比，分别提高了6.6、6.6、2.8倍。

在延伸时间为60s时，KOD_Mu_1#、KOD_Mu_2#及KOD_Mu_3#的DNA延伸速度与KOD聚合酶相比，分别提高了5.0、4.3、1.6倍，KOD_Mu_1#及KOD_Mu_2#的延伸速度达到4000～4500bp/min。

在延伸时间为90s时，KOD_Mu_1#、KOD_Mu_2#及KOD_Mu_3#的DNA延伸速度与KOD聚合酶相比，分别提高了3.0、3.0、1.2倍。

2)保真性

A)pUC19质粒用NdeI(Thermo scientific)酶切，Klenow酶(Thermo scientific)补平，再用HindIII酶切(Thermo scientific)，胶回收(将lacZ-α及MSC(多克隆位点)序列区切走，保留lac启动子序列区)，去磷酸化酶SAP(NEW England BioLabs)处理回收后片段，使末端去磷酸化。

a)NdeI酶切：酶切体系37℃温育2hr后，65℃温育20min以灭活NdeI酶。NdeI酶切体系如下表所示：

pUC19质粒	30μg
		NdeI	2μL
10*Cutsmart buffer(NEB)	3μL
		ddH<sub>2</sub>O	补至30μL

b)Klenow酶补平

灭活NdeI酶后，在a)步骤的体系中加入2.5μL dNTP(2.5mM)及1μL 5U/μL Klenow，37℃温育30min，再65℃温育20min灭活Klenow酶，乙醇沉淀纯化产物。

c)HindIII酶切

向乙醇沉淀纯化产物中加入2μL 10*NEB buffer 2.1，2μL HindIII，1μL ddH₂O，经37℃温育2hr后，65℃温育20min以灭活HindIII酶。

d)回收纯化

1％胶回收纯化步骤c)得到的酶切产物，ddH₂O溶解纯化产物。

e)SAP去磷酸化

步骤d)得到的纯化产物去磷酸化处理，将去磷酸化体系37℃温育30min后，65℃温育5min以灭活SAP，得到去磷酸化产物，即pUC19载体骨架。SAP去磷酸化体系如下：

步骤d)得到的纯化产物	30μL
		10*NEB Cutsmart	4μL
SAP(虾碱性磷酸酶)	2μL
		ddH<sub>2</sub>O	补至40μL

B)利用LacZ上游引物和LacZ下游引物从BL21(DE3)中扩增完整的lacZ片段，将序列正确的lacZ片段与pUC19载体骨架相连，将序列正确的重组载体命名为lacZ-pUC19。

LacZ上游引物序列为：5'-GCATAAGCTTGACCATGATTACGGA-3'(下划线为HindIII的识别序列)

LacZ下游引物序列为：5'-TTATTTTTGACACCAGACCAACTGG-3'

C)以1ng lacZ-pUC19为模板，利用LacZ上游引物和LacZ下游引物PCR扩增lacZ片段，所用DNA聚合酶分别为步骤2的KOD酶液、KOD_Mu_1#酶液、KOD_Mu_2#酶液、KOD_Mu_3#酶液和KOD_Mu_4#酶液以及对照酶液，每种反应体系一种酶液，所用反应体系与反应条件为如下：

PCR体系

PCR程序

将得到的PCR产物纯化，测定产物浓度，计算d值(2^d＝产物量/模板量，d＝log₂ ^{(产物量/模板量)})。

D)将步骤C)得到的PCR产物中加入DpnI及HindIII进行酶切，胶回收酶切产物，然后序列正确的酶切产物与步骤A)酶切后的pUC19质粒连接，转化DH5α感受态细胞，涂含IPTG与Xgal以及Amp的培养板，37℃倒置培养过夜。第二天取出后在4℃放置2hr。统计白斑数及菌落总数。计算Mf值＝(白斑数/总菌落数)，ER值(出错率)＝Mf/(d×3029)，其中d为步骤C中的d值。KOD聚合酶及KOD_Mu_1#、KOD_Mu_2#、KOD_Mu_3#和KOD_Mu_4#的出错率见表4。

表4、DNA聚合酶的出错率

DNA聚合酶	KOD_Mu_1#	KOD_Mu_2#	KOD_Mu_3#	KOD_Mu_4#	KOD聚合酶
						出错率	4.7×10<sup>-7</sup>	2.1×10<sup>-7</sup>	3.7×10<sup>-7</sup>	7.8×10<sup>-7</sup>	2.4×10<sup>-6</sup>

从上表可见，4个突变KOD聚合酶的PCR出错率均低于KOD聚合酶，KOD_Mu_1#的出错率比KOD聚合酶下降了80％，KOD_Mu_2#下降了91％，KOD_Mu_3#下降了84％，

KOD_Mu_4#下降了67％，且4个突变KOD聚合酶的出错率均低于8.0×10^-7，与KOD聚合酶相比，出错率至少降低了65％以上。

3)扩增性测试

以0.1ng步骤2)的lacZ-pUC19为模板，利用LacZ上游引物和LacZ下游引物PCR扩增lacZ片段，所用DNA聚合酶分别为步骤2的KOD酶液、KOD_Mu_1#酶液、KOD_Mu_2#酶液、KOD_Mu_3#酶液和KOD_Mu_4#酶液以及对照酶液，每种反应体系一种酶液，所用反应体系同步骤1)，反应条件同2)保真性测试中的PCR反应条件，PCR扩增循环数均设置两种，为25和30。

将得到的各PCR产物经纯化后，测定产物DNA的量，结果见图2。从图2结果可见，KOD_Mu_1#、KOD_Mu_2#、KOD_Mu_3#和KOD_Mu_4#得到的PCR产物量比KOD聚合酶均有明显提高，其扩增性均优于野生型KOD聚合酶。KOD_Mu_3#与KOD聚合酶相比，扩增性基本持平，但其保真性能有提升。

具体的，KOD_Mu_1#、KOD_Mu_2#和KOD_Mu_4#在PCR扩增循环数为25时，PCR产物量分别提高了196％、66％、129％。KOD_Mu_1#、KOD_Mu_2#和KOD_Mu_4#在PCR扩增循环数为30时，PCR产物量分别提高了182％、53％、44％。

<110> 广州市锐博生物科技有限公司、广州锐康医学检验所有限公司

<120> DNA聚合酶及其制备方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1671

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

Met Ile Leu Asp Thr Asp Tyr Ile Thr Glu Asp Gly Lys Pro Val Ile

1 5 10 15

Arg Ile Phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg

20 25 30

Thr Phe Glu Pro Tyr Phe Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile

35 40 45

Glu Glu Val Lys Lys Ile Thr Ala Glu Arg His Gly Thr Val Val Thr

50 55 60

Val Lys Arg Val Glu Lys Val Gln Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Val

65 70 75 80

Glu Val Trp Lys Leu Tyr Phe Thr His Pro Gln Asp Val Pro Ala Ile

85 90 95

Arg Asp Lys Ile Arg Glu His Pro Ala Val Ile Asp Ile Tyr Glu Tyr

100 105 110

Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Val Pro

115 120 125

Met Glu Gly Asp Glu Glu Leu Lys Met Leu Ala Phe Asp Ile Glu Thr

130 135 140

Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Ala Glu Gly Pro Ile Leu Met Ile

145 150 155 160

Ser Tyr Ala Asp Glu Glu Gly Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Asn Val

165 170 175

Asp Leu Pro Tyr Val Asp Val Val Ser Thr Glu Arg Glu Met Ile Lys

180 185 190

Arg Phe Leu Arg Val Val Lys Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Ile Thr

195 200 205

Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Cys Glu

210 215 220

Lys Leu Gly Ile Asn Phe Ala Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys

225 230 235 240

Ile Gln Arg Met Gly Asp Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile

245 250 255

His Phe Asp Leu Tyr Pro Val Ile Arg Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr

260 265 270

Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Val Phe Gly Gln Pro Lys Glu

275 280 285

Lys Val Tyr Ala Glu Glu Ile Thr Thr Ala Trp Glu Thr Gly Glu Asn

290 295 300

Leu Glu Arg Val Ala Arg Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Tyr

305 310 315 320

Glu Leu Gly Lys Glu Phe Leu Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu

325 330 335

Ile Gly Gln Ser Leu Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu

340 345 350

Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala

355 360 365

Pro Asn Lys Pro Asp Glu Lys Glu Leu Ala Arg Arg Arg Gln Ser Tyr

370 375 380

Glu Gly Gly Tyr Val Lys Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Glu Asn Ile

385 390 395 400

Val Tyr Leu Asp Phe Arg Cys His Pro Ala Asp Thr Lys Val Val Val

405 410 415

Lys Gly Lys Gly Ile Ile Asn Ile Ser Glu Val Gln Glu Gly Asp Tyr

420 425 430

Val Leu Gly Ile Asp Gly Trp Gln Arg Val Arg Lys Val Trp Glu Tyr

435 440 445

Asp Tyr Lys Gly Glu Leu Val Asn Ile Asn Gly Leu Lys Cys Thr Pro

450 455 460

Asn His Lys Leu Pro Val Val Thr Lys Asn Glu Arg Gln Thr Arg Ile

465 470 475 480

Arg Asp Ser Leu Ala Lys Ser Phe Leu Thr Lys Lys Val Lys Gly Lys

485 490 495

Ile Ile Thr Thr Pro Leu Phe Tyr Glu Ile Gly Arg Ala Thr Ser Glu

500 505 510

Asn Ile Pro Glu Glu Glu Val Leu Lys Gly Glu Leu Ala Gly Ile Leu

515 520 525

Leu Ala Glu Gly Thr Leu Leu Arg Lys Asp Val Glu Tyr Phe Asp Ser

530 535 540

Ser Arg Lys Lys Arg Arg Ile Ser His Gln Tyr Arg Val Glu Ile Thr

545 550 555 560

Ile Gly Lys Asp Glu Glu Glu Phe Arg Asp Arg Ile Thr Tyr Ile Phe

565 570 575

Glu Arg Leu Phe Gly Ile Thr Pro Ser Ile Ser Glu Lys Lys Gly Thr

580 585 590

Asn Ala Val Thr Leu Lys Val Ala Lys Lys Asn Val Tyr Leu Lys Val

595 600 605

Lys Glu Ile Met Asp Asn Ile Glu Ser Leu His Ala Pro Ser Val Leu

610 615 620

Arg Gly Phe Phe Glu Gly Asp Gly Ser Val Asn Arg Val Arg Arg Ser

625 630 635 640

Ile Val Ala Thr Gln Gly Thr Lys Asn Glu Trp Lys Ile Lys Leu Val

645 650 655

Ser Lys Leu Leu Ser Gln Leu Gly Ile Pro His Gln Thr Tyr Thr Tyr

660 665 670

Gln Tyr Gln Glu Asn Gly Lys Asp Arg Ser Arg Tyr Ile Leu Glu Ile

675 680 685

Thr Gly Lys Asp Gly Leu Ile Leu Phe Gln Thr Leu Ile Gly Phe Ile

690 695 700

Ser Glu Arg Lys Asn Ala Leu Leu Asn Lys Ala Ile Ser Gln Arg Glu

705 710 715 720

Met Asn Asn Leu Glu Asn Asn Gly Phe Tyr Arg Leu Ser Glu Phe Asn

725 730 735

Val Ser Thr Glu Tyr Tyr Glu Gly Lys Val Tyr Asp Leu Thr Leu Glu

740 745 750

Gly Thr Pro Tyr Tyr Phe Ala Asn Gly Ile Leu Thr His Asn Ser Leu

755 760 765

Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn

770 775 780

Arg Glu Gly Cys Lys Glu Tyr Asp Val Ala Pro Gln Val Gly His Arg

785 790 795 800

Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly Phe Ile Pro Ser Leu Leu Gly Asp Leu

805 810 815

Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile Lys Lys Lys Met Lys Ala Thr Ile Asp

820 825 830

Pro Ile Glu Arg Lys Leu Leu Asp Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile

835 840 845

Leu Ala Asn Ser Ile Leu Pro Glu Glu Trp Leu Pro Val Leu Glu Glu

850 855 860

Gly Glu Val His Phe Val Arg Ile Gly Glu Leu Ile Asp Arg Met Met

865 870 875 880

Glu Glu Asn Ala Gly Lys Val Lys Arg Glu Gly Glu Thr Glu Val Leu

885 890 895

Glu Val Ser Gly Leu Glu Val Pro Ser Phe Asn Arg Arg Thr Asn Lys

900 905 910

Ala Glu Leu Lys Arg Val Lys Ala Leu Ile Arg His Asp Tyr Ser Gly

915 920 925

Lys Val Tyr Thr Ile Arg Leu Lys Ser Gly Arg Arg Ile Lys Ile Thr

930 935 940

Ser Gly His Ser Leu Phe Ser Val Arg Asn Gly Glu Leu Val Glu Val

945 950 955 960

Thr Gly Asp Glu Leu Lys Pro Gly Asp Leu Val Ala Val Pro Arg Arg

965 970 975

Leu Glu Leu Pro Glu Arg Asn His Val Leu Asn Leu Val Glu Leu Leu

980 985 990

Leu Gly Thr Pro Glu Glu Glu Thr Leu Asp Ile Val Met Thr Ile Pro

995 1000 1005

Val Lys Gly Lys Lys Asn Phe Phe Lys Gly Met Leu Arg Thr Leu

1010 1015 1020

Arg Trp Ile Phe Gly Glu Glu Lys Arg Pro Arg Thr Ala Arg Arg

1025 1030 1035

Tyr Leu Arg His Leu Glu Asp Leu Gly Tyr Val Arg Leu Lys Lys

1040 1045 1050

Ile Gly Tyr Glu Val Leu Asp Trp Asp Ser Leu Lys Asn Tyr Arg

1055 1060 1065

Arg Leu Tyr Glu Ala Leu Val Glu Asn Val Arg Tyr Asn Gly Asn

1070 1075 1080

Lys Arg Glu Tyr Leu Val Glu Phe Asn Ser Ile Arg Asp Ala Val

1085 1090 1095

Gly Ile Met Pro Leu Lys Glu Leu Lys Glu Trp Lys Ile Gly Thr

1100 1105 1110

Leu Asn Gly Phe Arg Met Arg Lys Leu Ile Glu Val Asp Glu Ser

1115 1120 1125

Leu Ala Lys Leu Leu Gly Tyr Tyr Val Ser Glu Gly Tyr Ala Arg

1130 1135 1140

Lys Gln Arg Asn Pro Lys Asn Gly Trp Ser Tyr Ser Val Lys Leu

1145 1150 1155

Tyr Asn Glu Asp Pro Glu Val Leu Asp Asp Met Glu Arg Leu Ala

1160 1165 1170

Ser Arg Phe Phe Gly Lys Val Arg Arg Gly Arg Asn Tyr Val Glu

1175 1180 1185

Ile Pro Lys Lys Ile Gly Tyr Leu Leu Phe Glu Asn Met Cys Gly

1190 1195 1200

Val Leu Ala Glu Asn Lys Arg Ile Pro Glu Phe Val Phe Thr Ser

1205 1210 1215

Pro Lys Gly Val Arg Leu Ala Phe Leu Glu Gly Tyr Phe Ile Gly

1220 1225 1230

Asp Gly Asp Val His Pro Asn Lys Arg Leu Arg Leu Ser Thr Lys

1235 1240 1245

Ser Glu Leu Leu Ala Asn Gln Leu Val Leu Leu Leu Asn Ser Val

1250 1255 1260

Gly Val Ser Ala Val Lys Leu Gly His Asp Ser Gly Val Tyr Arg

1265 1270 1275

Val Tyr Ile Asn Glu Glu Leu Pro Phe Val Lys Leu Asp Lys Lys

1280 1285 1290

Lys Asn Ala Tyr Tyr Ser His Val Ile Pro Lys Glu Val Leu Ser

1295 1300 1305

Glu Val Phe Gly Lys Val Phe Gln Lys Asn Val Ser Pro Gln Thr

1310 1315 1320

Phe Arg Lys Met Val Glu Asp Gly Arg Leu Asp Pro Glu Lys Ala

1325 1330 1335

Gln Arg Leu Ser Trp Leu Ile Glu Gly Asp Val Val Leu Asp Arg

1340 1345 1350

Val Glu Ser Val Asp Val Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Val Tyr Asp

1355 1360 1365

Leu Ser Val Glu Asp Asn Glu Asn Phe Leu Val Gly Phe Gly Leu

1370 1375 1380

Val Tyr Ala His Asn Ser Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Gly Tyr Ala Arg

1385 1390 1395

Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser Val Thr Ala Trp

1400 1405 1410

Gly Arg Glu Tyr Ile Thr Met Thr Ile Lys Glu Ile Glu Glu Lys

1415 1420 1425

Tyr Gly Phe Lys Val Ile Tyr Ser Asp Thr Asp Gly Phe Phe Ala

1430 1435 1440

Thr Ile Pro Gly Ala Asp Ala Glu Thr Val Lys Lys Lys Ala Met

1445 1450 1455

Glu Phe Leu Lys Tyr Ile Asn Ala Lys Leu Pro Gly Ala Leu Glu

1460 1465 1470

Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Lys Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys

1475 1480 1485

Lys Lys Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Thr Thr Arg

1490 1495 1500

Gly Leu Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu

1505 1510 1515

Thr Gln Ala Arg Val Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asp Gly Asp Val

1520 1525 1530

Glu Lys Ala Val Arg Ile Val Lys Glu Val Thr Glu Lys Leu Ser

1535 1540 1545

Lys Tyr Glu Val Pro Pro Glu Lys Leu Val Ile His Glu Gln Ile

1550 1555 1560

Thr Arg Asp Leu Lys Asp Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His Val Ala

1565 1570 1575

Val Ala Lys Arg Leu Ala Ala Arg Gly Val Lys Ile Arg Pro Gly

1580 1585 1590

Thr Val Ile Ser Tyr Ile Val Leu Lys Gly Ser Gly Arg Ile Gly

1595 1600 1605

Asp Arg Ala Ile Pro Phe Asp Glu Phe Asp Pro Thr Lys His Lys

1610 1615 1620

Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln Val Leu Pro Ala Val

1625 1630 1635

Glu Arg Ile Leu Arg Ala Phe Gly Tyr Arg Lys Glu Asp Leu Arg

1640 1645 1650

Tyr Gln Lys Thr Arg Gln Val Gly Leu Ser Ala Trp Leu Lys Pro

1655 1660 1665

Lys Gly Thr

1670

<210> 2

<211> 5016

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

atgatcctcg acactgacta cataaccgag gatggaaagc ctgtcataag aattttcaag 60

aaggaaaacg gcgagtttaa gattgagtac gaccggactt ttgaacccta cttctacgcc 120

ctcctgaagg acgattctgc cattgaggaa gtcaagaaga taaccgccga gaggcacggg 180

acggttgtaa cggttaagcg ggttgaaaag gttcagaaga agttcctcgg gagaccagtt 240

gaggtctgga aactctactt tactcatccg caggacgtcc cagcgataag ggacaagata 300

cgagagcatc cagcagttat tgacatctac gagtacgaca tacccttcgc caagcgctac 360

ctcatagaca agggattagt gccaatggaa ggcgacgagg agctgaaaat gctcgccttc 420

gacattgaaa ctctctacca tgagggcgag gagttcgccg aggggccaat ccttatgata 480

agctacgccg acgaggaagg ggccagggtg ataacttgga agaacgtgga tctcccctac 540

gttgacgtcg tctcgacgga gagggagatg ataaagcgct tcctccgtgt tgtgaaggag 600

aaagacccgg acgttctcat aacctacaac ggcgacaact tcgacttcgc ctatctgaaa 660

aagcgctgtg aaaagctcgg aataaacttc gccctcggaa gggatggaag cgagccgaag 720

attcagagga tgggcgacag gtttgccgtc gaagtgaagg gacggataca cttcgatctc 780

tatcctgtga taagacggac gataaacctg cccacataca cgcttgaggc cgtttatgaa 840

gccgtcttcg gtcagccgaa ggagaaggtt tacgctgagg aaataaccac agcctgggaa 900

accggcgaga accttgagag agtcgcccgc tactcgatgg aagatgcgaa ggtcacatac 960

gagcttggga aggagttcct tccgatggag gcccagcttt ctcgcttaat cggccagtcc 1020

ctctgggacg tctcccgctc cagcactggc aacctcgttg agtggttcct cctcaggaag 1080

gcctatgaga ggaatgagct ggccccgaac aagcccgatg aaaaggagct ggccagaaga 1140

cggcagagct atgaaggagg ctatgtaaaa gagcccgaga gagggttgtg ggagaacata 1200

gtgtacctag attttagatg ccatccagcc gatacgaagg ttgtcgtcaa ggggaagggg 1260

attataaaca tcagcgaggt tcaggaaggt gactatgtcc ttgggattga cggctggcag 1320

agagttagaa aagtatggga atacgactac aaaggggagc ttgtaaacat aaacgggtta 1380

aagtgtacgc ccaatcataa gcttcccgtt gttacaaaga acgaacgaca aacgagaata 1440

agagacagtc ttgctaagtc tttccttact aaaaaagtta agggcaagat aataaccact 1500

ccccttttct atgaaatagg cagagcgaca agtgagaata ttccagaaga agaggttctc 1560

aagggagagc tcgctggcat actattggct gaaggaacgc tcttgaggaa agacgttgaa 1620

tactttgatt catcccgcaa aaaacggagg atttcacacc agtatcgtgt tgagataacc 1680

attgggaaag acgaggagga gtttagggat cgtatcacat acatttttga gcgtttgttt 1740

gggattactc caagcatctc ggagaagaaa ggaactaacg cagtaacact caaagttgcg 1800

aagaagaatg tttatcttaa agtcaaggaa attatggaca acatagagtc cctacatgcc 1860

ccctcggttc tcaggggatt cttcgaaggc gacggttcag taaacagggt taggaggagt 1920

attgttgcaa cccagggtac aaagaacgag tggaagatta aactggtgtc aaaactgctc 1980

tcccagcttg gtatccctca tcaaacgtac acgtatcagt atcaggaaaa tgggaaagat 2040

cggagcaggt atatactgga gataactgga aaggacggat tgatactgtt ccaaacactc 2100

attggattca tcagtgaaag aaagaacgct ctgcttaata aggcaatatc tcagagggaa 2160

atgaacaact tggaaaacaa tggattttac aggctcagtg aattcaatgt cagcacggaa 2220

tactatgagg gcaaggtcta tgacttaact cttgaaggaa ctccctacta ctttgccaat 2280

ggcatattga cccataactc cctgtacccc tcaatcatca tcacccacaa cgtctcgccg 2340

gatacgctca acagagaagg atgcaaggaa tatgacgttg ccccacaggt cggccaccgc 2400

ttctgcaagg acttcccagg atttatcccg agcctgcttg gagacctcct agaggagagg 2460

cagaagataa agaagaagat gaaggccacg attgacccga tcgagaggaa gctcctcgat 2520

tacaggcaga gggccatcaa gatcctggca aacagcatcc tacccgagga atggcttcca 2580

gtcctcgagg aaggggaggt tcacttcgtc aggattggag agctcataga ccggatgatg 2640

gaggaaaatg ctgggaaagt aaagagagag ggcgagacgg aagtgcttga ggtcagtggg 2700

cttgaagtcc cgtcctttaa caggagaact aacaaggccg agctcaagag agtaaaggcc 2760

ctgattaggc acgattattc tggcaaggtc tacaccatca gactgaagtc ggggaggaga 2820

ataaagataa cctctggcca cagcctcttc tctgtgagaa acggggagct cgttgaagtt 2880

acgggcgatg aactaaagcc aggtgacctc gttgcagtcc cgcggagatt ggagcttcct 2940

gagagaaacc acgtgctgaa cctcgttgaa ctgctccttg gaacgccaga agaagaaact 3000

ttggacatcg tcatgacgat cccagtcaag ggtaagaaga acttctttaa agggatgctc 3060

aggactttgc gctggatttt cggagaggaa aagaggccca gaaccgcgag acgctatctc 3120

aggcaccttg aggatctggg ctatgtccgg cttaagaaga tcggctacga agtcctcgac 3180

tgggactcac ttaagaacta cagaaggctc tacgaggcgc ttgtcgagaa cgtcagatac 3240

aacggcaaca agagggagta cctcgttgaa ttcaattcca tccgggatgc agttggcata 3300

atgcccctaa aagagctgaa ggagtggaag atcggcacgc tgaacggctt cagaatgaga 3360

aagctcattg aagtggacga gtcgttagca aagctcctcg gctactacgt gagcgagggc 3420

tatgcaagaa agcagaggaa tcccaaaaac ggctggagct acagcgtgaa gctctacaac 3480

gaagaccctg aagtgctgga cgatatggag agactcgcca gcaggttttt cgggaaggtg 3540

aggcggggca ggaactacgt tgagataccg aagaagatcg gctacctgct ctttgagaac 3600

atgtgcggtg tcctagcgga gaacaagagg attcccgagt tcgtcttcac gtccccgaaa 3660

ggggttcggc tggccttcct tgaggggtac ttcatcggcg atggcgacgt ccacccgaac 3720

aagagactca ggctctcaac gaaaagcgag cttttagcga accagctcgt cctcctcttg 3780

aactcggtgg gggtctctgc tgtaaaactt gggcacgaca gcggcgttta cagggtctat 3840

ataaacgagg agctcccgtt cgtaaagctg gacaagaaaa agaacgccta ctactcacac 3900

gtgatcccca aggaagtcct gagcgaggtc tttgggaagg ttttccagaa aaacgtcagt 3960

cctcagacct tcaggaagat ggtcgaggac ggaagactcg atcccgaaaa ggcccagagg 4020

ctctcctggc tcattgaggg ggacgtagtg ctcgaccgcg ttgagtccgt tgatgtggaa 4080

gactacgatg gttatgtcta tgacctgagc gtcgaggaca acgagaactt cctcgttggc 4140

tttgggttgg tctatgctca caacagctac tacggttact acggctatgc aagggcgcgc 4200

tggtactgca aggagtgtgc agagagcgta acggcctggg gaagggagta cataacgatg 4260

accatcaagg agatagagga aaagtacggc tttaaggtaa tctacagcga caccgacgga 4320

ttttttgcca caatacctgg agccgatgct gaaaccgtca aaaagaaggc tatggagttc 4380

ctcaagtata tcaacgccaa acttccgggc gcgcttgagc tcgagtacga gggcttctac 4440

aaacgcggct tcttcgtcac gaagaagaag tatgcggtga tagacgagga aggcaagata 4500

acaacgcgcg gacttgagat tgtgaggcgt gactggagcg agatagcgaa agagacgcag 4560

gcgagggttc ttgaagcttt gctaaaggac ggtgacgtcg agaaggccgt gaggatagtc 4620

aaagaagtta ccgaaaagct gagcaagtac gaggttccgc cggagaagct ggtgatccac 4680

gagcagataa cgagggattt aaaggactac aaggcaaccg gtccccacgt tgccgttgcc 4740

aagaggttgg ccgcgagagg agtcaaaata cgccctggaa cggtgataag ctacatcgtg 4800

ctcaagggct ctgggaggat aggcgacagg gcgataccgt tcgacgagtt cgacccgacg 4860

aagcacaagt acgacgccga gtactacatt gagaaccagg ttctcccagc cgttgagaga 4920

attctgagag ccttcggtta ccgcaaggaa gacctgcgct accagaagac gagacaggtt 4980

ggtttgagtg cttggctgaa gccgaaggga acttga 5016

Claims

1.蛋白质，其特征在于：所述蛋白质为下述B1）、B2）、B3）或B4）：

B1）将序列表中序列1所示的氨基酸序列中的第1025位的色氨酸残基突变为甘氨酸残基、第681位的精氨酸残基突变为赖氨酸残基、第1462位的赖氨酸残基突变为丝氨酸残基和第1347位的甘氨酸残基突变为苏氨酸残基得到的蛋白质；

B2）将序列表中序列1所示的氨基酸序列中的第1025位的色氨酸残基突变为甘氨酸残基、第681位的精氨酸残基突变为赖氨酸残基、第1462位的赖氨酸残基突变为丝氨酸残基和第357位的亮氨酸残基突变为丙氨酸残基得到的蛋白质；

B3）将序列表中序列1所示的氨基酸序列中的第1025位的色氨酸残基突变为精氨酸残基、第1462位的赖氨酸残基突变为苯丙氨酸残基、第357位的亮氨酸残基突变为甲硫氨酸残基和第1256位的亮氨酸残基突变为缬氨酸残基得到的蛋白质；

B4）将序列表中序列1所示的氨基酸序列中的第1025位的色氨酸残基突变为亮氨酸残基、第1462位的赖氨酸残基突变为甘氨酸残基、第1347位的甘氨酸残基突变为赖氨酸残基和第357位的亮氨酸残基突变为谷氨酸残基得到的蛋白质。

2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述C1）- C5）中的任一种：

C1）编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；

C2）含有C1）所述核酸分子的表达盒；

C3）含有C1）所述核酸分子的重组载体、或含有C2）所述表达盒的重组载体；

C4）含有C1）所述核酸分子的重组微生物、或含有C2）所述表达盒的重组微生物、或含有C3）所述重组载体的重组微生物；

C5）含有C1）所述核酸分子的细胞系、或含有C2）所述表达盒的细胞系，所述细胞系为微生物或动物细胞。

3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：C1）所述核酸分子为将序列表中序列2所示的cDNA分子或DNA分子进行突变得到的核酸分子。

4.根据权利要求2或3所述的生物材料，其特征在于：编码权利要求1中B1）所述蛋白质的核酸分子为将序列2的第2041位的C突变为A、第2042位的G突变为A，第3073位的T突变为G、第3075位的G突变为A，第4039位的G突变为A、第4040位的G突变为C，第4385位的A突变为G、第4386位的G突变为C得到的核酸分子；

编码权利要求1中B2）所述蛋白质的核酸分子为将序列2的第1069位的C突变为G、第1070位的T突变为C、第1071位的C突变为A，第2041位的C突变为A、第2042位的G突变为A，第3073位的T突变为G、第3075位的G突变为A，第4385位的A突变为G、第4386位的G突变为C得到的核酸分子；

编码权利要求1中B3）所述蛋白质的核酸分子为将序列2的第1069位的C突变为A、第1071位的C突变为G，第3073位的T突变为C，第3766位的C突变为G、第3768的C突变为A，第4384位的A突变为T、第4385位的A突变为T、第4386位的G突变为C得到的核酸分子；

编码权利要求1中B4）所述蛋白质的核酸分子为将序列2的第1069位的C突变为G、第1070位的T突变为A、第1071位的C突变为A，第3073位的T突变为C、第3074位的G突变为T，第4039位的G突变为A、第4040位的G突变为A，第4384位的A突变为G、第4385位的A突变为G得到的核酸分子。

5.权利要求1所述蛋白质的制备方法，包括：将权利要求1所述蛋白质的编码基因导入生物细胞中，使所述编码基因得到表达，得到所述蛋白质。

6.用于体外DNA合成，DNA扩增，或，DNA测序的试剂或试剂盒，包含权利要求1所述蛋白质。

7.下述任一应用：

E1）权利要求1所述蛋白质在作为DNA聚合酶中的应用；

E2）权利要求2-4中任一所述生物材料在制备DNA聚合酶中的应用；

E3）权利要求1所述蛋白质在DNA聚合反应中的应用；

E4）权利要求1所述蛋白质在制备聚合酶链式反应产品中的应用；

E5）权利要求2-4中任一所述生物材料在聚合酶链式反应中的应用；

E6）权利要求2-4中任一所述生物材料在制备聚合酶链式反应产品中的应用；

E7）权利要求5所述方法在制备DNA聚合反应产品中的应用。